Summary
Den præsenterede metode kombinerer den kvantitative analyse af DNA dobbelt-streng pauser (DSBs), celle cyklus distribution og apoptose at muliggøre celle cyklus-specifik evaluering af DSB induktion og reparation samt konsekvenserne af reparation fiasko.
Abstract
Den præsenterede metode eller let modificerede versioner er blevet udtænkt for at studere specifikke behandling svar og bivirkninger af forskellige anti-cancer behandlinger som anvendes i klinisk onkologi. Det muliggør en kvantitativ og langsgående analyse af DNA-skade respons efter genotoksisk stress, som induceret af strålebehandling og et væld af anti-cancer-lægemidler. Metoden dækker alle stadier af DNA-skade respons, der giver endepunkter for induktion og reparation af DNA dobbelt-streng pauser (DSBs), celle cyklus anholdelse og celledød ved apoptose i tilfælde af reparation fiasko. Kombinationen af disse målinger giver oplysninger om celle cyklus afhængige behandlingseffekter og giver således mulighed for en dybtgående undersøgelse af samspillet mellem cellulær spredning og håndterings mekanismer mod DNA-skader. Da virkningen af mange kræft terapeutiske stoffer, herunder kemoterapeutika og ioniserende stråling, er begrænset til eller stærkt varierende i henhold til specifikke celle cyklus faser, er de korrelative analyser baseret på en robust og gennemførlig metode til at vurdere behandlingseffekterne på DNA i en celle cyklus-specifik måde. Dette er ikke muligt med enkeltpunkts-assays og en vigtig fordel ved den præsenterede metode. Metoden er ikke begrænset til en bestemt cellelinje og er blevet grundigt testet i et væld af tumor og normale vævs cellelinjer. Det kan anvendes bredt som en omfattende genotoksicitet analyse på mange områder af onkologi foruden radio-onkologi, herunder miljø risikofaktor vurdering, Drug screening og evaluering af genetisk ustabilitet i tumorceller.
Introduction
Målet med onkologi er at dræbe eller at inaktivere kræftceller uden at skade normale celler. Mange terapier enten direkte eller indirekte inducere genotoksisk stress i kræftceller, men også til nogle udvide i normale celler. Kemoterapi eller målrettede lægemidler kombineres ofte med strålebehandling for at øge radio følsomheden af den bestrålede tumor1,2,3,4,5, hvilket giver mulighed for en reduktion af strålingsdosis for at minimere den normale vævsskade.
Ioniserende stråling og andre genotoksiske agenser fremkalder forskellige former for DNA-skade, herunder base modifikationer, streng deres og enkelt-eller dobbelt-streng pauser. DNA dobbelt-streng pauser (DSBs) er de mest alvorlige DNA-læsioner og deres induktion er nøglen til celle drab effekt af ioniserende stråling og forskellige cytostatiske lægemidler i radioterapi. DSBs ikke kun skade integriteten af genomet, men også fremme dannelsen af mutationer6,7. Derfor, forskellige DSB reparations veje, og mekanismer til at eliminere uopretteligt beskadigede celler som apoptose har udviklet sig under Evolution. Hele DNA-skade respons (DDR) reguleres af et komplekst netværk af signalerings veje, der rækker fra DNA-skade genkendelse og celle cyklus anholdelse for at muliggøre DNA-reparation, programmeret celledød eller inaktivering i tilfælde af reparations fejl8.
Den præsenterede flow cytometriske metode er blevet udviklet for at undersøge DDR efter genotoksisk stress i en omfattende analyse, der dækker DSB induktion og reparation, samt følgerne af reparations svigt. Den kombinerer målingen af den almindeligt anvendte DSB-markør γH2AX med analyse af cellecyklussen og induktion af apoptose ved hjælp af klassisk subG1 analyse og mere specifik evaluering af caspase-3-aktivering.
Kombinationen af disse endepunkter i en analyse reducerer ikke kun tid, arbejdskraft og omkostnings udgifter, men muliggør også celle cyklus specifik måling af DSB-induktion og-reparation samt caspase-3-aktivering. Sådanne analyser ville ikke være mulige med selvstændigt udførte assays, men de er yderst relevante for en omfattende forståelse af DNA-skade reaktionen efter genotoksisk stress. Mange anti-cancer medicin, såsom cytostatika, er rettet mod opdeling celler og deres effektivitet er stærkt afhængig af celle cyklus fase. Tilgængeligheden af forskellige DSB reparationsprocesser er også afhængig af celle cyklus fase og pathway valg, som er afgørende for reparation nøjagtighed, og til gengæld bestemmer skæbnen for cellen9,10,11, 12. Desuden er celle cyklus specifik måling af DSB-niveauerne mere nøjagtig end den samlede analyse, fordi DSB-niveauerne ikke kun afhænger af dosen af en genotoksisk forbindelse eller stråling, men også af cellens DNA-indhold.
