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Cancer Research

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/59968
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

Summary

La méthode présentée combine l'analyse quantitative des ruptures à double brin d'ADN (DSB), de la distribution du cycle cellulaire et de l'apoptose pour permettre l'évaluation par cycle cellulaire de l'induction et de la réparation de l'ASD ainsi que les conséquences d'une défaillance de réparation.

Abstract

La méthode présentée ou les versions légèrement modifiées ont été conçues pour étudier les réponses spécifiques de traitement et les effets secondaires de divers traitements anticancéreux utilisés en oncologie clinique. Il permet une analyse quantitative et longitudinale de la réponse aux dommages à l'ADN après un stress génotoxique, induit par la radiothérapie et une multitude de médicaments anticancéreux. La méthode couvre toutes les étapes de la réponse aux dommages à l'ADN, fournissant des points de terminaison pour l'induction et la réparation des ruptures à double brin d'ADN (DSB), l'arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire par apoptose en cas de défaillance de réparation. La combinaison de ces mesures fournit des informations sur les effets du traitement dépendant du cycle cellulaire et permet ainsi une étude approfondie de l'interaction entre la prolifération cellulaire et les mécanismes d'adaptation contre les dommages à l'ADN. Comme l'effet de nombreux traitements contre le cancer, y compris les agents chimiothérapeutiques et le rayonnement ionisant, est limité ou varie fortement selon les phases spécifiques du cycle cellulaire, les analyses corrélatives reposent sur une méthode robuste et faisable pour évaluer les effets du traitement. sur l'ADN d'une manière spécifique au cycle cellulaire. Ce n'est pas possible avec des essais à extrémité unique et un avantage important de la méthode présentée. La méthode n'est pas limitée à une ligne cellulaire particulière et a été soigneusement testé dans une multitude de tumeurs et de lignées cellulaires tissulaires normales. Il peut être largement appliqué comme un test complet de génotoxicité dans de nombreux domaines de l'oncologie en plus de la radio-oncologie, y compris l'évaluation des facteurs de risque environnemental, le dépistage des médicaments et l'évaluation de l'instabilité génétique dans les cellules tumorales.

Introduction

Le but de l'oncologie est de tuer ou d'inactiver les cellules cancéreuses sans nuire aux cellules normales. De nombreuses thérapies induisent directement ou indirectement le stress génotoxique dans les cellules cancéreuses, mais aussi dans certaines d'autres qui s'étendent dans les cellules normales. La chimiothérapie ou les médicaments ciblés sont souvent combinés avec la radiothérapie pour améliorer la radiosensibilité de la tumeur irradiée1,2,3,4,5, ce qui permet une réduction de la dose de rayonnement pour minimiser les lésions normales des tissus.

Le rayonnement ionisant et d'autres agents génotoxiques induisent différents types de dommages à l'ADN, y compris les modifications de base, les liens croisés des brins et les ruptures à brin unique ou double. Les ruptures de double brin d'ADN (DSBs) sont les lésions d'ADN les plus sérieuses et leur induction est essentielle à l'effet de tueur de cellules du rayonnement ionisant et de divers drogues cytostatiques dans la radiochimiothérapie. Les DSB ne nuisent pas seulement à l'intégrité du génome, mais favorisent également la formation de mutations6,7. Par conséquent, différentes voies de réparation d'ESTB, et les mécanismes pour éliminer les cellules irrémédiablement endommagées comme l'apoptose se sont développées pendant l'évolution. L'ensemble de la réponse aux dommages à l'ADN (DDR) est régulée par un réseau complexe de voies de signalisation qui atteignent de la reconnaissance des dommages à l'ADN et l'arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation de l'ADN, à la mort cellulaire programmée ou l'inactivation en cas de défaillance de réparation8.

La méthode cytométrique présentée de flux a été développée pour étudier le DDR après le stress génotoxique dans un test complet qui couvre l'induction et la réparation d'ESTD, aussi bien que des conséquences de la rupture de réparation. Il combine la mesure du marqueur DSB largement appliqué H2AX avec l'analyse du cycle cellulaire et l'induction de l'apoptose, en utilisant l'analyse classique subG1 et une évaluation plus spécifique de l'activation de la caspase-3.

La combinaison de ces paramètres dans un seul analyse réduit non seulement le temps, la main-d'œuvre et les coûts, mais permet également la mesure du cycle cellulaire spécifique à l'induction et la réparation de l'ORD, ainsi que l'activation de la caspase-3. De telles analyses ne seraient pas possibles avec des essais effectués indépendamment, mais elles sont très pertinentes pour une compréhension complète de la réponse aux dommages à l'ADN après un stress génotoxique. Beaucoup de médicaments anticancéreux, tels que les composés cytostatiques, sont dirigés contre la division des cellules et leur efficacité dépend fortement du stade du cycle cellulaire. La disponibilité de différents processus de réparation DSB dépend également de l'étape de cycle cellulaire et le choix de voie qui est critique pour la précision de réparation, et détermine à son tour le sort de la cellule9,10,11, 12. En outre, la mesure spécifique au cycle cellulaire des niveaux d'ORD est plus précise que l'analyse mise en commun, parce que les niveaux d'ORD dépendent non seulement de la dose d'un composé génotoxique ou d'un rayonnement, mais aussi de la teneur en ADN de la cellule.

