Summary
제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.
Abstract
제시된 방법 또는 약간 변형된 버전은 임상 종양학에서 사용된 것과 같이 각종 항암 처리의 특정 처리 반응 그리고 부작용을 공부하기 위하여 고안되었습니다. 방사선 요법과 다수의 항암 제에 의해 유도된 바와 같이, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응의 정량적 및 세로 분석을 가능하게 한다. 이 방법은 DNA 손상 반응의 모든 단계를 커버, DNA 이중 가닥 휴식의 유도 및 수리를위한 엔드 포인트를 제공 (DSBs), 세포 주기 체포 및 수리 실패의 경우 세포 사멸에 의한 세포 사망. 이 측정을 결합하는 것은 세포 주기 의존적인 처리 효력에 관하여 정보를 제공하고, 이렇게 DNA 손상에 대하여 세포 증식과 대처 기계장치 사이 상호 작용의 심층적인 연구를 허용합니다. 화학요법제 및 이온화 방사선을 포함한 많은 암 치료제의 효과는 특정 세포 주기 단계에 따라 제한되거나 강하게 변화하기 때문에, 상관분석은 치료 효과를 평가하기 위한 강력하고 실행 가능한 방법에 의존합니다. 세포 주기 특정 방식으로 DNA에. 이것은 단일 엔드포인트 어세이와 제시된 방법의 중요한 이점으로는 불가능합니다. 이 방법은 임의의 특정 세포주에 제한되지 않으며 다수의 종양 및 정상 조직 세포주에서 철저히 시험되었다. 종양 세포의 유전적 불안정성 평가, 약물 스크리닝 및 평가를 포함하여 방사선 종양학 외에 종양학의 많은 분야에서 포괄적인 유전독성 분석술로 널리 적용될 수 있다.
Introduction
종양학의 목표는 정상적인 세포를 손상시키지 않고 암세포를 죽이거나 비활성화하는 것입니다. 많은 치료는 직접 또는 간접적으로 암세포에서 유전자 독성 스트레스를 유도하지만, 일부는 정상 세포에서 확장됩니다. 화학요법 또는 표적 약물은 종종 방사선 요법과 결합되어 조사된종양 1, 2,3,4,5의방과민성을 향상시킵니다. 방사선 선량은 정상적인 조직 손상을 최소화합니다.
이온화 방사선 및 기타 유독성 제제는 염기 수정, 가닥 가교 및 단일 또는 이중 가닥 파손을 포함한 다양한 종류의 DNA 손상을 유발합니다. DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는 가장 심각한 DNA 병변이고 그들의 유도는 방사선과 방사선 화학요법에 있는 각종 세포 성 약의 세포 살해 효력의 열쇠입니다. DSB는 게놈의 무결성을 해칠뿐만 아니라 돌연변이 6,7의형성을촉진합니다. 따라서, 다른 DSB 수리 경로, 및 세포 사멸 과 같은 돌이킬 수없는 손상된 세포를 제거하는 메커니즘은 진화 중에 개발되었다. 전체 DNA 손상 반응(DDR)은 DNA 손상 인식 및 세포 주기 검거로부터 DNA 복구, 프로그램된 세포 사멸 또는 수리 실패시불활성화에 이르는 신호 경로의 복잡한 네트워크에 의해 조절된다 8.
제시된 유동 세포 측정 방법은 DSB 유도 및 수리뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 포함하는 하나의 포괄적 인 분석에서 유독성 스트레스 후 DDR을 조사하기 위해 개발되었습니다. 그것은 고전적인 subG1 분석 및 caspase-3 활성화의 더 구체적인 평가를 사용하여 세포 주기 및 세포 사멸의 유도의 분석과 널리 적용되는 DSB 마커 γH2AX의 측정을 결합합니다.
하나의 분석에서 이러한 엔드포인트의 조합은 시간, 인건비 및 비용 비용을 감소시킬 뿐만 아니라 Caspase-3 활성화뿐만 아니라 DSB 유도 및 수리의 세포 주기별 측정을 가능하게 합니다. 이러한 분석은 독립적으로 수행 된 분석으로는 불가능하지만, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응에 대한 포괄적 인 이해를 위해 매우 관련이 있습니다. 세포성 화합물과 같은 많은 항암제는 세포 분열에 대해 지시되며 그 효율은 세포 주기 단계에 크게 의존합니다. 상이한 DSB 수리 공정의 가용성은 또한 수리 정확도에 중요한 세포 주기 단계 및 경로 선택에 따라 달라지며, 차례로셀9,10,11의운명을 결정합니다. 12. 또한, DSB 수준은 유독성 화합물 또는 방사선의 투여량뿐만 아니라 세포의 DNA 함량에 의존하기 때문에 DSB 수준의 세포 주기별 측정은 풀화 분석보다 더 정확하다.
이 방법은 교모세포종13에서 내성 메커니즘을 극복하고 골육종14,15에서 이온화 방사선과 표적 약물 간의 상호 작용을 해부하기 위해 다른 방사선 요법의 효능을 비교하는 데 사용되었습니다. 및 비정형 테라로이드 라브도이드 암16. 또한, 기재된 방법은 중간엽 줄기세포17,18,19,20,21, 22,23,24,이는 치료 유도 정상 조직 손상의 수리에 필수적이며 재생 의학에서 잠재적 인 응용 프로그램을 갖는다.
