Summary
Sunulan yöntem DNA çift iplikçiks breaks (DSBs), hücre döngüsü dağılımı ve apoptosis kantitatif analizi birleştirerek DSB indüksiyon ve onarım hücre döngüsü özgü değerlendirilmesi yanı sıra onarım başarısızlık sonuçları sağlar.
Abstract
Sunulan yöntem veya biraz değiştirilmiş versiyonları klinik onkolojide kullanılan çeşitli anti-kanser tedavilerinin spesifik tedavi yanıtlarını ve yan etkilerini incelemek için geliştirilmiştir. Radyoterapi ve çok sayıda anti-kanser ilacının indüklediği gibi, genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kantitatif ve uzunlamasına analizini sağlar. Yöntem DNA hasar tepkisinin tüm aşamalarını kapsamaktadır, dna çift iplikçikli sonları (DSBs), hücre döngüsü durması ve onarım apoptosis ile hücre ölümü için uç noktaları sağlar. Bu ölçümlerin birleştirilmesi hücre döngüsüne bağlı tedavi etkileri hakkında bilgi sağlar ve böylece hücresel proliferasyon ve DNA hasarına karşı başa çıkma mekanizmaları arasındaki etkileşimin derinlemesine incelenmesini sağlar. Kemoterapötik ajanlar ve iyonlaştırıcı radyasyon da dahil olmak üzere birçok kanser terapötik etkisi sınırlı dır veya güçlü belirli hücre döngüsü aşamalarına göre değişir, korelasyon analizleri tedavi etkilerini değerlendirmek için sağlam ve uygulanabilir bir yöntem güveniyor hücre döngüsüne özgü bir şekilde DNA üzerinde. Bu tek uç nokta lı denemeler ve sunulan yöntemin önemli bir avantajı ile mümkün değildir. Yöntem herhangi bir hücre hattı ile sınırlı değildir ve iyice tümör ve normal doku hücre hatları çok sayıda test edilmiştir. Çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve tümör hücrelerindeki genetik istikrarsızlığın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere radyo-onkolojinin yanı sıra onkolojinin birçok alanında kapsamlı bir genotoksisite teşbesi olarak yaygın olarak uygulanabilir.
Introduction
Onkolojinin amacı normal hücrelere zarar vermeden kanser hücrelerini öldürmek veya inaktive etmektir. Birçok tedaviler ya doğrudan ya da dolaylı olarak kanser hücrelerinde genotoksik stres neden, ama aynı zamanda bazı normal hücrelerde genişletmek. Kemoterapi veya hedefli ilaçlar genellikle radyasyonlu tümör 1 radyosensitivite artırmak için radyoterapi ile birleştirilir1,2,3,4,5, hangi bir azalma sağlar normal doku hasarı en aza indirmek için radyasyon dozu.
Iyonlaştırıcı radyasyon ve diğer genotoksik ajanlar, baz modifikasyonları, iplikçik çapraz bağlantıları ve tek veya çift iplikçikli kırılmalar da dahil olmak üzere farklı türde DNA hasarına neden olur. DNA çift iplikçiksi sonları (DSB' ler) en ciddi DNA lezyonlarıdır ve indüksiyonları radyokemoterapide iyonlaştırıcı radyasyon ve çeşitli sitostatik ilaçların hücre öldürücü etkisinin anahtarıdır. DSB'ler sadece genomun bütünlüğüne zarar vermekle kalmıyor, aynızamanda mutasyonların oluşumunu teşvik 6,7. Bu nedenle, farklı DSB onarım yolları, ve mekanizmalar apoptoz gibi onarılamaz hasarlı hücreleri ortadan kaldırmak için evrim sırasında geliştirilmiştir. Tüm DNA hasar yanıtı (DDR) DNA hasarı tanıma ve hücre döngüsü tutuklama DNA onarımı için izin vermek için ulaşmak sinyal yolları karmaşık bir ağ tarafından düzenlenir, programlanmış hücre ölümü veya inaktivasyon onarım başarısızlık durumunda8.
Sunulan akış sitometrik yöntemi, DSB indüksiyon ve onarımının yanı sıra onarım arızalarının sonuçlarını kapsayan kapsamlı bir analizde genotoksik stresten sonra DDR'yi araştırmak için geliştirilmiştir. Yaygın olarak uygulanan DSB marker γH2AX'ın ölçümü ile hücre döngüsünün analizi ve apoptozin indüksiyonu, klasik subG1 analizi ve caspase-3 aktivasyonunun daha spesifik değerlendirilmesi ile birleştirir.
Bu uç noktaların tek bir teşrindeki birleşimi sadece zaman, işçilik ve maliyet giderlerini azaltmaz, aynı zamanda hücre döngüsüne özgü DSB indüksiyon ve onarım ölçümünün yanı sıra caspase-3 aktivasyonunu da sağlar. Bu tür analizler bağımsız olarak yapılan tahlillerle mümkün değildir, ancak genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kapsamlı bir şekilde anlaşılması için son derece önemlidir. Birçok anti-kanser ilaçları, sitostatik bileşikler gibi, hücreleri bölen karşı yönlendirilir ve verimlilik güçlü hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. Farklı DSB onarım süreçlerinin durumu da hücre döngüsü aşaması ve onarım doğruluğu için kritik olan yol seçimi bağlıdır ve sırayla hücre nin kaderini belirler9,10,11, 12. Yıl. Buna ek olarak, DSB düzeylerinin hücre döngüsüne özgü ölçümü havuzlu analizden daha doğrudur, çünkü DSB düzeyleri sadece bir genotoksik bileşiğin veya radyasyonun dozuna değil, aynı zamanda hücrenin DNA içeriğine de bağlıdır.
