Summary
이 프로토콜 셀룰러 맥락에서 본질적으로 낮은 활동, 단일 매출 효소의 분해 활동을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 특히,이 메서드는 PCSK9, 그 분해 활동은 그것의 궁극적인 노인 기능에 필요한 지질 대사의 핵심 드라이버의 분해 활동을 평가에 적용 됩니다.
Abstract
Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9) 형식이 단일 매출 protease 혈 청 저밀도 지 단백질 (LDL) 수치를 조절 하 고, 따라서, 심장 혈관 질병. PCSK9 베이스에 필요 하지만 전체 콜레스테롤 효과, 분해 기능 평가 도전 이다: PCSK9 자체 쪼개만 알려져, 겪 습만 단일 회전율, 및 베이스, 후에 그것의 기질을 유지 자동-억제제로 그것의 활성 사이트입니다. 여기에 제시 된 방법을 이러한 문제를 극복 하는 분석 결과 설명 합니다. 분석 결과 셀 컨텍스트 및 링크 쉽게 읽을 수 있습니다 밖으로 바른된 매체에 은닉 luciferase 활동에 성공적인 분열 intermolecular 베이스에 집중 한다. 통해 순차적 단계 mutagenesis, 과도 transfection 그리고 luciferase 판독, 분석 결과 높은 처리량 방법에서 유전적 또는 분자 섭 동의 조건 하에서 PCSK9 베이스를 프로브 수 있습니다. 이 시스템은 임상 발견된 missense 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp), 또한 PCSK9 베이스의 작은 분자 억제제의 심사에 관해서는 모두 생 화 학적 평가 대 한 적합 합니다.
Introduction
LDL 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤)을 제기 하 고 동맥 경 화성 심장 질환1,2운전 PCSK9 성능 저하, LDL 수용 체 (LDL-R)를 대상. 치료 대상 PCSK9 튼튼하게 LDL-콜레스테롤을 낮출 하 고 적극적인 지질을 낮추는 치료 스타 틴3,4에 추가 하는 경우에 환자에 대 한 심장 혈관 결과 개선. 그러나 현재 승인 된 치료 항 체 기반 접근에 제한 된다, 그리고 비용 효율성5,6의 부족에서 고통. 이 문제를 해결 하려면 비용이 많이 드는 치료 대안, 환자 더 큰 혜택을 얻을 것을 식별 하는 수단 또는 둘 다 필요 합니다.
작은 분자 접근은 세포내 PCSK9 대상, 관리의 향상 된 경로 제공 고 비용, 그들에 게이 지역7에 있는 "성배"를 줄일 수 있습니다. 그러나, PCSK9 작은 분자 약물 어려운 입증 했다. 한 효소로 PCSK9의 분해 기능을 대상으로 자체 베이스 PCSK9 성숙8 의 속도 제한 단계가 고 LDL-R9에 그것의 최대 효과 위해 필요한 매력적인 전략 이다. 그러나 현재까지,,이 전략 하지 않은 성공 가능성이 PCSK9의 고유한 생화학 때문: PCSK9 앞만 자체10, 수행 하는 단일-매출 반응, 그리고 자기 분열 후 PCSK9 prodomain와 활성 사이트에 바인딩된는 자동-억제제11, 어떤 더 프로 테아 제 활동의 판독을 방지.
이 문서는 높은 처리량 패션8PCSK9 분해 기능을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 사이트 지시 된 mutagenesis, 통해 조사자는 베이스, PCSK9 성숙의 속도 제한 단계에 효과 대 한 그들을 평가 하기 위해 병원에서 발견 하는 Snp 코딩의 효과 조사 하이 분석 결과 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 궁극적으로 LDL-r PCSK9의 프레 젠 테이 션을 방해 (및 변조 PCSK9의 콜레스테롤 효과) 것으로 예상 되는 PCSK9 베이스의 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 스크린의 설계에 도움이 될 것입니다. . 마지막으로,이 프로토콜은 i) 특정 기질-효소 쌍을 찾을 수 있습니다, 고 기판에 대 한 ii)는 적당 한 세포내 앵커를 설정할 수 있습니다 본질적으로 낮은 활동, 다른 프로 테아 제를 적용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 사이트 감독 Mutagenesis Protease 벡터의
- 디자인과 표준 사이트 감독 mutagenesis 프로토콜12의 수정을 사용 하 여 관심사의 돌연변이 설치 하려면 사용자 정의 합성 oligonucleotides 주문. 표준 desalted 뇌관 (추가 정화) 없이 완벽 하 게 사용할 수 있습니다.