La méthode a été utilisée pour comparer l'efficacité de différentes radiothérapies pour surmonter les mécanismes de résistance dans le glioblastome13 et pour disséquer l'interaction entre le rayonnement ionisant et les médicaments ciblés dans l'ostéosarcome14,15 et les cancers tératoïdes rhabdoïdes atypiques16. En outre, la méthode décrite a été largement utilisée pour analyser les effets secondaires de la radio et de la chimiothérapie sur les cellules souches mésenchymales17,18,19,20,21, 22,23,24, qui sont essentiels pour la réparation des dommages normaux induits par le traitement de tissu et ont une application potentielle en médecine régénérative.

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Protocol

1. Préparation

  1. Préparer 1 x 105 cellules/échantillon dans n'importe quel type de récipient de culture comme matériau de départ.
    1. Par exemple, effectuer une expérience dans le temps après l'exposition des cellules du glioblastome U87 au rayonnement ionisant : Irradiir les cellules U87 sous-confluentes dans les flacons T25 dans les tripliciats pour chaque point de temps. Choisissez des points de temps précoces (15 min jusqu'à 8 h après l'irradiation) pour suivre la cinétique de la réparation de l'ASD (niveau H2AX) et les points de temps tardif (24 h jusqu'à 96 h) pour évaluer les niveaux résiduels de DSB, les effets du cycle cellulaire et l'apoptose.
      REMARQUE: Le protocole ne se limite pas aux expériences d'irradiation ou à une lignée cellulaire spécifique. Il a été testé avec de nombreuses lignées cellulaires de tous types, de différentes espèces et pour diverses conditions de traitement.
  2. Préparer les solutions suivantes, y compris 10% de volume excédentaire.
    1. Préparer 2 mL par échantillon de solution de fixation composé de 4,5 % de paraformaldéhyde (PFA) en salin tamponné par phosphate (PBS). Préparer la solution fraîche. Diluer le PFA dans le PBS en chauffant à 80 oC en remuant lentement sous le capot de fumée. Couvrir le flacon de papier d'aluminium pour éviter la perte de chaleur. Laissez la solution refroidir à température ambiante et ajustez le volume final. Passer la solution à travers un filtre de cellulose plié, grade 3hw (voir le tableau des matériaux).
      MISE EN GARDE: Les vapeurs de PFA sont toxiques. Effectuez cette étape sous une hotte de fumée et éliminez les déchets PFA de façon appropriée.
    2. Préparer 3 ml par échantillon de solution de perméabilisation composé de 70 % d'éthanol dans le h2O. À la glace à -20 oC.
    3. Préparer 7 mL par échantillon de solution de lavage composée de 0,5 % d'albumine de sérum bovin (BSA) en PBS.
    4. Préparer 100 L par échantillon de 3 % de BSA en PBS en tant que diluant d'anticorps.
    5. Préparer 100 à 250 L par échantillon de solution de coloration de l'ADN composée de 1 g/mL 4', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) en PBS.
  3. Fixer la centrifugeuse pour les tubes de 15 ml à 5 min à 200 x g et 7 oC. Laissez refroidir la centrifugeuse et utilisez ces réglages pour toutes les étapes de centrifugation.

2. Collection d'échantillons

  1. Si le traitement des cellules adhérentes (p. ex. les cellules du glioblastome U87 cultivées dans des flacons T25 avec 5 ml de milieu d'aigle modifié de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal à 37 oC et 5 % d'atmosphère de dioxyde de carbone), se poursuit avec des étapes 2.1.1. et 2.1.2. Pour les cellules de suspension procéder directement à l'étape 2.1.2.
    1. Recueillir le milieu dans un tube de centrifugation. Détachez les cellules à l'aide d'une méthode de culture cellulaire de routine, qui peut inclure l'utilisation de trypsine, d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) ou d'autres agents de détachement cellulaire.
      1. Pour les cellules U87, préréchauffer PBS et trypsine/EDTA (voir le Tableau des Matériaux) à 37 oC, lavez la couche cellulaire avec 1 ml de PBS, incubez les cellules pendant 1-2 min avec 1 ml de trypsine/EDTA et supportez le détachement cellulaire en tapant sur le flacon. Recueillir toute la solution de lavage et la suspension cellulaire dans le tube avec le milieu.
    2. Centrifuger les cellules, jeter le milieu et resuspendre les cellules dans 1 ml de PBS.
  2. Pipet les cellules de haut en bas à plusieurs reprises pour assurer une suspension de cellule unique et transférer la suspension cellulaire dans un tube avec 2 ml de solution de fixation (4,5% PFA / PBS, 3% de concentration finale).
    MISE EN GARDE: Les vapeurs de PFA sont toxiques. Effectuez cette étape sous une hotte de fumée et éliminez les déchets PFA de façon appropriée.
  3. Incuber les cellules pendant 10 min à température ambiante.
  4. Centrifuger les cellules et jeter le supernatant par décantation.
  5. Desserrer la pastille cellulaire en tapant sur le tube et resuspendre les cellules dans 3 ml d'éthanol à 70%. Procédez directement à l'étape suivante ou entreposez les échantillons à 4 oC pendant plusieurs semaines.

