Summary
Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.
Abstract
Proprotein konvertaz subtilisin/kexin 9 (PCSK9) türüdür serum düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) düzeyleri düzenleyen bir tek-ciro proteaz ve sonuç olarak, kalp-damar hastalıkları. PCSK9 proteolizis tam hypercholesterolemic etkisi için gerekli olmasına rağmen proteolitik işlevini değerlendirilmesi zordur: PCSK9 sadece kendisini ayırmak için bilinen, sadece tek bir ciro uğrar ve proteolizis sonra substrat korur onun aktif bir otomatik inhibitörü olarak. Burada sunulan yöntemleri bu zorlukların üstesinden gelir bir tahlil açıklanmaktadır. Cins proteolizis bir hücre tabanlı içerik ve bağlantılar başarılı bölünme klimalı ortamda kolayca okunabilir salgılanan luciferase etkinlik için tahlil odaklanır. Via sıralı adımları mutagenesis, geçici transfection ve bir luciferase okuma tahlil PCSK9 proteolizis ya da moleküler genetik pertürbasyon koşullar altında bir yüksek-den geçerek şekilde sonda. Bu sistem klinik olarak keşfedilen missense tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs), de PCSK9 proteolizis küçük molekül inhibitörleri ile taranması gelince biyokimyasal değerlendirme için son derece uygundur.
Introduction
PCSK9 hedefi LDL reseptör (LDL-R) bozulması için LDL kolesterol (LDL-C) yükselterek ve aterosklerotik kalp hastalığı1,2sürüş. Tedavi hedefleme PCSK9 sağlam LDL-C daha düşük ve kardiyovasküler sonuçlar hastalar için bile bir saldırgan lipid düşürücü tedavi statinler3,4ile eklendiğinde geliştirmek. Şu anda onaylanmış tedaviler antikor tabanlı yaklaşımlar, sınırlı ancak ve maliyet-etkililik5,6bir eksikliği muzdarip. Bu sorunu çözmek için daha az maliyetli tedavi alternatifleri, hastalar daha büyük yararlar elde etmek büyük olasılıkla tanımlamak için bir yol ya da her ikisi, gereklidir.
Küçük molekül yaklaşımlar hücre içi PCSK9 hedef, geliştirilmiş bir rota yönetim sağlamak ve onları yapma "Kutsal kase" içinde bu alan7maliyetleri azaltmak. Ancak, PCSK9 küçük moleküller tarafından uyuşturucu için zor kanıtlamıştır. Öz-proteolizis PCSK9 olgunlaşma8 hızı sınırlaması adım ve LDL-R9üzerindeki maksimal etkisi için gerekli gibi bir proteaz PCSK9'ın proteolitik işlevi hedefleme çekici bir strateji vardır. Bugüne kadar ancak, bu strateji büyük olasılıkla PCSK9'ın benzersiz Biyokimya nedeniyle başarılı olmamıştır: PCSK9 cleaves yalnızca kendisini10, bir tek-ciro tepki gerçekleştirme ve öz-bölünme sonra prodomain PCSK9 aktif bölgesinde bağlı kalır bir herhangi bir daha fazla proteaz aktivitesinin okuma engelleyen otomatik inhibitörü11.
Bu makale PCSK9 proteolitik işlevi yüksek üretilen iş moda8değerlendirmek için bir yöntem sunar. Site yönettiği mutagenesis Müfettişler bu tahlil onları proteolizis, PCSK9 olgunlaşma hızı sınırlaması adım üzerindeki etkileri için değerlendirmek için klinikte buldum SNPs kodlama etkilerini araştırmak için kullanabilirsiniz. Ayrıca, bu yöntem hangi sonuçta LDL-r PCSK9 sunumunu bozabilir (ve PCSK9'ın hypercholesterolemic etkisi modüle için) beklenen PCSK9 proteolizis, modülatörler tanımlamak için yüksek üretilen iş ekranlar tasarımında yararlı olacaktır . Son olarak, i) bir belirli substrat-proteaz çift bulunabilir ve uygun II) bir hücre içi bağlantı için belgili tanımlık substrate kurulabilir koşuluyla bu iletişim kuralı ile özünde düşük etkinlik, diğer proteaz için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. site yönettiği Mutagenesis proteaz vektör
- Bir mutasyon ilgi standart site yönettiği mutagenesis protokolleri12bir değişiklik kullanarak yüklemek için tasarım ve düzen özel sentez oligonucleotides. (Olmadan ek arıtma) standart desalted astar tamamen kabul edilebilir.