Bu yöntem glioblastoma13 direnç mekanizmaları aşmak için farklı radyoterapilerin etkinliğini karşılaştırmak ve osteosarkom 14,15 iyonlaştırıcı radyasyon ve hedefli ilaçlar arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılmıştır ve atipik teratoid rabdoid kanserler16. Ayrıca, açıklanan yöntem yaygın olarak mezenkimal kök hücreler üzerinde radyo ve kemoterapi yan etkilerini analiz etmek için kullanılmıştır17,18,19,20,21, 22,23,24, tedavikaynaklı normal doku hasarının onarımı için gerekli olan ve rejeneratif tıpta potansiyel bir uygulama var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık
-
Başlangıç malzemesi olarak her türlü kültür kabında ≥1 x 105 hücre/örnek hazırlayın.
- Örneğin, U87 glioblastoma hücrelerinin iyonlaştırıcı radyasyona maruz kaldıktan sonra bir zaman-ders deneyi gerçekleştirin: T25 şişelerinde her zaman noktası için alt kondronlu U87 hücrelerini ışınlayın. DSB onarımının kinetiklerini (γH2AX seviyesi) ve geç zaman noktalarını (24 saat 96 saate kadar) takip etmek için kalıntılar, hücre döngüsü etkileri ve apoptozu değerlendirmek için erken zaman noktalarını (ışınlamadan sonra 8 saate kadar 15 dk) seçin.
NOT: Protokol ışınlama deneyleri veya belirli bir hücre hattı ile sınırlı değildir. Farklı türlerden ve çeşitli tedavi koşullarından her türden çok sayıda hücre hattı ile test edilmiştir.
- Örneğin, U87 glioblastoma hücrelerinin iyonlaştırıcı radyasyona maruz kaldıktan sonra bir zaman-ders deneyi gerçekleştirin: T25 şişelerinde her zaman noktası için alt kondronlu U87 hücrelerini ışınlayın. DSB onarımının kinetiklerini (γH2AX seviyesi) ve geç zaman noktalarını (24 saat 96 saate kadar) takip etmek için kalıntılar, hücre döngüsü etkileri ve apoptozu değerlendirmek için erken zaman noktalarını (ışınlamadan sonra 8 saate kadar 15 dk) seçin.
-
%10 fazla hacim de dahil olmak üzere aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- Fosfat tamponlu salinde (PBS) %4,5 paraformaldehit (PFA) oluşan fiksasyon çözeltisi numunesi başına 2 mL hazırlayın. Çözümü taze hazırlayın. Duman kaputunun altında yavaş karıştırarak 80 °C'ye ısıtarak PBS'de PFA'yı seyreltin. Isı kaybını önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile kapatın. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve son hacmi ayarlayın. Bir katlanmış selüloz filtre, grade 3hw (Malzemeler Tablosubakınız) ile çözüm geçirin.
DİkKAT: PfA dumanları zehirlidir. Bu adımı bir duman başlığı altında gerçekleştirin ve PfA atıklarını uygun şekilde atın. - -20 °C'de buz gibi H2O. Deposunda %70 etanolden oluşan permeabilizasyon çözeltisi numunesi başına 3 mL hazırlayın.
- PBS'de %0,5 büyükbaş serum albuminden (BSA) oluşan yıkama çözeltisi numunesi başına 7 mL hazırlayın.
- PBS'de %3 BSA numunesi başına 100 μL'yi antikor dilüent olarak hazırlayın.
- PBS'de 1 μg/mL 4',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) oluşan DNA boyama çözeltisi numunesi başına 100-250 μL hazırlayın.
- Fosfat tamponlu salinde (PBS) %4,5 paraformaldehit (PFA) oluşan fiksasyon çözeltisi numunesi başına 2 mL hazırlayın. Çözümü taze hazırlayın. Duman kaputunun altında yavaş karıştırarak 80 °C'ye ısıtarak PBS'de PFA'yı seyreltin. Isı kaybını önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile kapatın. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve son hacmi ayarlayın. Bir katlanmış selüloz filtre, grade 3hw (Malzemeler Tablosubakınız) ile çözüm geçirin.
- Santrifüju 15 mL tüpler için 200 x g ve 7 °C'de 5 dk'ya ayarlayın. Santrifüj soğumaya bırakın ve tüm santrifüj adımları için bu ayarları kullanın.
2. Örnek Toplama
-
Yapışık hücrelerin işlenmesi (örneğin, U87 glioblastoma hücreleri T25 şişelerinde 5 mL ile Yetiştirilen Ve Dulbecco'nun modifiye Kartal'ın 37 °C'de %10 fetal sığır serumu ve %5 karbondioksit atmosferi ile desteklenmiş sayılsa), 2.1.1 adımlarıyla devam edin. ve 2.1.2. Süspansiyon hücreleri için doğrudan adım 2.1.2 devam edin.
- Bir santrifüj tüpü nde orta toplayın. Hücreleri tripsin, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) veya diğer hücre ayırma ajanlarının kullanımını içerebilen rutin bir hücre kültürü yöntemi kullanarak ayırın.
- U87 hücreleri için, prewarm PBS ve tripsin/EDTA (Malzeme Tablosunabakınız) 37 °C'ye, hücre tabakasını 1 mL PBS ile yıkayın, hücreleri 1 mL tripsin/EDTA ile 1 mL'lik kuluçkaya yatırın ve şişeye dokunarak hücre ayrıştırmasını destekleyin. Tüm yıkama çözeltisi ve orta ile tüp hücre süspansiyon toplayın.
- Hücreleri santrifüj edin, ortayı atın ve PBS'nin 1 mL'sinde hücreleri yeniden askıya alın.