Metoden er blevet anvendt til at sammenligne effekten af forskellige stråleterapeutiske midler til at overvinde resistensmekanismer i glioblastoma13 og til at dissekere samspillet mellem ioniserende stråling og målrettede læge stoffer i osteosarkom14,15 og atypiske teratoide karcinom Cancer16. Desuden, den beskrevne metode er blevet meget anvendt til at analysere bivirkninger af radio-og kemoterapi på mesenchymal stamceller17,18,19,20,21, 22,23,24, som er afgørende for reparation af behandling-induceret normal vævsskade og har en potentiel anvendelse i regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
-
Forbered ≥ 1 x 105 celler/prøve i enhver type kultur fartøj som udgangsmateriale.
- For eksempel gennemføre et tidsforløb eksperiment efter eksponering af U87 glioblastoma celler til ioniserende stråling: Irradiate sub-confluent U87 celler i T25 kolber i triplicater for hvert tidspunkt. Vælg tidlige tidspunkter (15 min. op til 8 timer efter bestråling) for at følge DSB-reparatens kinetik (γH2AX-niveau) og sene tidspunkter (24 timer op til 96 h) for at vurdere de resterende DSB-niveauer, celle cyklus effekter og apoptose.
Bemærk: Protokollen er ikke begrænset til bestrålingsforsøg eller nogen specifik cellelinje. Det er blevet testet med talrige cellelinjer af alle typer, fra forskellige arter og til forskellige behandlingsforhold.
- For eksempel gennemføre et tidsforløb eksperiment efter eksponering af U87 glioblastoma celler til ioniserende stråling: Irradiate sub-confluent U87 celler i T25 kolber i triplicater for hvert tidspunkt. Vælg tidlige tidspunkter (15 min. op til 8 timer efter bestråling) for at følge DSB-reparatens kinetik (γH2AX-niveau) og sene tidspunkter (24 timer op til 96 h) for at vurdere de resterende DSB-niveauer, celle cyklus effekter og apoptose.
-
Forbered følgende løsninger, herunder 10% overskydende volumen.
- 2 mL pr. prøve fikserings opløsning, sammensat af 4,5% PARAFORMALDEHYD (PFA), klargjort i fosfat-bufferet saltvand (PBS). Forbered opløsningen frisk. PFA fortyndes i PBS ved opvarmning til 80 °C med langsom omrøring under røghætten. Dæk kolben med aluminiumsfolie for at forhindre varmetab. Lad opløsningen køle af til stuetemperatur og justere den endelige lydstyrke. Passere opløsningen gennem et foldet cellulose filter, grade 3hw (Se tabellen over materialer).
Forsigtig: PFA dampe er giftige. Udfør dette trin under en Røghætte, og kassér PFA-affaldet korrekt. - Forbered 3 mL pr. prøve af permeabiliserings opløsning sammensat af 70% ethanol i iskold H2O. opbevares ved-20 °c.
- 7 mL pr. prøve vaskeopløsning, sammensat af 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS, forberedes.
- Forbered 100 μL pr. prøve på 3% BSA i PBS som antistoffortynd.
- Forbered 100-250 μL pr. prøve af DNA-farvningsopløsning sammensat af 1 μg/mL 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) i PBS.
- 2 mL pr. prøve fikserings opløsning, sammensat af 4,5% PARAFORMALDEHYD (PFA), klargjort i fosfat-bufferet saltvand (PBS). Forbered opløsningen frisk. PFA fortyndes i PBS ved opvarmning til 80 °C med langsom omrøring under røghætten. Dæk kolben med aluminiumsfolie for at forhindre varmetab. Lad opløsningen køle af til stuetemperatur og justere den endelige lydstyrke. Passere opløsningen gennem et foldet cellulose filter, grade 3hw (Se tabellen over materialer).
- Centrifugen indstilles til 15 mL rør til 5 min ved 200 x g og 7 °c. Lad centrifugen køle ned, og brug disse indstillinger til alle Centrifugerings trin.
2. indsamling af prøver
-
Hvis behandling af vedede celler (f. eks. U87 glioblastoma-celler dyrket i T25-kolber med 5 mL Dulbecco's modificerede ørne medium suppleret med 10% føtal kvægserum ved 37 °C og 5% kuldioxid atmosfære), fortsættes med trin 2.1.1. og 2.1.2. For suspension celler gå direkte til trin 2.1.2.
- Saml mediet i et Centrifugerings slange. Cellerne fjernes ved hjælp af en rutine celle dyrkningsmetode, som kan omfatte brug af trypsin, ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) eller andre midler til løsrivelse af celler.
- For U87 celler, prewarm PBS og trypsin/EDTA (Se tabellen over materialer) til 37 °c, vaskes cellelag med 1 ml PBS, inkuberes cellerne i 1-2 min med 1 ml trypsin/EDTA og støtter cellernes løsrivelse ved at tappe på kolben. Saml alle Vaskeopløsningen og cellesuspensionen i røret med mediet.
- Cellerne centrifugeres, kasseres mediet og resuspenderes cellerne i 1 mL PBS.
