Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Чувствительным измерение Mitophagy, поток цитометрии с помощью РН зависимых флуоресцентные репортер mt-Keima

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/58099
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 1,2
1Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 3Aging Institute, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Mitophagy, селективный деградации митохондрий, был вовлечен в митохондриальной гомеостаза и дерегулирование в различных заболеваний человека. Однако удобный экспериментальные методы для измерения активности mitophagy весьма ограничены. Здесь мы предоставляем чувствительных анализа для определения mitophagy активности с помощью проточной цитометрии.

Abstract

Mitophagy представляет собой процесс селективного удаления поврежденных или ненужные митохондрий, с использованием машин autophagy. Тесные связи были найдены между дефектных mitophagy и различных заболеваний человека, включая нейродегенеративные заболевания, рак и болезни обмена веществ. Кроме того недавние исследования показали, что mitophagy участвует в нормальных клеточных процессах, например дифференциация и развития. Однако конкретная роль и лежащих в основе mitophagy молекулярные механизмы требуют дальнейшего изучения. Таким образом крайне важно разработать надежный и удобный способ для измерения изменений в mitophagy деятельности. Здесь мы описываем подробный протокол для количественной оценки mitophagy деятельность через проточной цитометрии, с помощью ориентированных на митохондрии флуоресцентный белок Keima (mt-Keima). Этот assay цитометрии потока можно анализировать mitophagy более быстро и деликатно, чем обычные микроскопия - или immunoblotting-на основе методов. Этот протокол может применяться для анализа mitophagy активности в различных типах клеток.

Introduction

Митохондрии являются органеллы, которые необходимы для пролиферации клеток и физиологии. Митохондрии отвечают за создание более чем 80% поставок СПС через окислительное фосфорилирование, и они также предоставляют различные метаболические интермедиатов для биосинтеза и метаболизм1,2. Помимо их роли в энергоснабжении и метаболизм митохондрии играют центральную роль во многих других важных процессах, включая реактивнооксигенных видов (ров) поколения, регулирование клеточной смерти и внутриклеточных Ca2 + динамики3 . Изменения в митохондриальной функции были связаны с человека болезней, включая рак, сахарный диабет и различных нейродегенеративных заболеваний4,5. Увеличение митохондриальной дисфункции и митохондриальных мутаций ДНК также думал вносить нормального старения процессов6,,78. Таким образом контроль качества является ключевым вопросом в митохондриях. Митохондрии являются высокодинамичные органеллы, которые непрерывно можно изменить их форму между удлиненным сетей и короткие, раздробленной формой. Митохондрии динамики играет важную роль в поддержании функции митохондрий, а также их деградации через mitophagy9.

Mitophagy — это механизм, который включает селективного деградации всего митохондрий, с использованием механизма autophagy. Mitophagy является принцип механизма основной митохондриальную оборот и удаление поврежденных или неблагополучных митохондрий. В этом процессе митохондрии окружены сначала мембраны, что приводит к формированию autophagosomes, которые затем сливаются с лизосомы гидролитическая деградации9. Предыдущих генетические исследования в дрозофилы предложили что два генов, связанных с болезнью Паркинсона, PTEN-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) (PARK6) и Паркин (PARK2), функционировать в том же пути10,11. Самой длинной общей подпоследовательности исследования показали, что путь PINK1-Паркин отвечает за устранение повреждения митохондрий и дефектов в результате этот путь в неблагополучных mitophagy и может способствовать болезни человека12,13. Дефекты в mitophagy процессах были недавно найдены в различных человеческих заболеваний, включая рак, болезни сердца, заболевания печени и нейродегенеративные болезни 14. Кроме того недавние исследования также показали, что mitophagy имеет решающее значение для многих физиологических процессов, например дифференциация, развития и иммунный ответ15,16,17,18 ,19, предполагая, что mitophagy могут играть более активную роль в управлении функции клеток.

