Summary
Dit protocol biedt een methode om te evalueren van de proteolytic activiteit van een intrinsiek laag-activiteit, één omzet protease in een cellulaire context. In het bijzonder is deze methode toegepast om te evalueren van de proteolytic activiteit van PCSK9, een belangrijke bestuurder van lipide metabolisme waarvan proteolytic activiteit vereist voor de ultieme hypercholesterolemic functie is.
Abstract
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is een single-omzet protease die serum low-density lipoprotein (LDL) niveaus regelt en, bijgevolg, hart-en vaatziekten. Hoewel PCSK9 proteolyse vereist voor het volledige hypercholesterolemic effect is, de evaluatie van zijn proteolytische functie is uitdagend: PCSK9 is alleen bekend dat het klieven zelf, ondergaat slechts een enkele omzet, en na proteolyse, behoudt zijn substraat in de actieve site als een auto-remmer. De hier gepresenteerde methoden beschrijven een bepaling die deze uitdagingen overwint. De test richt zich op intermoleculaire proteolyse in een cel-gebaseerde context en de succesvolle decollete koppelingen aan de secreted luciferase activiteit, die kan gemakkelijk worden voorgelezen in het geconditioneerde medium. Via opeenvolgende stappen van mutagenese, voorbijgaande transfectie en een luciferase uitlezing, de bepaling kan sonde PCSK9 proteolyse onder voorwaarden van genetische of moleculaire perturbation in zodanig hoge gegevensdoorvoer. Dit systeem is geschikt voor zowel de biochemische evaluatie van klinisch ontdekte missense single-nucleotidepolymorfisme (SNPs), alsook wat betreft de screening van kleine-molecuul remmers van PCSK9 proteolyse.
Introduction
PCSK9 richt de LDL-receptor (LDL-R) voor afbraak, verhoging van LDL cholesterol (LDL-C) en rijden atherosclerotische hart-en vaatziekten1,2. Therapeutiek targeting PCSK9 krachtig lagere LDL-C en verbeteren van cardiovasculaire uitkomsten voor patiënten, zelfs wanneer toegevoegd aan een agressieve lipide-verlagende therapie met statines3,4. Momenteel goedgekeurde therapieën zijn beperkt tot antilichaam-gebaseerde benaderingen, echter, en lijden onder een gebrek aan kosteneffectiviteit5,6. U kunt dit probleem oplossen, zijn minder dure therapeutische alternatieven, een middel om het identificeren van patiënten kunnen profiteren van meer voordelen, of beide, nodig.
Kleine-molecuul benaderingen kunnen richten intracellulaire PCSK9, bieden een betere wijze van toediening en kostenverlaging, waardoor ze de "Heilige Graal" in dit gebied7. PCSK9 heeft echter bewezen moeilijk te drug door kleine moleculen. Als een protease is gericht op PCSK9 van Proteolytische functie een aantrekkelijke strategie, zoals zelf-proteolyse de snelheidslimieten stap in de PCSK9 maturatie8 is en vereist voor het maximale effect op de LDL-R9 is. Tot op heden echter deze strategie niet geslaagd, waarschijnlijk als gevolg van de PCSK9 van unieke biochemie: PCSK9 cleaves alleen zelf10, uitvoeren van een reactie van single-omzet, en na zelf-decolleté, de PCSK9 prodomain blijft gebonden in de actieve site als een auto-remmer11, voorkomen van de uitlezing van elke verdere protease-activiteit.
Dit artikel presenteert een methode om te evalueren van de Proteolytische functie PCSK9 in high-throughput mode8. Via plaats-geleide mutagenese, kunnen onderzoekers deze test gebruiken om de effecten van codering SNPs gevonden in de kliniek om te beoordelen voor effecten op proteolyse, de snelheidslimieten stap van PCSK9 rijping sonde. Bovendien, zal deze methode nuttig zijn in het ontwerp van hoge-doorvoer schermen te identificeren modulatoren van PCSK9 proteolyse, die worden verwacht om uiteindelijk het verstoren van de presentatie van PCSK9 de LDL-r (en moduleren van PCSK9 van hypercholesterolemic effect) . Ten slotte kan dit protocol worden aangepast aan andere proteasen met intrinsiek lage activiteit, mits i) een paar specifieke substraat-protease kan worden gevonden, en ii) een geschikt intracellulaire anker voor het substraat kan worden vastgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plaats-geleide mutagenese van Protease Vector
- Ontwerp en bestel aangepaste-gesynthetiseerd oligonucleotides te installeren van een mutatie van belang met behulp van een wijziging van de standaard plaats-geleide mutagenese protocollen12. Standaard ontzout inleidingen (zonder extra reiniging) zijn volkomen aanvaardbaar.