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Protocol
1. 준비
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시작 물질로 배양 용기의 모든 유형에 ≥1 x 105 세포 / 샘플을 준비합니다.
- 예를 들어, U87 아교모세포종 세포를 이온화 방사선에 노출한 후 시간 코스 실험을 수행합니다: 각 시점마다 삼중배액으로 T25 플라스크에서 하위-Confluent U87 세포를 조사합니다. 초기 시간 포인트(조사 후 15분에서 최대 8시간)를 선택하여 DSB 수리(γH2AX 수준) 및 늦은 시간 점(24h ~ 96시간)의 역학을 따라 잔류 DSB 수준, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 평가합니다.
참고: 프로토콜은 조사 실험 또는 임의의 특정 세포주에 제한되지 않는다. 그것은 모든 종류의 수많은 세포주, 다른 종에서 그리고 다양 한 치료 조건에 대 한 테스트 되었습니다.
- 예를 들어, U87 아교모세포종 세포를 이온화 방사선에 노출한 후 시간 코스 실험을 수행합니다: 각 시점마다 삼중배액으로 T25 플라스크에서 하위-Confluent U87 세포를 조사합니다. 초기 시간 포인트(조사 후 15분에서 최대 8시간)를 선택하여 DSB 수리(γH2AX 수준) 및 늦은 시간 점(24h ~ 96시간)의 역학을 따라 잔류 DSB 수준, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 평가합니다.
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10% 초과 부피를 포함한 다음 솔루션을 준비합니다.
- 인산완식염수(PBS)에서 4.5% 파라포름알데히드(PFA)로 구성된 고정 용액 샘플당 2 mL를 준비합니다. 솔루션을 신선하게 준비합니다. 연기 후드 하에서 천천히 교반하여 80°C로 가열하여 PBS에서 PFA를 희석한다. 열 손실을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플라스크를 덮습니다. 용액을 실온으로 식히고 최종 부피를 조정하십시오. 접힌 셀룰로오스 필터, 등급 3hw를 통해 용액을 전달합니다 (재료 표참조).
주의 사항: PFA 연기는 독성이 있습니다. 이 단계를 연기 후드 아래에서 수행하고 PFA 폐기물을 적절하게 폐기하십시오. - -20°C의 얼음-차가운H2O. 스토어에서 70% 에탄올로 구성된 투과성 용액 샘플당 3 mL를 준비합니다.
- PBS에서 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 구성된 세척용액의 샘플당 7 mL를 준비한다.
- 항체 희석제로 PBS에서 3% BSA의 샘플 당 100 μL을 준비한다.
- PBS에서 1 μg/mL 4', 6-디아미딘-2-페닐린돌(DAPI)으로 구성된 DNA 염색 용액 샘플당 100-250 μL을 준비합니다.
- 인산완식염수(PBS)에서 4.5% 파라포름알데히드(PFA)로 구성된 고정 용액 샘플당 2 mL를 준비합니다. 솔루션을 신선하게 준비합니다. 연기 후드 하에서 천천히 교반하여 80°C로 가열하여 PBS에서 PFA를 희석한다. 열 손실을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플라스크를 덮습니다. 용액을 실온으로 식히고 최종 부피를 조정하십시오. 접힌 셀룰로오스 필터, 등급 3hw를 통해 용액을 전달합니다 (재료 표참조).
- 15 mL 튜브에 대한 원심 분리기를 200 x g 및 7 °C에서 5 분으로 설정합니다. 원심분리기를 식히고 모든 원심분리 단계에 이러한 설정을 사용합니다.
2. 샘플 수집
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부착 세포(예를 들어, T25 플라스크에서 자란 U87 교모세포 세포가 Dulbecco의 변형된 이글 배지 5 mL로 37°C 및 5% 이산화탄소 대기에서 10% 태아 소 혈청을 보충한 경우) 2.1.1단계를 계속합니다. 및 2.1.2. 현탁액 세포의 경우 2.1.2 단계로 직접 진행됩니다.
- 원심분리관에서 배지를 수집합니다. 일상적인 세포 배양 방법을 사용하여 세포를 분리, 이는 트립신의 사용을 포함 할 수있다, 에틸렌디아민테아세트산 (EDTA) 또는 다른 세포 분리 에이전트.
- U87 세포의 경우, 프리웜 PBS 및 트립신/EDTA(재료 표참조)를 37°C로 세척하고, 1 mL의 PBS로 세포층을 세척하고, 트립신/EDTA 1mL로 세포를 배양하고, 플라스크를 탭하여 세포 분리를 지원합니다. 배지와 함께 튜브내의 모든 세척용액 및 셀 현탁액을 수집한다.
- 세포를 원심분리하고, 배지를 폐기하고, PBS의 1 mL에서 세포를 다시 중단한다.
- 원심분리관에서 배지를 수집합니다. 일상적인 세포 배양 방법을 사용하여 세포를 분리, 이는 트립신의 사용을 포함 할 수있다, 에틸렌디아민테아세트산 (EDTA) 또는 다른 세포 분리 에이전트.
- 세포를 위아래로 여러 번 피펫하여 단일 셀 현탁액을 보장하고 2 mL의 고정 용액 (4.5 % PFA / PBS, 3 % 최종 농도)으로 튜브로 셀 현탁액을 옮니다.