Несмотря на недавнее подтверждение, что mitophagy играет важную роль в обоих качества управления в митохондриях и болезней человека, лежащие в основе mitophagy молекулярные механизмы остаются плохо понимают. Хотя механизмы, связанные с mitophagy систематически исследованы в дрожжи, исследования, направленные на изучение механизмов, связанных с mitophagy, в клетках млекопитающих главным образом на PINK1-Паркин путь. Предыдущие исследования установили, что путь PINK1-Паркин отвечает главным образом за селективное удаление поврежденных митохондрий через mitophagy12,,2021. Однако недавние исследования сообщили, что в некоторых моделях, mitophagy может быть активирован даже в отсутствие функциональных PINK122,,23-24. Эти результаты показывают, что в дополнение к PINK1-Паркин путь, там еще неопознанных путь, который может активировать mitophagy.

Отсутствие удобного метода для оценки деятельности mitophagy является серьезным препятствием для изучения путей, которые регулируют mitophagy и его роль в патофизиологической событий. Электронная микроскопия является мощным инструментом непосредственно визуализировать охватил autophagosome митохондрий. Однако электронная микроскопия имеет ограничения в количественном определении mitophagy активность. Хотя стратегии, которые используют связанные микротрубочек белка-1 легкая цепь 3 (LC3)-конъюгированных флуоресцентных зондов, например GFP-LC3, в настоящее время наиболее широко используемых подходов25, преходящий характер на основе LC3 сигнала и его высокий уровень ложно положительных сигналов ограничивают его чувствительность обнаружения mitophagy в клетки26. Сочетание Западный blotting для измерения уровня митохондриальных белок, количественная оценка митохондриальной ДНК и анализ микроскопии флуоресцирования colocalize митохондрий с autophagosomes или лизосомы будет хорошим подходом для оценки mitophagy. Однако количественная оценка ограничений и отсутствия удобства существующих методологий требуют новых подходов. Введение новой рН зависимых флуоресцентный белок, митохондриальных целевой Keima (mt-Keima), значительно улучшить способность обнаруживать mitophagy27. Смешав последовательности митохондриальной ориентации цитохрома с-оксидазы субъединицы VIII (Кокс VIII) в Keima, mt-Keima направлена на митохондриальной матрицы. Большой сдвиг в пик возбуждения Keima от 440 Нм до 586 Нм (соответствует рН 7 и pH 4, соответственно) могут быть использованы для оценки mitophagy с хорошим чутко в как in vitro и in vivo эксперименты28,29 . Что еще более важно сопротивление МТ Keima лизосомальных деградации вызывает интеграции МТ Keima сигнала в лизосомы, позволяя легко количественного измерения активности mitophagy. Флуоресценции изменение, которое происходит в МТ Keima могут быть проанализированы с использованием либо конфокальная микроскопия поток или цитометрии28,29. Однако на основе цитометрии метод потока для определения mitophagy активности с использованием МТ Keima не обеспечивается в деталях на сегодняшний день.

Здесь мы описываем подробный протокол для потока на основе цитометрии техники для измерения mitophagy активность в клетках, использование МТ Keima. Хотя мы показали здесь, что cytometry анализ потока успешно обнаружен CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa, выражая Паркин, этот метод может быть применен к широкий спектр типов клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. поколение клеток HeLa, выражая mito-Keima (mt-Keima)