Opmerking: Een algemene aanpak primer ontwerpen gaat om het creëren van gedeeltelijk overlappende inleidingen, zoals aangegeven in tabel 1, met behulp van een smelten temperatuur (Tm) rekenmachine die specifiek zijn voor de polymerase van belang. - Instellen polymerase kettingreactie (PCRs) voor de plaats-geleide mutagenese op het ijs, zoals aangegeven in tabel 2.
- Cyclus de PCRs zoals aangegeven in tabel 3.
- 2-5 µL van elke PCR uitvoeren op een 1% agarose gel en visualiseren van de producten ter bevestiging van een succesvolle versterking.
Opmerking: Een succesvolle PCR is een enkele, prominent DNA-band zichtbaar bij het markeerteken van de geschatte omvang van de sjabloon (~7.8 kB). - Voeg 0,5 µL (per 25-µL reactie) van DpnI en de monsters bij 37 ° C gedurende 1 uur uit te broeden.
- Transformeren 2 µL van de reactie in chemisch bevoegde Escherichia coli.
Opmerking: Een stam E. coli snelgroeiende incubatie keer zal verminderen, maar klonen stam acceptabel zal zijn. - Plaat de transformaties op Luria Bertani (LB) agar met 50-100 µg/mL carbenicillin. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C.
- Selecteer 2-4 kolonies groeien in een kleinschalige cultuur (2-5 mL van LB medium met 50-100 µg/mL carbenicillin). Incubeer de cultuur bij 37 ° C bij 220 t/min, totdat het is troebel.
- Isoleren van de plasmide DNA van de cellen met behulp van een plasmide DNA zuivering (dat wil zeggen, "miniprep") kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeren van de concentratie van geëlueerd DNA met een spectrofotometer microvolume.
- Het volgnummer van de plasmide DNA uitgebreid met een service voor het rangschikken van Sanger (zoals een core of commerciële faciliteit). De DNA-monsters volgens de specificaties van de dienst voor te bereiden. Primers met succes gebruikt in voorafgaande sequencing reacties zijn vermeld in tabel 4.
Opmerking: Als gevolg van de PCR versterking van het gehele plasmide, de volgorde van de hele PCSK9 codering regio wordt aanbevolen voor elke mutant.
2. high-throughput Luciferase gebaseerde proteolyse Assay
-
Cel beplating (dag 0)
- Lage-passage HEK293T cellen gebruiken voor experimenten en een cultuur in Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS). Uitvoeren van alle celopmaak onder steriele omstandigheden in de kap van een weefselkweek werk totdat u aan de activiteit luciferase assay. Schatten van het aantal putten en platen die nodig zijn voor het experiment, anticiperen op dat transfections in drievoud voor elke voorwaarde getest zal worden uitgevoerd.
- HEK293T cellen uit een bovenliggende kolf distantiëren door ze te behandelen met een minimaal volume van 0,05% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) ter dekking van de cellen. Inactivering van de trypsine-EDTA met 2 delen van DMEM aangevuld met 10% FBS en overdracht de cellen aan een steriele buis. Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller (en met trypan blauw kleuring). Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 5 min om te herstellen van cellen.
- Gecombineerd trypsine bevattende medium en reconstrueren van de cellen in het kweekmedium tot een concentratie van 2 x 105 cellen/mL. Met behulp van een meerkanaalspipet, Breng 100 µL van de cellen aan elk putje van een wit (dekkend-onder) 96-wells-plaat, waardoor een seeding eindconcentratie van 2 x 104 cellen per putje.