주의 사항: PFA 연기는 독성이 있습니다. 이 단계를 연기 후드 아래에서 수행하고 PFA 폐기물을 적절하게 폐기하십시오. - 실온에서 세포를 10 분 동안 배양하십시오.
- 세포를 원심분리하고 장식에 의해 상한제를 버린다.
- 튜브에 눌러 세포 펠릿을 느슨하게하고 70 % 에탄올의 3 mL에서 세포를 다시 중단. 다음 단계로 직접 진행하거나 샘플을 최대 몇 주 동안 4 °C에 저장하십시오.
3. 세탁 및 염색
- 세포를 원심분리하고 장식에 의해 상한제를 버린다.
- 튜브에 눌러 세포 펠릿을 느슨하게. 3 mL의 세척 용액 (0.5 % BSA / PBS)에서 세포를 다시 일시 중단하고 원심 분리기를 제거하고 상한체를 폐기하십시오.
- 3 mL로 세탁 단계를 1x반복한 다음 1mL 세척 용액으로 1x를 반복합니다. 마지막 단계에서, 파이펫팅하여 상급을 조심스럽게 버린다. 펠릿을 흡인하지 않도록주의하십시오.
- 100 μL/샘플에서 γH2AX, 포스포스-히스톤 H3(Ser10) 및 카스파제-3에 대한 항체를 희석(3% BSA/PBS).
- 튜브에 탭하여 세포 펠릿을 느슨하게 하고 3.4 단계에서 제조된 항체 용액의 100 μL에서 세포를 다시 중단한다. 이 단계부터 샘플을 어두운 곳에서 유지하십시오.
- 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양하십시오.
- 세포를 원심 분리하고 피펫팅하여 상급체를 조심스럽게 버립니다. 펠릿을 흡인하지 않도록주의하십시오.
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튜브에 눌러 세포 펠릿을 느슨하게하고 DNA 염색 용액의 100-250 μL에서 세포를 다시 중단 (1 μg / mL DAPI / PBS).
- 1-2 x105 세포가 존재하는 경우 100 μL을 사용하고 더 높은 세포 수에 대한 부피를 증가시다 (≥1 x 106 셀의 경우 250 μL). 다음 단계로 직접 진행하거나 샘플을 최대 2주 동안 4°C에서 어두운 위치에 보관하십시오.
참고: DAPI 농도를 최적화하는 일부 세포 유형의 경우 세포 주기 단계의 분리를 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
- 1-2 x105 세포가 존재하는 경우 100 μL을 사용하고 더 높은 세포 수에 대한 부피를 증가시다 (≥1 x 106 셀의 경우 250 μL). 다음 단계로 직접 진행하거나 샘플을 최대 2주 동안 4°C에서 어두운 위치에 보관하십시오.
- 35 μm의 메쉬 기공 크기로 샘플 튜브의 셀 스트레이너 캡을 통해 샘플을 피펫.
4. 측정
- 샘플을 얼음 위에 놓고 표 1에 따라 광학 설정으로 구성된 유량 세포계(재료 표참조)를 시작하고 프라임 버튼을 누릅니다. 필요한 경우 자외선 레이저(355nm 파장)를 별도로 켜고 적절한 소프트웨어를 사용하여 10mW로 전력을 설정합니다.
- 수집 소프트웨어(재료 표참조)를 열고 브라우저 도구 모음에서 새 실험 단추를 클릭하여 로그인하고 새 실험을 만듭니다.
- 검사기 창을 사용하여 실험 이름을 사용자 지정하고 플롯 표시를 위해 '5 Log 수십년'을 선택합니다.
- 브라우저 도구 모음에서 새 표본 단추를 클릭하고 왼쪽에 있는 '+' 기호를 클릭하여 새 항목을 확장하여 첫 번째 튜브를표시합니다. 각각의 아이콘을 선택하고 표본(예: 셀 유형) 및 튜브(샘플 식별자)의 이름을 바꿀 수 있습니다. 첫 번째 튜브의 튜브 포인터(왼쪽에 있는 화살표 모양 기호)를 클릭하여 녹색(활성)으로 바뀝니다.
- 세포계 창에서 매개 변수 탭을 열고 표 1에 따라 매개 변수를 선택합니다. 불필요한 매개 변수를 모두 삭제합니다.
참고: 매개 변수 이름은 사용자 지정 사전 설정(예: Alexa555 대신 Cy3)에 따라 달라질 수 있습니다. 선택 항목이 표1의 광학 필터 및 검출기와 일치하는지 확인합니다. 모든 형광단의 광 경로는 이 설정에서 완전히 독립적이며 스펙트럼 중복의 보정은 필요하지 않습니다. 그러나 다른 광학 설정을 사용하는 경우 필요할 수 있습니다. - 워크시트 창을 열고 그림1에 따라 플롯을 작성합니다. 해당 도구 모음 버튼을 사용하여 2개의 도트 플롯과 4개의 히스토그램을 그려 적절한 매개변수(전면 산란(FSC-A) 대 측면 산란(SSC-A), DAPI-W 대 DAPI-A 및 DAPI-A 및 각 항체 결합을 위한 히스토그램을 선택합니다. 형광소.