3. Lavage et coloration

  1. Centrifuger les cellules et jeter le supernatant par décantation.
  2. Desserrer la pastille cellulaire en tapant sur le tube. Resuspendre les cellules en 3 ml de solution de lavage (0,5% BSA/PBS), centrifugeuse et jeter le supernatant.
  3. Répéter l'étape de lavage 1x avec 3 ml, puis 1x avec 1 ml solution de lavage. Dans la dernière étape, jetez soigneusement le supernatant par pipetting. Veillez à ne pas aspirer la pastille.
  4. Diluer les anticorps contre le H2AX, le phospho-histone H3 (Ser10) et la caspase-3 (voir le Tableau des matériaux)en 100 l/échantillon avec diluant d'anticorps (3 % BSA/PBS).
  5. Desserrer le granule cellulaire en tapant sur le tube et resuspendre les cellules dans 100 l de la solution d'anticorps préparée à l'étape 3.4. Gardez les échantillons dans l'obscurité à partir de cette étape.
  6. Incuber les échantillons pendant 1 h à température ambiante.
  7. Centrifuger les cellules et jeter le supernatant soigneusement par pipetting. Veillez à ne pas aspirer la pastille.
  8. Desserrer la pastille cellulaire en tapant sur le tube et resuspendre les cellules dans 100-250 L de la solution de coloration de l'ADN (1 'g/mL DAPI/PBS).
    1. Utilisez 100 L si 1-2 x105 cellules sont présentes et augmentez le volume pour des nombres cellulaires plus élevés (250 l pour 1 x 106 cellules). Procéder directement à l'étape suivante ou entreposer les échantillons dans l'obscurité à 4 oC pendant une période pouvant aller jusqu'à 2 semaines.
      REMARQUE: Pour certains types de cellules optimisant la concentration de DAPI peut aider à améliorer la séparation des phases de cycle cellulaire.
  9. Pipet les échantillons à travers le bouchon de passoire cellulaire d'un tube d'échantillon avec une taille de pores de maille de 35 m.

4. Mesure

  1. Placez les échantillons sur la glace, démarrez le cytomètre d'écoulement (voir le tableau des matériaux)configuré avec une configuration optique selon le tableau 1 et appuyez sur le bouton Prime. Au besoin, allumez le laser ultraviolet (longueur d'onde de 355 nm) séparément et configurez la puissance à 10 mW à l'aide du logiciel approprié.
  2. Ouvrez le logiciel d'acquisition (voir Tableau des matériaux),connectez-vous et créez une nouvelle expérience en cliquant sur le bouton Nouvelle expérience sur la barre d'outils du navigateur.
  3. Utilisez la fenêtre Inspecteur pour personnaliser le nom de l'expérience et choisissez ' 5 Log Decades' pour l'affichage de l'intrigue.
  4. Cliquez sur le bouton New Specimen dans la barre d'outils du navigateur et élargissez la nouvelle entrée en cliquant sur le symbole '' à sa gauche pour afficher le premier Tube. Sélectionnez l'icône et le type respectifs pour renommer le Specimen (p. ex., type de cellule) et le tube (identificateur d'échantillon). Cliquez sur le pointeur tube du premier tube (symbole en flèche à sa gauche) pour le rendre vert (actif).
  5. Ouvrez l'onglet Paramètres dans la fenêtre Cytometer et choisissez les paramètres en fonction du tableau 1. Supprimer tous les paramètres inutiles.
    REMARQUE : les noms des paramètres peuvent varier en fonction des préréglages personnalisés (p. ex., Cy3 au lieu d'Alexa555). Assurez-vous que la sélection correspond aux filtres optiques et aux détecteurs du tableau 1. Les voies de lumière de tous les fluorophores sont totalement indépendantes dans cette configuration et la compensation du chevauchement spectral n'est pas exigée ; cependant, il pourrait être nécessaire si une autre configuration optique est utilisée.
  6. Ouvrez la fenêtre de la feuille de travail et créez des parcelles selon la figure 1. Dessinez 2 parcelles de points et 4 histogrammes à l'aide des boutons de la barre d'outils correspondantes et cliquez sur les étiquettes de l'axe pour choisir les paramètres appropriés (diffusion avant (FSC-A) par rapport à la diffusion latérale (SSC-A), DAPI-W contre DAPI-A et un histogramme pour DAPI-A et chaque anticorps couplé Fluorophore.