Opmerking: Voor de eerste experimenten, het wellicht nuttig om het zaad bovendien een zus, de clear-96-Wells bodemplaat, teneinde te controleren van de celgroei en aanhankelijkheid tijdens het protocol en de toekomstige problemen met gids. - Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Voorbereiding van een master plaat van plasmiden in een 96-Wells-indeling. Verdun elk plasmide in elutie buffer (Tris-HCl, pH 8,5) 50 ng/µL in een individuele put van een 96-wells-plaat.
- Elke 4 putten voorbereiden op de positieve controle (WT) plasmide8, negatieve controle (S386A) plasmide8en plasmide-vrije buffer (voor mock transfections). Als drugs of andere mobiele gebaseerde behandelingen worden gepland, dan de master plaat met de positieve controle (WT) plasmide in elk putje bereiden, wells samen met 4 elk van de plasmide negatieve controle (S386A) en de buffer plasmide-vrij.
-
Transfectie (dag 1)
- De transfectie mengsel in een 96-wells-plaat-formaat met behulp van deep-well 96-wells-platen voor te bereiden. Voer de transfections in drievoud, controleren of het bereiden van genoeg reagentia ter verantwoording voor pipetteren en overdracht verliezen.
Opmerking: De volgende berekeningen bereiden genoeg reagens te lopen een 96-wells-plaat in drievoud (conservatief geschat voor 420 putten).- Het maken van een master mix van een verdunde lipide transfectiereagens, 50.4 µL van het reagens aan 2050 µL van verminderd-serum medium toe te voegen. Het maken van een master mix van een DNA precomplexation reagens, toevoegen van 33,6 µL van het reagens in 1730 µL van verminderd-serum medium.
- Met behulp van een meerkanaalspipet, aliquoot 16,8 µL van het verdunde mengsel van het reagens van de precomplexation van de DNA in elk putje van de plaat van de diep-well.
- Met behulp van een meerkanaalspipet, aliquoot 3.2 µL (160 ng) van elke plasmide van de master plaat in elk putje van de plaat van de diep-well.
- Met behulp van een meerkanaalspipet, aliquoot 20 µL van het mengsel verdunde lipide transfectie reagens voor elk goed van de plaat en meng de inhoud van elk goed met de meerkanaalspipet. Dekking van de platen en laat ze op kamertemperatuur (RT) zitten voor 10-15 min naar formulier lipide: DNA complexen.
Opmerking: Bij de transfectie, de definitieve componenten per putje worden als volgt: 40 ng van DNA, 0,12 µL van transfectiereagens en 0,08 µL van DNA pre-kleurverandering reagens, en de inhoud van elk goed zullen 10 µL totaalvolume (verminderd-serum medium).
- Zachtjes het medium van de 293T cellen in de 96-wells-platen met een meerkanaalspipet, verzorgen niet te verstoren de cellen uit te wisselen. Vervang het aanzuiging medium met 95 µL van DMEM aangevuld met 10% FBS.
Opmerking: Dit zou een geschikte tijd voor de behandeling van de cellen met een drug van belang. - Voeg 10 µL van het mengsel van de Transfectie aan elke passende goed via een meerkanaalspipet. Zachtjes swirl de plaat om te mengen van de inhoud in de putjes. Incubeer de plaat bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
Let op: Het eindvolume van de putten komt tot 105 µL, ter verantwoording voor verdamping meer dan 24u.
- De transfectie mengsel in een 96-wells-plaat-formaat met behulp van deep-well 96-wells-platen voor te bereiden. Voer de transfections in drievoud, controleren of het bereiden van genoeg reagentia ter verantwoording voor pipetteren en overdracht verliezen.
-
Assay (dag 2)
- Bereiden van een stamoplossing voor coelenterazine reagentia: 3 M natrium ascorbaat [ontbonden in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), vers bereid], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovien serumalbumine (BSA; opgeloste in PBS, vers bereid) en 2 mM coelenterazine (ontbonden aangezuurde methanol met 200 µL van 3 N HCl per 10 mL).