  1. Подготовка человека mt-Keima
    1. Слой 100-мм культуры блюдо, добавив 2 мл 0,001% поли L-лизин/фосфат амортизированное saline (PBS) и дайте ему постоять 5 мин при комнатной температуре.
    2. Удаление поли L-лизин решения с помощью стеклянной пипетки, подключенных к вакуум и мыть культуры блюдо, добавив 2 мл ПБС.
    3. Плита 1,5 х 106 HEK293T клетки на покрытые культуры блюдо с 10 мл DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и культура клетки при 37 ° C в инкубатор культуры ткани CO2 на один день.
    4. Transfect 2 мкг МТ Keima лентивирусные плазмида29 ДНК вместе с упаковкой ННО (psPAX 2 мкг и pVSVG 0,25 мкг) с помощью трансфекции реагент для 8 h согласно инструкциям производителя.
    5. Извлеките носитель transfection и добавить 8 мл свежего средств массовой информации.
    6. Сбор средств массовой информации, содержащие вирусных частиц 48 h позже. Удаление сотовой мусора из собранных средств массовой информации центрифугированием на 500 g x 5 мин и фильтровать их с 0,45 мкм фильтром шприца.
      Примечание: Для длительного использования сделать аликвоты лентивирусные частиц и хранить образцы-80 ° c. Избегайте, подвергая вирусных образцов для замораживания оттаивания циклов для эффективного вирусной инфекции.
  2. Заражение клетки HeLa Паркин с МТ Keima Лентивирусы
    1. Клетки HeLa4 Клемная 5 x 10, выражая Паркин (HeLa-Паркин) в 60-мм культуры блюдо с 4 мл DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 ° C за один день до уборки МТ Keima человека.
      Примечание: Из-за отсутствия эндогенного Паркин выражения в НеЬа клетки30, клетки HeLa-Паркин, использованы здесь, чтобы более четко показать CCCP-индуцированной mitophagy. Эта процедура может также применяться к другим основным или увековечен клеточных линий.
    2. Удалите средство роста следующий день и добавьте 1 mL МТ Keima лентивирусные средств массовой информации. Добавьте еще 2 мл среднего роста, содержащий 3 мкл Полибрен раствор (8 мг/мл в дистиллированной воде). Инкубируйте на один день в инкубатор культуры ткани CO2 .
    3. Снимите смесь лентивирусные МТ Keima следующий день и мыть ячейки дважды с ПБС. Добавьте 4 мл среднего роста и лечить клетки с 2 мкг/мл puromycin за два дня.
    4. После двух дней puromycin выбор удалить среднего роста и вымыть клетки дважды с ПБС. Добавьте средство роста и культура клетки в инкубатор CO2 до использования.
      Примечание: Этот метод может применяться для создания клетки, которые стабильно Экспресс МТ Keima, включая другие линии клетки и клетки первичной.

2. побудить mitophagy с помощью CCCP лечения и подготовка образцов СУИМ

  1. Клемная 5 x 104 Паркин НеЬа клетки, выражая МТ Keima в культуре 60-мм блюдо с 4 мл DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и культура их на один день при 37 ° C в инкубатор культуры ткани CO2 .
  2. Удалите средство роста следующий день и добавить 4 мл свежего DMEM, содержащие 10 мкм карбонильных цианида m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Инкубируйте клетки HeLa-Паркин mt-Keima в инкубатор ткани CO2 на 6 ч.
  3. Удалите средство роста 6 h позже и вымыть клетки с 2 мл ПБС. Отсоединить клетки, рассматривая их раствором трипсина/ЭДТА и инактивировать трипсина, добавив среднего роста, содержащие 10% FBS. Перенесите клетки в 15 мл Конические трубки.
  4. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин.
  5. Осторожно удалите среднего роста, стремление и Ресуспензируйте клеток в 1 мл холодного ПБС.
  6. Клетки перехода в соответствующую трубку СУИМ и поместите его на льду.
    Примечание: Подготовьте неинфицированных клеток HeLa в качестве отрицательного контроля.
    Примечание: Клетки являются жизнеспособной на льду на несколько часов, и МТ Keima флуоресценции сигналы также остаются стабильными.

3. СУИМ анализ mitophagy

Примечание: В этом исследовании, клетки были проанализированы с проточный цитометр оснащены лазером 405 нм и 561 Нм. Клетки были в восторге с фиолетовым лазером (405 нм) с выбросов, обнаруженные на 610 ± 10 нм с BV605 детектором и желто зеленый лазер (561 Нм) с выбросов определяется PE-CF594 детектор 610 ± 10 Нм, одновременно (рис. 1).