Not: Astar tasarımlar için genel bir yaklaşım faiz polimeraz için belirli bir erime sıcaklık (Tm) hesaplama kullanarak Tablo 1, gösterildiği gibi kısmen üst üste astar oluşturma içerir. - Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) kadar site yönettiği mutagenesis için buza, Tablo 2' de gösterildiği gibi ayarlayın.
- PCR Tablo 3' te gösterildiği gibi döngüsü.
- Her PCR 2-5 µL % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak ve başarılı bir amplifikasyon onaylamak için ürünler görselleştirin.
Not: Başarılı bir PCR şablonu (~7.8 kB) yaklaşık boyutu işareti bir tek, önde gelen DNA bant gösterecektir. - DpnI (başına 25-µL reaksiyon) 0.5 µL ekleyin ve 1 h için 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
- Reaksiyon kimyasal olarak yetkili Escherichia coliiçine 2 µL dönüşümü.
Not: Bir hızlı büyüyen e.coli suşu kuluçka süreleri azaltmak ama klonlama herhangi bir zorlanma kabul edilebilir olacaktır. - 50-100 µg/mL carbenicillin içeren Luria-Bertani (LB) agar üzerine dönüşümleri plaka. Plakayı gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- 2-4 kolonileri küçük ölçekli Kültür (2-5 mL LB orta ile 50-100 µg/mL carbenicillin) büyümeye seçin. Bulanık kadar 220 rpm'de 37 ° C'de kültür kuluçkaya.
- Plazmid üretici yönergelerine göre bir plazmid DNA arıtma (yani, "miniprep") kit kullanarak hücrelerden DNA izole et. Eluted DNA microvolume spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçmek.
- Plazmid DNA kapsamlı bir Sanger sıralama Servisi (çekirdek veya gibi ticari tesis) kullanarak sıra. DNA örnekleri hizmetin belirtimlerine göre hazırlayın. Önceki sıralama tepkileri başarıyla kullanılan astar Tablo 4' te belirtilmiştir.
Not: tüm plazmid PCR güçlendirme nedeniyle tüm PCSK9 Kodlayıcı bölge sıralama her mutant için önerilir.
2. yüksek-den geçerek Luciferase tabanlı proteolizis tahlil
-
Hücre kaplama (0 gün)
- Düşük-geçit HEK293T hücreleri deneyler için kullanın ve Dulbecco'nın bir kültür kartal Orta (DMEM) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS) değiştirilebilir. Gerçekleştirmek tüm cep doku kültürü başlıklı steril koşullarda iş luciferase etkinliği tahlil için hazır kadar. Wells ve transfections nüsha test her koşul için gerçekleştirilecek tahmin deney için gerekli tabak sayısını tahmin ediyoruz.
- Bir üst şişesi HEK293T hücrelerden en az hacmi % 0.05 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA hücreleri kapsayacak şekilde) ile tedavi bunları ayırmak. Tripsin-EDTA DMEM %10 FBS ve transferi ile desteklenmiş 2 hacimleri ile devre dışı bırakabilirsiniz bir steril tüp hücrelere. Hücreleri saymak bir otomatik hücre sayaç (ve trypan ile mavi boyama). 500 x g hücreleri kurtarmak 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi.
- Tripsin içeren orta Aspire edin ve 2 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon kültür ortamına hücrelerde sulandırmak. Bir çok kanallı pipet kullanarak, hücrelerin 100 µL 2 x 104 hücreleri/iyi bir son tohum konsantrasyon verir bir beyaz (opak-alt) 96-şey plaka, her şey için transfer.
Not: ilk deneyler için bir kız kardeşi, temiz-alt 96-şey plaka, hücre büyümesi ve bağlılık iletişim kuralı ve sorun giderme kılavuzu gelecekteki sırasında izlemek için Ayrıca temel yararlı olabilir. - Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.