Opmerking: De coelenterazine van 2 mM kan worden opgeslagen voor 2 weken wanneer het wordt bewaard bij-80 ° C en in de afwezigheid van licht. - 2 x coelenterazine reagentia voorbereiden door de luciferase uitlezing, met een aparte reagens, elk voor de cellen en medium, volgens tabel 5. Alle reagentia opslaan de coelenterazine eerst Meng, filtreer het mengsel door een 0,22 µm spuit filter en voegt u de coelenterazine. De reagentia beschermen tegen licht, totdat ze klaar om te worden toegevoegd aan de platen.
Opmerking: Als gevolg van het verlies van de oplossing van filtratie, moet voldoende reagens ter verantwoording voor zowel het verlies van filtratie, alsmede van de overdracht. Tabel 5 geeft de uiteindelijke concentratie van de 2 x reagentia (evenals het bedrag van de stockoplossing toe te voegen om te lezen uit een 96-wells-plaat met een reagens). - Verwijder de cellen uit de incubator 24u na de transfectie. Met behulp van een meerkanaalspipet, overdracht 50 µL van geconditioneerde medium van elk putje naar een frisse, witte bodem (dekkend) 96-wells-plaat.
- Label de platen over de vraag of ze gemiddeld of cellen bevatten. Als meer dan één 96-wells-plaat was transfected, label de platen om ervoor te zorgen dat elke plaat middellange-bevattende is gekoppeld aan de plaat van de bovenliggende cellen.
- Met behulp van een meerkanaalspipet, 50 µL van 2 x non-lytische coelenterazine reagens toevoegen aan de plaat met alleen geconditioneerde medium. Zachtjes rock of schud de plaat in de afwezigheid van licht voor 5-10 min op RT.
- Met behulp van een meerkanaalspipet, 50 µL van 2 x lytische coelenterazine reagens aan de plaat met de cellen toevoegen. Zachtjes rock of schud de plaat in de afwezigheid van licht voor 5-10 min op RT.
- Na de incubatie, lees de luminescentie van de middellange-alleen plaat in een afleesapparaat. Vervolgens leest de luminescentie van de cel-bevattende plaat in de dezelfde afleesapparaat.
- Negeren van de platen en opslaan van de bestanden voor data-analyse.
- Bereiden van een stamoplossing voor coelenterazine reagentia: 3 M natrium ascorbaat [ontbonden in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), vers bereid], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovien serumalbumine (BSA; opgeloste in PBS, vers bereid) en 2 mM coelenterazine (ontbonden aangezuurde methanol met 200 µL van 3 N HCl per 10 mL).
3. de gegevensanalyse
- Een analyse van de eerste gegevens met behulp van spreadsheet-software uit te voeren. Maak een werkblad met de resultaten van de cel en de middellange platen.
- Handmatig controleren van de gegevens uit de cel platen te identificeren slecht transfected wells. Putten die Toon < 5% - 10% van de uitlezing van de plasmide negatieve controle (S386A) moet worden beschouwd als slecht transfected, de interpretatie van die gegevens verdachte.
- Bereken de gemiddelde achtergrond luminescentie van elke plaat uit de mock-transfected putten. Aftrekken van de achtergrond van elke plaat uit de waarden van die plaat.
Opmerking: Deze waarde is mogelijk te verwaarlozen is afhankelijk van de lezer van de plaat gebruikt. - Proces de gegevens door het berekenen van het aandeel van luciferase activiteit in het medium in vergelijking met de totale luciferase activiteit voor elk putje. Omdat de cel plaat beide geconditioneerde medium naast cellen bevat en de plaat alleen-medium evenveel van geconditioneerde medium als de plaat van de cel bevat, is het geschikt voor gebruik van de volgende vergelijking:
Hier, RLU = relatieve luminescentie eenheden, de achtergrond-afgetrokken uitlezing van de afleesapparaat. - Bereken de gemiddelde secreted luciferase van de positieve controle (WT) en de negatieve controle (S386A)-wells.
- Het evalueren van de algehele kwaliteit van het experiment door berekening van een Z-factor13:
Opmerking: De actieve waarden komen uit de positieve controle (WT) en de inactieve waarden zijn afkomstig uit de putten van de negatieve controle (S386A). Waarden dichter naar 1 geven aan een hogere experimentele kwaliteit. Overweeg dan herhalen van het experiment of de workflow optimaliseren als de waarde lager dan 0 is. - De gegevens van de spreadsheet-programma in de software van de analyse van de wetenschappelijke gegevens overbrengen.