- Saml mediet i et Centrifugerings slange. Cellerne fjernes ved hjælp af en rutine celle dyrkningsmetode, som kan omfatte brug af trypsin, ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) eller andre midler til løsrivelse af celler.
- Pipet cellerne op og ned flere gange for at sikre en enkelt cellesuspension og overføre cellesuspensionen til et rør med 2 mL fikserings opløsning (4,5% PFA/PBS, 3% endelig koncentration).
Forsigtig: PFA dampe er giftige. Udfør dette trin under en Røghætte, og kassér PFA-affaldet korrekt. - Cellerne inkubates i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuger cellerne og kassér supernatanten ved decantation.
- Løsn celle pellet ved at tappe på røret og resuspendere cellerne i 3 mL 70% ethanol. Fortsæt direkte med næste trin, eller Opbevar prøverne ved 4 °C i op til flere uger.
3. vask og farvning
- Centrifuger cellerne og kassér supernatanten ved decantation.
- Løsn celle pellet ved at tappe på røret. Cellerne opslæmmes i 3 mL vaskeopløsning (0,5% BSA/PBS), centrifugeres og kasseres supernatanten.
- Gentag vaske trin 1x med 3 mL, og derefter 1x med 1 mL vaskeopløsning. I det sidste trin, kassér supernatanten forsigtigt ved pipettering. Pas på ikke at aspirere pellet.
- Antistofferne fortyndes mod γH2AX, phospho-Histon H3 (Ser10) og caspase-3 (Se tabellen over materialer) i 100 μl/prøve med antistof fortyndingsmiddel (3% BSA/PBS).
- Celle pellet løsnes ved at tappe på røret og resuspendere cellerne i 100 μL af antistof opløsningen, tilberedt i trin 3,4. Hold prøverne i mørke fra dette trin fremad.
- Prøverne inkubates i 1 time ved stuetemperatur.
- Centrifuger cellerne og kassér supernatanten forsigtigt ved pipettering. Pas på ikke at aspirere pellet.
-
Celle pellet løsnes ved at tappe på røret og resuspendere cellerne i 100-250 μL DNA-farvningsopløsning (1 μg/mL DAPI/PBS).
- Brug 100 μL, hvis der er 1-2 x105 celler, og øg lydstyrken for højere celle tal (250 μl for ≥ 1 x 106 celler). Fortsæt direkte med næste trin, eller Opbevar prøverne i mørke ved 4 °C i op til 2 uger.
Bemærk: For nogle celletyper optimering af DAPI-koncentrationen kan bidrage til at forbedre adskillelsen af celle cyklus faser.
- Brug 100 μL, hvis der er 1-2 x105 celler, og øg lydstyrken for højere celle tal (250 μl for ≥ 1 x 106 celler). Fortsæt direkte med næste trin, eller Opbevar prøverne i mørke ved 4 °C i op til 2 uger.
- Pipet prøverne gennem celle sien hætten af et prøveglas med en maske porestørrelse på 35 μm.
4. måling
- Placer prøverne på is, start flow flowcytometer (Se tabellen over materialer) konfigureret med en optisk opsætning i henhold til tabel 1 , og tryk på Prime -knappen. Hvis det er nødvendigt, tænde for ultraviolet laser (355 nm bølgelængde) separat og indstille strømmen til 10 mW ved hjælp af den relevante software.
- Åbn anskaffelses softwaren (Se tabel over materialer), log på, og Opret et nyt eksperiment ved at klikke på knappen nyt eksperiment på browserens værktøjslinje.
- Brug vinduet Inspector til at tilpasse navnet på eksperimentet, og vælg ' 5 log årtier ' for plot display.
- Klik på knappen nyt objekt i browserens værktøjslinje og Udvid den nye indtastning ved at klikke på ' + ' symbolet i venstre side for at vise det første rør. Vælg det respektive ikon og type for at omdøbe prøven (f. eks. celletype) og røret (eksempel-identifikator). Klik på Rørmarkøren på det første rør (pil-lignende symbol til venstre) for at slå det grøn (aktiv).
- Åbn fanen parametre i vinduet cytometer , og vælg parametrene i henhold til tabel 1. Slet alle unødvendige parametre.
Bemærk: parameternavnene kan variere afhængigt af de brugerdefinerede forudindstillinger (f. eks. Cy3 i stedet for Alexa555). Sørg for, at valget svarer til de optiske filtre og detektorer i tabel 1. Lysstierne for alle fluorophorer er helt uafhængige i denne opsætning, og der kræves ikke kompensation for spektral overlap. Det kan dog være nødvendigt, hvis der bruges en anden optisk opsætning. - Åbn vinduet regneark , og Opret plots i henhold til figur 1. Tegn 2 prikker og 4 histogrammer ved hjælp af de tilsvarende værktøjslinjeknapper, og klik på akseetiketterne for at vælge de relevante parametre (front scatter (FSC-A) versus side scatter (SSC-A), DAPI-W versus DAPI-A og et histogram for DAPI-A og hvert antistof-koblet fluoroforet.