  1. Шлюзовые живых клеток
    1. Включите проточный цитометр и компьютер и войдите в программное обеспечение для анализа.
    2. Создайте новый эксперимент или дублировать существующие эксперимент. Для возбуждения клеток с фиолетовыми (405 нм) и желто зеленый (561 Нм) лазеры и обнаружения выбросов на 610 ± 10 Нм детектор, выберите BV605 и PE-CF594 помимо вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC) в окне параметров требуется флуорофоров.
      Примечание: Все флуорофоров должны быть добавлены в линейном режиме.
    3. Вихревой каждый образец клеток кратко разойтись клеток агрегатов.
    4. Место трубка, содержащая управления HeLa Паркин образец клеток, который не заражен с МТ Keima человека на порт впрыска образца и нажмите кнопку «выполнить» на цитометр.
    5. В сюжете точка FSC по сравнению SSC Отрегулируйте FSC и SSC напряжения для размещения ячеек в центре сюжета точка.
    6. Нарисуйте P1 ворота, используя значок многоугольник вокруг живых клеток и устранить омертвевшие клетки и клетки мусора (рис. 2A).
  2. Настройка напряжения для фиолетовый и зеленый лазер
    1. Место труб, содержащих HeLa Паркин клетки, инфицированные с МТ Keima человека на образец инъекции порт и нажмите кнопку «выполнить» на цитометр.
    2. В сюжет точка BV605 (405 нм) по сравнению с ККК, отрегулируйте BV605 напряжения так, что клетки HeLa-Паркин, выражая МТ Keima четко отличать от управления клеток, которые не выражают МТ Keima (рис. 2B).
    3. В сюжете точка PE-CF594 (561 Нм) по сравнению с ККК, настроить напряжения PE-CF594, чтобы клетки HeLa-Паркин, выражая МТ Keima четко отличать от управления клеток (рис. 2B).
  3. Оценить процент клеток в mitophagy
    1. Приобрести BV605 против PE-CF594 точка участок с помощью линейной шкалы. Нарисуйте ворот, используя значок многоугольник вокруг клетки, выражая МТ Keima и ликвидации клеток, не выражая МТ Keima (рис. 3A). Mt-Keima населения флуоресценции положительных клеток называется ворот «МТ Keima».
    2. Создайте еще один участок точка BV605 против PE-CF594 показаны только «МТ Keima»-закрытый клетки. В этом участке точка Нарисуйте ворот вокруг необработанных МТ Keima положительных клеток. Базальной mitophagy деятельность управления НеЬа клетки является низким, и коэффициент выбросов в PE-CF594/BV605-меньше 1. Таким образом этот ворот называется ворот «низкий».
    3. Нарисуйте другой ворота, содержащий регионе выше ворот «низкий». Эти ворота именуется как «высокий» ворота потому, что он содержит ячейки с высокой mitophagy активностью, то есть, клетки с высоким соотношением эмиссии в PE-CF594/BV605 (рис. 3B).
    4. Чтобы вычислить процент клеток в ворота «высокий», выберите в меню «Показать иерархию населения». «Процентов родителей» (% родителей) значение представляет собой процент клеток в «высокий» ворота среди МТ Keima позитивной популяции.
    5. Установите по крайней мере 10 000 событий для записи в ворота «МТ Keima» остановки и запуска каждого образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Пример анализа потока цитометрии CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa Паркин показан на рисунке 4. Использование метода анализа цитометрии потока, описанных выше, мы можем обнаружить резкое увеличение в mitophagic клетках в ворота «высокий». Процент клеток в ворота «высокий» был увеличен более чем в 10 раз по сравнению с необработанными управления клеток (рис. 4A). Это увеличение активности mitophagy была полностью отменена совместное лечение с bafilomycin (БФА) (рис. 4A и 4B).