- Bir santrifüj tüpü nde orta toplayın. Hücreleri tripsin, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) veya diğer hücre ayırma ajanlarının kullanımını içerebilen rutin bir hücre kültürü yöntemi kullanarak ayırın.
- Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ve fiksasyon çözeltisi 2 mL ile bir tüp içine hücre süspansiyon transfer (4.5% PFA / PBS, 3% son konsantrasyon).
DİkKAT: PfA dumanları zehirlidir. Bu adımı bir duman başlığı altında gerçekleştirin ve PfA atıklarını uygun şekilde atın. - Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri santrifüj ve decantation tarafından supernatant atın.
- Tüpüzerine dokunarak hücre pelet gevşetin ve% 70 etanol 3 mL hücreleri yeniden askıya. Doğrudan bir sonraki adıma geçin veya numuneleri 4 °C'de birkaç haftaya kadar saklayın.
3. Yıkama ve Boyama
- Hücreleri santrifüj ve decantation tarafından supernatant atın.
- Tüpüzerine dokunarak hücre pelet gevşetin. Yıkama çözeltisi 3 mL hücreleri resuspend (0.5% BSA / PBS), santrifüj ve supernatant atın.
- Yıkama adımını 3 mL, 1 mL yıkama çözeltisi ile 1x tekrarlayın. Son adımda, pipetting tarafından dikkatle supernatant atın. Pelet aspire değil dikkat edin.
- Antikorları γH2AX, fosfo-histon H3 (Ser10) ve caspase-3 (Malzeme Tablosuna bakınız) karşı 100 μL/numunede antikor dilüentli (%3 BSA/PBS) karşı seyreltin.
- Hücre peletini tüpe dokunarak gevşetin ve 3.4 adımda hazırlanan antikor solüsyonunun 100 μL'sinde hücreleri yeniden askıya alın. Bu adımdan itibaren örnekleri karanlıkta tutun.
- Örnekleri oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri santrifüj edin ve pipetting tarafından dikkatle supernatant atın. Pelet aspire değil dikkat edin.
-
Hücre peletini tüpe dokunarak gevşetin ve 100-250 μL DNA boyama çözeltisi (1 μg/mL DAPI/PBS) ile hücreleri yeniden askıya alın.
- 1-2 x105 hücre varsa 100 μL kullanın ve daha yüksek hücre numaraları (≥1 x 106 hücre için 250 μL) için hacmi artırın. Doğrudan bir sonraki adıma geçin veya numuneleri karanlıkta 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
NOT: DAPI konsantrasyonu optimize bazı hücre türleri için hücre döngüsü aşamalarının ayrılmasını artırmak için yardımcı olabilir.
- 1-2 x105 hücre varsa 100 μL kullanın ve daha yüksek hücre numaraları (≥1 x 106 hücre için 250 μL) için hacmi artırın. Doğrudan bir sonraki adıma geçin veya numuneleri karanlıkta 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- Örnekleri, 35 μm mesh gözenek boyutuna sahip bir numune tüpünün hücre süzgeci kapağından geçirin.
4. Ölçüm
- Örnekleri buza yerleştirin, tablo 1'e göre optik kurulumla yapılandırılan akış sitometresini başlatın (Malzeme Tablosu'na bakın). Gerekirse ultraviyole lazeri (355 nm dalga boyu) ayrı ayrı açın ve uygun yazılımı kullanarak gücü 10 mW'a ayarlayın.
- Satın alma yazılımını açın (Bkz. MalzemeTablosu), oturum açın ve Tarayıcı araç çubuğundaki Yeni Deneme düğmesini tıklatarak yeni bir deneme oluşturun.
- Denemenin adını özelleştirmek için Denetçi penceresini kullanın ve çizim ekranı için '5 Günlük On Yıl' seçeneğini belirleyin.
- Tarayıcı araç çubuğundaki Yeni Örnek düğmesini tıklatın ve ilk Tüpügöstermek için sol tarafındaki '+' simgesine tıklayarak yeni girişi genişletin. Numuneyi (örn. hücre türü) ve Tüpü (örnek tanımlayıcı) yeniden adlandırmak için ilgili simgeyi ve türü seçin. Yeşile çevirmek (etkin) açmak için ilk Tüpün Tube Pointer'ını (soldaki ok benzeri sembol) tıklatın.
- Sitometre penceresindeki Parametreler sekmesini açın ve Tablo 1'e göre parametreleri seçin. Tüm gereksiz parametreleri silin.
NOT: Parametre adları özel hazır ayarlara bağlı olarak değişebilir (örneğin, Alexa555 yerine Cy3). Seçimin Tablo1'deki optik filtreler ve dedektörlerle eşleştiğinden emin olun. Tüm floroforların ışık yolları bu kurulumda tamamen bağımsızdır ve spektral örtüşme telafisi gerekli değildir; ancak, başka bir optik kurulum kullanılırsa gerekli olabilir. - Çalışma Sayfası penceresini açın ve Şekil1'e göre çizimler oluşturun. İlgili araç çubuğu düğmelerini kullanarak 2 nokta çizimi ve 4 histogram çizin ve uygun parametreleri (ön dağılım (FSC-A) karşı yan dağılım (SSC-A), DAPI-W ve DAPI-A için bir histogram ve her antikor birleştiğinde seçmek için eksen etiketlerini tıklatın florofor.
- Sitometreye bir kontrol örneği takın ve cihazın üzerindeki Çalıştır düğmesine basın. Yazılımın Tarayıcı penceresindeki ilk tüpü seçin ve Edinme Panosundaki Veri Kazan düğmesini tıklatın. Düşük, Orta veya Yüksek düğmeleri ve alet üzerindeki ince ayar tekerleğikullanarak numune enjeksiyon hacmini ayarlayın. Tercihen Düşük ayarda çalışın, ancak en az 100 etkinlik/saniye edinmeye çalışın (Bkz. EdinmePanosu).