참고: 뇌관 디자인에 대 한 일반적인 접근 표 1의 중 합 효소에 녹는 온도 (Tm) 계산기를 사용 하 여 표시 된 대로 부분적으로 겹치는 뇌관을 만드는 작업이 포함 됩니다. - 설정 중 합 효소 연쇄 반응 (PCRs) 사이트 감독 mutagenesis 얼음, 표 2에 표시 된 대로.
- 표 3에 표시 된 대로 PCRs를 주기.
- 1 %agarose 젤에 각 PCR의 2-5 µ L을 실행 하 고 성공적인 증폭을 확인 하는 제품을 시각화.
참고: 성공적인 PCR (~7.8 kB) 서식 파일의 대략적인 크기 표시에서 단일, 저명한 DNA 밴드를 표시 합니다. - DpnI의 (25 µ L 반응) 당 0.5 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- 화학적으로 유능한 병원 성 대장균으로 반응의 2 µ L를 변환.
참고: 급성장 E. 콜라이 긴장 부 화 시간을 줄일 것입니다 하지만 어떤 복제 긴장 든 지 받아들일 수 있을 것입니다. - 포함 하는 50-100 µ g/mL carbenicillin Luria Bertani (파운드) agar에 변형 판 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어
- 2-4 식민지는 소규모 문화 (50-100 µ g/mL carbenicillin와 파운드 매체의 2-5 mL)에서 성장 하는 것을 선택 합니다. 혼 탁 한 때까지 220 rpm에서 37 ° C에서 문화를 품 어.
- 제조업체의 지침에 따라 플라스 미드 DNA (i.e, "miniprep") 정화 키트를 사용 하 여 셀에서 DNA 플라스 미드를 분리. Microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 eluted DNA의 농도 계량.
- 플라스 미드는 생어 시퀀싱 서비스 (코어 또는 상업 시설)를 사용 하 여 광범위 하 게 DNA 순서. 서비스의 사양에 따라 DNA 샘플을 준비 합니다. 사전 연속 반응에서 성공적으로 사용 하는 뇌관은 표 4에 설명 되어 있습니다.
참고: 전체 플라스 미드 PCR 증폭으로 인해 전체 PCSK9 코딩 영역의 시퀀싱이 좋습니다 각 돌연변이 대 한.
2. 높은 처리량 Luciferase 기반 베이스 분석 결과
-
셀 도금 (0 일)
- 실험에 대 한 낮은 통로 HEK293T 셀을 사용 하 고 Dulbecco의에 문화 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 독수리 매체 (DMEM) 수정. 수행 모든 luciferase 활동 시험 준비까지 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 작업 셀. 우물과 transfections를 테스트 하는 각 조건에 대 한 3 중에 수행 하 게 될 예상 실험에 필요한 접시의 수를 견적 한다.
- 0.05% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 셀 커버의 최소 볼륨으로 그들을 치료 하 여 부모 플라스 크에서 HEK293T 세포를 분리. 트립 신-EDTA 10 %FBS 전송 보충 DMEM의 2 볼륨 비활성화 무 균 튜브에 세포. 셀 계산 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 (와 함께 trypan 블루 얼룩). 500 x g 세포를 복구 하려면 5 분 동안에 튜브 원심
- 트립 신 포함 된 매체를 발음 하 고 문화 매체 2 x 105 셀/mL의 농도에 있는 셀을 다시 구성 하기. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 셀의 100 µ L의 2 × 104 셀/최종 시드 농도 주는 흰색 (불투명 하단) 96 잘 접시의 각 잘 전송.
참고: 초기 실험에 대 한 그것은 유용할 수 있습니다 또한 자매, 클리어 아래 96 잘 접시, 세포 성장 및 프로토콜 및 가이드 미래 문제 해결 동안 준수 모니터링 되므로 씨앗. - 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 품 어.