- 제어 샘플을 세포계에 부착하고 기기의 실행 버튼을 누릅니다. 소프트웨어의 브라우저 창에서 첫 번째 튜브를 선택하고 수집 대시보드에서 데이터 수집 버튼을 클릭합니다. 낮은, 중간 또는 높은 버튼과 계측기의 미세 튜닝 휠을 사용하여 샘플 주입 볼륨을 조정합니다. 낮은 설정에서 작동하지만 초당 100개 이상의 이벤트를 획득하는 것이 좋습니다(획득 대시보드참조).
- 지침으로 그림 1의 점 플롯을 사용하여 검사기 창의 매개 변수 탭에서 FSC, SSC 및 DAPI에 대한 검출기 전압을 조정합니다. 셀 채우기가 선형 눈금으로 너무 분산된 것처럼 보이는 경우 FSC 및 SSC 매개변수에 대한 로그 축척으로 전환합니다.
- 세포계의 대기 버튼을 누르고 소프트웨어의 워크시트 설정을 계속합니다.
- 다각형 게이트 도구를 사용하여 FSC-A 대 SSC-A 플롯및 직사각형 게이트 도구의 셀 모집단을 정의하여 DAPI-W 대 DAPI-A 플롯의 SingleCells 모집단을 정의합니다. Ctrl + G 키를 눌러 모집단 계층 구조를 표시하고 기본 게이트 이름을 클릭하여 이름을 바꿉니다.
- 그 후 모든 히스토그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 인구 표시 | 컨텍스트 메뉴에서 SingleCells입니다.
- 항체 결합 형광단에 대한 검출기 전압을 최적화하여 이후에 제어 및 처리된 샘플을 획득하여 전체 동적 범위를 커버합니다. 신호 대 잡음 비를 최대화하고 검출기 채도를 방지합니다. SingleCells 채우기의 Alexa488 피크가 컨트롤이나 처리된 샘플에서 잘린 것이 없는지 확인합니다.
- 세포계의 대기 버튼을 누르고 소프트웨어의 워크시트 창에서 4.11.1-4.11.3 단계를 선택적으로 수행하여 샘플 수집 중에 치료 효과의 대략적인 추정치를 얻을 수 있습니다.
- 모집단 계층 구조에서 SingleCells을 선택하고 사각형 게이트 도구를 사용하여 DAPI-W 대 DAPI-A 플롯에서 G1 모집단을 정의합니다. Alexa488 히스토그램에서 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 채우기 표시 | 컨텍스트 메뉴에서 G1.
- Alexa488 히스토그램을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 컨텍스트 메뉴에서 통계 보기 만들기를 선택합니다. 통계 보기에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 통계 보기 편집을선택합니다. 통계 탭으로 이동하여 G1 모집단의 Alexa488 신호 중앙값에 대한 확인란을 활성화합니다(다른 모든 옵션을 비활성화).
- 모집단 계층 구조에서 SingleCells을 선택하고 간격 게이트 도구를 사용하여 DAPI-A, Alexa555-A(그림 1의 Cy3-A)에서 하위G1, M 및 Casp3+ 모집단을 정의하고 알렉사647-A 히스토그램.
- 세포계의 실행 버튼을 누르고 소프트웨어의 수집 대시보드를 사용하여 샘플을 측정합니다. 모든 이벤트 또는 셀 게이트(수많은 작은 파티클이 있는 경우)와 기록할 이벤트 수를 10,000개로 설정합니다.
- 다음 튜브를 클릭하여 새 샘플을 만들고 브라우저 창에서 이름을 바꾸고 데이터 수집을 클릭하여 수집을 시작하고 데이터를 기록하여 기록을 시작합니다.
- 파일 선택 | 수출 | 메뉴 모음에서 실험을 하고 대화 상자에서 디렉터리 내보내기를 선택하여 데이터를 '.fcs' 파일로 저장합니다. 선택적으로 나중에 실험을 다시 가져올 수 있도록 하는 경우 추가 zip 파일로 실험을 저장합니다.
참고: 기존 실험의 설정은 편집으로 쉽게 재사용할 수 있습니다 | 데이터없이 복제.
5. 데이터 평가
- '.fcs' 파일을 유동 세포 측정 분석 소프트웨어의 샘플 브라우저에 끌어 놓습니다(재료 표 참조). 그림2에 표시된 게이팅 전략을 적용합니다. 다음 딸 게이트를 진행하기 전에 게이트가 모든 샘플의 해당 모집단에 맞는지 확인하십시오.
- 모든 샘플에 변경 사항을 적용하려면 샘플 브라우저에서 변경된 게이트를 선택하고 Ctrl +C를 눌러 복사하고 상위 게이트를 선택하고 Ctrl + Shift + E를 눌러 모든 샘플에서 동등한 노드를 선택하고 Ctrl + V를 눌러 붙여 넣거나 덮어씁니다. 게이트. 그룹 게이트를 사용하지 마십시오.
- 브라우저의 첫 번째 샘플을 두 번 클릭하여 SSC-A 대 FSC-A 플롯을 엽니다. 도구 모음의 다각형 도구를 사용하여 해석에서 이물질을 제외한 셀 모집단(그림2,플롯 1)을 정의합니다. 게이트가 치료 관련 교대조를 수용할 수 있을 만큼 오른쪽 상단 모서리쪽으로 충분히 넓지 않은지 확인하지만 플롯의 왼쪽 아래 모서리를 향하는 테두리를 제한하여 셀을 안정적으로 제외합니다.