- Şekil 1'deki nokta çizimlerini kılavuz olarak kullanarak Denetçi penceresinin Parametreler sekmesinde FSC, SSC ve DAPI için dedektör gerilimlerini ayarlayın. Hücre popülasyonu doğrusal ölçekte çok dağınık görünüyorsa FSC ve SSC parametreleri için logaritmik skalaya geçin.
- Sitometredeki Bekleme düğmesine basın ve yazılımdaki çalışma sayfası kurulumuna devam edin.
- DAPI-W ve DAPI-A çizimindeki SingleCells popülasyonunu tanımlamak için FSC-A ve SSC-A çizimindeki Hücre popülasyonu ve Dikdörtgen Kapı aracını tanımlamak için Çokgen Kapısı aracını kullanın. Nüfus Hiyerarşisini göstermek için Ctrl + G tuşlarına basın ve bunları yeniden adlandırmak için varsayılan kapı adlarını tıklatın.
- Daha sonra tüm histogramlara sağ tıklayın ve Popülasyonları Göster'i seçin | Bağlam menüsünden SingleCells.
- Daha sonra kontrol ve tedavi örnekleri elde ederek tam dinamik aralığı kapsayacak şekilde antikor birleştiği floroforlar için dedektör voltajlarını optimize edin. Sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarın ve dedektör doygunluğundan kaçının. SingleCells popülasyonundaki Alexa488 zirvesinin ne kontrolde ne de tedavi edilen örnekte kesildikdiğinden emin olun.
- Sitometredeki Bekleme düğmesine basın ve numune alımı sırasında tedavi etkilerihakkında kabaca bir tahmin elde etmek için yazılımın Çalışma Sayfası penceresinde isteğe bağlı olarak 4.11.1-4.11.3 adımlarını gerçekleştirin.
- Nüfus Hiyerarşisi'nde SingleCells'i seçin ve DAPI-W ile DAPI-A çizimindeki G1 popülasyonunu tanımlamak için Dikdörtgen Kapı aracını kullanın. Alexa488 histogram sağ tıklayın ve Nüfus göster seçin | Bağlam menüsünden G1.
- Alexa488 histogramına sağ tıklayın ve bağlam menüsünden İstatistik Görünümü Oluştur'u seçin. İstatistik Görünümü'ne sağ tıklayın ve İstatistik Görünümü'niEdit'i seçin. İstatistikler sekmesine gidin ve G1 popülasyonundaki Alexa488 sinyalinin ortancası için onay kutusunu etkinleştirin (diğer tüm seçenekleri devre dışı bırakın).
- Nüfus Hiyerarşisi'ndeki SingleCells'i seçin ve DAPI-A, Alexa555-A (Şekil 1'deki Cy3-A) alt G1 , M ve Casp3+ popülasyonlarını tanımlamak için Interval Gate aracını kullanın ve Alexa647-A histogramları.
- Sitometredeki Çalıştır düğmesine basın ve yazılımdaki Edinme Panosu'nu kullanarak örnekleri ölçün. Durdurma kapısını Tüm olaylara veya Hücreler kapısına (çok sayıda küçük parçacık varsa) ve kaydedilecek olay sayısını 10.000'e ayarlayın.
- Yeni bir örnek oluşturmak için Sonraki Tube'u tıklatın, tarayıcı penceresinde yeniden adlandırın, satınalma başlatmak için Veri Edinin'i tıklatın ve kaydetmeye başlamak için Verileri Kaydet'i tıklatın.
- Dosya Yı Seçin | İhracat | Menü çubuğundan denemeler yapın ve verileri '.fcs' dosyaları olarak kaydetmek için iletişim kutusunda Dizin Dışa Aktar'ı seçin. Denemenin daha sonraki bir noktada yeniden içe aktarılmasını sağlamak için denemeyi isteğe bağlı olarak ek bir zip dosyası olarak kaydedin.
NOT: Varolan denemelerin kurulumu Düzenle | Veri olmadançoğaltma.
5. Veri Değerlendirmesi
- '.fcs' dosyalarını akış sitometrik analiz yazılımının örnek tarayıcısına sürükleyin ve bırakın (bkz. Malzeme Tablosu). Şekil2'de gösterilen gating stratejisini uygulayın. Bir sonraki kız kapısına geçmeden önce kapıların tüm örneklerdeki ilgili popülasyona uyduğunu unutmayın.
- Tüm örneklere değişiklik uygulamak için, örnek tarayıcıda değiştirilen kapıyı seçin, Ctrl + Ctuşuna basarak kopyalayın, ana kapıyı seçin, tüm örneklerdeki eşdeğer düğümleri seçmek için Ctrl + Shift + E tuşuna basın ve yapıştırmak veya üzerine yazmak için Ctrl + V tuşuna basın kapı. Grup kapılarını kullanmayın.
- SSC-A vs. FSC-A çizimini açmak için tarayıcıdaki ilk örneğe çift tıklayın. Analizden enkaz hariç, Hücre popülasyonu (Şekil2, çizim 1) tanımlamak için araç çubuğundaki Çokgen aracını kullanın. Geçidin, tedaviyle ilgili vardiyaları karşılamak için sağ üst köşeye doğru yeterince geniş olduğundan emin olun, ancak hücreyi güvenilir bir şekilde dışlamak için çizimin sol alt köşesine bakan sınırı kısıtlayın.