- 96-잘 형식에 플라스 미드의 마스터 플레이트를 준비 합니다. 차입 버퍼 (Tris HCl, pH 8.5) 96 잘 접시의 개별 잘에서 50 ng / µ L를 각 플라스 미드를 희석.
- 긍정적인 통제 (WT) 플라스 미드8, 부정적인 컨트롤 (S386A) 플라스 미드8, 및 플라스 미드 무료 버퍼 (mock transfections) 4 우물을 준비 합니다. 약물 이나 다른 셀룰러 기반 치료 계획 되 고, 다음에 각 잘 각 부정적인 4 우물 함께 긍정적인 제어 (WT) 플라스 미드와 마스터 플레이트를 준비 하는 경우 (S386A) 플라스 미드, 플라스 미드 무료 버퍼를 제어 합니다.
-
Transfection (주 1)
- 깊은 잘 96 잘 접시를 사용 하 여 96 잘 접시 형태로 transfection 혼합물을 준비 합니다. Pipetting 및 전송 손실에 대 한 계정에 충분 한 시 약을 준비 해야 되 고 3 중에는 transfections를 수행 합니다.
참고: 다음 계산 (420 웰 스에 대 한 보수적 추정) 3 중에 한 96 잘 접시를 실행할 충분 한 시 약을 준비 합니다.- 마스터는 희석된 지질 transfection 시 약, 시 약의 50.4 µ L 감소-혈 청 매체의 2050 µ L을 추가 혼합을 확인 합니다. DNA precomplexation 시 약, 시 약의 33.6 µ L 감소-혈 청 매체의 1730 µ L에 추가의 마스터 믹스를 확인 합니다.
- 멀티 채널 피 펫, 깊은 잘 격판덮개의 각 음에 희석된 DNA precomplexation 시 약 혼합물의 aliquot 16.8 µ L를 사용 하 여.
- 멀티 채널 피 펫, aliquot 3.2 µ L를 사용 하 여 (160 ng) 깊은 잘 격판덮개의 각 음에 마스터 플레이트에서 각 플라스 미드의.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 희석된 지질 transfection 시 혼합물의 aliquot 20 µ L 접시의 잘 하 고 잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫의 내용을 혼합. 플레이트 커버 그리고 그들이 실내 온도 (RT)에 앉아 폼 지질: DNA 단지 10-15 분.
참고: transfection, 시 잘 당 최종 구성 될 것입니다 다음과 같습니다: 40 DNA, transfection 시 약의 0.12 µ L 및 DNA 중 complexation 시 약의 0.08 µ L의 ng와 각각의 내용을 잘 될 것입니다 10 µ L 총 볼륨 (감소-혈 청 매체).
- 부드럽게 셀을 방해 하지 않도록 주의 복용 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시에서 293T 세포에 매체를 교환 합니다. DMEM 10% 보충의 95 µ L 발음된 매체 바꿉니다 FBS.
참고:이 셀의 모든 약물을 치료 하는 적절 한 시간 것입니다. - 각 적절 한 잘 통해 멀티 채널 피 펫을 transfection 혼합물의 10 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 우물에 내용을 섞어 접시를 소용돌이 친다. 24 시간 5% CO2 와 37 ° C에서 접시를 품 어.
참고: 우물의 최종 볼륨 증발 이상 24 h에 대 한 계정에 105 µ L에 온다.
- 깊은 잘 96 잘 접시를 사용 하 여 96 잘 접시 형태로 transfection 혼합물을 준비 합니다. Pipetting 및 전송 손실에 대 한 계정에 충분 한 시 약을 준비 해야 되 고 3 중에는 transfections를 수행 합니다.
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분석 결과 (주 2)
- 재고 솔루션 coelenterazine 시 약 준비: [인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 신선한 준비에 녹아] 3m 나트륨 하는데, 5 M NaCl, 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA;에 녹아 PBS, 신선한 준비), 그리고 2 m m coelenterazine (에 녹아 산성화 메탄올 10 mL 당 3 N HCl의 200 µ L를 포함).
참고: 2 mM coelenterazine 때 그것은 유지-80 ° C에서 빛의 부재에 2 주 동안 저장할 수 있습니다. - 표 5에 따르면 luciferase 판독 한 별도 시 약 각 세포와 매체와 2 x coelenterazine 시 약 준비. 먼저는 coelenterazine 저장 모든 시 약을 혼합 하 고 혼합 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링은 coelenterazine를 추가 합니다. 그들은 접시에 추가 될 준비가 될 때까지 약 빛에서 보호 합니다.
