Summary
Denne protokollen gir en metode for å vurdere proteolytiske av en egentlig lav aktivitet, enkelt omsetning protease i mobilnettet sammenheng. Denne metoden brukes spesielt for å evaluere proteolytiske av PCSK9, en nøkkelkomponent lipid stoffskifte som proteolytiske kreves for sin ultimate hypercholesterolemic funksjon.
Abstract
Proprotein konvertasene subtilisin/kexin 9 (PCSK9) er en enkelt-omsetning protease som regulerer serum low-density lipoprotein (LDL) nivåer og følgelig hjerte-og karsykdommer. Selv om PCSK9 proteolyse nødvendig for sin full hypercholesterolemic effekt, evalueringen av proteolytisk funksjonen er utfordrende: PCSK9 er bare kjent deler seg, gjennomgår bare en enkelt omsetning og etter proteolyse, beholder sin underlaget i det aktive området som en auto-hemmer. Metodene presenteres her beskriver en analyse som overvinner disse utfordringene. Analysen fokuserer på intermolekylære proteolyse i celle-baserte kontekst og lenker vellykket cleavage til utskilles luciferase aktiviteten, som kan være lett å lese i betinget medium. Via sekvensielle trinn mutagenese, forbigående transfection og en luciferase avlesning, analysen kan undersøke PCSK9 proteolyse under forhold med enten er genetisk eller molekylær forstyrrelsene på en høy gjennomstrømming måte. Dette systemet er godt egnet for både biokjemiske vurdering av klinisk oppdaget eks. missense enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPer), så vel som for screening av små-molekylet hemmere av PCSK9 proteolyse.
Introduction
PCSK9 mål LDL reseptoren (LDL-R) til fornedrelse, heve LDL kolesterol (LDL-C) og kjører aterosklerotisk hjerte sykdom1,2. Therapeutics målretting PCSK9 robustly senke LDL-C og forbedre hjerte resultater for pasienter, selv når lagt til en aggressiv lipidsenkende terapi med statiner3,4. Allerede er godkjent terapier imidlertid begrenset til antistoff-baserte tilnærminger, og lider av mangel på kostnadseffektivitet5,6. For å løse dette problemet, kreves det mindre kostnadskrevende terapeutiske alternativer, en måte å identifisere pasienter vil få større fordeler, eller begge.
Små molekyl tilnærminger kan målrette intracellulær PCSK9, gi en bedre rute med administrasjonen og redusere kostnadene, gjør dem "Hellige Grail" i denne område7. PCSK9 har imidlertid vist seg vanskelig stoffet av små molekyler. Som en protease er målretting PCSK9's proteolytisk funksjonen en attraktiv strategi, som selv-proteolyse er hastighetsbegrensningen skritt PCSK9 modning8 og er nødvendig for sin maksimal effekt på LDL-R9. Hittil har imidlertid denne strategien har ikke vært vellykket, sannsynligvis på grunn av PCSK9's unike biokjemi: PCSK9 innstiftet bare seg10, utføre en enkelt Omsettning reaksjon, og etter selv-cleavage, PCSK9 prodomain forblir bundet på det aktive området som en Auto-hemmer11, forebygge avlesning av ytterligere protease aktiviteter.
Denne artikkelen presenterer en metode for å vurdere PCSK9 proteolytisk funksjon i høy gjennomstrømming mote8. Gjennom nettstedet-rettet mutagenese, kan etterforskere bruke denne analysen for å undersøke virkningene av koding SNPs i klinikken for å vurdere dem for effekter på proteolyse, det hastighetsbegrensning trinnet i PCSK9 modning. I tillegg, vil denne metoden være nyttig i utformingen av høy gjennomstrømming skjermer å identifisere modulatorer av PCSK9 proteolyse, som er forventet å til slutt forstyrre presentasjon av PCSK9 til LDL-R (og modulere PCSK9's hypercholesterolemic effekt) . Til slutt kan denne protokollen tilpasses andre proteaser med egentlig lav aktivitet, forutsatt at i) en bestemt substrat-protease par finner og ii) et egnet intracellulær anker kan opprettes av underlaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stedet rettet mutagenese av Protease vektor
- Design og bestille custom-syntetisk oligonucleotides installere en mutasjon av interesse ved hjelp av en endring av standard område-rettet mutagenese protokoller12. Standard avsalte primere (uten ekstra rensing) er helt akseptabelt.