  7. Fixez un échantillon de commande au cytomètre et appuyez sur le bouton Run sur l'instrument. Sélectionnez le premier tube dans la fenêtre Navigateur du logiciel et cliquez sur le bouton Acquire Data dans le tableau de bord d'acquisition. Ajustez le volume d'injection de l'échantillon à l'aide des boutons Low, Mid ou High et de la roue de réglage fine de l'instrument. Travailler de préférence à Low setting, mais essayer d'acquérir au moins 100 événements/seconde (voir Tableau de bord d'acquisition).
  8. Ajuster les tensions de détecteur pour FSC, SSC et DAPI dans l'onglet Paramètres de la fenêtre de l'inspecteur en utilisant les parcelles de points de la figure 1 comme ligne directrice. Passez à l'échelle logarithmique pour les paramètres FSC et SSC si la population cellulaire semble trop dispersée à l'échelle linéaire.
  9. Appuyez sur le bouton Standby sur le cytomètre et continuez avec la configuration de la feuille de travail dans le logiciel.
    1. Utilisez l'outil Polygon Gate pour définir la population de cellules dans la parcelle FSC-A par rapport à SSC-A et l'outil Rectangle Gate pour définir la population de SingleCells dans la parcelle DAPI-W versus DAPI-A. Appuyez sur les touches Ctrl et G pour afficher la Hiérarchie de population et cliquez sur les noms de porte par défaut pour les renommer.
    2. Par la suite, cliquez à droite sur tous les histogrammes et choisissez Afficher les populations SingleCells du menu contextuel.
  10. Optimisez les tensions de détecteur pour les fluorophores couplés à l'anticorps pour couvrir toute la plage dynamique en acquérant par la suite des échantillons de contrôle et traités. Maximisez le rapport signal-bruit et évitez la saturation du détecteur. Assurez-vous que le pic Alexa488 dans la population de SingleCells n'est ni tronqué dans le contrôle ni dans l'échantillon traité.
  11. Appuyez sur le bouton Standby sur le cytomètre et effectuez en option les étapes 4.11.1-4.11.3 dans la fenêtre de la feuille de travail du logiciel pour obtenir une estimation approximative des effets du traitement lors de l'acquisition de l'échantillon.
    1. Sélectionnez SingleCells dans la Hiérarchie des Populations et utilisez l'outil Rectangle Gate pour définir la population G1 dans la parcelle DAPI-W versus DAPI-A. Cliquez à droite à l'histogramme Alexa488 et choisissez Show Populations (fr) G1 du menu contextuel.
    2. Cliquez à droite à l'histogramme Alexa488 et choisissez Créer des statistiques Voir dans le menu contextuel. Cliquez à droite à l'afficher les statistiques et choisissez Edit Statistics View. Rendez-vous à l'onglet Statistiques et activez la case à cocher pour la médiane du signal Alexa488 dans la population G1 (désactiver toutes les autres options).
    3. Sélectionnez SingleCells dans la Hiérarchie des Populations et utilisez l'outil Interval Gate pour définir les populations subG1, M et Casp3MD dans le DAPI-A, Alexa555-A (Cy3-A à la figure 1) et Alexa647-Un histogramme.
  12. Appuyez sur le bouton Run sur le cytomètre et mesurez les échantillons à l'aide du tableau de bord d'acquisition dans le logiciel. Définir la porte d'arrêt à Tous les événements ou la porte des cellules (si de nombreuses petites particules sont présentes) et le nombre d'événements à enregistrer à 10.000.
  13. Cliquez sur Next Tube pour créer un nouvel exemple, renommez-le dans la fenêtre Navigateur, cliquez sur Acquire Data pour commencer l'acquisition et Enregistrez les données pour commencer l'enregistrement.
  14. Sélectionner le fichier Exportation (Exportation) Expériences à partir de la barre de menu et choisissez Directory Export dans la boîte de dialogue pour enregistrer les données en tant que fichiers '.fcs'. Enregistrer l'expérience en option comme un fichier zip supplémentaire si pour permettre la réimportation de l'expérience à un moment ultérieur.
    REMARQUE: La configuration des expériences existantes peut être facilement réutilisée avec Edit . Duplicate sans données.