참고: 여과에서 솔루션의 손실로 인해 전송 뿐만 아니라 여과에서 모두 손실에 대 한 계정에 충분 한 시 약 확인. 표 5 는 2 x 시 약 (뿐만 아니라 한 시 약으로 한 96 잘 접시를 읽을 추가 하려면 재고 솔루션의 금액)의 최종 농도 보여 줍니다. - Transfection는 후 24 h 인큐베이터에서 셀을 제거 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 신선한, 화이트 바닥 (불투명) 96 잘 접시에 각 우물에서 50 µ L 조절된 하는 매체의 전송.
- 그들은 매체 또는 셀을 포함 하는 여부로 접시를 레이블을 지정 합니다. 하나 이상의 96 잘 접시 페 했다 매체 포함 된 플레이트 각 셀의 그것의 부모 플레이트와 결합 하 여 수 있도록 접시를 레이블을 지정 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 바른된 매체를 포함 하는 접시에 비 용균성 coelenterazine 시 약 x 2의 50 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 바위 또는 실시간에 5-10 분에 대 한 빛의 부재에 접시를 흔들어
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀을 포함 하는 접시에 2 x 용균성 coelenterazine 시 약의 50 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 바위 또는 실시간에 5-10 분에 대 한 빛의 부재에 접시를 흔들어
- 부 화 후 플레이트 리더에서 매체 전용 플레이트의 발광 밖으로 읽기. 그런 다음, 동일한 플레이트 리더에 포함 하는 셀 판의 발광 밖으로 읽기.
- 판 삭제 하 고 데이터 분석에 대 한 파일을 저장 합니다.
- 재고 솔루션 coelenterazine 시 약 준비: [인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 신선한 준비에 녹아] 3m 나트륨 하는데, 5 M NaCl, 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA;에 녹아 PBS, 신선한 준비), 그리고 2 m m coelenterazine (에 녹아 산성화 메탄올 10 mL 당 3 N HCl의 200 µ L를 포함).
3. 데이터 분석
- 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 초기 데이터 분석을 수행 합니다. 셀 및 중간 플레이트에서 결과 포함 하는 스프레드시트를 만듭니다.
- 수동으로 제대로 transfected 우물을 식별 하기 위해 셀 격판덮개에서 데이터를 검사 합니다. 우물 < 5%-10% 부정적인 컨트롤 (S386A) 플라스 미드의 판독의 고려 되어야 한다으로 저조한 페, 그 데이터 용의자의 해석 만들기.
- Mock 페 우물에서 각 판의 평균 배경 발광을 계산 합니다. 그 접시의 값에서 각 판의 배경 빼기.
참고:이 값을 사용 하는 플레이트 리더에 따라 무시할 수 수 있습니다. - 각 잘 전반적인 luciferase 활동에 비해 매체에서 luciferase 활동의 비율을 계산 하 여 데이터 처리 합니다. 셀 접시 포함 셀, 뿐만 아니라 모두 바른된 매체 때문에 세포 격판덮개로 조절된 하는 매체의 동일한 금액을 포함 하는 매체 전용 접시, 그것은 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 적절 한:
여기서, RLU = 상대 발광 단위, 플레이트 리더에서 배경 빼고 판독. - 긍정적인 통제 (WT)와 부정적인 컨트롤 (S386A) 우물의 평균 secreted luciferase를 계산 합니다.
- Z-팩터13를 계산 하 여 실험의 전반적인 품질을 평가.
참고: 활성 값에서 긍정적인 제어 (WT)와 서 부정적인 컨트롤 (S386A) 우물에서 비활성 값 온. 1에 가까운 값 높은 실험 품질을 나타냅니다. 실험을 반복 값이 0 미만의 경우 워크플로 최적화 하십시오. - 과학적인 데이터 분석 소프트웨어 스프레드시트 프로그램에서 데이터를 전송.
- 긍정적인 통제 (WT) 및 부정적인 제어 (S386A)의 평균 값을 0으로 긍정적인 통제 1와 부정적인 컨트롤 설정 luciferase 분 비 활동을 정상화.