Merk: En generell tilnærming til primer design må du opprette delvis overlappende primere som vist i tabell 1, bruke en smeltende temperatur (Tm) Kalkulator gjelder for utvalg av interesse. - Definere utvalg kjedereaksjoner (PCRene) for området-rettet mutagenese på is, som vist i tabell 2.
- Syklusen PCRene som vist i tabell 3.
- Kjør 2-5 µL av hver PCR på en 1% agarose gel og visualisere produktene å bekrefte en vellykket forsterkning.
Merk: En vellykket PCR viser et enkelt, fremtredende DNA band på tilnærmet størrelse markør for malen (~7.8 kB). - Legg til 0,5 µL (per 25-µL reaksjon) av DpnI og ruge prøvene ved 37 ° C i 1 time.
- Transformere 2 µL av reaksjonen til kjemisk kompetent Escherichia coli.
Merk: En raskt voksende E. coli belastning vil redusere inkubasjon ganger, men kloning belastning vil være akseptabelt. - Plate transformasjonene på Luria-Bertani (LB) agar inneholder 50-100 µg/mL carbenicillin. Inkuber platene overnatting på 37 ° C.
- Velg 2-4 kolonier å vokse i en småskala kultur (2-5 mL av LB medium med 50-100 µg/mL carbenicillin). Inkuber kulturen på 37 ° C på 220 rpm før det er grumset.
- Isolere plasmider DNA fra cellene med en plasmider DNA rensing (dvs., "miniprep") kit i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifisere konsentrasjonen av elut DNA ved hjelp av et microvolume spektrofotometer.
- Sekvens plasmider DNA mye bruker en Sanger sekvensering (som en kjerne eller kommersielle anlegg). Forberede DNA-prøver etter tjenestens spesifikasjoner. Primere brukt med suksess i tidligere sekvensering reaksjoner er oppført i Tabell 4.
Merk: På grunn av PCR forsterkning av det hele plasmider, sekvensering av hele PCSK9 koding regionen er anbefalt for hver mutant.
2. høy gjennomstrømming Luciferase-baserte proteolyse analysen
-
Cellen plating (dag 0)
- Bruk lav-passasjen HEK293T celler for eksperimenter og en kultur i Dulbeccos endret Eagle medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS). Utføre alle celle arbeidet under sterile forhold i vev kultur hette helt klar til å analysen luciferase aktivitet. Anslå antall brønner og plater nødvendig for eksperimentet, forventer at transfections vil bli utført i tre eksemplarer for hvert vilkår testet.
- Oppheve tilknytningen HEK293T celler fra en overordnet kolbe ved å behandle dem med en minimal mengde 0,05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) å dekke cellene. Deaktiver trypsin-EDTA med 2 mengder DMEM med 10% FBS og overføre cellene slik sterilt. Telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller (og flekker med trypan blå). Sentrifuge røret på 500 x g i 5 min gjenopprette celler.
- Sug opp trypsin inneholder middels og gjeninnføre cellene i kultur mellomlang til en konsentrasjon av 2 x 105 celler/mL. Bruke en flerkanals pipette, overføre 100 µL av cellene i hver brønn av en hvit (ugjennomsiktig bunn) 96-brønns plate, som gir en siste seeding konsentrasjon av 2 x 104 celler/godt.
Merk: For initial eksperimenter, kan det være nyttig å i tillegg frø en søster, klart 96-brønnen-bunnplaten, for å overvåke cellevekst og etterlevelse under protokollen og guide fremtidige feilsøking. - Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO2 24 h.
- Forberede en master tallerken med plasmider i 96-brønnen format. Fortynn hver plasmider i elueringsrørets buffer (Tris-HCl, pH 8.5) 50 ng/µL i en individuell godt av en 96-brønns plate.
- Forberede 4 brønner for positiv kontroll (WT) plasmider8, negativ kontroll (S386A) plasmider8og plasmider-fri buffer (for narr transfections). Hvis narkotika eller andre mobil-basert behandling planlegges, og forberede master platen med positiv kontroll (WT) plasmider i hver brønn, med 4 brønner hver av negative kontroll (S386A) plasmider og plasmider-fri bufferen.