- Plazmid bir 96-iyi biçimde ana bir tabak hazırla. Her plazmid elüsyon arabelleği (Tris-HCl, pH 8,5) 50 ng/µL bireysel bir iyi bir 96-şey plaka için sulandırmak.
- 4 kuyu olumlu denetim (WT) plazmid8, negatif kontrol (S386A) plazmid8ve plazmid ücretsiz tampon (için sahte transfections) hazırlayın. Eğer ilaç ya da diğer hücresel dayalı tedaviler planlanmaktadır, o zaman her şey olumlu denetim (WT) plazmid ile ana plaka hazırlamak, 4 ile birlikte her negatif kontrol (S386A) plazmid ve plazmid ücretsiz tampon kuyuları.
-
Transfection (1. gün)
- Derin-şey 96-şey plakaları kullanarak bir 96-şey plaka biçimde transfection karışımı hazırlayın. Transfections pipetting ve transfer kayıplar için hesabınıza yeterli reaktifler hazırlamak emin olun nüsha gerçekleştirin.
Not: Aşağıdaki hesaplamaları (420 kuyular için konservatif tahmini) nüsha bir 96-şey plaka çalıştırmak için yeterli reaktif hazırlayın.- Reaktif 50.4 µL azaltılmış-serum orta 2050 µL için ekleme bir seyreltilmiş lipid transfection reaktif ana bir karışımını yapmak. Bir DNA precomplexation reaktif reaktif 33.6 µL azaltılmış-serum orta 1730 µL ekleme, ana bir karışımını yapmak.
- Bir çok kanallı pipet, aliquot 16.8 µL derin-şey plaka her kuyuya seyreltilmiş DNA precomplexation reaktif karışımı kullanarak.
- Bir çok kanallı pipet, aliquot 3.2 µL kullanarak (160 ng), her plazmid derin-şey plaka her kuyuya ana plaka.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, her seyreltilmiş lipid transfection reaktif karışımı aliquot 20 µL tabak iyi ve her şey çok kanallı pipet kullanarak içeriği karıştırın. Kuruyucu ve onlara oda sıcaklığında (RT) oturup formu lipid: DNA komplekslerinde için 10-15 dk için.
Not: transfection iyi başına son bileşenleri aşağıdaki gibi olacaktır: 40 ng DNA, transfection reaktif 0,12 µL ve 0,08 µL DNA pre-complexation reaktif ve içerik her şey-ecek var olmak 10 µL toplam hacim (azaltılmış-serum orta).
- Yavaşça hücreleri bozmaya değil dikkat çekici bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plakaları 293T hücrelerde ortamda değişimi. DMEM % 10 ile desteklenen 95 µL emişli orta yerine FBS.
Not: Bu ilgi herhangi bir ilaç hücrelerle tedavi için uygun bir zaman olacaktır. - Her uygun iyi üzerinden için çok kanallı pipet 10 µL transfection karışımı ekleyin. Yavaşça kuyuları içeriğini karıştırmak için plaka girdap. Plaka %5 CO2 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: Wells son hacim 105 µL için buharlaşma için 24 h üzerinden hesap gelir.
- Derin-şey 96-şey plakaları kullanarak bir 96-şey plaka biçimde transfection karışımı hazırlayın. Transfections pipetting ve transfer kayıplar için hesabınıza yeterli reaktifler hazırlamak emin olun nüsha gerçekleştirin.
-
Tahlil (2 gün)
- Bir hisse senedi çözüm coelenterazine kimyasalları hazırlamak: [taze hazırlanan fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde (PBS), çözünmüş] 3 M sodyum askorbat, 5 M NaCl, 10 mg/mL Sığır serum albumin (BSA; içinde çözünmüş PBS, taze hazırlanmış) ve 2 mM coelenterazine (içinde çözünmüş acidified metanol) 3 N HCL 10 mL başına 200 µL içeren.