- 셀 게이트를 두 번 클릭하여 새 플롯 창을 열고 축 레이블을 클릭하여 축을 DAPI-W(세로) 대 DAPI-A(가로)로 축을 변경합니다. 사각형 도구를 사용하여 SingleCells 모집단(그림2, 플롯 2)을 정의하고 분석에서 셀 이배또는 덩어리를 제외합니다(G1 셀의 이중은 G2 및 M 셀과 동일한 DAPI-A 강도를 가지지만 DAPI-W는 상당히 높습니다. 값)을 참조하십시오.
참고: 상이한 샘플에서 다양한 세포 수는 DNA에 대한 DAPI의 평형 결합으로 인해 전체 DAPI-A 신호 강도의 변화를 야기할 것이다. 이것은 세포 주기 분석에 영향을 미치지 않습니다, 그러나 이 교대를 설명하기 위하여 견본에 의하여 단 세포 문 견본의 적당한 경계를 조정하는 것이 필요할 지도 모릅니다. - SingleCells 게이트를 두 번 클릭하여 새 플롯 창을 열고 축을 변경하여 DAPI-A 히스토그램을 표시합니다. Bisector 도구를 사용하여 정상 DNA 함량(CellCycle population)을 저하 된 DNA(subG1 인구)가있는 세포 세포세포에서 단일 세포를 구별하십시오. 그런 다음 브라우저에서 새 게이트를 선택하고 Ctrl + R을눌러 그에 따라 이름을 바꿉니다(그림 2, 플롯 3).
- 브라우저에서 셀사이클 게이트를 선택하고 도구를 선택 | 생물학 | 세포 주기... 메뉴 모음에서 셀 주기 모델링 도구를 엽니다. 모델 섹션에서 딘 제트 폭스25,26을 선택하여 G1, S 및 G2/M 상에서 셀의 빈도를 추정합니다(그림2,플롯 4). 모델링 성능이 저하된 경우에만 제약 조건을 사용합니다(모델과 데이터 간의 근평균 제곱 편차를 최소화).
- 셀사이클 모집단의 DAPI-W 대 DAPI-A 플롯에서 G1(타원 도구), S(다각형 도구) 및 G2 + M(타원 도구) 단계에 대한 게이트 생성 그림2, 플롯 5). DAPI-A 히스토그램을 기반으로 하는 자동 셀 주기 게이팅에는 모델링 도구를 사용하지 마십시오.
참고: 전체 DAPI 신호 강도의 전술한 변화를 설명하기 위해 샘플별로 DAPI-A 축 샘플을 따라 게이트를 이동해야 할 수도 있습니다. 세 개의 게이트만 그룹으로 이동하고 바이어스를 피하기 위해 개별 게이트의 모양을 변경하지 마십시오. - 세포순환 집단의 알렉사555-A 히스토그램에서 인-히스톤 H3 양성(M) 및 -음극(M-) 세포를 구별하기 위해 바이섹터 도구를 사용한다(그림 2,플롯 6). Ctrl을 잡고 게이트 G2 + M 및 M-를선택합니다. Ctrl + Shift + A를 눌러 G2(G2+M & M-) 게이트를 만듭니다.
- Bisector 도구를 사용하여 단일 셀 모집단의 Alexa647-A 히스토그램에서 카스파제 3-양성(Casp3+ +) 및 -negative(Casp3-) 셀을 구별합니다(그림2,플롯 7). 처리되지 않은 대조군에서 Casp3+ 인구의 평균이 ~0.8%에 달하는 임계값을 설정하여 높은 민감도를 보장하고 분석-분석 변형을 최소화합니다.
- Ctrl + T를 눌러 테이블 편집기를 열고 그림3에 따라 구성합니다. 샘플 브라우저에서 다른 채우기를 끌어서 테이블 편집기로 끌어놓고 행을 두 번 클릭하여 통계, 매개 변수 및 이름 설정을 변경합니다. 행을 선택하고 Del을 눌러 셀 주기 모델링 아이콘의 드래그 앤 드롭 후에 자동으로 추가되는 불필요한 행을 제거합니다.
- 파일 로선택 , 메뉴 리본의 출력 섹션에서 형식 및 대상을 선택하고 테이블 만들기를 클릭하여 데이터를 '.xlsx' 파일로 내보냅니다.
- 보충 파일 1(FACS_Analysis_Template_(1).xlsx)에 따른 추가 데이터 분석을 위해 표 계산 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용합니다.
- X'= X * 100 / Σ (모든 셀 사이클 단계)를 적용하여 각 셀 주기 단계에서 세포의 주파수를 수정합니다.
참고: 100 %의 합계에서 편차는 세포 주기 모델링의 부정확성으로 인해 발생하지만 일반적으로 작습니다 (<5%). - S상에서값을 1.5로 나누고 G2 및 M상에서 2.0으로 나누어 상이한 세포 주기 단계에서 DNA 함량에 대한 중앙값 γH2AX 강도를 정상화한다.
- 전체 세포 집단에서 결합 된 정규화 된 γH2AX 수준을 계산하려면 공식I A = IG1 * G1 + IS * S + IG2 * G2 + IM , 여기서 IA, IG1, IS, IG2, IM을 사용합니다. 모두의 중간 γH2AX 강도, G1, S, G2, M 세포각각 및 G1, S, G2, M은 각각의 세포 주기 단계에서 세포의 주파수를 보정한다.