- Normaliseren van de werkzaamheden van de secreted luciferase aan de gemiddelde waarden van de positieve controle (WT) en de negatieve controle (S386A), waarin de positieve controle als 1 en de negatieve controle als 0.
- Schoon de gegevens voor uitschieters methode regressie en uitbijter verwijdering (nederlaag), het instellen van het interval van de maximale valse ontdekking tot 1%.
- Evalueren voor statistisch significant verschillen door het vergelijken van de gegevens voor elke mutant voorwaarde (of mutant) aan het gemiddelde van de activiteit van de WT (genormaliseerd tot een waarde van 1). Uitvoeren van meerdere ongepaarde t-tests, corrigeren voor meerdere vergelijkingen met behulp van de Holm-Sidak methode en α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De high-throughput proteolyse bepaling berust op drie belangrijke uitdagingen te overwinnen. Eerst, om te overwinnen de intrinsiek lage output van een single-omzet PCSK9 protease, een PCSK9 protease ontbreekt de remmende prodomain wordt gebruikt, met de volgorde van de splitsing op de staart van de prodomain gekoppeld aan een luciferase die kan secreted14. Ten tweede, om te voldoen aan de behoefte aan de protease te vouwen in complexe met zijn remmende prodomain, dat de twee polypeptiden zijn coexpressed in trans in een cellulaire kader15,16, via een bicistronic-vector. Ten derde, zodat u kunt onderscheiden de gekloofd uit het uncleaved substraat, het PCSK9 protease wordt afgekapt op C678, die voorkomt dat de uitgang van de complexe PCSK9 van het endoplasmatisch reticulum (ER), maar heeft geen effect op de Proteolytische functie17,18 . Samen genomen, zorgt dit voor een evaluatie van de secreted luciferase als een proxy voor de aanwezigheid en de mate van PCSK9 proteolyse (figuur 1A). Het algemene tijdschema van de bepaling is kort, met de stappen van de plaats-geleide mutagenese van de vector assay (dagen 1 - 2) gevolgd door de voorbijgaande transfectie (dag 3) en luciferase uitlezing (dag 4) alle ingevuld zo snel als 4 dagen, met minimale "hands-on" tijd () Figuur 1B).
Over het geheel genomen, deze bepaling zorgt voor de gelijktijdige evaluatie van PCSK9 proteolyse onder uiteenlopende omstandigheden, met de uitlezing gedaan door een luciferase assay. Na de acquisitie en verwerking, kunnen de gegevens in warmte kaart- of tabelvorm worden gevisualiseerd. Vogelgriepvirus analyses van codering SNPs zijn met name geschikt zijn voor deze aanpak. Figuur 2 toont een warmte-kaart van een verzadiging mutagenese bibliotheek evaluatie van het specifieke karakter van splijten, opeenvolging van het PCSK9 protease op substraat sites P6 tot en met P6'. De resultaten tonen aan dat de optimale splitsingsproducten-volgorde in wezen hetzelfde als de WT-sequentie is (SSVFAQ | SIPWNL). Met name de mutatie van de P6 of P4 door P1' residuen wordt slecht verdragen door de protease, consistent met de ondiepe, hydrofobe bindende groef voor deze standpunten in de kristalstructuur van de volwassen, gekloofd PCSK9. Vanuit het oogpunt van de ontwikkeling van de Inhibitor van de omwenteling is dit smalle reeks specificiteit profiel een nuttig vinden, zoals het suggereert dat geen geïdealiseerde substraat mimetische de endogene splitsingsproducten-reeks kon outcompete. Figuur 3 toont de activiteit van de relatieve splitsingsproducten (vergeleken met WT) van een bibliotheek van missense SNPs beschreven in de kliniek, uitgestippeld op de primaire structuur van PCSK9. De 84 SNPs geëvalueerd, meer dan de helft sprake van een significante verandering in activiteit t.o.v. de WT protease. Deze resultaten suggereren dat wijzigingen in de PCSK9 proteolytic activiteit inderdaad heel gebruikelijk in de klinische bevolking, en dergelijke veranderingen kunnen helpen verklaren van de variabiliteit in LDL-cholesterol waarden gezien in de kliniek.