Not: 2 mM coelenterazine 2 hafta ne zaman-80 ° c ve ışık yokluğunda tutulur depolanabilir. - 2 x coelenterazine reaktifler bir ayrı reaktif her hücre ve orta, ile luciferase okuma için Tablo 5göre hazırlayın. İlk coelenterazine kurtarmak tüm reaktifler karışımı karışımı bir 0,22-µm şırınga filtre ve coelenterazine ekleyin. Plakalar için eklenecek hazır olana reaktifleri ışıktan korumak.
Not: eriyik--dan filtrasyon kaybı nedeniyle, filtrasyon, hem de transferler için kaybı her iki hesap için yeterli reaktif olun. Tablo 5 son konsantrasyonu 2 x reaktifler (aynı zamanda bir reaktif bir 96-şey plaka okumak için eklemek için hisse senedi çözüm miktarı) gösterir. - Hücreleri kuluçka 24 saat sonra transfection kaldırın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 50 µL şartına orta her kuyudan taze, beyaz popolu (opak) bir 96-şey plakasına aktarın.
- Tabak ister orta veya hücreleri içeren olarak etiketleyin. Eğer birden fazla 96-şey plaka transfected, böylece her Orta içeren plaka hücreleri onun üst plaka ile eşleştirilmiş olan sağlamak için tabak etiketleyin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak 2 x litik sigara coelenterazine reaktif 50 µL sadece şartına orta içeren plaka ekleyin. Yavaşça rock veya plaka için 5-10 dk RT. az ışık yokluğunda sallamak
- Bir çok kanallı pipet kullanarak 2 x litik coelenterazine reaktif 50 µL hücreleri içeren plaka ekleyin. Yavaşça rock veya plaka için 5-10 dk RT. az ışık yokluğunda sallamak
- Kuluçka sonra plaka okuyucu yalnızca orta plaka ışıldama okumak. Sonra aynı plaka okuyucu hücreyi içeren plaka ışıldama okumak.
- Tabakları atmak ve veri analizi için dosyaları kaydetmek.
- Bir hisse senedi çözüm coelenterazine kimyasalları hazırlamak: [taze hazırlanan fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde (PBS), çözünmüş] 3 M sodyum askorbat, 5 M NaCl, 10 mg/mL Sığır serum albumin (BSA; içinde çözünmüş PBS, taze hazırlanmış) ve 2 mM coelenterazine (içinde çözünmüş acidified metanol) 3 N HCL 10 mL başına 200 µL içeren.
3. veri analizi
- Elektronik tablo yazılımı kullanarak bir ilk veri çözümlemesi gerçekleştirin. Hücre ve orta plakaları sonuçlarını içeren bir elektronik tablo oluşturun.
- El ile kötü transfected kuyu tanımlamak için hücre plakaları verilerden inceleyin. < %5 - 10 göstermek Wells % negatif kontrol (S386A) plazmid okuma kabul edilmelidir olarak kötü transfected, bu veri şüpheli yorumu yapma.
- Her plaka sahte transfected kuyulardan ortalama arka plan ışıldama hesaplayın. Bu plaka değerleri her tabaktan arka plan çıkarma.
Not: Bu değer kullanılan plaka okuyucu bağlı olarak önemsiz olabilir. - İşlem luciferase etkinliği genel luciferase faaliyet her şey için karşılaştırıldığında orta oranda hesaplayarak verileri. Çünkü her iki klimalı ortam ek olarak hücreleri hücre plaka içeren ve salt orta plaka hücre plaka şartına orta aynı miktarı içerir, aşağıda ki formül kullanmak uygundur:
Burada, RLU göreli ışıldama birimleri, arka plan düşülen okuma plaka okuyucu =. - Ortalama salgılanan luciferase pozitif kontrol (WT) ve negatif kontrol (S386A) kuyu hesaplayın.
- Bir Z-faktör13hesaplayarak deneme genel kalitesini değerlendirmek:
Not: Etkin değerleri pozitif denetiminden (WT) ve etkin olmayan değerler negatif kontrol (S386A) kuyulardan gelir. 1'e yakın değerler daha deneysel kaliteli belirtir. Deneme yinelenen veya değeri 0 ise iş akışı en iyi duruma getirme düşünün. - Verileri elektronik tablo programından bilimsel veri analiz yazılımı aktarın.