- Fastgør en kontrolprøve til flowcytometer, og tryk på knappen Run på instrumentet. Vælg den første tube i browser vinduet af softwaren og klik på knappen Hent data i erhvervelse Dashboard. Juster prøvevolumen ved hjælp af knapperne lav, mellem eller høj og finjusterings hjulet på instrumentet. Helst arbejde ved lav indstilling, men forsøge at erhverve mindst 100 begivenheder/sekund (Se erhvervelse Dashboard).
- Juster detektorens spændinger for FSC, SSC og DAPI under fanen parametre i vinduet Inspector ved hjælp af prik-plottet i figur 1 som retningslinje. Skift til logaritmisk skala for FSC-og SSC-parametrene, hvis celle populationen vises for spredt på en lineær skala.
- Tryk på standby-knappen på flowcytometer, og Fortsæt med opsætningen af regnearket i softwaren.
- Brug polygon Gate -værktøjet til at definere cellerne i FSC-A versus SSC-a-plottet og rektangel Gate -værktøjet til at definere Singlecells -populationen i Dapi-W versus dapi-a-plottet. Tryk på CTRL + G nøgler for at vise befolknings hierarkiet og klik på standard Gate navnene for at omdøbe dem.
- Derefter højreklikke på alle histogrammer og vælge Vis populationer | SingleCells fra genvejsmenuen.
- Optimer detektoren spændinger for de antistof-koblede fluorophorer til at dække det fulde dynamikområde ved efterfølgende at erhverve kontrol og behandlede prøver. Maksimer signal-til-støj-forholdet, og undgå detektor mætning. Sørg for, at Alexa488-toppen i Singlecells -populationen hverken er afkortet i kontrolelementet eller den behandlede prøve.
- Tryk på standby-knappen på flowcytometer, og Udfør eventuelt trin 4.11.1-4.11.3 i regnearksvinduet i softwaren for at få et groft estimat af behandlingseffekterne under prøve anskaffelsen.
- Vælg Singlecells i populations hierarkiet , og brug rektangel Gate -værktøjet til at definere G1-populationen i dapi-W versus dapi-A-plottet. Højreklik på Alexa488 Histogram og vælg Vis populationer | G1 fra kontekstmenuen.
- Højreklik på Alexa488 histogram, og vælg Opret statistik visning i genvejsmenuen. Højreklik på statistik visningen , og vælg Rediger statistik visning. Gå til fanen statistik , og Aktivér afkrydsningsfeltet for medianen af Alexa488-signalet i G1-populationen (Deaktiver alle andre indstillinger).
- Vælg Singlecells i populations hierarkiet , og brug værktøjet interval Gate til at definere subG1- , M -og Casp3 + -Populationerne i Dapi-a, Alexa555-a (Cy3-a i figur 1), og Alexa647-en histogrammer.
- Tryk på knappen Run på flowcytometer og måle prøverne ved hjælp af erhvervelse Dashboard i softwaren. Indstil stop porten til alle hændelser eller cellens port (hvis der er mange små partikler) og antallet af hændelser, der skal optages til 10.000.
- Klik på næste tube for at oprette en ny prøve, omdøbe den i browser vinduet, skal du klikke på Hent data for at starte indsamlingen og registrere data for at starte optagelsen.
- Vælg fil | Eksport | Eksperimenter fra menulinjen, og vælg mappe eksport i dialogboksen for at gemme dataene som '. FCS '-filer. Du kan vælge at gemme eksperimentet som en ekstra zip-fil , hvis du vil aktivere genimport af eksperimentet på et senere tidspunkt.
Bemærk: Opsætningen af eksisterende eksperimenter kan nemt genbruges med Edit | Dupliker uden data.
5. evaluering af data
- Træk og slip '. FCS '-filerne i eksempel browseren på flowcytometric Analysis-softwaren (se tabel over materialer). Anvend den gating-strategi, der er vist i figur 2. Sørg for, at portene passer til den tilsvarende population i alle prøverne, før du fortsætter med den næste datter port.
- Hvis du vil anvende ændringer på alle eksempler, skal du vælge den ændrede port i eksempel browseren, kopiere den ved at trykke på CTRL + C, vælge den overordnede port, trykke på CTRL + SKIFT + E for at vælge de tilsvarende noder i alle eksempler og trykke på CTRL + V for at indsætte eller overskrive porten. Brug ikke gruppe porte.
- Dobbeltklik på den første prøve i browseren for at åbne SSC-A vs. FSC-A plot. Brug polygon værktøjet på værktøjslinjen til at definere celle populationen (figur 2, plot 1), bortset fra snavs fra analysen. Sørg for, at porten er bred nok til det øverste højre hjørne til at rumme behandlingsrelaterede Skift, men Begræns grænsen, der vender mod det nederste venstre hjørne af plottet, for at udelukke cellen pålideligt.