Figuur 1: Algemeen schema van de high-throughput in trans PCSK9 decollete assay. (A) dit paneel toont een biochemische schematische voorstelling van de bepaling die hier gepresenteerd. Het substraat bestaat uit de PCSK9 signaal reeks (donker grijs) en prodomain (red) gekoppeld aan de luciferase dat kan worden afgescheiden (NLuc, groen) door de PCSK9 decollete volgorde (geel). De protease bestaat uit de signaal-reeks (donker grijs), de katalytische domein (lichtgrijs) en de cysteïne-histidine rijke (CHR) domein met C679X moet worden afgekapt. Het substraat-protease-paar is coexpressed stoichiometrische bedragen in een 2A gebaseerde bicistronic vector, vatbaar voor genetische manipulatie. Op coexpression, de protease en substraat samen te vouwen en blijven afgezonderd in het endoplasmatisch reticulum (ER). Met decollete activiteit, is de luciferase bevrijd van het complex en uitgescheiden, waar het kan worden gedetecteerd door de luciferase bepaling van het geconditioneerde medium. Potentiële verstoringen tot de splitsingsproducten-activiteit omvatten, maar zijn niet beperkt tot, genetische manipulatie (perturbation A) of de aanwezigheid van kleine molecules (perturbation B). (B) dit paneel toont de tijdlijn voor de algehele assay. Plaats-geleide mutagenese op het WT-plasmide wordt uitgevoerd op dag -1 en 0, gevolgd door de transfectie op dag 1 en de bepaling van de luciferase op dag 2, voor een totale tijdlijn van 4 dagen. Dit percentage is aangepast van Chorba et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: volgorde van de specificiteit van het PCSK9 protease. (A) dit warmte kaart toont de proteolytic activiteit, genormaliseerd naar achtergrond en WT, voor elke één aminozuur mutant van een verzadiging mutagenese bibliotheek van de P6 tot en met P6' decollete volgorde. De identiteit van de reeks WT wordt weergegeven aan de onderkant, met de waarden voor de reeks van de WT zowel aan de bovenkant en gemarkeerd door witte rechthoeken. Een waarde van 0 (zwart) geeft achtergrond activiteit en een waarde van + 1 (groen) geeft de WT-waarde. (B) dit warmte kaart toont de standaarddeviatie van de waarden van de proteolyse uit dezelfde verzadiging mutagenese bibliotheek, met lagere waarden in zwart en hogere waarden rood. Waarden die worden beschreven in de witte gestippelde rechthoeken vertegenwoordigen mutanten waaruit bleek aanzienlijk verschillende proteolyse waarden van die van de WT protease, zoals bepaald door de Holm-Sidak-gecorrigeerd, ongepaarde t-tests met α < 0.05. De gegevens die worden weergegeven zijn uit 3 onafhankelijke experimenten, elk met 3 wordt gerepliceerd. Dit percentage is aangepast van Chorba et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: gevolgen van PCSK9 SNPs Proteolytische functie. (A) dit paneel toont de primaire structuur van PCSK9, met de volgorde van het signaal (SS; zwarte omtrek), de prodomain (rode omtrek), het katalytische domein (grijze omtrek) en de cysteïne-histidine rijke domein (CHR; blauwe omtrek). (B) dit paneel toont de locatie van 84 klinische SNPs (gele rechthoeken met zwarte lijnen) geplaatst in de proteolyse assay, toegewezen op de primaire structuur. (C) dit paneel toont de waarden van de 47 SNPs met aanzienlijk veranderde proteolytic activiteit t.o.v. de WT protease, zoals bepaald door de Holm-Sidak-gecorrigeerde ongepaarde t-tests met α < 0.05. De waarden worden toegewezen op de primaire structuur van PCSK9, met een waarde van -1 (rood) die aangeeft geen proteolytic activiteit en een waarde van + 1 (cyaan) die aangeeft van een 2-fold verbetering over de WT protease. Dit percentage is aangepast van Chorba et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: plaats-geleide mutagene PCR primer ontwerp. PCR de inleidingen hebben gedeeltelijk overlappen sequenties, volgens het ontwerp komt te staan. De tabel hieronder een voorbeeld van een paar succesvolle primer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Component | Voorraad | Volume (µL) | Laatste |
| Ultrazuiver H2O | 17,5 | naar 25 µL totale volume | |
| Polymerase reactie Buffer | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTPs) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Sjabloon (wild-type (WT)) | 2 ng/µL | 0,5 | 1 ng (totaal) |
| Primer (Fwd) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Primer (Rev) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| High-Fidelity Polymerase van DNA | 2 U/ΜL | 0,25 | 0,5-U (totaal) |
Tabel 2: onderdelen van een PCR voor plaats-geleide mutagenese. De onderdelen moeten worden toegevoegd in de volgorde waarin ze staan, met het mengsel gehouden op ijs totdat de reactie begint.