-
Hva (dag 1)
- Forberede transfection blandingen i 96-brønnen plate format med dyptgående brønn 96-brønns plater. Utføre transfections i tre eksemplarer, husk å forberede nok reagenser til kontoen pipettering og overføring.
Merk: Følgende beregninger forberede nok reagenser til å kjøre en 96-brønns plate i tre eksemplarer (estimert konservativt 420 brønner).- Gjøre en master blanding av en utvannet lipid transfection reagens, legger 50.4 µL til reagensen til 2050 µL av redusert serum medium. Gjøre en master blanding av en DNA precomplexation reagens, tilføyer 33,6 µL til reagensen i 1730 µL av redusert serum medium.
- Bruker en flerkanals pipette, aliquot 16,8 µL av utvannet DNA precomplexation reagens blandingen i hver brønn av dyptgående brønn plate.
- Bruke en flerkanals pipette, aliquot 3.2 µL (160 ng) av hver plasmider fra master platen i hver brønn av dyptgående brønn plate.
- Bruker en flerkanals pipette, aliquot 20 µL av utvannet lipid transfection reagens blandingen til hver godt av platen og bland innholdet i hver brønn ved å flerkanals pipette. Dekke platene og la dem sitte ved romtemperatur (RT) i 10-15 min til skjemaet lipid: DNA komplekser.
Merk: På transfection, siste komponentene per brønn vil være som følger: 40 ng DNA, 0,12 µL av transfection reagensen og 0,08 µL av DNA pre-complexation reagensen og innholdet på hver godt vil være 10 µL i totalt volum (redusert serum medium).
- Forsiktig bytte medium på 293T cellene i 96-brønnen platene med en flerkanals pipette, ta vare ikke for å forstyrre cellene. Erstatte aspirerede mediet med 95 µL av DMEM med 10% FBS.
Merk: Dette ville være en passende tid å behandle cellene med ethvert stoff av interesse. - Legge til 10 µL av transfection blandingen i hver riktig godt via en flerkanals pipette. Forsiktig snurr på å blande innholdet i brønnene. Inkuber platen på 37 ° C med 5% CO2 for 24 timer.
Merk: Det siste bindet av brønnene kommer til 105 µL, å ta hensyn fordamping over 24 timer.
- Forberede transfection blandingen i 96-brønnen plate format med dyptgående brønn 96-brønns plater. Utføre transfections i tre eksemplarer, husk å forberede nok reagenser til kontoen pipettering og overføring.
-
Analysen (dag 2)
- Forberede en lagerløsning coelenterazine reagenser: 3 M natrium ascorbate [oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS), tilberedt ferske], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovin serum albumin (BSA, oppløst i PBS, tilberedt ferske) og 2 mM coelenterazine (oppløst i sur metanol inneholder 200 µL av 3 N HCl per 10 mL).
Merk: 2 mM coelenterazine kan lagres i 2 uker når det holdes på-80 ° C og i fravær av lys. - Forberede 2 x coelenterazine reagenser luciferase avlesning, med en egen reagens hver for celler og medium, ifølge tabell 5. Først blande reagenser lagre i coelenterazine, filtrere blandingen gjennom et 0.22-µm sprøyte filter, og deretter legge til coelenterazine. Beskytte reagensene fra lys til de er klare til å legges til platene.
Merk: På grunn av løsning fra filtrering, gjør nok reagenser til kontoen for begge tap fra filtrering, og overføringer. Tabell 5 viser siste konsentrasjonen av 2 x reagenser (samt mengden lagerløsning til å lese ut en 96-brønns plate med en reagens). - Fjerne celler fra inkubator 24 timer etter transfection. Bruker en flerkanals pipette, overføre 50 µL av betinget medium fra hver brønn til en frisk, hvit bunn (ugjennomsiktig) 96-brønns plate.
- Etiketten plater som om de inneholder middels eller celler. Hvis mer enn en 96-brønns plate var transfekterte, merke platene for å sikre at hver middels inneholder plate er sammenkoblet med sin overordnede plate av celler.
- Bruker en flerkanals pipette, legge til 50 µL av 2 x ikke-lytisk coelenterazine reagens til platen inneholder bare betinget medium. Forsiktig rock eller riste platen i fravær av lys for 5-10 minutter til RT.