- Dobbeltklik på cellernes port for at åbne et nyt plot vindue og ændre akserne til Dapi-W (lodret) vs. Dapi-a (vandret) ved at klikke på akseetiketterne. Brug rektangel værktøjet til at definere singlecells -populationen (figur 2, plot 2), undtagen celle form eller klumper fra analysen (form af G1-celler har samme dapi-intensitet som G2-og M-celler, men en betydeligt højere dapi-W værdi).
Bemærk: Varierende celletal i forskellige prøver vil medføre forskydninger i den samlede DAPI-en signalstyrke på grund af ligevægts binding af DAPI til DNA. Dette vil ikke påvirke celle cyklus analysen, men det kan være nødvendigt at justere den højre kant af enkelt celle Gate stikprøven for at aflægge regnskab for disse Skift. - Dobbeltklik på Singlecells -porten for at åbne et nyt plot vindue og ændre akserne for at vise Dapi-et histogram. Brug Bisector værktøj til at skelne enkeltceller med normalt DNA-indhold (cellcycle population) fra apoptotiske celler med forringet DNA (subG1 population). Derefter vælge de nye porte i browseren og tryk Ctrl + R at omdøbe dem i overensstemmelse hermed (figur 2, plot 3).
- Vælg Cellcycle Gate i browseren og vælg Tool | Biologi | Celle cyklus... fra menulinjen for at åbne værktøjet til modellering af celle cyklus. Vælg Dean-Jett-Fox25,26 i afsnittet model for at estimere hyppigheden af celler i G1, S og G2/M fase (figur 2, plot 4). Brug kun begrænsninger i tilfælde af dårlig modellerings ydelse (minimer den kvadratiske middel kvadratafvigelse mellem model og data).
- Opret Gates til G1 (Ellipse værktøj), S (polygon Tool) og G2 + M (Ellipse Tool) fase i Dapi-W vs. dapi-en plot af Cellcycle populationen for at muliggøre celle cyklus-specifikke γh2ax måling ( Figur 2, plot 5). Brug ikke Modelleringsværktøjet til automatisk celle cyklus-gating baseret på DAPI-A-histogrammet, da dette kan være unøjagtigt.
Bemærk: Det kan være nødvendigt at flytte portene langs DAPI-en akse stikprøve for at gøre sig til regnskab for de førnævnte forskydninger i den samlede DAPI signalstyrke. Flyt kun de tre porte som en gruppe, og Skift ikke formen på de enkelte porte for at undgå bias. - Brug Bisector værktøj til at skelne fosho-Histon H3-positive (m) og-negative (m-) celler i Alexa555-et histogram af cellcycle populationen (figur 2, plot 6). Hold CTRL nede, og vælg portene G2 + m og m-. Tryk på Ctrl + Skift + A for at oprette G2 -porten (G2 + m & m-).
- Brug Bisector værktøj til at skelne caspase-3-positive (Casp3 +) og-negative (Casp3-) celler i Alexa647-et histogram af singlecells population (figur 2, plot 7). Sæt tærsklen således, at gennemsnittet af Casp3 + befolkningen i de ubehandlede Kontroller beløber sig til ~ 0,8% for at sikre høj følsomhed og minimere assay-til-assay variationer.
- Tryk på CTRL + T for at åbne tabel editoren og konfigurere den i henhold til figur 3. Træk og slip de forskellige populationer fra eksempel browseren til tabel editoren , og dobbeltklik på rækkerne for at ændre indstillingerne for statistik, parameter og navn. Fjern de unødvendige rækker, der automatisk tilføjes efter træk og slip af celle cyklus modellerings ikonet ved at vælge rækkerne og trykke på del.
- Vælg at fil, format og destination i output -sektionen på menubåndet, og klik på Opret tabel for at eksportere dataene som '. xlsx '-fil.
- Brug tabel beregningssoftware (se tabel over materialer) til yderligere dataanalyse i henhold til supplerende fil 1 (FACS_Analysis_Template_ (1). xlsx).
- Korrigere hyppigheden af celler i de forskellige celle cyklus faser, således at deres sum beløber sig til 100% ved at anvende formlen X ' = X * 100/Σ (alle celle cyklus faser), med X ': korrigeret værdi, X: rå værdi, til hver celle cyklus fase.
Bemærk: Afvigelser fra et beløb på 100% forekommer på grund af unøjagtigheder i celle cyklus modellering, men er normalt små (< 5%). - Normaliserer median γH2AX-intensiteterne til DNA-indholdet i de forskellige celle cyklus faser ved at dividere værdierne i S-fasen med 1,5 og i G2-og M-fasen med 2,0.
- Hvis du vil beregne det kombinerede normaliserede γH2AX-niveau i hele celle populationen, skal du bruge formlen Ia = iG1 * G1 + is * s + iG2 * G2 + im * m, hvor jega, iG1, is, iG2, im er normaliseret median γH2AX intensiteter af alle, G1, S, G2, M celler henholdsvis G1, S, G2, M er korrigeret hyppigheden af celler i den respektive celle cyklus fase.