- 정규화된 γH2AX 수준 및 subG1 및 카스파제-3 양성 세포의 주파수의 경우, 각 샘플에서 처리되지 않은 대조물의 평균 값을 뺍니다.
- 모든 복제 샘플에서 각 매개변수의 평균 및 표준 편차를 계산하고 결과를 다이어그램으로 플로팅합니다.
- X'= X * 100 / Σ (모든 셀 사이클 단계)를 적용하여 각 셀 주기 단계에서 세포의 주파수를 수정합니다.
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Representative Results
인간 U87 또는 LN229 교모세포종 세포를 광자 또는 탄소 이온 방사선의 4Gy로 조사하였다. 세포 주기 특이적 γH2AX 수준 및 세포자멸은 여기에 제시된 유세포측정 방법을 사용하여 조사 후 최대48시간까지 상이한 시점에서 측정하였다(도 3). 두 세포주에서, 탄소 이온은 더 느린 감소와 동일한 물리적 용량에서 광자 방사선에 비해 24~48시간에서 유의하게 상승된 γH2AX 피크 수준을 유도하였다(도4A). 이것은 탄소 이온이 덜 효율적으로 수리된 광자보다 DNA 이중 가닥 파손(DSB)의 피크 수치가 더 높다는 것을 나타냈습니다. 두 방사선 유형 모두에 대해, γH2AX 수준은 G1 세포에서 가장 높았는데, 아마도 DSB 수리가 세포 주기의 이 단계에서 비상동성 종단 접합의 경로로 제한되기 때문일 것이다.
더 높은 DSB 유도 속도 및 느린 수리 역학에 따라, 탄소 이온은 G2 상에서 더 강하고 오래 지속되는 세포 주기 체포를 유도 (그림3B) 광자보다 세포 자멸의 높은 속도 (그림4C). 탄소 이온 방사선은 따라서 광자를 가진 고전적인 방사선 요법에 교모세포종에서 관찰된 방사선 저항 기계장치를 극복하는 것을 도울 수 있습니다 (상세한 토론을 위한 Lopez Perez, 외 1참조).
그림 4에 나타난 결과는 치료되지 않은 세포와 조사된 세포 간의 명확한 차이와 다른 치료법 간의 통계적으로 유의한 차동 효과를 보여주는 이 방법의 최적 결과의 예입니다. DSBs와 apoptosis의 유도가 덜 명확한 경우에, 긍정적인 통제를 포함하는 것이 중요합니다. 여기서 나타낸 바와 같이, 포자 조사 후 1시간 고정된 세포는 γH2AX 유도에 대한 양수 대조군이다. 광자 방사선은 또한 효과적으로 림프구에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이는 조사 후 2-4 일 후에 세포 사멸에 대한 긍정적 인 대조군으로 유용하게 만듭니다. 또 다른 가능성은 프로테아좀 억제제 MG132 또는 사망 수용체 리간드와 같은 세포사멸유도를 위한 약물을 사용하는 것이다(도 5).
분석의 최적 결과를 위한 또 다른 중요한 양상은 세포 주기 단면도의 질입니다. 도 4B에서 G1 및 G2 피크는 좁고 명확하게 분리되어 셀 주기 모델링을 적용하고 γH2AX의 셀 주기별 측정을 위한 게이트를 정의하기 가 용이합니다. 세포 유형 및 치료 효과의 강도에 따라 (도6A,B), 상이한 세포 주기 단계의 분해능은 현저히 악화될 수 있다. 일부 경우에, DAPI 농도는 세포 주기 프로파일의 품질에 큰 영향을 미치며 조정될 필요가 있다(도6C). 처리로 인해 명확한 G1 피크를 감지할 수 없는 경우 셀 주기 모델링 도구를 정확하게 적용할 수 없습니다. 프로토콜에 설명된 대로 잘 정의된 셀 주기 프로파일을 가진 컨트롤을 기반으로 DAPI-A 대 DAPI-W 플롯에서만 수동 게이팅을 사용하는 것이 좋습니다.
명확한 G1 피크가 없는 세포 주기 프로파일의 분석은 치료가 전체 DAPI 신호 강도에서 큰 변화를 초래하는 낮은 셀 수로 이어질 경우 더욱 복잡해질 수 있다. 이 상황에서 피크가 G1 또는 G2 피크인 경우 판단하기 어려울 수 있습니다. 이러한 문제를 피하기 위해, 세포는 마지막 세척 단계(단계 3.3) 후에 Neubauer 챔버 또는 다른 수단에 의해 계수될 수 있고 세포 수를 조정할 수 있다. 처리된 셀의 피크 위치는 컨트롤과 일치합니다.