Figure 1
Рисунок 1 . Схематическое представление метода, используемого для измерения mitophagy с проточной цитометрии. Схемы описываются основные шаги, необходимые для количественного определения клетки проходят mitophagy подачей cytometry. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Параметры потока цитометр. (A) Gating живых клеток. Регион для живых клеток определяли по FSC по сравнению SSC заговор чтобы исключить мертвые клетки и клетки мусора. (B) регулировка 405 нм и 531 Нм лазеры, с помощью управления НеЬа клетки и НеЬа клетки выражая МТ Keima. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Расчет доли клеток mitophagic подачей cytometry. (A) Gating НеЬа клетки, выражая МТ Keima. (B) стробирование mitophagic клеток и расчета доли, используя средство статистики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Количественная оценка CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa подачей cytometry. (A) клетки HeLa Паркин, выражая МТ Keima лечили 10 мкм CCCP 6 h с или без bafilomycin 100 Нм (БФА). Клетки были проанализированы СУИМ, используя BV605 и PE-CF594 детекторов. (B) клетки с высоким соотношением PE-CF594/BV605 были выбраны («высокий»), и их доля была рассчитана. Результаты трех повторных экспериментов, выводятся с стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представляем быстрый и чувствительных метод использования проточной цитометрии для измерения активности клеточных mitophagy в клетках, выражая МТ Keima. Клетки, переживает высокий уровень mitophagy демонстрируют увеличение соотношения между объемом PE-CF594 (561 Нм) / BV605 (405 нм) возбуждения. Таким образом mitophagy активность может выражаться как процент клеток, экспонируется высокий коэффициент 561/405. Мы подсчитали процент клеток в регионе «высокий» ворота на участке точка PE-CF594 (561 Нм) против BV605 (405 нм), и результаты показали, что лечение с CCCP индуцированной увеличение mitophagy в клетки HeLa Паркин. Ранее мы показали, что человека опосредованной гиперэкспрессия МТ Keima не сам влияет на митохондриальной функции или клеточной физиологии31. Хотя мы показали в нашей рукописи что cytometry анализ потока может успешно обнаруживать CCCP-индуцированной mitophagy в НеЬа клетки, выражая Паркин, этот метод может быть применен к любому типу клеток после введения mt-Keima. Ранее мы показали, что что гипоксия индуцированной mitophagy могут быть обнаружены в клетки HeLa без внематочная Паркин выражение29. Кроме того предыдущие исследования, включая ours и других групп, показали, что МТ Keima флуоресцентный анализ может обнаружить mitophagy в начальных клеток, таких как мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) и увековечил клеток, таких как клетки HeLa, HEK293 и SH-SY5Y 28 , 29 , 32.

По сравнению с другими на основе микроскопии или immunoblotting mitophagy анализов, поток цитометрии анализов имеют преимущества в том, что они позволяют быстрое, воспроизводимость анализа большого числа клеток31. Таким образом в то время как в основе микроскопии анализов, исследователь предвзятости может исказить результаты, эта предвзятость проблема не возникает при использовании потока цитометрии анализов.

Меньше чем 1 x 106 клеток необходимы для анализа потока цитометрии. Кроме того поскольку анализ образца занимает только одну-две минуты, до нескольких десятков образцов могут быть проанализированы в течение одного-двух часов. Кроме того поток цитометрии анализов можно обнаружить увеличение в mitophagic клетках с хорошей чувствительностью. В нашем анализе цитометрия потоков мы обнаружили десятикратного увеличения в mitophagic клетках после 6 h лечения с CCCP.

Важным шагом для анализа mitophagy, с помощью проточной цитометрии является правильно задать «высокий» и «низкий» ворота различать клетки, переживает высокий уровень mitophagy. Поскольку уровень базальной mitophagy может быть различным в зависимости от типа клеток, установка ворот «высокий» и «низкий» может быть затруднено в некоторых клеточных линий. В таком случае полезно включить строки ячейки элемента управления с низкими базальный mitophagy активность таких НеЬа клетки. Кроме того для ячеек, получавших ингибитор лизосомальных как хлорохин, bafilomycin A могут быть включены как низкий mitophagy управления для установки правильного стробирования. Хотя lentiviruses обычно используются для внематочная выражение интересных белков, некоторые клеточные линии могут быть восприимчивы к инфекции вируса. Если сама инфекция человека приводит к изменениям в рост клеток или функции митохондрий, другой метод следует рассматривать для МТ Keima выражение. Уровень экспрессии МТ Keima может также варьироваться в зависимости от типа ячейки. Если сигнал флуоресценции МТ Keima слишком слаб, или слишком гетерогенными, только клетки с сигналом флуоресценции сильную МТ Keima могут быть собраны с помощью сортировщик клетки или клетки МТ Keima, снова лечить с высокой концентрацией puromycin антибиотиков в течение нескольких дней . Mt-Keima сигнал отдельностоящий клеток являются стабильными, пока клетки являются жизнеспособными, но мы рекомендуем, анализируя образцы подачей cytometry как можно быстрее.