- For de normaliserede γH2AX-niveauer og hyppigheden af subG1-og caspase-3-positive celler trækkes den gennemsnitlige værdi af de ubehandlede kontrolelementer fra hver prøve.
- Beregn middelværdien og standardafvigelsen for hver parameter fra alle replikatprøver, og Afbild resultaterne i diagrammer.
- Korrigere hyppigheden af celler i de forskellige celle cyklus faser, således at deres sum beløber sig til 100% ved at anvende formlen X ' = X * 100/Σ (alle celle cyklus faser), med X ': korrigeret værdi, X: rå værdi, til hver celle cyklus fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humane U87 eller LN229 glioblastoma celler blev bestrålet med 4 Gy af foton eller Carbon ion stråling. Celle cyklus specifikke γH2AX-niveauer og apoptose blev målt på forskellige tidspunkter op til 48 h efter bestråling ved hjælp af den flowcytometriske metode, der er præsenteret her (figur 3). I begge cellelinjer inducerede carbonioner højere γH2AX peak niveauer, der faldt langsommere og forblev signifikant forhøjet ved 24 til 48 h sammenlignet med foton stråling ved samme fysiske dosis (figur 4A). Dette indikerede, at kulstof-ioner inducerede højere spids niveauer af DNA-dobbelt linjeskift (DSBs) end fotoner, der blev repareret mindre effektivt. For begge strålingstyper var γH2AX-niveauerne højest i G1-celler, sandsynligvis fordi DSB-reparation er begrænset til den vej, hvor ikke-homologe slut-slutter på dette stadie af cellecyklussen.
I overensstemmelse med den højere DSB induktions rate og langsommere reparations kinetik inducerede carbonioner en stærkere og længerevarende celle cyklus anholdelse i G2 fase (figur 3B) og en højere rate af apoptose end fotoner (figur 4C). Kulstof-ion-stråling kan derfor bidrage til at overvinde radioresistance mekanismer observeret i glioblastoma ved klassisk strålebehandling med fotoner (Se Lopez Perez, et al.1 for detaljeret drøftelse).
Resultaterne i figur 4 er eksempler på et optimalt resultat af denne metode, der viser klare forskelle mellem ubehandlede og bestrålede celler og statistisk signifikante differentiale virkninger mellem forskellige behandlinger. I tilfælde, hvor induktion af DSBs og apoptose er mindre klar, er det vigtigt at inkludere positive kontroller. Som vist her, celler fast 1 h efter foton bestråling er gode positive kontroller for γH2AX induktion. Foton stråling er også kendt for effektivt at inducere apoptose i lymfocytter, hvilket gør dem nyttige som positive kontroller for apoptose 2-4 dage efter bestråling. En anden mulighed er at bruge medicin til apoptose induktion, såsom proteasomet inhibitor MG132 eller en død receptor ligand (figur 5).
Et andet vigtigt aspekt for et optimalt resultat af analysen er kvaliteten af celle cyklus profiler. I figur 4B var G1-og G2-toppene smalle og tydeligt adskilte, hvilket gjorde det nemt at anvende celle cyklus modellering og definere portene til celle cyklus specifik måling af γh2ax. Afhængigt af celle typen og styrken af behandlingseffekten (figur 6A, B), kan opløsningen af de forskellige celle cyklus faser være betydeligt værre. I nogle tilfælde har DAPI-koncentrationen en stor indvirkning på kvaliteten af celle cyklus profilen og skal justeres (figur 6C). I tilfælde, hvor der ikke kan påvises nogen klar G1-spids på grund af behandlingen, er det ikke korrekt at anvende celle cyklus Modelleringsværktøjet. Det er tilrådeligt derefter kun at bruge manuel gating i DAPI-A versus DAPI-W plot baseret på kontrol med en veldefineret celle cyklus profil, som beskrevet i protokollen.
Analysen af en celle cyklus profil uden en klar G1 peak kan være yderligere kompliceret, hvis behandlingen fører til lave cellenumre, der resulterer i store forskydninger i den samlede DAPI signalstyrke. I denne situation kan det være svært at bedømme, hvis et højdepunkt er G1 eller G2 Peak. For at undgå dette problem kan cellerne tælles med et Neubauer kammer eller på anden måde efter det sidste vaske trin (trin 3,3), og celle numrene kan justeres. Peak positionerne i de behandlede celler vil derefter matche med kontrollerne.