- Pozitif kontrol (WT) ve negatif kontrol (S386A), ortalama değerleri pozitif kontrol 1 ve negatif kontrol 0 ayarlanması salgılanan luciferase faaliyete normalleştirmek.
- En büyük yanlış bulma oranı % 1'e ayarlama regresyon ve aykırı kaldırma (bozgun) yöntemini kullanarak outliers için verileri temizlemek.
- İçin istatistiksel olarak anlamlı fark mutant her koşul (veya mutant) için verileri karşılaştırarak WT etkinliği (1 değeri için normalleştirilmiş) ortalaması değerlendirin. Birden çok unpaired tgerçekleştirmek-α ve Holm-Sidak yöntemini kullanarak birden çok karşılaştırmaları için düzeltme testleri, 0,05 =.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek işlem hacmi proteolizis tahlil üç büyük zorlukların üstesinden üzerine dayanır. İlk olarak, bir tek-ciro PCSK9 proteaz inhibitör eksik bir PCSK9 proteaz özünde düşük çıktı aşmak için prodomain, bölünme serisi prodomain kuyruğunu, salgılanan14olabilir bir luciferase bağlantılı kullanılır. İkinci olarak, pas proteaz ihtiyacını karşılamak için onun inhibitör kompleksi prodomain, iki polipeptitler olan trans içinde bir hücresel bağlam15,16, üzerinden bir bicistronic vektör içinde coexpressed. Üçüncü olarak, cleaved uncleaved substrat ayırt etmek için PCSK9 proteaz da karmaşık PCSK9 çıkışından endoplazmik retikulum (ER) engeller ancak proteolitik işlevi17,18 üzerinde hiçbir etkisi C678, kesilir . Birlikte ele alındığında, bu bir değerlendirme salgılanan luciferase varlığı ve PCSK9 proteolizis (Şekil 1A) derecesi için bir proxy olarak sağlar. Tahlil genel süre kısa, site yönettiği mutagenesis tahlil vektörünün adımlarla (gün 1 - 2 geçici transfection (3 gün) tarafından takip) ve 4 gün, en az "Uygulamalı" zaman () ile en kısa sürede tamamlanması luciferase okuma (4 gün) tüm Şekil 1B).
Genel olarak, bu tahlil PCSK9 proteolizis koşulları, çeşitli altında eşzamanlı değerlendirilmesi ile luciferase tahlil tarafından yapılan okuma sağlar. Satın alma ve işleme sonra verileri ısı haritası veya tablo biçiminde görüntülenir. Özellikle, SNPs kodlama mutational analizleri bu yaklaşım için de uygundur. Şekil 2 bir ısı haritası PCSK9 proteaz substrat sitelerinden P6 P6, bölünme sıra özgüllük değerlendiren bir doygunluk mutagenesis kitaplığının gösterir '. En iyi göğüs arası sıra esas WT sıra ile aynı olduğunu sonuçları göstermek (SSVFAQ | SIPWNL). Özellikle, P6 veya P4 P1 ile mutasyon ' artıkları kötü tolere proteaz, sığ, hidrofobik bağlama groove ile tutarlı tarafından Olgun, kristal yapısını bu konumlarda i ciddi için PCSK9. Hiçbir idealize substrat mimetic endojen bölünme sıra kul anlaşılacağı gibi inhibitörü geliştirme açısından bakıldığında, bu dar sıra özgüllük profil yararlı bir bulgu olduğunu. Şekil 3 klinikte, açıklanan missense SNPs PCSK9 birincil yapısı planladım Kütüphanesi (WT için karşılaştırıldığında) göreli bölünme faaliyet göstermektedir. Değerlendirilen 84 SNPs üzerinde yarısı etkinlik için WT proteaz karşılaştırıldığında önemli bir değişiklik gösterdi. Bu sonuç PCSK9 proteolitik aktivite değişiklikler klinik kalabalıkta gerçekten oldukça yaygındır ve bu tür değişiklik klinikte seen LDL kolesterol düzeyleri değişkenlik açıklamaya yardımcı olabilir öneririz.