- Bruker en flerkanals pipette, legge til 50 µL av 2 x lytisk coelenterazine reagensen til platen inneholder cellene. Forsiktig rock eller riste platen i fravær av lys for 5-10 minutter til RT.
- Etter inkubasjon, lese ut luminescence av medium-bare plate i en plate-leser. Deretter lese ut luminescence av cellen inneholder plate i samme plate leseren.
- Utelate platene og lagre filene for dataanalyse.
- Forberede en lagerløsning coelenterazine reagenser: 3 M natrium ascorbate [oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS), tilberedt ferske], 5 M NaCl, 10 mg/mL bovin serum albumin (BSA, oppløst i PBS, tilberedt ferske) og 2 mM coelenterazine (oppløst i sur metanol inneholder 200 µL av 3 N HCl per 10 mL).
3. dataanalyse
- Utfør en innledende dataanalyse ved hjelp av regneark. Lage et regneark som inneholder resultatene fra cellen og middels platene.
- Manuelt kontrollere dataene fra cellen platene å identifisere dårlig transfekterte brønner. Brønner som viser < 5% - 10% av avlesning av negativ kontroll (S386A) plasmider anses som dårlig transfekterte, gjør tolkningen av disse dataene mistenkte.
- Beregne gjennomsnittlig bakgrunn luminescence av hver plate fra de uekte-transfekterte brønnene. Trekke på bakgrunn av hver plate fra verdiene i den platen.
Merk: Denne verdien kan være ubetydelig avhengig av platen leseren brukes. - Prosessen data ved å beregne andelen luciferase aktivitet i medium sammenlignet med den totale luciferase aktiviteten for hver brønn. Fordi cellen platen inneholder både betinget middels i tillegg til celler og medium-bare platen inneholder samme mengde betinget medium som cellen platen, er det hensiktsmessig å bruke følgende ligning:
Her, RLU = relativ luminescence enheter, er bakgrunnen-trukket avlesning fra platen leseren. - Beregne den mener secreted luciferase av positiv kontrollen (WT) og negativ kontroll (S386A) brønnene.
- Vurdere kvaliteten eksperimentet ved å beregne en Z-faktor13:
Merk: Aktiv verdiene kommer fra positiv kontrollen (WT) og inaktive verdiene kommer fra brønnene negativ kontroll (S386A). Verdiene nærmere 1 indikerer en høyere eksperimentelle kvalitet. Vurdere gjenta eksperimentet eller optimalisere arbeidsflyten Hvis verdien er under 0. - Overføre dataene fra regnearkprogrammet til vitenskapelige dataanalyse programvare.
- Normalisere utskilles luciferase aktiviteten mener verdiene av positive kontrollen (WT) og negative kontroll (S386A), sette kontrollen positiv 1 og kontrollen negative som 0.
- Rengjør dataene for outliers med metoden regresjon og avvikende fjerning (FLUKT) sette maksimal falske funnrate 1%.
- Vurdere for statistisk signifikante forskjeller ved å sammenligne data for hver mutant tilstand (eller mutant) middelverdien av WT aktivitet (normaliserte verdien 1). Utføre flere unpaired t-tester, korrigere for flere sammenligninger med Holm-Sidak metoden og α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Høy gjennomstrømming proteolyse analysen avhengig overvinne tre store utfordringer. Først, for å overvinne den egentlig lave produksjonen av en enkelt-omsetning PCSK9 protease, en PCSK9 protease mangler den hemmende prodomain brukes med cleavage sekvensen ved halen på den prodomain knyttet til en luciferase som kan utskilles14. Andre for å tilfredsstille behovet for protease å kaste med sin hemmende prodomain, de to polypeptides er coexpressed i trans i en mobilnettet sammenheng15,16, via en bicistronic vektor. Tredje, for å skille den cleaved fra uncleaved underlaget, PCSK9 protease er avkortet på C678, som hindrer utgangen av PCSK9 kompleks fra det endoplasmatiske retikulum (ER), men har ingen innvirkning på de proteolytiske funksjonen17,18 . Samlet gir dette en evaluering av den secreted luciferase som en proxy for nærværelsen og graden av PCSK9 proteolyse (figur 1A). De generelle tidsrammen til analysen er kort, med trinnene i området-rettet mutagenese av analysen vektoren (dager 1 - 2) etterfulgt av forbigående transfection (dag 3) og luciferase avlesning (dag 4) alle ferdig i så raskt som 4 dager, med minimal "hands-on" tid ( Figur 1B).