5. Évaluation des données

  1. Faites glisser et déposez les fichiers '.fcs' dans le navigateur de l'échantillon du logiciel d'analyse cytométrique de flux (voir Tableau des matériaux). Appliquer la stratégie de gating présentée à la figure 2. Assurez-vous que les portes correspondent à la population correspondante dans tous les échantillons avant de procéder à la prochaine porte de fille.
    1. Pour appliquer des modifications à tous les échantillons, sélectionnez la porte modifiée dans le navigateur de l'échantillon, copiez-la en appuyant sur Ctrl C, sélectionnez la porte parente, appuyez sur Ctrl et Shift E pour sélectionner les nœuds équivalents dans tous les échantillons et appuyez sur Ctrl et V pour coller ou écraser la porte. N'utilisez pas de portes de groupe.
    2. Double-cliquez sur le premier échantillon dans le navigateur pour ouvrir l'intrigue SSC-A vs FSC-A. Utilisez l'outil Polygone dans la barre d'outils pour définir la population de cellules (Figure 2, parcelle 1), à l'exclusion des débris de l'analyse. Assurez-vous que la porte est assez large vers le coin supérieur droit pour tenir compte des quarts de travail liés au traitement, mais limitez la bordure orientée vers le coin inférieur gauche de la parcelle pour exclure de façon fiable la cellule.
    3. Double-cliquez sur la porte Cells pour ouvrir une nouvelle fenêtre de parcelle et changer les axes en DAPI-W (vertical) vs DAPI-A (horizontal) en cliquant sur les étiquettes de l'axe. Utilisez l'outil Rectangle pour définir la population de SingleCells (Figure 2, parcelle 2), à l'exclusion des doublets cellulaires ou des touffes de l'analyse (les doublets des cellules G1 ont la même intensité DAPI-A que les cellules G2 et M, mais un DAPI-W considérablement plus élevé valeur).
      REMARQUE: Des numérations cellulaires variables dans différents échantillons entraîneront des changements dans la force globale du signal DAPI-A en raison de la liaison d'équilibre du DAPI à l'ADN. Cela n'affectera pas l'analyse du cycle cellulaire, mais il peut être nécessaire d'ajuster la bordure droite de l'échantillon de la porte à cellule unique par échantillon pour tenir compte de ces changements.
    4. Double-cliquez sur la porte SingleCells pour ouvrir une nouvelle fenêtre de l'intrigue et changer les axes pour afficher l'histogramme DAPI-A. Utilisez l'outil Bisector pour distinguer les cellules individuelles ayant une teneur normale en ADN (population deCellCycle) des cellules apoptotiques à ADN dégradé (populationsous-G1). Sélectionnez ensuite les nouvelles portes dans le navigateur et appuyez sur Ctrl 'R pour les renommer en conséquence (Figure 2, parcelle 3).
    5. Sélectionnez la porte CellCycle dans le navigateur et choisissez l'outil Biologie (biologie) Cycle cellulaire... de la barre de menu pour ouvrir l'outil de modélisation du cycle cellulaire. Choisissez Dean-Jett-Fox25,26 dans la section Modèle pour estimer la fréquence des cellules en phase G1, S et G2/M (figure2, parcelle 4). Utilisez les contraintes uniquement en cas de mauvaise performance de modélisation (minimiser l'écart Root Mean Square entre le modèle et les données).
    6. Créer des portes pour la phase G1 (outilEllipse), S (outilPolygone) et G2 et M (outilEllipse) dans la parcelle DAPI-W vs DAPI-A de la population CellCycle pour permettre la mesure spécifique au cycle cellulaire (H2AX mesure ( Figure 2, parcelle 5). N'utilisez pas l'outil de modélisation pour le gating automatique du cycle cellulaire basé sur l'histogramme DAPI-A, car cela peut être inexact.
      REMARQUE: Il peut être nécessaire de déplacer les portes le long de l'échantillon de l'axe DAPI-A par échantillon pour tenir compte des changements susmentionnés dans la force globale du signal DAPI. Déplacez seulement les trois portes en groupe et ne changez pas la forme des portes individuelles pour éviter les préjugés.
    7. Utilisez l'outil Bisector pour distinguer les cellules phospho-histone H3-positives(M) et -négatives (M-) dans l'histogramme Alexa555-A de la population cellCycle (Figure 2, parcelle 6). Tenez Ctrl et sélectionnez les portes G2 et M-. Appuyez sur Ctrl et Shift a pour créer la porte G2 (G2-M et M-) .
    8. Utilisez l'outil Bisector pour distinguer les cellules caspase-3-positives (Casp3)et -négatives (Casp3-) dans l'histogramme Alexa647-A de la population SingleCells (Figure 2, parcelle 7). Fixez le seuil de telle sorte que la moyenne de la population de Casp3 Dans les contrôles non traités s'élève à 0,8 % pour assurer une sensibilité élevée et minimiser les variations d'analyse à l'analyse.
    9. Appuyez sur Ctrl et T pour ouvrir l'éditeur de table et le configurer selon la figure 3. Faites glisser et déposez les différentes populations du navigateur de l'échantillon dans l'éditeur de table et cliquez en deux clics sur les lignes pour modifier les paramètres de statistiques, de paramètres et de nom. Supprimer les lignes inutiles qui sont automatiquement ajoutées après la traînée et la baisse de l'icône de modélisation du cycle cellulaire en sélectionnant les lignes et en appuyant sur Del.
    10. Choisissez de fichier, le format et la destination dans la section Sortie du ruban de menu et cliquez sur Créer table pour exporter les données comme '.xlsx' fichier.
  2. Utilisez le logiciel de calcul de table (voir tableau des matériaux) pour une analyse plus approfondie des données selon le fichier supplémentaire 1 (FACS-Analysis-TemplateMD(1).xlsx).
    1. Corriger les fréquences des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire de telle sorte que leur somme s'élève à 100% en appliquant la formule X ' X ' X ' 100 / (toutes les phases de cycle cellulaire), avec X': valeur corrigée, X: valeur brute, à chaque phase du cycle cellulaire.
      REMARQUE: Les écarts par rapport à une somme de 100 % se produisent en raison d'inexactitudes dans la modélisation du cycle cellulaire, mais ils sont généralement faibles (lt;5 %).
    2. Normaliser les intensités médianes de H2AX à la teneur en ADN dans les différentes phases du cycle cellulaire en divisant les valeurs en phase S par 1,5 et en phase G2 et M par 2,0.
    3. Pour calculer le niveau combiné normalisé de H2AX dans l'ensemble de la population cellulaire, utilisez la formule IA , IG1 , G1 , IS , S , IG2 , G2 , IM , M, où je suisA, IG1, IS, IG2, IM sont des intensités médianes normalisées de H2AX de toutes, G1, S, G2, M cellules respectivement et G1, S, G2, M sont la fréquence corrigée des cellules dans la phase de cycle cellulaire respectif.
    4. Pour les niveaux normalisés de H2AX et la fréquence des cellules sous-G1 et caspase-3-positives, soustrayez la valeur moyenne des contrôles non traités de chaque échantillon.
    5. Calculez l'écart moyen et standard de chaque paramètre de tous les échantillons de reproduisent et tracez les résultats en diagrammes.

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Representative Results

Les cellules humaines de glioblastome U87 ou LN229 ont été irradiées avec 4 Gy de rayonnement de photon ou d'ion de carbone. Les niveaux de h2AX et l'apoptose spécifiques au cycle cellulaire ont été mesurés à différents moments jusqu'à 48 h après irradiation à l'aide de la méthode cytométrique du débit présentée ici (figure 3). Dans les deux lignées cellulaires, les ions de carbone ont induit des niveaux de pointe plus élevés de H2AX qui ont diminué plus lentement et sont demeurés significativement élevés à 24 à 48 h par rapport au rayonnement de photon à la même dose physique (figure 4A). Cela indique que les ions de carbone ont induit des niveaux de pointe plus élevés de ruptures à double brin d'ADN (DSB) que les photons qui ont été réparés moins efficacement. Pour les deux types de rayonnement, les niveaux de H2AX étaient les plus élevés dans les cellules G1, probablement parce que la réparation de l'ORD se limite à la voie de l'assemblage final non-homologue à ce stade du cycle cellulaire.