Resim 1: Genel şematik yüksek üretilen iş içinde trans PCSK9 bölünme testin. (A)Bu panel gösterir burada sunulan testin biyokimyasal bir şematik. Substrat PCSK9 sinyal dizisi (koyu gri) oluşur ve prodomain (kırmızı) bağlantılı olabilir luciferase (NLuc, yeşil) PCSK9 bölünme sırası (sarı) tarafından salgılanan. Proteaz sinyal sıra (koyu gri), katalitik etki alanı (açık gri) ve C679X kesme içeren sistein-histidin zengin (CHR) etki oluşur. Bicistronic 2A tabanlı vektör, genetik manipülasyon mükellef stokiometrik miktarlarda, substrat-proteaz çifti coexpressed. Coexpression, üzerine proteaz ve substrat ortak kat ve endoplazmik retikulum (ER) münzevi kalır. Bölünme faaliyetle luciferase karmaşık serbest bırakıldı ve salgılanan, nerede şartına orta luciferase tahlil tarafından tespit edilebilir. Bölünme etkinlik için potansiyel tedirginlikler içerir, ancak genetik manipülasyon (a pertürbasyon) veya küçük moleküller (pertürbasyon B) varlığı için sınırlı değildir. (B) Bu panel genel tahlil için zaman çizelgesini gösterir. Site yönettiği mutagenesis WT plazmid üzerinde gün -1 ve 0, günde 1 transfection ve luciferase tahlil toplam zaman çizelgesi 4 gün için günde 2, ardından gerçekleştirilir. Bu rakam çorba ve ark. adapte edilmiş 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sıra PCSK9 proteaz özgüllüğü. (A)bu ısı haritası proteolitik aktivite göstermektedir normalleştirilmiş arka plan ve WT, her tek amino asit mutant bir doygunluk mutagenesis Kütüphanesi, P6 aracılığıyla P6 için ' bölünme sıra. WT sıra kimlik alt hem üst gösterilen ve Beyaz dikdörtgenler tarafından vurgulanan WT sırası değerleri ile gösterilir. Arka plan etkinliği ve + 1 (yeşil) değerini gösterir WT değeri 0 (siyah) değerini gösterir. (B) Bu ısı harita kırmızı siyah ve daha yüksek değerler, düşük değerler ile aynı doygunluk mutagenesis kitaplığından proteolizis değerlerin standart sapmasını gösterir. Beyaz kesikli dikdörtgenler özetlenen değerleri temsil eden Holm-Sidak-düzeltilir, unpaired ttarafından belirlendiği gibi önemli ölçüde farklı proteolizis WT proteaz olan değerleri gösterdi mutantlar-α < 0,05 testlerle. Gösterilen veriler 3 bağımsız deneylerden her 3 çoğaltır içeren vardır. Bu rakam çorba ve ark. adapte edilmiş 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: proteolitik işlevi PCSK9 SNPs etkilerini. (A) Bu panel gösterir PCSK9, birincil yapısını sinyal sıra (SS; siyah anahat), prodomain (kırmızı anahat), katalitik etki alanı (gri anahat) ve sistein-histidin içeren zengin etki alanı (CHR; mavi anahat). (B) Bu panel birincil yapısını eşlenen proteolizis tahlil yerleştirilen 84 klinik SNPs (siyah anahatları ile sarı dikdörtgenler) konumunu gösterir. (C) Bu panel Holm-Sidak-düzeltilir unpaired ttarafından belirlenen WT proteaz için karşılaştırıldığında önemli ölçüde değişmiş proteolitik aktivite ile 47 SNPs değerleri gösterir-α < 0,05 testlerle. Değerleri üzerine PCSK9 birincil yapısı, proteolitik aktivite gösteren bir değer-1 (kırmızı) ve + 1 (mavi) WT proteaz logosuna 2 kat bir gelişme gösteren bir değeri ile eşleşir. Bu rakam çorba ve ark. adapte edilmiş 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: mutajenik PCR astar tasarım Site Yönetmen:. PCR astar kısmen dizileri, örtüşen gösterilen tasarım göre sahip. Başarılı astar çiftinin bir örnek aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
| Bileşen | Hisse senedi | Birim (µL) | Son |
| Ultrasaf H2O | 17,5 | 25 µL toplam hacim için | |
| Polimeraz tepki arabellek | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTPs) | 200 ΜM | 0,5 | 4 ΜM |
| Şablon (vahşi türü (WT)) | 2 ng/µL | 0,5 | 1 ng (Toplam) |
| Astar (Fwd) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Astar (devir) | 20 ΜM | 0.625 | 500 nM |
| Yüksek sadakat DNA polimeraz | 2 U/ΜL | 0,25 | 0,5 U (Toplam) |
Tablo 2: bileşenleri bir PCR için site yönettiği mutagenesis. Bileşenleri içinde listelendikleri tepki başlayana kadar buz tuttu karışımı ile sırayla eklenmelidir.