Samlet gir denne analysen samtidig evaluering av PCSK9 proteolyse under en rekke forhold, med avlesning gjort av en luciferase analysen. Etter oppkjøp og behandling, kan data visualiseres i varmekartet eller tabellformat. Mutational analyser av koding SNPs er spesielt godt egnet til denne tilnærmingen. Figur 2 viser et varmekartet av en metning mutagenese bibliotek evaluere cleavage sekvens spesifisiteten av PCSK9 protease på underlaget nettsteder P6 gjennom P6'. Resultatene viser at den optimale cleavage sekvensen er egentlig det samme som WT sekvensen (SSVFAQ | SIPWNL). I særdeleshet, mutasjon av P6 eller P4 gjennom P1' rester er dårlig tolerert av protease, samsvar med grunne, hydrofobe bindende sporet for disse stillingene i crystal strukturen i den eldre, kløyvde PCSK9. Fra standpunkt hemmer utvikling er denne smale sekvens spesifisitet profilen en nyttig funn, som det antyder at ingen idealiserte substrat mimetic kunne utkonkurrere endogene cleavage sekvensen. Figur 3 viser relativ cleavage aktiviteten (sammenlignet WT) til et bibliotek av eks. missense SNPs beskrevet i klinikken, kartlagt på PCSK9 primære strukturen. Av 84 SNPs vurdert, over halvparten viste en betydelig endring i aktivitet i forhold til WT protease. Disse resultatene tyder på at endringer i PCSK9 proteolytisk aktivitet er faktisk ganske vanlig i kliniske befolkningen, og slike endringer kan hjelpe for å forklare variasjon i LDL kolesterol nivåer sett i klinikken.
Figur 1: Total skjematisk av høy gjennomstrømming i trans PCSK9 cleavage analysen. (A) dette panelet viser en biokjemiske skjematisk av analysen presenteres her. Underlaget består av en PCSK9 signal sekvens (mørk grå) og den prodomain (red) knyttet til luciferase som kan utskilles (NLuc, grønn) av PCSK9 cleavage sekvensen (gul). Protease består av signal sekvensen (mørk grå), katalytisk domenet (lys grå) og cystein-histidin rike (CHR) domenet som inneholder C679X trunkering. Substrat-protease paret er coexpressed på stoichiometric beløp i en 2A-baserte bicistronic vektor, mottakelig for genetisk manipulasjon. På coexpression, protease og underlaget co brett og sequestered i det endoplasmatiske retikulum (ER) er fortsatt. Med cleavage aktivitet, er luciferase frigjort fra komplekset og utskilles, der den kan gjenkjennes av luciferase analysen av betinget medium. Potensielle forstyrrelser i spalting aktiviteten inkluderer, men er ikke begrenset til, genetisk manipulasjon (forstyrrelsene A) eller tilstedeværelsen av små molekyler (forstyrrelsene B). (B) dette panelet viser tidslinjen for generelle analysen. Nettstedet-rettet mutagenese på WT plasmider utføres på dager -1 og 0, etterfulgt av transfection på dag 1 og luciferase analysen på dag 2, for en total tidslinje over 4 dager. Dette tallet er tilpasset fra Chorba et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sekvens spesifisitet av PCSK9 protease. (A) dette varmekartet viser proteolytiske, normalisert bakgrunn og WT, for hver enkelt aminosyre mutant av en metning mutagenese bibliotek av P6 gjennom P6' cleavage sekvens. WT sekvens identiteten vises nederst, med verdiene for WT sekvensen vises både på toppen og markert med hvite rektangler. Verdien 0 (svart) angir bakgrunn aktivitet, og en verdi på 1 (grønn) angir WT verdien. (B) denne varmen kartet viser standardavviket for proteolyse verdiene fra samme metning mutagenese bibliotek med lavere verdier i svart og høyere verdier i rødt. Verdiene i hvit tankestrekene rektanglet representerer mutanter som viste signifikant forskjellig proteolyse verdier fra av WT protease, som bestemmes av Holm-Sidak-korrigert, hender t-tester med α < 0,05. Dataene er fra 3 uavhengige eksperimenter, hver med 3 gjentak. Dette tallet er tilpasset fra Chorba et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: effekter av PCSK9 SNPs proteolytisk funksjonen. (A) dette panelet viser den primære strukturen til PCSK9, som inneholder signal sekvensen (SS, svart omriss), prodomain (rød kontur), katalytisk domenet (grå omriss) og cystein-histidin rik domene (CHR, blå omriss). (B) dette panelet viser plasseringen av 84 klinisk SNPs (gul rektangler med svart omriss) i proteolyse analysen, avbildet på den primære strukturen. (C) dette panelet viser verdiene for 47 SNPs med betydelig endret proteolytisk aktivitet i forhold til WT protease, som bestemmes av Holm-Sidak-korrigert kortet t-tester med α < 0,05. Verdiene tilordnes til PCSK9 primære strukturen, med en verdi på -1 (rød) som angir ingen proteolytisk aktivitet og en verdi på 1 (cyan) som indikerer en 2-fold forbedring over WT protease. Dette tallet er tilpasset fra Chorba et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: nettsted rettet mutagene PCR primer design. PCR primere har delvis overlapper sekvenser, design vises. Et eksempel på en vellykket primer par nedenfor tabellen. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Komponent | Lager | Volum (µL) | Siste |
| Ultrapure H2O | 17,5 | 25 µL totalt volum | |
| Polymerase reaksjon Buffer | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTPs) | JEKTET 200 ΜM BAKOVER | 0,5 | 4 ΜM |
| Mal (vill-type (WT)) | 2 ng/µL | 0,5 | 1 ng (totalt) |
| Primer (Fwd) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Primer (Rev) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Hi-Fi-DNA Polymerase | 2 U/ΜL | 0,25 | 0,5 U (totalt) |
Tabell 2: komponenter i et PCR for området-rettet mutagenese. Komponentene skal legges i rekkefølge som de står oppført, med blandingen holdt på is til reaksjonen begynner.
| Trinn | Temp (° C) | Tid | |
| Første rødsprit | 1 | 98 | 30 s |
| Rødsprit | 2 | 98 | 10 s |
| Avspenning | 3 | (Tm mal) * + 1 | 20 s |
| Utvidelse | 4 | 72 | 30 s/kilobase (kb) (4 minutter) |
| Sykling | 5 (gå til trinn 2, 35 sykluser totalt) | ||
| Endelig utvidelse | 6 | 72 | 5 min |
| Hold | 7 | 12 | Hold |
| * - Velg lavere Tm mal primer par | |||
Tabell 3: foreslåtte sykling parametere for PCR. Foreslåtte parameterne representerer et godt utgangspunkt, men kan kreve optimalisering.
| Primer | Avspenning plassering | Sekvens (5' til 3) |
| 1 | CMV arrangøren | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminus av NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tabell 4: godkjent primere for sekvensering. Hver primer har vært brukt med hell i sekvensering koding regionen plasmider i denne metoden.
| Komponent (aksjer) | Ikke-lytisk (middels) | Lytisk (celler) | Beløpet 96 brønner (1 plate) |
| Natrium ascorbate (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, 1%) | 0,10% | - | 700 ΜL |
| Triton X-100 | - | 0,10% | 7 ΜL |
| PBS | 50 µL/brønn | 50 µL/brønn | Til 7000 µL |
| Filtrere gjennom 0.22 µm membran og overføre 5880 µL av filtratet i frisk rør | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Totalt volum: 6000 µL | |||
Tabell 5: komponenter i 2 x coelenterazine reagensene luciferase readouts. Både ikke-lytisk og lytisk reagenser kreves for hver brønn som er analysert, å vurdere separat betinget mediet og transfekterte celler. Reagenser er blandet og filtrert før tillegg av coelenterazine. Etter at coelenterazine, beskytte reagensen fra lys til du er klar for bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentell fremgangsmåtene ovenfor presentere en metode for å overvinne den egentlig lav aktiviteten av enkelt-omsetning protease PCSK9 og evaluere proteolytisk funksjonen på en robust måte. Nøkkelen begrepet analysen avhengig konvertere en enkelt Omsettning hendelse i en enzymatisk forsterket avlesning. Styrkene til analysen er relativt kort tidsramme og brukervennlighet av luciferase reporter, samt dens skalerbarhet til høy gjennomstrømming tilnærminger. I tillegg evaluerer analysen proteolyse i sin innfødt mobilnettet kontekst. Videre med denne analysen, kan klinisk identifiserte SNPs vurderes for deres virkninger på PCSK9 proteolyse uten behov for noen mennesker eller pasienten vev; bare kunnskap av genotype rundt er nødvendig.