- Yeni bir çizim penceresi açmak için Hücreler kapısına çift tıklayın ve eksen etiketlerini tıklatarak eksenleri DAPI-W (dikey) ile DAPI-A (yatay) olarak değiştirin. TekHücre popülasyonunu tanımlamak için Dikdörtgen aracını kullanın (Şekil2,çizim 2), hücre çiftleri veya kümeleri hariç (G1 hücrelerinin doublet'leri G2 ve M hücreleriyle aynı DAPI-A yoğunluğuna sahiptir, ancak çok daha yüksek bir DAPI-W değeri).
NOT: Farklı örneklerdeki hücre sayılarının değişmesi, DAPI'nin DNA'ya denge seli nedeniyle genel DAPI-A sinyal gücünde kaymalara neden olur. Bu, hücre döngüsü çözümlemesi etkilemez, ancak bu vardiyaları hesaba katmak için tek hücreli geçit örneğinin doğru kenarlığı örnek tarafından ayarlanması gerekebilir. - Yeni bir çizim penceresi açmak ve DAPI-A histogramını göstermek için eksenleri değiştirmek için SingleCells kapısına çift tıklayın. Normal DNA içeriğine (HücreDöngüsü popülasyonu) sahip tek hücreleri bozulmuş DNA'ya(subG1 popülasyonu) sahip apoptotik hücrelerden ayırmak için Bisector aracını kullanın. Daha sonra tarayıcıdaki yeni kapıları seçin ve ctrl + R tuşuna basın ve bunları buna göre yeniden adlandırmak için (Şekil2, çizim 3).
- Tarayıcıdaki CellCycle kapısını seçin ve Araç | Biyoloji | Hücre Döngüsü... hücre döngüsü modelleme aracını açmak için menü çubuğundan. G1, S ve G2/M fazındaki hücrelerin sıklığını tahmin etmek için Model bölümünde Dean-Jett-Fox25,26'yı seçin (Şekil2, çizim 4). Kısıtlamaları yalnızca düşük modelleme performansı durumunda kullanın (model ve veriler arasındaki Kök Ortalama Kare sapması en aza indirin).
- Hücre döngüsüne özgü γH2AX ölçümü sağlamak için DAPI-W ve DAPI-A konusu olan Hücre Döngüsü popülasyonunda G1 (Elips aracı), S (Polygon aracı) ve G2 + M (Elips aracı) fazı için kapılar oluşturun ( Şekil 2, arsa 5). Bu yanlış olabilir gibi, DAPI-A histogram dayalı otomatik hücre döngüsü gating için modelleme aracı kullanmayın.
NOT: Genel DAPI sinyal gücünde yukarıda belirtilen kaymaları hesaba katmak için kapıları niçin ÖRNEK le DAPI-A ekseni numunesi boyunca taşımak gerekebilir. Sadece bir grup olarak üç kapı hareket ve önyargı önlemek için tek tek kapıların şeklini değiştirmeyin. - Hücre Döngüsü popülasyonunun Alexa555-A histogramındaki fosfo-histon H3-pozitif(M) ve -negatif(M-)hücrelerini ayırt etmek için Bisector aracını kullanın (Şekil2, çizim 6). Ctrl tuşuna basılı tutun ve G2 + M ve M-kapılarını seçin. G2 (G2+M & M-) kapısını oluşturmak için Ctrl + Shift + A tuşuna basın.
- TekHücre popülasyonunun Alexa647-A histogramındaki caspase-3-pozitif(Casp3+) ve -negatif(Casp3-) hücrelerini ayırt etmek için Bisector aracını kullanın (Şekil 2, çizim 7). İşlenmemiş kontrollerde Casp3+ popülasyonortalamasının yüksek hassasiyeti sağlamak ve asay-to-tsay varyasyonlarını en aza indirmek için %0,8'e tekabül edecek şekilde eşiği ayarlayın.
- Tablo Düzenleyicisini açmak ve Şekil3'e göre yapılandırmak için Ctrl + T tuşuna basın. Örnek tarayıcıdaki farklı popülasyonları Tablo Düzenleyicisi'ne sürükleyin ve bırakın ve istatistik, parametre ve ad ayarlarını değiştirmek için satırları çift tıklatın. Satırları seçerek ve Deltuşuna basarak hücre döngüsü modelleme simgesinin sürüp düşmesinden sonra otomatik olarak eklenen gereksiz satırları kaldırın.
- Menü şeridinin Çıktı bölümündeki biçim ve hedef dosyayı seçinve verileri '.xlsx' dosyası olarak dışa aktarmak için Tablo Oluştur'u tıklatın.
- Ek Dosya 1'e (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx) göre daha fazla veri analizi için tablo hesaplama yazılımını (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.
- X' = X * 100 / Σ (tüm hücre döngüsü fazları) formülünü x' ile uygulayarak, farklı hücre döngüsü evrelerindeki hücrelerin frekanslarını düzeltin: düzeltilmiş değer, X: ham değer, her hücre döngüsü aşamasına.
NOT: Hücre döngüsü modellemesindeki yanlışlıklar nedeniyle %100'lük bir toplamsapmalar meydana gelir, ancak genellikle küçüktür (<%5). - S fazındaki değerleri 1,5 ve G2 ve M fazındaki değerleri 2,0'a bölerek farklı hücre döngüsü evrelerinde DNA içeriğine ortanca γH2AX yoğunluklarını normalleştirin.
- Tüm hücre popülasyonundaki kombine normalleştirilmiş γH2AX düzeyini hesaplamak için, IA = IG1 * G1 + IS * S * IG2 * G2 + IM * M, IA, IG1, IS, IG2, IM formüllerini kullanın tüm, G1, S, G2, M hücrelerinin sırasıyla median γH2AX yoğunlukları normalleştirilmiş ve G1, S, G2, M ilgili hücre döngüsü fazında hücrelerin sıklığı düzeltilir.