| Adım | Sıcaklığı (° C) | Zaman | |
| İlk denatürasyon | 1 | 98 | 30 s |
| Denatürasyon | 2 | 98 | 10 s |
| Tavlama | 3 | (Tm şablon) * + 1 | 20 s |
| Uzantısı | 4 | 72 | 30 s/kilobaz (kb) (4 min) |
| Bisiklete binme | 5 (2. adımda, 35 döngüleri toplam gitmek) | ||
| Son uzantısı | 6 | 72 | 5 dk |
| Basılı tutun | 7 | 12 | Basılı tutun |
| * - Astar çiftinin alt Tm şablonu seçin | |||
Tablo 3: önerilen Bisiklete binme parametreleri PCR. Önerilen parametreleri iyi bir başlangıç noktası temsil ancak en iyi duruma getirme gerektirebilir.
| Astar | Tavlama konumu | Sıra (5'-3') |
| 1 | CMV organizatörü | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | C-terminus, NLuc | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
Tablo 4: astar sıralama için doğrulanmış. Her astar Bu yöntemde başvurulan plazmid Kodlayıcı bölge sıralama başarıyla kullanılmıştır.
| Bileşen (hisse senedi) | Sigara-litik (orta) | Litik (hücre) | Miktar için 96 wells (1 plaka) |
| Sodyum askorbat (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 ΜL |
| NaCl (5 M) | 5 mM | 5 mM | 7 ΜL |
| BSA (10 mg/mL, %1) | %0.10 | - | 700 ΜL |
| Triton X-100 | - | %0.10 | 7 ΜL |
| PBS | 50 µL/iyi | 50 µL/iyi | 7000 µL |
| 0,22 µm membran filtre ve filtrate 5880 µL taze tüp içine aktarma | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 ΜM | 40 ΜM | 120 ΜL |
| Toplam hacim: 6000 µL | |||
Tablo 5: luciferase güzel 2 x coelenterazine kimyasalları bileşenlerinin. Litik sigara ve litik reaktifler şartına orta ve transfected hücreleri ayrı ayrı değerlendirmek için analiz her şey için gereklidir. Reaktifleri karışık ve coelenterazine yanı sıra önce filtre. Coelenterazine eklenmesinden sonra kullanım için hazır kadar ışıktan reaktif korumak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan deneysel prosedürler tek-ciro proteaz PCSK9 özünde düşük etkinlik üstesinden gelmek ve proteolitik işlevini sağlam bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Tahlil anahtar kavramı enzimatik güçlendirilmiş bir okuma bir tek-ciro olay dönüştürme üzerine dayanır. Güçlü bir tahlil nispeten kısa zaman dilimi ve rahatlık-in kullanma luciferase muhabir, hem de onun ölçeklenebilirliği yüksek üretilen iş yaklaşımlara içerir. Buna ek olarak, tahlil proteolizis onun yerli, hücresel bağlamda değerlendirir. Ayrıca, bu tahlil ile klinik olarak tanımlanan SNPs PCSK9 proteolizis ezelî belgili tanımlık lüzum için herhangi bir insan ya da hasta doku üzerindeki etkileri için değerlendirilebilir; Sadece ilgi genotip bilgisi gereklidir.