Conformément au taux d'induction plus élevé de l'ORD et à la cinétique de réparation plus lente, les ions de carbone ont induit une arrestation plus forte et plus durable du cycle cellulaire en phase G2 (figure 3B) et un taux plus élevé d'apoptose que les photons (figure 4C). Le rayonnement d'ion de carbone peut donc aider à surmonter des mécanismes de radiorésistance observés dans le glioblastome sur la radiothérapie classique avec des photons (voir Lopez Perez, et autres1 pour la discussion détaillée).

Les résultats présentés à la figure 4 sont des exemples d'un résultat optimal de cette méthode, montrant des différences claires entre les cellules non traitées et irradiées et des effets différentiels statistiquement significatifs entre les différents traitements. Dans les cas où l'induction d'ISD et d'apoptose est moins claire, il est important d'inclure des contrôles positifs. Comme indiqué ici, les cellules fixées 1 h après l'irradiation du photon sont de bons contrôles positifs pour l'induction h2AX. Le rayonnement de photon est également connu pour induire efficacement l'apoptosis dans les lymphocytes, qui les rend utiles comme contrôles positifs pour l'apoptose 2-4 jours après l'irradiation. Une autre possibilité est d'utiliser des médicaments pour l'induction de l'apoptose, comme l'inhibiteur du protéasome MG132 ou un ligand récepteur de la mort (Figure 5).

Un autre aspect important pour un résultat optimal de l'analyse est la qualité des profils de cycle cellulaire. Dans la figure 4B, les pics G1 et G2 étaient étroits et clairement séparés, ce qui rendait facile l'application de la modélisation du cycle cellulaire et la définition des portes pour la mesure spécifique au cycle cellulaire de l'H2AX. Selon le type de cellule et la force de l'effet de traitement (Figure 6A,B), la résolution des différentes phases du cycle cellulaire peut être significativement pire. Dans certains cas, la concentration de DAPI a un grand impact sur la qualité du profil du cycle cellulaire et doit être ajustée (figure 6C). Dans les cas où aucun pic G1 clair n'est détectable en raison du traitement, l'outil de modélisation du cycle cellulaire ne peut pas être appliqué avec précision. Il est alors conseillé d'utiliser uniquement le gating manuel dans la parcelle DAPI-A versus DAPI-W basée sur des contrôles avec un profil de cycle cellulaire bien défini, tel que décrit dans le protocole.

L'analyse d'un profil de cycle cellulaire sans pic G1 clair peut être encore plus compliquée si le traitement conduit à de faibles nombres cellulaires qui se traduisent par de grands changements dans la force globale du signal DAPI. Dans cette situation, il peut être difficile de juger, si un pic est le G1 ou le pic G2. Pour éviter ce problème, les cellules peuvent être comptées avec une chambre Neubauer ou par d'autres moyens après la dernière étape de lavage (étape 3.3) et les numéros de cellules peuvent être ajustés. Les positions de pointe dans les cellules traitées correspondent alors aux commandes.