Figur 1 : Opsætning af regneark til prøve anskaffelse. Plots og porte til signal visning i regnearksvinduet i flowcytometer-softwaren (Se tabellen over materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Gating strategi for dataevaluering. Populations træ og diagrammer, der viser, hvordan portene er indstillet til at definere de forskellige delpopulationer i flowcytometrisk Analysis-softwaren. DJF refererer til cellen cyklus modellering værktøj ved hjælp af Dean-Jett-Fox metode25,26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Eksporttabel for RAW-data. Opsætning af ' table Editor ' til RAW-dataeksport i flowcytometric Analysis-softwaren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : DNA-skade respons af humane U87 og LN229 glioblastoma celler efter bestråling med 4 Gy af photon versus Carbon ion stråling. A) DSB-induktion og-reparation målt ved γH2AX-niveauer. Den mediane fluorescens intensitet blev normaliseret til det relative DNA-indhold i hver celle cyklus fase (G1 = 1,0, S = 1,5, G2 = 2,0), og kontrolniveauerne blev fratrukket. Symboler indikerer middel-og fejllinjer indikerer SD-værdier. Faste linjer repræsenterer passer i henhold til funktionen I (t) = (P1 * t ² + P2 * t)/(t ² + Q1 * t + Q2) | t ≥ 0, P1 < 0, P1, Q1, Q2 > 0. B) celle cyklussens fordeling (gennemsnit og SD) og repræsentative histogrammer af DNA-indholds mærket dapi ved 24 timer efter bestråling med foton eller Carbon ion. C) induktion af apoptose, målt ved caspase-3 og subG1 positive celler (middelværdi og SD). * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001 (tosidet Student's t test). Dette tal er blevet ændret fra Lopez, et al.1 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Lægemiddel medieret apoptose-induktion i U87 glioblastoma-celler. U87 celler blev behandlet med 5 ng/mL af en modificeret TNF-relateret apoptose-inducerende ligand (Se tabel over materialer) plus 2,5 μM MG132 for 20 timer før fiksering for at validere apoptose måling ved aktiv caspase-3 og subG1 analyse. A) histogrammet for caspase-3-signalet fra behandlede versus ubehandlede celler. B) dapi-histogram over behandlede celler med en subG1 population, der indikerer DNA-nedbrydning. Histogrammet af caspase-3-positive hændelser er overlagt i rødt, hvilket viser, at de fleste af de apoptotiske celler endnu ikke havde forringet deres DNA på dette tidspunkt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Faktorer, som påvirker kvaliteten af celle cyklus profiler. For barske behandlinger komplicere celle cyklus analyse. (A) ingen G1 peak er detekterbar 48 h efter behandling af LLC celler (Lewis Lung carcinoma) med 20 Gy af foton stråling eller (B) 96 h efter behandling af HS68 fibroblaster med 100 MJ af UV-stråling. C) dapi-koncentration i forskellige cellelinjer: i HS68 fibroblaster (øvre panel) var G2/M Peak (Se pilene) lige så godt adskilt fra G1 peak for dapi koncentrationer mellem 0,01 og 1,0 μg/ml. I modsætning hertil resulterede DAPI-koncentrationer under 0,75 μg/mL i dårlig adskillelse og form definition af G2/M Peak (Se pilene) i MRC-5 fibroblaster (lavere panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: konfiguration af typisk flow-flowcytometer. λ = bølgelængde af excitation laser, U = detektor spænding, log = logaritmisk skala (ellers lineær),-A = signal område,-H = maksimal signal højde,-W = signal bredde (varighed), FSC = front scatter, SSC = side scatter. Optisk filterspecifikationer er givet som central bølgelængde/båndbredde i nanometer. Indstillingerne kan variere for forskellige flow-cytometre, og detektor spændinger skal justeres for forskellige cellelinjer.
Supplerende figur 1: mikroskopiske billeder af γH2AX Foci. U87 celler blev bestrålet med forskellige doser af foton stråling, fast og farvet efter 30 min i henhold til den præsenterede protokol og forberedt til mikroskopi som beskrevet i diskussionen. Ved 2 Gy, individuelle Foci kunne let skelnes, mens ved 8 Gy Foci optælling var forudindtaget på grund af betydelige overlap. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den featured metode er nem at bruge og tilbyder en hurtig, præcis og reproducerbar måling af DNA-skade respons herunder dobbelt-streng break (DSB) induktion og reparation, celle cyklus effekter og apoptotiske celledød. Kombinationen af disse endepunkter giver et mere fuldstændigt billede af deres indbyrdes relationer end individuelle analyser. Metoden kan anvendes bredt som en omfattende genotoksicitets analyse inden for strålings biologi, terapi og beskyttelse og mere generelt i onkologi (f. eks. til vurdering af miljørisikofaktorer, screening af lægemidler og evaluering af genetisk ustabilitet i tumorceller).
Det mest kritiske trin i denne protokol er fiksering af cellerne. For at opnå en ren prøve med en klart defineret cellepopulation og optimal opløsning af forskellige celle cyklus faser er det vigtigt at give vedlagte celler tilstrækkelig tid til at løsne sig fra kultur beholderen og danne en helt rund form. Cellerne skal overføres til fikserings opløsningen som en enkelt cellesuspension uden celle klumper. For at adskille dem, skal cellerne pipetteres op og ned eller passeret gennem en fin nål flere gange i svære tilfælde. Fikserings tiden skal holdes konstant mellem alle prøver og bør ikke overstige 20 min inklusive tid til centrifugering før opblanding af cellerne i 70% ethanol. Langvarig fiksering vil føre til tab af tilgængelige epitoper for antistof binding og vil mindske signalstyrken og følsomheden af metoden.