- Outliers 회귀 및 국외 자 제거 (패 주) 메서드를 사용 하 여 최대 틀린 발견 비율을 1%로 설정에 대 한 데이터를 청소.
- (1의 값으로 정규화) WT 활동의 의미를 각 돌연변이 상태 (또는 돌연변이)에 대 한 데이터를 비교 하 여 통계적으로 유의 한 차이 평가 합니다. 수행 하는 여러 홀된 t-테스트, Holm Sidak 방법과 α를 사용 하 여 여러 비교에 대 한 수정 = 0.05.
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Representative Results
높은 처리량 베이스 분석 결과 세 가지 주요 과제를 극복에 의존 합니다. 첫째, 단일-매출 PCSK9 효소는 억제 부족 PCSK9 효소의 본질적으로 낮은 출력을 극복 하기 위해 prodomain 사용 됩니다, 분열 순서는 prodomain의 꼬리에서 분 비14수 luciferase에 연결. 둘째, 접으면 protease에 대 한 필요를 만족 시키기 위해 복잡 한 그것의 억제와 함께 prodomain, 2 개의 polypeptides는 coexpressed 트랜스에서 셀룰러 컨텍스트15,16를 통해 bicistronic 벡터에. 셋째,에서 차별화 하는 쪼개진 uncleaved 기판, PCSK9 효소가 잘립니다 C678 바인딩과 그물 (응급실)에서 복잡 한 PCSK9 출구를 방지 하지만 분해 기능17,18에 아무런 영향도 주지에서 . 함께 찍은, 존재와 PCSK9 베이스 (그림 1A)의 정도 대 한 프록시 secreted luciferase의 평가 대 한 수 있습니다. 분석 결과의 일반적인 기간 짧은, 분석 결과 벡터의 사이트 감독 mutagenesis의 단계는 (일 1-2) 과도 transfection (3 일) 뒤와 luciferase 판독 (주 4) 모든에 신속 하 게 최소한의 "실제" 시간 (4 일 완성 그림 1B)입니다.
전반적으로,이 분석 결과 판독 luciferase 분석 결과 의해 수행과 다양 한 조건에서 PCSK9 베이스의 동시 평가 대 한 수 있습니다. 수집 및 처리 후 데이터 열 지도 또는 테이블 형식으로 구상 될 수 있다. 특히, Snp 코딩의 mutational 분석은이 접근 방식에 적합. 그림 2 는 P6 통해 기판 사이트 P6에서 PCSK9 효소의 분열 순서 특이성 평가 포화 mutagenesis 라이브러리의 열 지도 '. 결과 최적의 절단 순서는 기본적으로 WT 시퀀스와 동일 (SSVFAQ | SIPWNL)입니다. 특히, P6 또는 P1 통해 P4의 돌연변이 ', 성숙의 결정 구조에서 이러한 위치는 PCSK9 죽 습에 대 한 잔류물 효소, 얕은, 소수 바인딩 그루브와 일치 하 여 저조한 용납. 억제제 개발의 관점에서이 좁은 순서 특이성 프로필은 유용한 찾기, 모방 없는 이상적인된 기판 내 생 분열 시퀀스 노르만족 수 있듯이. 그림 3 PCSK9 기본 구조에 밖으로 매핑된 missense Snp는 클리닉에 설명 된 라이브러리의 (무게에 비해) 상대적 분열 활동을 보여준다. 평가 84 Snp의 이상 절반 보였다 중요 한 변화 활동 WT 효소에 비해. 이 결과 변경 PCSK9 분해 활동에는 실제로 꽤 임상 인구에 있는 일반적인 이러한 변경 LDL 콜레스테롤 수치는 병원에서 본에 있는 변화를 설명 하기 위해 도움이 될 수 있습니다 것이 좋습니다.