Det finnes flere tekniske begrensninger til analysen. Selv om analysen evaluerer proteolyse i cellen, krever det også en overuttrykte vektoren. Fordi analysen krever det forbigående transfection av HEK293T celle linje, legger transfection effektivitet iboende godt-å-godt variasjon. Mens protease døde S386A PCSK9 fungerer som kontrollen negative for proteolyse, fungerer også som kontrollen positiv for hva, siden disse cellene produsere funksjonelle, men intracellulært fanget, luciferase. Evaluere rådata om mobilnettet platene bidrar til å identifisere disse cellene med brutto variasjoner i transfection effektivitet, og disse dataene kan kastes (og forsøket gjentas hvis ønskelig). Videre produsert behandling av dataene for andelen utskilles luciferase av den totale luciferase bidrar til å justere for mindre variasjoner i både plasmider levering og transcriptional produksjon. Slike variasjoner forventes å påvirke luciferase resultatene av cellene og betinget medium tilsvarende. I tillegg vektorer brukt for denne analysen er mottakelig for dannelsen av induserbart, isogenic stabile cellelinjer med kommersielt tilgjengelig Flp-In T-Rex 293 linje, som har vært ansatt med suksess å omgå behovet for lipid-formidlet Hva. Dette er trolig en attraktiv funksjonen når bruke analysen til en liten-molekylet screening for PCSK9 proteolyse hemmere. Hittil har identifisert ingen slike hemmere, ytterligere understreker betydningen av denne analysen.
Prosjektering av PCSK9 protease oppretter også flere biologiske begrensninger. Først analysen måler intermolekylære PCSK9 proteolyse, i stedet for den intramolekylære proteolyse som oppstår med WT PCSK9. Mens disse to aktivitetene relatere generelt, er det usannsynlig at slik sammenheng finnes i alle biologiske situasjoner, og dermed i noen situasjoner kontroll av disse effektene i en i cis PCSK9 cleavage analysen, trolig av en alternativ metode som immunoblot, kan behøves. I tillegg kan analysen bare evaluere eks. missense SNPs (og ikke effekten av ikke-koding). Til slutt, om PCSK9 proteolyse er hastighetsbegrensningen skritt av PCSK9 sekresjon, og reduksjon av PCSK9 proteolyse er forventet å medføre en tap av funksjon PCSK9 variant (om kliniske kolesterol fenotypen), dette er ikke sant for alle SNPs, indikerer minst for noen mutasjoner, ekstra biologi som spille8.
Nytten av denne analysen ligger i dens evne til å vurdere en egentlig lav-output protease proteolytisk funksjon. Disse design konsepter skal oversette til proteaser enn PCSK9 som lider av liknende utfordringer. Hvis du vil utføre denne endringen, er det nødvendig å beholde koblingen mellom cleavage og luciferase sekret. En strategi der underlaget er erstattet med en type jeg membran anker knyttet til luciferase via en cleavage sekvens gjelder protease rundt bør oppfylle dette kravet.
I sammendraget beskriver denne protokollen en metode for å vurdere PCSK9 proteolyse på en høy gjennomstrømming måte. Denne metoden vil være nyttig både for å vurdere effekten av klinisk SNPs på PCSK9 proteolyse, samt for screening av små-molekylet hemmere av PCSK9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker sjenerøs finansiering støtte fra NHLBI/NIH (K08 HL124068 og LRP HMOT1243), NCATS/NIH gjennom UCSF kliniske og translasjonsforskning Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), UCSF akademiske Senatet, Hellman Foundation, en Gilead Sciences Research Scholar Award, en Pfizer ASPIRE hjerte Award (alle John S. Chorba) og Howard Hughes Medical Institute (til Adri M. Galvan og Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