Den vigtigste begrænsning af teknikken er, at den ikke giver oplysninger om kvaliteten af γH2AX Foci ud over intensiteten i hele kernen. Særligt store γh2ax Foci samt forekomsten af en pan-nuklear γh2ax farvning er blevet knyttet til grupperet DSBs1,27,28,29, som er meget komplekse læsioner, der er meget vanskelige at reparere30. Sådanne klynge læsioner synes at være karakteristiske for partikel stråling såsom klinisk anvendt kulstof ionstråling og kan være årsagen til den overlegne biologiske effektivitet af tung ionstråling sammenlignet med fotoner31,32 ,33. Analyse af γH2AX Foci størrelse kan derfor være af interesse som en indikator for skaden kompleksitet. Selv om det er muligt at bruge denne protokol med et billede Stream flowcytometer til at visualisere γH2AX Foci, kan den opnåelige opløsning ikke konkurrere med en klassisk mikroskopisk tilgang. Vi har dog med succes forberedt mikroskopiske slides fra de resterende prøver efter flow cytometrisk måling (supplerende figur 1) og evalueret flere funktioner, herunder γH2AX Foci Count, størrelse og pan-nuklear intensitet ved hjælp af en semi-automatiseret billeddannelse og analyse system. For at forberede prøverne til mikroskopi blev 30-50 μL af de farvede celler spredt over overfladen af et 24 mm x 24 mm dækglas, lufttørret natten ved stuetemperatur i mørket og derefter indlejret med monterings medium på en glas rutsjebane.
Sammenlignet med mikroskopisk evaluering af DSB-niveauerne ved hjælp af γH2AX Foci-tælling er strømnings cytometrisk måling overlegen i gennemløb, prøvetagningsfrekvens, dynamikområde og nøjagtighed. Det dynamiske område af mikroskopisk Foci tælling er begrænset af den optiske opløsning, hvilket fører til manglende evne til at skelne overlappende Foci29,34. I praksis har vi observeret en lineær sammenhæng mellem strålingsdosis og γH2AX Foci tal under 2 Gy, og en stærk mætning effekt over 2 Gy i U87 glioblastoma celler1. I modsætning hertil øgedes intensiteten af γH2AX-signalet målt ved flowcytometri lineært med dosis for hele det testede dosisinterval (0-8 Gy).
Nøjagtigheden af mikroskopisk Foci tælling er begrænset af manglende evne til at skelne mellem forskellige celle cyklus faser uden yderligere farme35. Antallet af DSBs induceret i en celle er ikke kun afhængig af strålingsdosis, men også på DNA-indholdet, og dermed celle cyklus fase. G2 celler for eksempel har dobbelt så meget DNA som G1 celler og det gennemsnitlige antal DSBs induceret ved en bestemt stråledosis er dobbelt så høj for G2 celler sammenlignet med G1. Dette afspejles tydeligt i γH2AX-signal intensiteten af G2 versus G1-celler ved tidlige tidspunkter efter stråling målt ved flowcytometri. Det er derfor vigtigt at evaluere DSB-niveauerne på en celle cyklus specifik måde for at opnå nøjagtige resultater. En poolet analyse af celler i forskellige celle cyklus faser, som sædvanlig i mikroskopiske tilgange, kan være partisk af forskydninger i celle cyklus fordelingen især på grund af stråling-induceret G2 anholdelse. For at gøre opmærksom på denne effekt og sammenligne DSB-reparations egenskaberne mellem forskellige celle cyklus stadier kan γH2AX-niveauerne let normaliseres til DNA-indholdet i flowcytometri-metoden som angivet i protokollen.
Forlængelser af denne protokol er mulige med relativt lidt ekstra indsats. Yderligere antistoffer med kompatible fluorophores-etiketter kan inkluderes i trin 3,4, uden at der er behov for ekstra trin under prøveforberedelsen. Hvis der ønskes en mere detaljeret analyse af apoptose, kan caspase-7,-9 og-8 antistoffer inkluderes. Som en anden udvidelse, har vi for nylig inkluderet en levende og døde cellefarve stof, en troponin T antistof og tælle perler i protokollen til specifikt at analysere kardiomyocytter Co-kultiveret med fibroblaster efter bestråling. Tilføjelsen af levende/døde celle pletter og tælle perler udvider evnen af metoden til at omfatte fibroblast proliferation og ikke-apoptotisk celledød af kardiomyocytter som yderligere endepunkter, der giver nyttige yderligere oplysninger om cellen skæbne efter genotoksisk stress. Den udvidede protokol er tilgængelig efter anmodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Flowcytometry Facility team på det tyske Cancer Research Center (DKFZ) for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