| Stap | Temp (° C) | Tijd | |
| Eerste denaturatie | 1 | 98 | 30 s |
| Denaturatie | 2 | 98 | 10 s |
| Gloeien | 3 | (Tm sjabloon) * + 1 | 20 s |
| Uitbreiding | 4 | 72 | 30 s/kilobase (kb) (4 min) |
| Fietsen | 5 (Ga naar stap 2, 35 cycli totaal) | ||
| Final Extension | 6 | 72 | 5 min |
| Houd | 7 | 12 | Houd |
| * - Kies de lagere Tm sjabloon van primer paar | |||
Tabel 3: voorgestelde fietsen parameters voor de PCR. De voorgestelde parameters vertegenwoordigen een goed uitgangspunt, maar wellicht optimalisatie.
| Primer | Locatie gloeien | Volgorde (5' naar 3') |
| 1 | CMV promotor | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminus van NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabel 4: gevalideerd inleidingen voor sequencing. Elke primer is met succes gebruikt in de volgorde van de codering regio van de plasmiden, waarnaar wordt verwezen in deze methode.
| Component (voorraad) | Niet-lytische (Medium) | Lytische (cellen) | Bedrag voor 96 putten (1 plaat) |
| Natrium ascorbaat (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, 1%) | 0,10% | - | 700 ΜL |
| Triton-X-100 | - | 0,10% | 7 ΜL |
| PBS | Tot 50 µL per putje | Tot 50 µL per putje | Tot 7000 µL |
| Filtreer door 0,22 µm membraan en breng 5880 µL van het filtraat in verse buis | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Total volume: 6000 µL | |||
Tabel 5: onderdelen van 2 x coelenterazine reagentia voor luciferase uitlezingen. Zowel niet-lytische als lytische reagentia zijn vereist voor elk putje dat wordt geanalyseerd, zodat de geconditioneerde medium en transfected cellen afzonderlijk te evalueren. De reagentia worden gemengd en gefilterd voordat het prestatiemeteritembestand van de coelenterazine. Na de toevoeging van coelenterazine, behoeden voor het reagens licht tot klaar voor gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De experimentele procedures die hierboven beschreven presenteer een methode om te overwinnen de intrinsiek lage activiteit van de single-omzet protease PCSK9 en zijn proteolytische functie wordt geëvalueerd in een robuuste manier. Het sleutelbegrip van de bepaling is gebaseerd op het omzetten van een single-omzet-evenement in een enzymatisch versterkte uitlezing. De sterke punten van de bepaling zijn de relatief korte tijd-frame en gebruiksgemak van de luciferase verslaggever, evenals haar schaalbaarheid voor high-throughput benaderingen. Daarnaast is de bepaling evalueert proteolyse in zijn eigen, cellulaire context. Bovendien, met deze test, klinisch geïdentificeerde SNPs kunnen worden geëvalueerd op hun effecten op PCSK9 proteolyse zonder de noodzaak voor iedere mens of patiënt weefsel; alleen kennis van het genotype van belang is noodzakelijk.