- Normalleştirilmiş γH2AX düzeyleri ve subG1 ve kaspas-3-pozitif hücrelerin sıklığı için, her örnekten işlenmemiş kontrollerin ortalama değerini çıkarın.
- Her parametrenin tüm çoğaltma örneklerinden ortalama ve standart sapmasını hesaplayın ve sonuçları diyagramlara dönüştürün.
- X' = X * 100 / Σ (tüm hücre döngüsü fazları) formülünü x' ile uygulayarak, farklı hücre döngüsü evrelerindeki hücrelerin frekanslarını düzeltin: düzeltilmiş değer, X: ham değer, her hücre döngüsü aşamasına.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan U87 veya LN229 glioblastoma hücreleri 4 Gy foton veya karbon iyon radyasyonu ile ışınlandı. Hücre döngüsüne özgü γH2AX düzeyleri ve apoptoz, burada sunulan akış sitometrik yöntemi kullanılarak ışınlama dan sonra 48 saate kadar farklı zaman noktalarında ölçüldü (Şekil 3). Her iki hücre hattında da karbon iyonları daha yüksek γH2AX pik seviyelerini indükler ve aynı fiziksel dozdaki foton radyasyonuna kıyasla 24 ila 48 h'de önemli ölçüde yükselmiş olarak kaldılar (Şekil4A). Bu, karbon iyonlarının daha az verimli bir şekilde onarılan fotonlardan daha yüksek dna çift iplikçik li sonları (DSBs) düzeylerine yol açtığını göstermiştir. Her iki radyasyon türü için de γH2AX düzeyleri G1 hücrelerinde en yüksek seviyedeydi, muhtemelen DSB onarımı hücre döngüsünün bu aşamasında homolog olmayan bitiş-birleştirme yolu ile sınırlı olduğundan.
Daha yüksek DSB indüksiyon hızı ve daha yavaş onarım kinetiği doğrultusunda, karbon iyonları G2 fazında daha güçlü ve daha uzun ömürlü hücre döngüsü arrestine (Şekil3B) ve fotonlara göre daha yüksek bir apoptoz oranına neden oldu (Şekil4C). Karbon iyon radyasyonu bu nedenle fotonlarla klasik radyoterapi üzerine glioblastoma gözlenen radyodirenç mekanizmaları nın üstesinden gelmek için yardımcı olabilir (ayrıntılı tartışma için Lopez Perez, ve ark.1 bakınız).
Şekil 4'te gösterilen sonuçlar, tedavi edilmeyen ve ışınlanmış hücreler arasında net farklar ve farklı tedaviler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı diferansiyel etkileri gösteren bu yöntemin optimal sonucuna örnektir. DSB ve apoptozin indüksiyonunun daha az açık olduğu durumlarda pozitif kontroller dahil etmek önemlidir. Burada gösterildiği gibi, foton ışınlama sonra 1 saat sabit hücreler γH2AX indüksiyon için iyi pozitif kontrollerdir. Foton radyasyonu da verimli lenfositlerde apoptosis neden olduğu bilinmektedir, Hangi onları apoptoz için olumlu kontroller olarak yararlı hale getirir 2-4 gün ışınlama sonra. Başka bir olasılık apoptoz indüksiyon için ilaç kullanmaktır, proteozom inhibitörü MG132 veya ölüm reseptör ligand gibi (Şekil5).
Taşkınlık optimal bir sonuç için bir diğer önemli yönü hücre döngüsü profillerinin kalitesidir. Şekil 4B'de G1 ve G2 zirveleri dar ve net bir şekilde ayrılmıştı, bu da hücre döngüsü modellemesinin uygulanmasını ve γH2AX'ın hücre döngüsüne özgü ölçümü için kapıları tanımlamayı kolaylaştırdı. Hücre tipine ve tedavi etkisinin gücüne bağlı olarak (Şekil6A,B),farklı hücre döngüsü fazlarının çözünürlüğü önemli ölçüde daha kötü olabilir. Bazı durumlarda, DAPI konsantrasyonu hücre döngüsü profilinin kalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir ve ayarlanması gerekir (Şekil6C). Tedavi nedeniyle net Bir G1 zirvesinin saptanamadığı durumlarda hücre döngüsü modelleme aracı doğru şekilde uygulanamaz. O zaman yalnızca DAPI-A ve DAPI-W çiziminde, protokolde açıklandığı gibi iyi tanımlanmış hücre döngüsü profiline sahip kontrollere dayalı manuel gating kullanılması tavsiye edilir.
Tedavi genel DAPI sinyal gücünde büyük kaymalara neden düşük hücre numaralarına yol açarsa, net bir G1 zirvesi olmayan bir hücre döngüsü profilinin analizi daha da karmaşık olabilir. Bu durumda, bir tepe G1 veya G2 tepe ise, yargılamak zor olabilir. Bu sorunu önlemek için, hücreler bir Neubauer odası veya son yıkama adımı (adım 3.3) sonra başka yollarla sayılabilir ve hücre numaraları ayarlanabilir. Tedavi edilen hücrelerdeki tepe konumları daha sonra denetimlerle eşleşir.