그림 1: 높은 처리량에 트랜스에서 PCSK9 분열 분석 결과의 전체 회로도 (A)이이 패널은 여기에 제시 된 분석 결과의 생 화 확 적인 회로도 보여준다. 기판 구성 PCSK9 신호 순서 (어두운 회색) 및 prodomain (레드)에 연결 될 수 있는 luciferase PCSK9 분열 시퀀스 (노란색) (NLuc, 그린) 분 비. 신호 순서 (어두운 회색), 촉매 도메인 (밝은 회색), 및 시스테인-히스티딘 풍부한 (CHR) 도메인 C679X 잘림을 포함 하는 프로 테아 제에 의하여 이루어져 있다. 기질-효소 쌍 2A 기반 bicistronic 벡터, 유전자 조작 의무가 있는 화학 량 론 총계에서 coexpressed입니다. Coexpression, 효소와 기질 공동 배 고 바인딩과 그물 (응급실)에서 분리 된 유지. 분열 활동은 luciferase 복잡 한에서 해방 이며 분 비, 조절된 하는 매체의 luciferase 분석 결과 의해 감지 수 있습니다. 잠재적인 섭 분열 활동을 포함, 하지만, 유전자 조작 (섭 동 A) 이나 작은 분자 (섭 동 B)의 존재에 국한 되지 않습니다. (B)이이 패널 전체 분석 결과 대 한 일정을 보여 줍니다. 사이트 감독 mutagenesis WT 플라스 미드에는-1과 0, 뒤에 1 일 transfection luciferase 분석 결과 하루에 2, 4 일의 전체 타임 라인에 대 한 일에 수행 됩니다. 이 그림에서 Chorba 외 적응 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: PCSK9 효소의 특이성을 시퀀싱. (A)이 열 지도 표시 분해 활동 표준화 배경과 WT, P6 통해 P6의 포화 mutagenesis 라이브러리의 각 단일 아미노산 돌연변이 대 한 ' 분열 시퀀스. WT 시퀀스 id WT 시퀀스 상단에 모두 표시 하 고 흰색 사각형으로 강조 표시에 대 한 값으로 하단에 표시 됩니다. 값이 0 (검정) WT 값을 표시 하는 배경 활동, 및 + (녹색) 1의 값을 나타냅니다. (B)이이 열 지도 빨간색에서 검은색과 높은 값에서 낮은 값을 가진 동일한 포화 mutagenesis 라이브러리에서 베이스 값의 표준 편차를 보여 줍니다. 흰색 점선된 사각형에 명시 된 값 나타냅니다 Holm Sidak 수정, 짝이 없는 t에 의해 결정으로 WT protease의 크게 다른 베이스 값을 보여준 돌연변이-α < 0.05와 함께 테스트. 표시 된 데이터 3 독립적인 실험에서 각각 3 복제를 포함 하는. 이 그림에서 Chorba 외 적응 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 분해 기능에 PCSK9 Snp의 효과. (A)이이 패널 표시 PCSK9의 기본 구조 신호 순서 (SS, 검은 윤곽선), prodomain (빨강 윤곽선), 촉매 도메인 (회색 개요), 그리고 시스테인-히스티딘 풍부한 도메인 (CHR; 블루 개요). (B)이이 패널 기본 구조에 매핑된 베이스 분석 결과 84 임상 Snp (노란색 사각형 검은 윤곽선으로)의 위치를 보여줍니다. (C)이이 패널 Holm Sidak 수정 홀된 t에 의해 결정으로 WT 효소에 비해 상당히 변경 된 분해 활동 47 Snp의 값을 표시-α < 0.05와 함께 테스트. 값은 PCSK9 기본 구조, 아니 분해 활동을 나타내는-1 (빨간색)의 가치와 WT protease에 2-fold 향상을 나타내는 + (청록색) 1의 값에 매핑됩니다. 이 그림에서 Chorba 외 적응 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 돌연변이 PCR 뇌관 디자인 사이트 감독. PCR 뇌관 디자인 표시에 따라 부분적으로 중복 시퀀스, 있다. 성공적인 뇌관 쌍의 예 표는 아래와 같습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 주식 | 볼륨 (µ L) | 최종 |
| 초순 H2O | 17.5 | 25 µ L 총 볼륨 | |
| 중 합 효소 반응 버퍼 | 5 X | 5 | 1 X |
| Deoxynucleotides (dNTPs) | 200 Μ M | 0.5 | 4 Μ M |
| 템플릿 (야생-타입 (WT)) | 2 ng / µ l | 0.5 | 1 기 (총) |
| 뇌관 (Fwd) | 20 Μ M | 0.625 | 500 nM |
| 뇌관 (계) | 20 Μ M | 0.625 | 500 nM |
| 고 충실도 DNA 중 합 효소 | 2 U/Μ L | 0.25 | 0.5 U (총) |
표 2: 사이트 지시 된 mutagenesis에 대 한 PCR의 구성 요소. 구성 요소에 있는 나열 된 순서 대로, 반응 시작 될 때까지 얼음에 보관 하는 혼합물에 추가 되어야 합니다.