그림 1 : 샘플 수집을 위한 워크시트 설치. 유세포계 소프트웨어의 워크시트 창에 신호 표시를 위한 플롯 및 게이트(재료 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 데이터 평가를 위한 게이팅 전략. 유세포 분석 소프트웨어에서 게이트가 서로 다른 하위 집단을 정의하도록 게이트가 설정되는 방법을 보여 주면 인구 트리 및 다이어그램입니다. DJF는 딘-제트-폭스방법(25,26)을이용한 세포 주기 모델링 툴을 지칭한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 원시 데이터 내보내기 테이블. 유세포분석 소프트웨어에서 원시 데이터 내보내기를 위한 '테이블 편집기' 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 인간 U87 및 LN229 교모세포종 세포의 DNA 손상 반응4 Gy 의 광자 대 탄소 이온 방사선 조사 후. (A) γH2AX 수준으로 측정된 DSB 유도 및 수리. 중앙값 형광 세기는 각 세포 주기 단계에서 상대적인 DNA 함량(G1 = 1.0, S=1.5, G2 = 2.0)으로 정규화되었고 대조군 수준을 빼었다. 기호는 평균을 나타내고 오류 막대는 SD 값을 나타냅니다. 실선은 함수 I(t) = (p1*t² + p2*t) / (t² + q1*t + q2)에 따라 적합함을 나타냅니다 | t ≥ 0, p1 < 0, p1, q1, q2 > 0. (b) 광자 또는 탄소이온 조사 후 24시간 에서 DNA 함량 마커 DAPI의 세포 주기 분포(mean 및 SD) 및 대표적인 히스토그램. (C) 카스파제-3 및 subG1 양성 세포(평균 및 SD)에 의해 측정된 세포사멸 유도. * P < 0.05, **P < 0.01, ***P & 0.001 (양면 학생의 t 시험). 이 그림은 로페즈에서 수정되었습니다,외. 1 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : U87 아교모세포종 세포에서 약물 매개 세포사멸 유도. U87 세포는 변형된 TNF 관련 세포자멸 유도 리간드의 5 ng/mL로 처리되었고(재료 표참조) 및 20시간 동안 2.5 μM MG132를 고정하기 전에 활성 카스파제-3 및 subG1 분석에 의한 세포자멸 측정을 검증하였다. (A) 처리된 세포의 카스파제-3 신호대 치료되지 않은 세포의 히스토그램. (B) DAPI 히스토그램은 서브G1 집단을 가진 치료된 세포의, DNA 분해를 나타낸다. caspase-3 양성 사건의 히스토그램은 적색으로 중첩되어, 대부분의 세포사멸 세포가 아직 이 시점에서 DNA를 저하시키지 않았다는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 세포 주기 프로파일의 품질에 영향을 미치는 요인. 너무 가혹한 처리는 세포 주기 분석을 복잡하게 합니다. (A) G1 피크는 광자 방사선의 20 Gy또는 (B) UV 방사선의 100 mJ로 HS68 섬유아세포의 처리 후 96 시간 LLC 세포 (루이스 폐 암종)의 처리 후 48 시간 검출 할 수 있습니다. (C) 상이한 세포주에서의 DAPI 농도: HS68 섬유아세포(상부 패널)에서 G2/M 피크(화살표 참조)는 0.01 및 1.0 μg/mL 사이의 DAPI 농도에 대한 G1 피크로부터 동등하게 잘 분리되었다. 대조적으로, 0.75 μg/mL 이하의 DAPI 농도는 MRC-5 섬유아세포(하부 패널)에서 G2/M 피크(화살표 참조)의 분리 및 형상 정의가 불량한 결과를 낳았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 일반적인 유량 세포계 구성. λ = 여기 레이저의 파장, U = 검출기 전압, 로그 = 로그 = 로그 = 신호 영역, -A = 신호 영역, -H = 최대 신호 높이, -W = 신호 폭 (지속 시간), FSC = 전면 산란, SSC = 측면 산란. 광학 필터 사양은 나노미터의 중앙 파장/대역폭으로 제공됩니다. 설정은 유동 세포계마다 다를 수 있으며 검출기 전압은 세포주마다 조정되어야 합니다.
보충 그림 1: γH2AX 초점의 현미경 이미지. U87 세포는 제시된 프로토콜에 따라 30분 후에 광자 방사선의 상이한 용량으로 조사되었고, 고정식을 위해 제조하였다. 2 Gy에서 개별 초점은 쉽게 구별 될 수 있으며 8 Gy foci 카운팅은 상당한 중복으로 인해 편향되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
추천된 방법은 사용하기 쉽고 이중 가닥 브레이크(DSB) 유도 및 수리, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 포함한 DNA 손상 반응의 빠르고 정확하며 재현 가능한 측정을 제공합니다. 이러한 끝점의 조합은 개별 적인 비약적인 비고지 보다는 그들의 상호 관계의 더 완전한 그림을 제공합니다. 이 방법은 방사선 생물학, 치료 및 보호, 그리고 종양학 (예를 들어, 환경 위험 요소 평가, 약물 스크리닝 및 유전 평가)의 분야에서 포괄적 인 유전 독성 분석법으로 널리 적용 될 수 있습니다. 종양 세포의 불안정성).
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 셀의 고정입니다. 명확하게 정의된 세포 집단과 다른 세포 주기 단계의 최적 분해능을 가진 깨끗한 견본을 장악하기 위하여는, 배양 용기에서 분리하고 완전히 둥근 모양을 형성하기 위하여 부착된 세포를 충분히 시간을 주는 것이 중요합니다. 세포는 세포 덩어리없이 단일 세포 현탁액으로 고정 용액으로 옮겨져야한다. 그(것)들을 분리하기 위하여는, 세포는 어려운 케이스에 있는 정밀한 바늘을 여러 번 위아래로 피펫하거나 통과해야 합니다. 고정 시간은 모든 샘플 간에 일정하게 유지되어야 하며 70% 에탄올에서 세포를 재증탁하기 전에 원심분리 시간을 포함하여 20분이상 이어야 합니다. 장기간 고정은 항체 결합을 위한 접근 가능한 에피토프의 손실로 이끌어 내고 방법의 신호 힘 및 감도를 감소시킬 것입니다.