Er bestaan diverse technische beperkingen van de test. Hoewel de bepaling proteolyse binnen de cel evalueert, vereist het ook een overexpressie van de vector. Omdat de bepaling de voorbijgaande transfectie voor de cellijn van HEK293T vereist, transfectie efficiëntie wordt toegevoegd aan de intrinsieke goed-te-goed-variabiliteit. Terwijl de protease-dode S386A PCSK9 als de negatieve controle voor proteolyse dient, dient het ook als positieve controle voor de transfectie zelf, aangezien deze cellen produceren functionele, zij het intracellulair gevangen, luciferase. Evaluatie van de ruwe gegevens van de cellulaire platen helpt om te identificeren die cellen met bruto variaties in Transfectie efficiëntie, en deze gegevens kunnen worden verwijderd (en het experiment herhaald indien gewenst). Bovendien, verwerking van de gegevens voor het aandeel van secreted luciferase uit de totale luciferase geproduceerd helpt om aan te passen voor kleinere variaties in zowel plasmide levering en transcriptionele output. Dergelijke variaties zou worden verwacht dat ook van invloed op de luciferase uitgangen van de cellen en het geconditioneerde medium. Bovendien, de vectoren gebruikt voor deze test zijn vatbaar voor de vorming van afleidbare, isogene, stabiele cellijnen met de verkrijgbare Flp-In T-Rex 293-lijn, die heeft gewerkt met succes als een middel om het omzeilen van de eis van lipide-gemedieerde transfectie. Dit is waarschijnlijk een aantrekkelijke functie bij de toepassing van de bepaling voor een kleine-molecuul screening voor PCSK9 proteolyse remmers. Tot op heden zijn geen dergelijke remmers geïdentificeerd, verder onderstrepen het belang van deze bepaling.
De techniek van het PCSK9 protease maakt ook verschillende biologische beperkingen. De test meet eerst intermoleculaire PCSK9 proteolyse, in plaats van de intramoleculaire proteolyse dat optreedt met WT PCSK9. Terwijl deze twee activiteiten over het algemeen correleren, is het onwaarschijnlijk dat een dergelijke correlatie in alle biologische situaties bestaat en, dus, in sommige situaties kan de verificatie van deze effecten in een splijting in cis PCSK9 assay, waarschijnlijk door een alternatieve methode zoals immunoblot, kan nodig zijn. Bovendien kan de bepaling alleen evalueren missense SNPs (en niet het effect van niet-coderende variaties). Tot slot, hoewel PCSK9 proteolyse de snelheidslimieten stap van de secretie van de PCSK9 is, en de vermindering van de PCSK9 proteolyse verwachting een verlies-van-functie PCSK9 variant (betreffende de klinische cholesterol fenotype) veroorzaken, dit geldt niet voor alle SNPs, die aangeeft dat althans voor sommige mutaties, extra biologie op spelen8 is.
Het nut van deze bepaling ligt in zijn vermogen om de Proteolytische functie van een intrinsiek laag-output protease wordt geëvalueerd. Deze ontwerpen moeten vertalen naar proteasen dan PCSK9 die lijden aan vergelijkbare uitdagingen. Voor het uitvoeren van deze wijziging, is het noodzakelijk de koppeling tussen decollete en luciferase afscheiding te handhaven. Een strategie waarbij het substraat is vervangen met een type I membraan anker gekoppeld aan de luciferase via een decolleté reeks specifiek voor de protease van belang moet voldoen aan deze eis.
Kortom beschrijft dit protocol een methode voor het uitrekenen van PCSK9 proteolyse in een high-throughput mode. Deze methode zal zitten nuttig zowel voor de evaluatie van het effect van klinische SNPs op PCSK9 proteolyse, alsmede voor de screening van kleine-molecuul remmers van PCSK9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de gulle financiële steun van de NHLBI/NIH (K08 HL124068 en LRP HMOT1243), NCATS/NIH via de UCSF klinisch en translationeel Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), de UCSF academische Senaat, de Hellman Foundation, een Gilead Sciences Research Scholar Award, een Pfizer ASPIRE cardiovasculaire Award (alles aan John S. Chorba) en het Howard Hughes Medical Institute (aan Adri M. Galvan en Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