Bazı teknik sınırlamaları testin adlı biri yok. Proteolizis hücre içinde tahlil değerlendirir rağmen aynı zamanda bir overexpression Yöneyin gerektirir. Tahlil HEK293T hücre kültürünü geçici transfection gerektirdiğinden, transfection verimliliği içsel iyi şey değişkenlik ekler. Proteolizis için negatif kontrol proteaz ölü S386A PCSK9 görür, bu hücreler üretmek beri o da transfection kendisi için pozitif kontrol olarak da olsa intracellularly kapana luciferase fonksiyonel, servis edilir. Hücresel plakaların ham veri değerlendirme transfection verimliliği ile brüt varyasyonları bu hücreleri belirlemeye yardımcı olur ve bu veriler atılır (ve eğer tekrarlanan deneme istenen). Ayrıca, toplam luciferase dışarı salgılanan luciferase oranı için veri işleme plazmid teslim ve transkripsiyon çıktı daha küçük değişimler için ayarlamak için yardımcı olur üretti. Böyle varyasyonları benzer şekilde luciferase çıkışlarını şartına orta ve hücreleri etkiler beklenir. Ayrıca, bu tahlil için kullanılan vektörel çizimler indüklenebilir, isogenic kararlı hücre hatları ile başarı gereksinimini atlamak için bir araç olarak istihdam piyasada bulunan Flp-In T-Rex 293 hattıyla oluşumu için mükellef bulunmaktadır lipid-aracılı transfection. Bu tahlil küçük molekül tarama için PCSK9 proteolizis inhibitörleri uygularken çekici bir özelliği olması muhtemeldir. Bugüne kadar böyle bir inhibitörleri, daha fazla bu tahlil önemini vurgulamış tespit edilmiştir.
PCSK9 proteaz Mühendislik aynı zamanda bazı biyolojik sınırlamaları oluşturur. İlk olarak, tahlil WT PCSK9 ile oluşan intramolecular proteolizis yerine, cins PCSK9 proteolizis ölçer. Bu iki faaliyetler genellikle ilişkilendirmek, tüm biyolojik durumlarda böyle bir ilişki var ve bu nedenle bazı durumlarda, bu etkilerin bir CIS içinde PCSK9 bölünme içinde doğrulama tahlil, büyük olasılıkla tarafından alternatif bir yöntem, olası iken immunoblot gibi gerekli olabilir. Ayrıca, tahlil sadece missense SNPs (ve değil kodlamayan varyasyonları etkisi) değerlendirebilir. Son olarak, olsa PCSK9 proteolizis PCSK9 salgı hızı sınırlaması adımında ve PCSK9 proteolizis azalma (klinik kolesterol fenotip ile ilgili) bir işlev kaybı PCSK9 değişken neden bekleniyor, bu gösteren tüm SNPs için geçerli değildir En azından bazı mutasyonlar için ek biyoloji oyun8' de olduğunu.
Belgili tanımlık yarar bu testin bir özünde düşük çıktı proteaz proteolitik işlevin yeteneğini yatıyor. Bu tasarım kavramları benzer sorunlar acı proteaz PCSK9 dışında çevirmek. Bu değişikliği gerçekleştirmek için bölünme ve luciferase salgılanması arasındaki bağlantıyı korumak için gerekli olan. Belgili tanımlık substrate nerede bir strateji yerine bir türü ile ben membran çapa luciferase üzerinden için bağlantılı bir bölünme sıra faiz proteaz için belirli bu gereksinimi karşılamak gerekir.
Özet olarak, bu iletişim kuralını PCSK9 proteolizis yüksek üretilen iş bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem açıklanır. Bu yöntem hem PCSK9 proteolizis klinik SNPs etkisini değerlendirmek için yanı sıra PCSK9 küçük molekül inhibitörleri ile taranması faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar NHLBI/NIH (K08 HL124068 ve LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü Catalyst programı (UL1 TR000004), UCSF akademik Senato Hellman Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteğinden teşekkür bir Gilead Sciences araştırma bilim adamı Ödülü, bir Pfizer ASPIRE kardiyovasküler Ödülü (tüm John S. Chorba) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (için Adri M. Galvan ve Kevan M. Shokat).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