기술의 주요 한계는 전체 핵의 강도 이외의 γH2AX 초점의 품질에 대한 정보를 제공하지 않는다는 것입니다. 특히 큰 γH2AX 초점뿐만 아니라 범핵 γH2AX 염색의 발생은 클러스터된 DSBs1,27,28,29,매우 어려운 매우 복잡한 병변에 연결되었습니다. 30을복구합니다. 이러한 군집병변은 임상적으로 적용된 탄소이온 방사선과 같은 입자 방사선에 대한 특징적인 것으로 보이며 광자31,32에 비해 무거운 이온 방사선의 생물학적 효과가 우수한 이유일 수 있습니다. ,33. 따라서 γH2AX 초점 크기의 분석은 손상 복잡성의 지표로서 관심을 가질 수 있습니다. γH2AX 초점을 시각화하기 위해 이미지 스트림 세포계와 함께 본 프로토콜을 사용할 수 있지만 달성 가능한 해상도는 고전적인 현미경 접근법과 경쟁할 수 없습니다. 그러나 유세포측정 후 나머지 시료로부터 현미경 슬라이드를 성공적으로 제조(보충그림1) γH2AX 초점 카운트, 크기 및 범핵 강도를 포함한 여러 특징을 평가하여 반자동 이미징 및 분석 시스템. 현미경 검사를 위해 샘플을 준비하기 위해, 염색된 세포의 30-50 μL을 24 mm x 24 mm 커버 유리의 표면에 퍼진 다음, 어두운 실내 온도에서 밤새 건조한 다음 유리 슬라이드에 장착 매체로 매립하였다.
γH2AX 초점 계수에 의한 DSB 레벨의 현미경 평가와 비교하여 유량 세포측정 측정은 처리량, 샘플링 속도, 동적 범위 및 정확도에서 우수합니다. 현미경 초점 계수의 동적 범위는 광학 해상도에 의해 제한되어 중첩 된 초점29,34를구별할 수 없습니다. 실제로, 우리는 U87 교모세포종 세포에서 2 Gy 이하의 방사선 선량과 γH2AX 초점 수 와 2 Gy이상의 강한 포화 효과 사이의 선형 관계를 관찰했습니다 1. 대조적으로, 유세포측정에 의해 측정된 γH2AX 신호의 세기는 시험된 전체 투여량 범위에 대한 투여량과 함께 선형적으로 증가하였다(0-8 Gy).
현미경 초점 계수의 정확도는 추가 염색 없이 상이한 세포 주기 단계를 구별할 수 없음에 의해 제한됩니다35. 세포에서 유도된 DSBs의 수는 방사선 선량뿐만 아니라 DNA 함량, 따라서 세포 주기 단계에 의존한다. 예를 들어 G2 세포는 G1 세포보다 두 배 많은 DNA를 가지며 특정 방사선 선량에서 유도된 DSB의 평균 수는 G1에 비해 G2 세포에 비해 두 배 높다. 이는 유세포측정에 의해 측정된 방사선 후 초기 시점에서 G2 대 G1 세포의 γH2AX 신호 강도에 명확하게 반영된다. 따라서 정확한 결과를 얻으려면 세포 주기별 방식으로 DSB 수준을 평가하는 것이 중요합니다. 현미경 접근법에서 평소와 같이 다른 세포 주기 단계에서 세포의 풀화 된 분석은 특히 방사선 유발 G2 체포로 인해 세포 주기 분포의 변화에 의해 편향 될 수 있습니다. 이러한 효과를 고려하고 상이한 세포 주기 단계 간의 DSB 수리 특성을 비교하기 위해 γH2AX 수준은 프로토콜에 명시된 바와 같이 유세포분석 법에서 DNA 함량을 쉽게 정규화할 수 있다.
현재 프로토콜의 확장은 상대적으로 적은 추가 노력으로 가능합니다. 호환 형광화 표지를 가진 추가 항체는 견본 준비 도중 어떤 추가 단계를 위한 필요 없이 단계 3.4에서 포함될 수 있습니다. 사멸의 보다 상세한 분석이 요구되는 경우, 카스파제-7, -9 및 -8 항체가 포함될 수 있다. 또 다른 확장으로, 우리는 최근에 살아있는 죽은 세포 염료, troponin T 항체 및 조사 후 섬유아세포와 병용 된 심근 세포를 구체적으로 분석하기 위해 프로토콜에 비드를 계수포함했습니다. 살아있는/죽은 세포 얼룩 및 계수 구슬의 추가는 세포에 유용한 추가 정보를 제공하는 추가 종점으로 섬유아세포 증식 및 심근세포의 비세포 사멸을 포함하는 방법의 기능을 확장한다. 유독성 스트레스 후 운명. 확장 프로토콜은 요청 시 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 독일 암 연구 센터 (DKFZ)의 흐름 세포 측정 시설 팀에게 그들의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
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