Figure 1
Figure 1 : Configuration de la feuille de travail pour l'acquisition d'échantillons. Terrains et portes pour l'affichage du signal dans la fenêtre de feuille de travail du logiciel de cytomètre de flux (voir le tableau des matériaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Stratégie de localisation pour l'évaluation des données. Arbre de population et diagrammes montrant comment les portes sont définies pour définir les différentes sous-populations dans le logiciel d'analyse cytométrique de flux. DJF se réfère à l'outil de modélisation du cycle cellulaire en utilisant la méthode Dean-Jett-Fox25,26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Tableau d'exportation de données brutes. Configuration du 'Table Editor' pour l'exportation de données brutes dans le logiciel d'analyse cytométrique de flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Réponse de dommages d'ADN des cellules humaines de glioblastome d'U87 et de LN229 après irradiation avec 4 Gy du photon contre le rayonnement d'ion de carbone. (A) Induction et réparation de l'ISD mesurées par les niveaux de H2AX. L'intensité médiane de fluorescence a été normalisée à la teneur relative en ADN dans chaque phase de cycle cellulaire (G1 - 1,0, S - 1,5, G2 et 2,0) et les niveaux de contrôle ont été soustraits. Les symboles indiquent les barres de moyenne et d'erreur indiquent les valeurs SD. Les lignes solides représentent des ajustements en fonction de la fonction I(t) '(p1 't2 ' p2 't) / (t2 ' q1 't 'q2) t 0, p1 et lt; 0, p1, q1, q2 et 0. (B) Distribution du cycle cellulaire (moyenne et DD) et histogrammes représentatifs du marqueur de contenu d'ADN DAPI à 24 h après irradiation du photon ou de l'ion carbonique. (C) Induction d'apoptose, mesurée par les cellules positives caspase-3 et subG1 (moyenne et SD). P 'lt; 0.05, 'P 'lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001 (test de l'étudiant à double face). Ce chiffre a été modifié à partir de Lopez, et al.1 avec la permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Induction d'apoptose-induction par la drogue dans les cellules de glioblastome u87. Les cellules U87 ont été traitées avec 5 ng/mL d'un ligand apoptosis-induisant tNF-connexe modifié (voir tableau des matériaux) plus 2.5 mg132 pendant 20 h avant fixation pour valider la mesure d'apoptosis par l'analyse active de caspase-3 et de subG1. (A) Histogramme du signal caspase-3 des cellules traitées contre non traitées. (B) Histogramme DAPI des cellules traitées avec une population subG1, indiquant la dégradation de l'ADN. L'histogramme des événements caspase-3-positifs est superposé en rouge, démontrant que la plupart des cellules apoptotiques n'avaient pas encore dégradé leur ADN à ce moment- Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Facteurs influençant la qualité des profils de cycle cellulaire. Les traitements trop durs compliquent l'analyse du cycle cellulaire. (A) Aucun pic G1 n'est détectable 48 h après traitement des cellules LLC (carcinome pulmonaire Lewis) avec 20 Gy de rayonnement photon ou (B) 96 h après le traitement des fibroblastes HS68 avec 100 mJ de rayonnement UV. (C) concentration de DAPI dans différentes lignées cellulaires : Dans les fibroblastes HS68 (panneau supérieur), le pic G2/M (voir flèches) était également bien séparé du pic G1 pour les concentrations de DAPI entre 0,01 et 1,0 g/mL. En revanche, les concentrations de DAPI inférieures à 0,75 g/mL ont entraîné une mauvaise définition de la séparation et de la définition de la forme du pic G2/M (voir flèches) dans les fibroblastes MRC-5 (panneau inférieur). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Table 1
Tableau 1 : Configuration typique des cytomètres d'écoulement. Longueur d'onde du laser d'excitation, tension du détecteur U, journal, échelle logarithmique (autrement linéaire), -A - zone de signal, -H - hauteur maximale du signal, -W - largeur du signal (durée), FSC ' diffusion avant, SSC - diffusion latérale. Les spécifications du filtre optique sont données en tant que longueur d'onde centrale/bande passante en nanomètres. Les réglages peuvent varier pour différents cytomètres d'écoulement et les tensions de détecteur doivent être ajustées pour différentes lignes cellulaires.

Figure 1
Figure supplémentaire 1 : Images microscopiques de foyers H2AX. Les cellules U87 ont été irradiées avec différentes doses de rayonnement de photon, fixes et souillées après 30 min selon le protocole présenté et préparées pour la microscopie comme décrit dans la discussion. À 2 Gy, les foyers individuels pouvaient être facilement distingués, tandis qu'à 8 Gy foci comptage était biaisé en raison de chevauchement considérable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dossier supplémentaire 1: Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La méthode décrite est facile à utiliser et offre une mesure rapide, précise et reproductible de la réponse aux dommages à l'ADN, y compris l'induction et la réparation de la rupture à double brin (DSB), les effets du cycle cellulaire et la mort des cellules apoptotiques. La combinaison de ces points de terminaison fournit une image plus complète de leurs interrelations que les essais individuels. La méthode peut être largement appliquée comme un test complet de génotoxicité dans les domaines de la biologie de la radioradio, de la thérapie et de la protection, et plus généralement en oncologie (p. ex., pour l'évaluation des facteurs de risque environnementaux, le dépistage des médicaments et l'évaluation de la génétique l'instabilité dans les cellules tumorales).

L'étape la plus critique dans ce protocole est la fixation des cellules. Pour obtenir un échantillon propre avec une population cellulaire clairement définie et une résolution optimale des différentes phases du cycle cellulaire, il est important de donner aux cellules adhérentes suffisamment de temps pour se détacher du vaisseau de culture et former une forme complètement ronde. Les cellules doivent être transférées dans la solution de fixation comme une suspension de cellule unique sans amas cellulaires. Pour les séparer, les cellules doivent être pipetted de haut en bas ou passé à travers une aiguille fine plusieurs fois dans les cas difficiles. Le temps de fixation doit être maintenu constant entre tous les échantillons et ne doit pas dépasser 20 min, y compris le temps de centrifugation avant la suspension des cellules dans 70% d'éthanol. Une fixation prolongée entraînera la perte d'épitopes accessibles pour la fixation des anticorps et diminuera la résistance et la sensibilité du signal de la méthode.

La principale limitation de la technique est qu'elle ne fournit pas d'informations sur la qualité des foyers de h2AX autres que l'intensité dans l'ensemble du noyau. Des foyers particulièrement importants de H2AX ainsi que l'apparition d'une coloration pannucléaire h2AX ont été liés à des DSB groupés1,27,28,29, qui sont des lésions très complexes qui sont très difficiles pour réparer30. Ces lésions groupées semblent être caractéristiques pour le rayonnement de particules tel que le rayonnement d'ion de carbone médicalement appliqué et peuvent être la raison de l'efficacité biologique supérieure du rayonnement lourd d'ion comparé aux photons31,32 ,33. L'analyse de la taille des foyers H2AX peut donc être intéressante en tant qu'indicateur de la complexité des dommages. Bien qu'il soit possible d'utiliser le protocole actuel avec un cytomètre de flux d'images pour visualiser les foyers de h2AX, la résolution réalisable ne peut pas rivaliser avec une approche microscopique classique. Cependant, nous avons préparé avec succès des diapositives microscopiques à partir des échantillons restants après la mesure cytométrique du débit (figuresupplémentaire 1) et évalué plusieurs caractéristiques, y compris le nombre de foci, la taille et l'intensité pannucléaire de h2AX à l'aide d'un système semi-automatisé d'imagerie et d'analyse. Pour préparer les échantillons pour la microscopie, 30 à 50 l des cellules tachées ont été réparties sur la surface d'un verre de couverture de 24 mm x 24 mm, séchés à l'air pendant la nuit à température ambiante dans l'obscurité, puis intégrés avec un support de montage sur une lame de verre.