| 단계 | 온도 (° C) | 시간 | |
| 초기 변성 | 1 | 98 | 30 s |
| 변성 | 2 | 98 | 10 s |
| 어 닐 링 | 3 | (Tm 템플릿) * + 1 | 20 s |
| 확장 | 4 | 72 | 30 s/kilobase (kb) (4 분) |
| 사이클링 | 5 (35 주기 총 2 단계로 이동) | ||
| 마지막 확장 | 6 | 72 | 5 분 |
| 보류 | 7 | 12 | 보류 |
| *-뇌관 쌍의 낮은 Tm 템플릿 선택 | |||
표 3: PCR에 대 한 제안된 자전거 매개 변수. 제안 된 매개 변수는 좋은 출발점 나타내지만 최적화 필요할 수 있습니다.
| 뇌관 | 어 닐 링 위치 | 시퀀스 (5' 3') |
| 1 | CMV 발기인 | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 2 | PCSK9 A95 | TCTCGCAGTCAGAGCGCAC |
| 3 | NLuc의 C-터미널 | TGTGCGAACGCATTCTGGCG |
| 4 | PCSK9 C301 | GCCAGCGCCTGGCTAGG |
| 5 | PCSK9 E501 | GAGGCCCAAGGGGGCAAG |
표 4: 뇌관 시퀀싱에 대 한 검증. 각 뇌관은이 방법에서 참조 하는 플라스 미드의 코딩 영역을 시퀀싱에 성공적으로 사용 되었습니다.
| 구성 요소 (재고) | 비-용균성 (매체) | 용균성 (셀) | 96 웰 (1 접시)에 대 한 금액 |
| 나트륨 하는데 (3 M) | 300 mM | 300 mM | 700 Μ L |
| NaCl (5m) | 5 mM | 5 mM | 7 Μ L |
| BSA (10mg/mL, 1%) | 0.10% | - | 700 Μ L |
| 트라이 톤 X-100 | - | 0.10% | 7 Μ L |
| PBS | 50 µ L/잘 하 | 50 µ L/잘 하 | 7000 µ L를 |
| 0.22 μ m 멤브레인을 통해 필터링 하 고 신선한 관으로 여과 액의 5880 µ L를 전송 | |||
| Coelenterazine (2 mM) | 40 Μ M | 40 Μ M | 120 Μ L |
| 전체 용량: 6000 µ L | |||
표 5: luciferase 판독에 대 한 2 x coelenterazine 시 약의 구성 요소. 용균성 비 및 용균성 시 약이 되므로 별도로 평가 하 조절된 매체 transfected 세포 분석은 각 잘 필요 합니다. 시 약은 혼합 하 고는 coelenterazine의 추가 사전 필터링. Coelenterazine 추가 후 사용을 위한 준비까지 시 빛 으로부터 보호 합니다.
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Discussion
위에서 설명한 실험 절차 단일 매출 protease PCSK9의 본질적으로 저조를 극복 하 고 강력한 방식으로 분해 기능을 평가 하는 방법을 제시. 분석 결과의 주요 개념 효소 증폭된 판독 단일 매출 이벤트 변환에 의존 합니다. 분석 결과의 강점 등는 상대적으로 짧은 시간 프레임 luciferase 기자는 확장성 높은 처리량 접근의 사용의 용이성. 또한, 분석 결과 네이티브, 셀룰러 맥락에서 베이스를 평가합니다. 또한,이 분석 결과와 임상적으로 확인 된 Snp 평가할 수 있다 어떤 인간이 나 환자 조직;에 대 한 필요 없이 PCSK9 베이스에 그들의 효과 대 한 관심사의 유전자 형의 기술만 필요 하다.