Şekil 1 : Örnek alma için çalışma sayfası kurulumu. Akış sitometre yazılımının Çalışma Sayfası penceresinde sinyal görüntülemesi için çizimler ve kapılar (Malzeme Tablosu'na bakın). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Veri değerlendirmesi için gating stratejisi. Popülasyon ağacı ve kapıların akış sitometrik analiz yazılımındaki farklı alt popülasyonları tanımlamak için nasıl ayarlandığını gösteren diyagramlar. DJF Dean-Jett-Fox yöntemi25,26kullanarak hücre döngüsü modelleme aracı anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : Ham veri dışa aktarma tablosu. Akış sitometrik analiz yazılımında ham veri ihracatı için 'Tablo Düzenleyicisi'nin kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : İnsan U87 ve LN229 glioblastoma hücrelerinin DNA hasar tepkisi 4 Gy foton ile karbon iyon radyasyonu ile ışınlama sonrası. (A) ΓH2AX düzeyleri ile ölçülen DSB indüksiyon ve onarımı. Ortanca floresan yoğunluğu her hücre döngüsü fazında göreli DNA içeriğine normalleştirildi (G1 = 1.0, S = 1.5, G2 = 2.0) ve kontrol düzeyleri çıkarıldı. Semboller ortalama ve hata çubuklarını gösterir SD değerlerini gösterir. Katı çizgiler I(t) = (p1*t² + p2*t) / (t² + q1*t + q2) fonksiyonuna göre uyum sağlar | t ≥ 0, p1 < 0, p1, q1, q2 > 0. (B) Hücre döngüsü dağılımı (ortalama ve SD) ve DNA içerik belirteci DAPI temsili histogramları foton veya karbon iyon ışınlama sonra 24 saat. (C) Apoptoz indüksiyon, caspase-3 ve subG1 pozitif hücreler (ortalama ve SD) ile ölçülür. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (iki taraflı Öğrenci t testi). Bu rakam Lopez, ve ark. 1'den izinle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 : U87 glioblastom hücrelerinde ilaç aracılı apoptoz-indüksiyon. U87 hücreleri, aktif kasko-3 ve subG1 analizi ile apoptoz ölçümlerini doğrulamak için fiksasyondan önce 20 saat için modifiye Edilmiş TNF'ye bağlı apoptoz-indükleyen ligandın 5 ng/mL'si (bkz. MalzemeTablosu) artı 20 saat için 2,5 μM MG132 ile tedavi edildi. (A) Tedavi edilmeyen hücrelere karşı tedavi edilen kaspas-3 sinyalinin histogramı. (B) DNA bozunmasını gösteren, subG1 popülasyonuna sahip tedavi edilmiş hücrelerin DAPI histogramı. Caspase-3-pozitif olayların histogramı kırmızı yayılarak apoptotik hücrelerin çoğunun henüz DNA'larını henüz bozmadığını gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6 : Hücre döngüsü profillerinin kalitesini etkileyen faktörler. Çok sert tedaviler hücre döngüsü analizini zorlaştırır. (A) No G1 tepe saptanabilir 48 h LLC hücrelerinin tedavisinden sonra (Lewis akciğer karsinomu) ile 20 Gy foton radyasyonveya (B) 96 h UV radyasyon u 100 mJ ile HS68 fibroblastlar tedavisinden sonra. (C) Farklı hücre hatlarında DAPI konsantrasyonu: HS68 fibroblastlarında (üst panel) G2/M tepe noktası (oklara bakınız) 0.01 ile 1.0 g/mL arasındaki DAPI konsantrasyonları için G1 zirvesinden eşit derecede ayrılmıştır. Buna karşılık, 0,75 μg/mL'nin altındaki DAPI konsantrasyonları, MRC-5 fibroblastlarında (alt panel) G2/M zirvesinin (bkz. oklara) kötü ayrılması ve şekil tanımıile sonuçlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Tipik akış sitometre yapılandırması. λ = uyarma lazerin in dalga boyu, U = dedektör gerilimi, log = logaritmik ölçek (doğrusal), -A = sinyal alanı, -H = maksimum sinyal yüksekliği, -W = sinyal genişliği (süre), FSC = ön dağılım, SSC = yan dağılım. Optik filtre özellikleri nanometrelerde merkezi dalga boyu/bant genişliği olarak verilmiştir. Ayarlar farklı akış sitometreleri için değişebilir ve dedektör gerilimlerinin farklı hücre hatları için ayarlanması gerekir.
Ek Şekil 1: γH2AX foci'nin mikroskobik görüntüleri. U87 hücreleri sunulan protokole göre 30 dakika sonra sabit ve lekeli foton radyasyonu farklı dozlarda ışınlanmış ve tartışmada açıklandığı gibi mikroskopi için hazırlanmıştır. At 2 Gy, bireysel foci kolayca ayırt edilebilir, 8 Gy foci sayma önemli örtüşme nedeniyle önyargılı iken. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özellikli yöntem kullanımı kolaydır ve çift iplikçik break (DSB) indüksiyon ve onarım, hücre döngüsü etkileri ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere DNA hasar yanıtı hızlı, doğru ve tekrarlanabilir ölçüm sunuyor. Bu uç noktaların birleşimi, bireysel tahlillerden daha fazla ilişki ortamı sağlar. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi, tedavisi ve korunması alanlarında ve daha genel olarak onkolojide (örn. çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve genetik değerlendirme için) kapsamlı bir genotoksisite talimi olarak yaygın olarak uygulanabilir. tümör hücrelerinde istikrarsızlık).
Bu protokoldeki en kritik adım hücrelerin fiksasyonudur. Açıkça tanımlanmış bir hücre popülasyonu ve farklı hücre döngüsü fazlarının en iyi çözünürlüğü ile temiz bir örnek elde etmek için, yapışık hücrelere kültür kabından ayrılması ve tamamen yuvarlak bir şekil oluşturması için yeterli zaman vermek önemlidir. Hücreler, hücre kümeleri olmadan tek hücreli süspansiyon olarak fiksasyon çözeltisine aktarılmalıdır. Onları ayırmak için, hücreler yukarı ve aşağı borulu veya zor durumlarda ince bir iğne birkaç kez geçirilen gerekir. Fiksasyon süresi tüm numuneler arasında sabit tutulmalı ve %70 etanoldeki hücrelerin yeniden askıya alınmadan önce santrifüj süresi de dahil olmak üzere 20 dakikayı geçmemelidir. Uzun süreli fiksasyon antikor bağlanması için erişilebilir epitopsların kaybına yol açacak ve yöntemin sinyal gücünü ve hassasiyetini azaltacaktır.
Tekniğin temel sınırlaması, γH2AX foci'nin kalitesi hakkında tüm çekirdekteki yoğunluk dışında bilgi sağlamamasıdır. Özellikle büyük γH2AX foci yanı sıra bir pan-nükleer γH2AX boyama oluşumu kümelenmiş DSBs1,27,28,29, çok zor olan son derece karmaşık lezyonlar ile bağlantılı olmuştur 30'uonarmak için. Bu tür kümelenmiş lezyonlar klinik olarak uygulanan karbon iyon radyasyonu gibi parçacık radyasyonu için karakteristik gibi görünüyor ve fotonlara göre ağır iyon radyasyonunun üstün biyolojik etkinliğinin nedeni olabilir31,32 ,33. Bu nedenle γH2AX foci boyutunun analizi, hasar karmaşıklığının bir göstergesi olarak ilgi çekici olabilir. ΓH2AX odaklarını görselleştirmek için mevcut protokolü görüntü akışı sitometresi ile kullanmak mümkün olsa da, elde edilebilir çözünürlük klasik mikroskobik yaklaşımla rekabet edemez. Ancak, akış sitometrik ölçümü (EkŞekil1) sonrasında kalan örneklerden mikroskobik slaytlar başarıyla hazırladık ve γH2AX foci sayısı, boyutu ve pan-nükleer yoğunluğu gibi çeşitli özellikleri yarı otomatik görüntüleme ve analiz sistemi. Numuneleri mikroskopi ye hazırlamak için, lekeli hücrelerin 30-50 μL'si 24 mm x 24 mm'lik kapak camı yüzeyine yayıldı, hava karanlıkta oda sıcaklığında bir gecede kurutuldu ve cam bir kaydırağa montaj ortamı ile gömüldü.
ΓH2AX foci sayımı ile DSB düzeylerinin mikroskobik değerlendirilmesi ile karşılaştırıldığında, akış sitometrik ölçümü, elde etme, örnekleme hızı, dinamik aralık ve doğruluk açısından üstündür. Mikroskobik foci sayma dinamik aralığı optik çözünürlük ile sınırlıdır, örtüşen foci ayırt etmek için yetersizlik yolaçan 29,34. Uygulamada, radyasyon dozu ile γH2AX foci sayıları arasında doğrusal bir ilişki gözlendik 2 Gy'nin altında, u87 glioblastoma hücrelerinde 2 Gy'nin üzerinde güçlü bir doygunluk etkisi1. Buna karşılık, akış sitometrisi ile ölçülen γH2AX sinyalinin yoğunluğu test edilen tüm doz aralığı için doz ile doğrusal olarak artmıştır (0-8 Gy).
Mikroskobik foci sayma doğruluğu ek boyama olmadan farklı hücre döngüsü aşamaları arasında ayırt etmek için yetersizlik ile sınırlıdır35. Bir hücrede indüklenen DSB sayısı sadece radyasyon dozuna bağlı değildir, aynı zamanda DNA içeriği, ve dolayısıyla hücre döngüsü aşamasında. Örneğin G2 hücreleri G1 hücrelerinden iki kat daha fazla DNA'ya sahiptir ve belirli bir radyasyon dozunda indüklenen ortalama DSB sayısı G1'e göre G2 hücreleri için iki kat daha yüksektir. Bu açıkça akış sitometri ile ölçülen radyasyon dan sonra erken zaman noktalarında G2 karşı G1 hücrelerinin γH2AX sinyal yoğunluğu yansıtılır. Bu nedenle, doğru sonuçlar elde etmek için hücre döngüsüne özgü bir şekilde DSB düzeylerini değerlendirmek önemlidir. Mikroskobik yaklaşımlarda olduğu gibi farklı hücre döngüsü evrelerinde hücrelerin bir araya gelen analizi, özellikle radyasyona bağlı G2 durması nedeniyle hücre döngüsü dağılımındaki kaymalar tarafından önyargılı olabilir. Bu etkiyi hesaba katmak ve Farklı hücre döngüsü aşamaları arasında DSB onarım özelliklerini karşılaştırmak için γH2AX düzeyleri protokolde belirtildiği gibi akış sitometri sitometrisi yöntemindeki DNA içeriğine kolayca normalleştirilebilir.
Bu protokolün uzantıları nispeten az ekstra çaba ile mümkündür. Uyumlu florofor etiketli ek antikorlar, numune hazırlama sırasında herhangi bir ekstra adıma gerek kalmadan adım 3.4'e eklenebilir. Apoptozisin daha detaylı analizi isteniyorsa caspase-7, -9 ve -8 antikorları dahil edilebilir. Başka bir uzantısı olarak, son zamanlarda canlı ve ölü hücre boyası dahil ettik, bir troponin T antikor ve protokol boncuk sayma özellikle kardiyomiyositler co-ışınlama sonrası fibroblastlar ile kültürlü analiz etmek için. Canlı/ölü hücre lekesi ve sayma boncuklarının eklenmesi, fibroblast proliferasyonu ve kardiyomiyositlerin apoptotik olmayan hücre ölümünü hücre hakkında yararlı ek bilgiler sağlayan diğer uç noktalar olarak içerecek şekilde yöntemin kapasitesini genişletir. genotoksik stres sonra kader. Genişletilmiş protokol istek üzerine kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Alman Kanser Araştırma Merkezi'ndeki (DKFZ) Flow Sitometri Tesisi ekibine desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