En comparaison avec l'évaluation microscopique des niveaux de DSB par le comptage des focis H2AX, la mesure cytométrique du débit est supérieure en débit, taux d'échantillonnage, plage dynamique et précision. La gamme dynamique de comptage des foyers microscopiques est limitée par la résolution optique, ce qui conduit à l'incapacité de distinguer les foyers qui se chevauchent29,34. Dans la pratique, nous avons observé une relation linéaire entre la dose de rayonnement et les nombres de foyers H2AX inférieurs à 2 Gy, et un fort effet de saturation au-dessus de 2 Gy dans les cellules de glioblastome U871. En revanche, l'intensité du signal H2AX mesuré par la cytométrie du débit a augmenté linéairement avec la dose pour toute la gamme de dose testée (0-8 Gy).

La précision du comptage microscopique des foyers est limitée par l'incapacité de distinguer les différentes phases du cycle cellulaire sans colorations supplémentaires35. Le nombre d'ORD induits dans une cellule dépend non seulement de la dose de rayonnement, mais aussi de la teneur en ADN, et donc du stade du cycle cellulaire. Les cellules G2, par exemple, ont deux fois plus d'ADN que les cellules G1 et le nombre moyen d'ORD induits à une certaine dose de rayonnement est deux fois plus élevé pour les cellules G2 que pour les cellules G1. Ceci est clairement reflété dans l'intensité du signal H2AX des cellules G2 par rapport aux cellules G1 aux premiers moments après le rayonnement mesuré par cytométrie d'écoulement. Par conséquent, il est important d'évaluer les niveaux d'ISD d'une manière spécifique au cycle cellulaire afin d'obtenir des résultats précis. Une analyse en commun des cellules dans différentes phases de cycle cellulaire, comme d'habitude dans les approches microscopiques, peut être biaisée par des changements dans la distribution du cycle cellulaire en particulier en raison de l'arrêt G2 induit par les radiations. Pour tenir compte de cet effet et pour comparer les caractéristiques de réparation de l'ORD entre les différentes étapes du cycle cellulaire, les niveaux de h2AX peuvent facilement être normalisés en fonction de la teneur en ADN de la méthode de cytométrie du débit, comme indiqué dans le protocole.

Les extensions du protocole actuel sont possibles avec relativement peu d'effort supplémentaire. D'autres anticorps avec des étiquettes fluorophores compatibles peuvent être inclus à l'étape 3.4 sans avoir besoin d'étapes supplémentaires pendant la préparation de l'échantillon. Si une analyse plus détaillée de l'apoptose est souhaitée, caspase-7, -9 et -8 anticorps pourraient être inclus. Comme une autre extension, nous avons récemment inclus un colorant vivant et mort de cellules, un anticorps de T de troponine et des perles de comptage dans le protocole pour analyser spécifiquement des cardiomyocytes co-cultivés avec des fibroblastes après irradiation. L'ajout de la tache de cellule vivante/morte et des perles de comptage augmente la capacité de la méthode d'inclure la prolifération de fibroblaste et la mort cellulaire non-apoptotic des cardiomyocytes comme points de terminaison supplémentaires qui fournissent l'information supplémentaire utile sur la cellule destin après le stress génotoxique. Le protocole étendu est disponible sur demande.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions l'équipe de l'installation de cytométrie de flux du Centre allemand de recherche sur le cancer (DKFZ) pour son soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL filter tips Nerbe plus 07-693-8300
100-1,000 µL pipette Eppendorf 3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size BD Falcon 352235
15 mL tubes BD Falcon 352096
200 µL filter tips Nerbe plus 07-662-8300
20-200 µL pipette Eppendorf 3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 BioLegend 613406 Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 BD Pharmingen 560626 Dilute 1:20
BD FACSClean solution BD Biosciences 340345 For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution BD Biosciences 340346 For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Biochrom L 182 Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin Biochrom FG 0415 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute VWR 20821.330
Excel software Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum) Biochrom S 0615 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software LLC online order
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw NeoLab 11416
LSRII or LSRFortessa cytometer BD Biosciences
MG132 Calbiochem 474787 optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+ Heraeus
Paraformaldehyde AppliChem A3813 Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 Cell Signaling Technology #3475 Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2 Integra Biosciences 155 016
Serological pipettes, 10 mL Corning 4488
Serological pipettes, 25 mL Corning 4489
Serological pipettes, 5 mL Corning 4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) Biomol AG-40T-0002-C020 optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks Greiner bio-one 690160 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-025500 Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells ATCC ATCC-HTB-14 Example cell line used in the protocol

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References

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Lopez Perez, R., Münz, F., Kroschke, J., Brauer, J., Nicolay, N. H., Huber, P. E. Cell Cycle-specific Measurement of γH2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (151), e59968, doi:10.3791/59968 (2019).

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