분석 결과의 몇 가지 기술적인 제한이 존재 한다. 분석 결과 평가 셀 내에 베이스, 비록 벡터의 overexpression을 또한 필요 합니다. 분석 결과 HEK293T 셀 라인의 과도 transfection를 해야 하므로 transfection 효율 내장 잘-투-잘 다양성을 추가 합니다. 효소-죽은 S386A PCSK9 베이스에 대 한 부정적인 제어 역할을, 하는 동안 그것은 또한 역할 transfection 자체에 대 한 긍정적인 통제 이후 이러한 셀 생산 기능, 침 갇혀, luciferase 이기는 하지만. Transfection 효율에 심한 변형을 그 셀을 식별 하는 데 도움이 휴대 전화 번호판의 원시 데이터를 평가 및 이러한 데이터가 삭제 될 수 있습니다 (그리고 경우 반복 실험 원하는). 또한, 총 luciferase에서 luciferase 분 비의 비율에 대 한 데이터 처리 플라스 미드 배달에 transcriptional 출력 작은 변화에 대 한 조정 하는 데 도움이 생산. 같은 유사 마찬가지로 세포와 조절된 매체의 luciferase 출력에 영향을 미칠 예상 또한,이 분석 결과 대 한 사용 하는 벡터는 성공에 대 한 요구를 무시 하는 수단으로 고용 되어 상용 Flp-In T-렉스 293 라인으로 유도할 수 있는, isogenic 안정 세포 선의 형성에 의무가 지질 중재 transfection입니다. 이 PCSK9 베이스 억제제에 대 한 작은 분자 검열에 분석 결과 적용할 때 매력적인 기능을 있을 것입니다. 날짜 하려면, 같은 저 해제 확인 되었습니다,이 분석 결과의 중요성을 더욱 강조.
PCSK9 효소 공학 또한 여러 생물 학적 한계를 만듭니다. 첫째, 분석 결과 WT PCSK9 발생 intramolecular 베이스 보다는 오히려 intermolecular PCSK9 베이스를 측정 합니다. 이러한 두 활동은 일반적으로 연결 하는 동안 그것은 모든 생물 학적 상황에 존재 하는 이러한 상관 관계 되 고, 따라서, 일부 상황에서 cis에서 PCSK9 분열에 이러한 효과의 검증 분석 결과, 가능성이 대안 방법 immunoblot, 같은 필요할 수 있습니다. 또한, 분석 결과 수만 평가 missense Snp (비 코딩 유사의 효과 아닙니다). 마지막으로, 비록 PCSK9 베이스 PCSK9 분 비의 속도-제한 단계 이며 PCSK9 베이스의 감소 (에 관하여 임상 콜레스테롤 phenotype) 기능 손실 PCSK9 variant를 일으킬 것으로 예상 된다, 이것은 사실이 아니다 나타내는 모든 Snp에 대 한 적어도 일부 돌연변이 대 한 추가 생물학은 플레이8에.
이 분석 결과의 유틸리티는 본질적으로 저 출력 효소의 분해 기능을 평가 하는 능력에 있다. 이러한 디자인 개념에서 유사한도 전에 고통 받는 PCSK9 이외의 프로 테아 제 번역 한다. 이 수정을 수행 하려면 그것이 절단, luciferase 분 비 사이의 연결을 유지 하기 위해 필요 합니다. 기판 한 전략 내가 막 앵커는 유형으로 대체 통해 luciferase에 연결 된 분열 시퀀스의 효소에이 요구 사항을 만족 해야 합니다.
요약 하자면,이 프로토콜 높은 처리량 패션에서 PCSK9 베이스를 평가 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 작은 분자 PCSK9 억제제의 심사에 대 한 뿐만 아니라 PCSK9 베이스에 임상 Snp의 효과 평가 하기 위한 모두 유용할 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 감사 NHLBI/NIH (K08 HL124068 및 LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF 임상 및 변환 과학 연구소 촉매 프로그램 (UL1 TR000004), UCSF 학술 상원 헬 맨 재단에서 관대 한 자금 지원을 한 길 르 앗 과학 연구 학술 상, (모두 존 S. Chorba) 화는 심장 혈관 상 고 (Adri M. Galvan Kevan M. Shokat)를 하 워드 휴즈 의학 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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