Наш поток цитометрии пробирного надежный и удобный способ для mitophagy анализа, но есть некоторые ограничения. Во-первых потому, что клетки должны быть разделены как одна ячейка уровня для проточной цитометрии, этот метод является трудно применять для анализа mitophagy тканей или органов, не изменяя физиологии. Кроме того mt-Keima флуоресценции теряет свои характеристики pH зависимой после фиксации, и таким образом, все образцы должны быть проанализированы как живой клетки. Это приводит к ограничение хранения проб, упомянутых выше и еще ограничения при применении дополнительных иммунофлюоресценции пятно. Эта техника может измерять активность mitophagy количественно, но он не в состоянии следить за изменениями в митохондриальной морфологии или динамики, которые как известно, играют важную роль в процессе mitophagy9. Исследователи должны иметь в виду, сложности и неопределенные аспекты mitophagy. Таким образом во избежание возможных просчетов, mitophagy процесс должен быть далее подтвержден Комбинированные результаты других общих методов анализа mitophagy, включая электронной микроскопии, оборот митохондриальных белок, сокращение митохондриальной ДНК и микроскопии флуоресцирования, измерения colocalization митохондрий лизосомы или autophagosomes, как описано ранее,33,34,35. Можно также дополнительно изучить любое наблюдаемое увеличение mitophagy через конфокальная микроскопия клеток, выражая МТ Keima. В mitophagic клетках mt-Keima выражается в шаблоне яркий пунктата с высоким соотношением 586/440, можно наблюдать под confocal микроскопии28,29.

Учитывая его способность быстро и деликатно обнаруживать mitophagy, этот assay цитометрии потока обеспечивает приближение первый шаг, который будет ценным для различных исследований. Просто заразить клетки с МТ Keima человека, изменения активности mitophagy может быть легко мерой в любой тип нужной ячейки. В сочетании с функцией сортировки клеток клеток с конкретным уровнем активности mitophagy можно специально изолированные и используется для изучения роли и регулирования механизмов, лежащих в основе mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грант от Национальный исследовательский фонд Кореи (2016R1D1A1B03931949) (на ю. д.) и Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF) Грант, финансируемого Кореи government(MSIT) (№ 2016R1A2B2008887, № 2016R1A5A2007009) (для J.Y .)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
HEK293T ATCC CRL-3216
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
Turbofect Thermos scientific R0531
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
HeLa ATCC CCL-2
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/ml
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/ml 
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) Sigma-Aldrich C2759 10 mM
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa BD Bioscience LSRFortessa
FACSDIVA BD Bioscience FACSDIVA (v8.0.1)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
  2. Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
  3. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  4. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  5. Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
  6. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  7. Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
  8. Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  10. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
  11. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  12. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  13. Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
  14. Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
  15. Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
  16. Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
  17. Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
  18. Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
  19. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
  20. Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
  21. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  22. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  23. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  24. Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
  25. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  26. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  27. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  28. Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
  29. Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  30. Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
  31. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  32. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
  33. Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
  34. Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
  35. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).

Tags

Биология выпуск 138 Mitophagy митохондрии mt-Keima проточной цитометрии флуоресцентный белок зависящих от рН зонд
Чувствительным измерение Mitophagy, поток цитометрии с помощью РН зависимых флуоресцентные репортер mt-Keima
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T.,… More

Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T., Yun, J. Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima. J. Vis. Exp. (138), e58099, doi:10.3791/58099 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter