Summary
Denne artikel beskriver genereringen af en ortotopisk musemodel af humant pleural mesotheliom ved implantation af H2052/484 Mesotheliom celler i pleural hulrum af immunkompromitterede athymic mus. Den langsgående overvågning af udviklingen af intrapleural tumorer blev vurderet af ikke-invasiv multimodal [18F] -2-fluoro-2-Deoxy-D-glucose Positron-emissions tomografi og computertomografi-billeddannelse.
Abstract
Malign pleural mesotheliom (MPM) er en sjælden og aggressiv tumor, der opstår i mesothelium, som dækker lungerne, hjertet og brysthulen. MPM-udvikling er hovedsageligt forbundet med asbest. Behandlinger giver kun beskeden overlevelse, da median overlevelsesgennemsnittet er 9 – 18 måneder fra diagnosetidspunktet. Derfor skal der identificeres mere effektive behandlinger. De fleste data, der beskriver nye terapeutiske mål, blev indhentet fra in vitro-eksperimenter og skal valideres i pålidelige in vivo prækliniske modeller. Denne artikel beskriver en sådan pålidelig MPM ortotopisk model opnået efter injektion af en menneskelig MPM cellelinje H2052/484 i pleural hulrum af immunodedygtige athymic mus. Transplantation i ortotopisk site gør det muligt at studere progression af tumor i det naturlige in vivo miljø. Positron emission tomografi/computertomografi (PET/CT) molekylær billeddannelse ved hjælp af den kliniske [18f] -2-fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18f] FDG) radiotracer er den diagnosemetode til at undersøge patienter med MPM. [18F] FDG-PET/CT blev derfor anvendt til at overvåge sygdomsprogression af H2052/484 ortotopisk-modellen i længderetningen. Denne teknik har en høj 3R potentiale (reduce antallet af dyr, refine at mindske smerter og ubehag, og rErstat dyreforsøg med alternativer), da tumor udvikling kan overvåges ikke-invasivt og antallet af dyr, der kræves kunne reduceres betydeligt.
Denne model viser en høj udviklingsrate, en hurtig tumorvækst, er omkostningseffektiv og giver mulighed for hurtig klinisk oversættelse. Ved at bruge denne ortotopisk xenograft MPM-model kan forskerne vurdere biologiske reaktioner af en pålidelig MPM-model efter terapeutiske indgreb.
Introduction
Malign pleural mesotheliom (MPM) er en kræft oftest forbundet med eksponeringen for asbestfibre1,2,3. Selv om asbest er blevet forbudt i de fleste vestlige lande4,5,6, forekomsten af MPM er stadig stigende7,8. For nylig tyder eksponering af mus på Carbon Nanorør, at de kan resultere i en betydelig sundhedsrisiko i mennesker9,10. Dataene tyder på, at eksponering for disse produkter kan forårsage kronisk inflammation og molekylære ændringer (f. eks tab af tumor-suppressor veje), der ligger til grund for progression til malign lungehindekræft. I øjeblikket er multiwall Carbon Nanorør et af de vigtigste produkter af nanoteknologi og er i stigende grad indarbejdet i forskellige produkter som kompositter, energi lagrings materialer, medicin, elektronik og miljømæssige afhjælpnings materialer.
MPM er en kræft med dårlig prognose, og de fleste patienter dør inden for to år efter diagnosen på grund af en begrænset effekt af de nuværende behandlingsmetoder11. Valget af behandling for MPM afhænger af kræft scenen. For de fleste tidlige fase MPM (fase 1 og muligvis nogle fase 2 eller 3 tumorer), den kliniske tilgang er en multimodal terapi, herunder kirurgisk resektion af tumorer, forbundet til strålebehandling og kemoterapi12. En kombineret kemoterapi med Cisplatin og pemetrexed er indiceret til behandling af de fleste patienter diagnosticeret med fremskreden lokalt invasiv sygdom, der ikke er modtagelig for kirurgisk resektion, eller som ellers ikke er kandidater til helbredende kirurgi13,14. Der er derfor et presserende behov for at udvikle mere effektive behandlinger for MPM-patienter. Der er dog få validerede in vivo-dyremodeller, der afspejler MPM'S kliniske relevans. Flere murine MPM modeller er blevet udviklet, men de fleste af dem ikke trofast rekapitulere de komplekse aspekter af MPM tumor mikromiljø15,16,17,18. Brugen af asbest-induceret MPM i mus, genmanipulerede MPM-musemodeller eller modeller af syngeneisk transplantation af murine MPM-cellelinjer er begrænset af grundlæggende fænotypiske og funktionelle forskelle og derfor dårligt oversætte nye opdagelser til klinikken. Andre prækliniske murine MPM-modeller er for det meste afhængige af subkutane eller peritoneale xenografter af humane cellelinjer i immundefekt mus. Selv om disse modeller er lette at overvåge og levere grundlæggende data, er mikromiljøet af disse xenografter ikke så sammenlignelige med humane tumorer, der hæmmer den translationelle effekt i de fleste af disse prækliniske studier17,19. Omvendt, ortotopisk xenografter bedre afspejle patientens tumor adfærd og respons på behandling, da de er omgivet med en lignende mikromiljø som den, der findes i den oprindelige tumor site16.
Molekylær billeddannelse med [18F] FDG-PET/CT er den foretrukne metode til at overvåge sygdomsprogression i længderetningen hos patienter med MPM20,21. Derfor, ty til denne ikke-invasive Imaging metode i høj grad fremmer oversættelsen af prækliniske undersøgelser til kliniske forsøg16,22. Desuden bidrager det til at reducere det krævede antal dyr, da hvert dyr repræsenterer sin egen kontrol over tid.
I denne artikel præsenterer vi en pålidelig ortotopisk xenograft MPM model opnået efter injektion af den humane MPM cellelinje H2052/484 ind i pleural hulrum af athymic mus. Kombineret med [18F] FDG-PET/CT Imaging, denne model er en værdifuld og reproducerbar metode til at studere funktionelle og mekanistiske virkninger af nye diagnostiske strategier og behandlinger for menneskelig MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der er beskrevet nedenfor, blev godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse og af dyrlæge statens kontor i Genève, Schweiz (tilladelse GE/106/16). MPM Cell line H2052/484 blev etableret og karakteriseret i vores laboratorium som beskrevet i artiklen af Colin DJ og et al.23. Kort, H2052/484 cellelinje blev etableret fra en thorax tumor opnået efter en intrapleural injektion af NCI-H2052 (ATCC) celler i immunodedygtige Nude mus.
1. eksperimentel design
- Bestem, hvor mange mus der er behov for i henhold til eksperimentet ved hjælp af statistisk effekt beregning (f. eks. http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
- Mindst en uge før implantation, købe otte til ti-ugers gamle athymic kvindelige Nude mus Foxn1nu nu/nu og huse dem i en specifik-patogen-fri (SPF) miljø i mindst en uge.
2. klargøring af celler til implantation
- Beregn, hvor mange H2052/484 celler der er brug for, da hver mus injiceres med 1 x 106 celler (trin 1,1). Forbered et ekstra antal celler som injektion til mus vil involvere sprøjte prøvetagning.
- Kultur MPM H2052/484 Cell line i RPMI 1640 medium suppleret med 10% (v/v) føtal kvægserum (FBS), 100 enheder/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin i en vævskultur inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Kultur celler til implantation til ca. 80% sammenløbet (~ 7 x 106 celler pr. 15 cm Petri skål).
- Om 1 h før podning, forberede cellerne.
- Kassér mediet, vask cellerne med sterile PBS uden calcium og magnesium (10 mL pr. 15 cm Petri skål), og frigør cellerne ved at inkube i 5 min med 0,05% trypsin-2 mM EDTA (2 mL pr. 15 cm petriskål).
- Saml cellerne i RPMI-mediet (10 mL pr. 15 cm Petri skål), og Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer.
- Saml det relevante antal celler for det antal mus, der skal injiceres, i betragtning som beregnet i henhold til trin 1,2.
- Centrifugeres ved 300 x g i 3 min., vask celle pellet i 10 ml rpmi-medium uden FBS og centrifugeres igen ved 300 x g i 3 min.
- Cellerne opslæmmes i en passende mængde RPMI-medium uden FBS til en koncentration på 1 x 106 celler pr. 50 μl, da hver mus skal injiceres med et volumen på 50 μl.
3. tumor celle implantation
- Før implantation forberedes anæstesi systemet og operationsområdet i en laminar flow hætte ved at sprøjte alle overflader med et desinfektionsmiddel. Forbered sterile eller desinficerede forsyninger i laminar flow hætten, herunder anæstesi systemet, varmepuden for at opretholde musens kropstemperatur, polyvidon jod-opløsningen, en 30 G Hamilton-sprøjte (f. eks. 705RN-sprøjte, 30 G nål-20 mm-punkt 4), steril gaze og vatpinde, sterile engangs skalpeller og kirurgiske instrumenter og sterile Mikropipetter og spidser.
- Hold og Åbn de mikroisolerede SPF-bure i den desinficeres flow hætte og anæstetize en mus efter den anden i henhold til podning hastighed. Podning varighed er omkring 5 – 10 min for eksperimenterede teknikere.
- Anæstesier mus ved at inducere først med 4 – 5% isofluran. Derefter vedligeholde under anæstesi på varmepuden mens podning med 3% isofluran. Bestem dybden af anæstesi ved tab af opretterende refleks ved mus.
- Når en mus er bedøvet, injiceres subkutant 0,05 mg/kg buprenorphin som en analgetisk/postoperativ smertelindring.
- Placer musen på dens højre side (højre lateral decubitus) på varmepuden.
- Rengør operationsområdet med polyvidon jod opløsning og lav en 5 mm indsnit af huden og klar omgivende fedt og muskler med stump saks til at udsætte ribbenene.
- Cellesuspensionen homogeniseres i en koncentration på 1 x 106 celler pr. 50 ΜL rpmi-medium uden FBS og belastning 50 μl af suspensionen med Hamilton-sprøjten. Undgå luftbobler og tør nålen med 70% alkohol for at undgå ikke-ortotopisk podning af celler. Homogeniser cellesuspensionen før hver injektion.
- Injicer langsomt cellerne i pleural hulen mellem 6th og 7th ribben med en vinkel på 30 ° og en dybde på 2 – 3 mm lige under interkostale muskler. Sørg for ikke at injicere i lungerne ved at holde nålen lige under ribbenene. Nålen skal være synlig ved hjælp af gennemsigtighed gennem musklerne (figur 1A).
- Luk såret med tre til fire absorberbare suturer.
- Opbevar musene i et opvarmet miljø, indtil de vågner.
- Dagen efter, gentagen buprenorphin injektion. Overvåg mus i henhold til eksperimentel design og autorisation.
4. [18F] FDG-PET/CT Imaging
Bemærk: Alle de procedurer, der er beskrevet nedenfor, skal godkendes af lokale stalde og billedbehandlings anlæg. Sørg for, at radioaktive materialer importeres, lagres og håndteres i henhold til lokale strålings sikkerhedsregler (f. eks. lager opløsninger, afskærmet hætte håndtering). SPF betingelser kan opretholdes ved at manipulere dyrene i en laminar flow hætte og ved at indlæse dem i SPF-kompatible scanner seng (figur 1B, C).
- Overvåg tumor udvikling udfører PET/CT Imaging, en gang om ugen, startende på dag 7 efter implantation af H2052/484 celler. Hvert dyr repræsenterer sin egen kontrol over tid.
- Undgå lidelser for dyr før billeddannelse ved at transportere mus til et billedbehandlings anlæg, hvis det er tilgængeligt, eller Opbevar dem tæt på anlægget.
- Hurtige mus til 12 – 16 timer før [18F] FDG-PET/CT, som reducerer baggrunds signaler. Se Fueger24 , som beskrev virkningen af dyre håndtering på [18F] FDG-PET/CT-scanninger.
- Defiltrere og opbevare musene seng i henhold til lokale regler.
- Registrere alle tidspunkter af radioaktivitet doser målinger, injektioner og PET scanninger at være i stand til at beregne SUVs.
- Pre-varm mus ved 30 °C i 30 min før injektion af [18F] FDG, der reducerer brunt fedtvæv (bat) metabolisme. For eksempel, præ-varme i varme kamre, ved hjælp af varmepuder eller ved hjælp af infrarøde lamper.
- Forbered 3 – 4 MBq-doser på [18F] FDG fra stamopløsning i 150-200 μl saltvand i 1 ml insulin sprøjter ved hjælp af en dosis kalibrator. Insulin sprøjter har den fordel at have næsten ingen døde volumen og kunne undgå måling af resterende aktivitet efter injektion.
- Bedøvelses mus med isofluran som beskrevet i trin 3,3. Veje mus og derefter injicere intravenøst 3 – 4 MBq [18F] FDG. Retro-orbital injektion er en metode til valg, da det er hurtigt, nemt og undgår hale vene injektion spørgsmål eller forsinket optagelse af intraperitoneal injektion.
- Efter injektion, lad mus vågne for 45 min i deres bure under de varme forhold initieret i trin 3,5. Varigheden af [18F] FDG-optagelsen er 1 time; 15 min er normalt nok til at indlæse mus på sengen og udføre CT før PET.
- Anæstetiserer mus med isofluran som beskrevet i trin 3,3 og læg dem på scanner sengen (figur 1B).
- Overfør sengen til scanneren og emne dyrene til en CT-scanning centreret på lungerne. Erhverve scanninger på 80 kVp, 160 μA, 1024 fremskrivninger under en 360 ° rotation, med et synsfelt af 74 mm (1.6 x forstørrelse, eksempel på triumf erhvervelse) (figur 1C).
- Flyt sengen til PET-undersystemet og start købet 1 time efter [18F] FDG injektion for en varighed på 15 min. Med de fleste af PET/CT-systemer, kan sengen flyttes automatisk fra CT til PET til at holde FOV centreret på samme område.
- Fjern musene fra billed kammeret og lad dem komme sig i deres bur.
- Hold mus i et område dedikeret til radioaktivt forfald i henhold til lokale regler.
5. analyser af [18F] FDG-PET/CT-scanninger
- Rekonstruere CT-scanninger udført under ovennævnte betingelser med en matrix af 512 og en voxel størrelse på 0,144 mm (filtreret tilbage projektion-FBP algoritme, indbygget software). Rekonstruere PET skanner benytter en 20 iterationer i en bestilt delmængde forventning maksimum-3 dimension-OSEM3D algoritme. Kalibrer billederne i BQ/mL ved at scanne en fantom cylinder. Automatisk Co-registrere CT og PET scanninger i henhold til din indbyggede software løsning.
- Analysér lunger-volumener ved hjælp af analysesoftwaren (tabel over materialer).
- Indlæs CT-data som reference (Ref) ved at klikke på ikonet Åbn data . Indlæs derefter PET-data som input (Inp1) ved at klikke på ikonet Tilføj data .
- Juster farveskalaer ("WL") af CT og PET til kontrast billeder til visuel inspektion.
- Vælg 3D ROI Tool fra drop-down menuen, klik på Tilføj ROI og navngiv fillungerne. Klik på segmenterings algoritmer | Kvarter Thresholding. Definer input som baggrund og billede som Ref. Indtast min og Max i henhold til musen lunge tæthed værdier, typisk-800 og-300 Hu. Undersøg 3D-gengivne lunger ved at klikke på vtk -ikonet og hente lydstyrken i tabellen, der genereres ved at klikke på ikonet Vis tabel.
- Analysér [18F] FDG-Optag i tumorer ved at udtrække maksimale standard optagelses værdier (SUVmax).
- Konverter PET billeder kalibreret i BQ/mL til SUV ved at vælge aritmetik fra drop-down menuen, så skalar formere sig og bruge Inp1 som valgt og skalar er BQ/ml til SUV faktor beregnet som følger: SUV = (BQ/ml)/(injiceret dosis (BQ)/legemsvægt (g)).
- Vælg 3D ROI Tool fra drop-down menuen, klik på Tilføj ROI og Navngiv filen tumorer. Klik på 3D Paint mode | Sfære. Fjern markeringen af kun 2D. Juster størrelsen af figuren og omgiver tumorer. Sørg for ikke at inkludere eventuelle forstyrrende signaler, der kommer fra hjertet for eksempel. Hent SUVmax-værdien i den tabel, der genereres ved at klikke på ikonet Vis tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den H2052/484 ortotopisk model
Orthotopic MPM modeller ved intra-thorax injektion af dyrkede kræftceller, især H2052/484 celler er relativt let at setup. De forskellige trin beskrevet ovenfor kræver kun beskeden cellekultur viden og kirurgi trin er tilgængelige for moderat uddannet dyreforsøg. Nøgne mus og celler bør manipuleres under sterile forhold for at maksimere resultatet af implantationer. Ved omhyggeligt at følge denne protokol, som involverer kort bedøvelse og minimal kirurgi, vi stødte kun 1 død blandt 266 mus injiceres med forskellige MPM cellelinjer. Ingen pneumothorax eller intra-pulmonale implantationer af tumorceller blev observeret blandt disse 266 mus omhyggeligt injiceres som beskrevet. Specifikt, den ortotopiske tumor udvikling sats af H2052/484 cellelinje er høj, da 93,8% af injicerede mus udviklet tumorer (n = 118). H2052/484 tumorer kan påvises ved PET/CT Imaging fra 14 dage efter injektion og den mediane varighed af forsøget i henhold til vores Endpoint kriterier var 31 dage i et repræsentativt eksperiment21. Som vi beskrev i denne anden undersøgelse21, tumorer blev lokaliseret i thorax hulrum, frit distribueres eller fastgjort på lungerne, thorax muskler, aortabuen eller ringere Vena cava. Metastaser blev ikke fundet.
MPM-overvågning af [18F] FDG-PET/CT Imaging
Orthotopic MPM blev overvåget ugentligt af kombineret PET/CT-scanning med den udbredte radiotracer [18F] FDG, der akkumuleres i stærkt metaboliske tumorer. Longitudinale anatomiske CT-scanninger tilladt visualisering af effekten af MPM udvikling på morfologien af lunger. Automatisk segmentering af stærkt kontrast rede lunger på CT-scanninger er enkel på grund af deres lave densitet i forhold til omgivende væv. 3D-gengivelser giver et overblik over lokaliseringen af tumorer og langsgående mængder af lunger kan ekstraheres (figur 2A). Lungevolumen målinger af CT faldt betydeligt over tid efter MPM injektion af mus med intrapleural (IPL) H2052/484 tumorer (figur 2B). Faktisk, MPM tumorer vokse inde i pleural hulrum og skabe pres på lungerne, reducere deres volumener. Korrelations analyser viste, at lunge volumener var omvendt korreleret til monitorerings tidspunktet med en koefficient for bestemmelse R2 af 0,8 (figur 2C). Samlet, disse data viser pålideligheden af CT-scanning til at overvåge udviklingen af denne MPM model.
Kombineret med CT, en [18F] FDG-PET-scanning giver yderligere og værdifulde oplysninger om den metaboliske status af MPM tumorer. Mens nogle gange kan det være kompliceret at fortolke CT og PET scanner billeder af sig selv, især på tidlige tidspunkter, en kombination af begge metoder giver yderligere robusthed til diagnose. Faktisk, repræsentative langsgående [18F] FDG-PET/CT overvågning udført mellem 10 dage og 44 dage af en mus med IPL H2052/484 tumorer viser, at tumorer begynder at skelne 2 uger efter podning (figur 3a). Dette eksempel fremhæver væksten og [18F] FDG aviditet af tumorer placeret i periferien af thorax hulrum og langs hjertet store fartøjer (hvide pile). [18F] FDG optagelse i tumorer blev kvantificeret ved at udtrække SUVMax i Rois trukket over tumorer, ved hjælp af CT-scanninger, og viser betydelige tidsafhængige stigninger i deres glukose metabolisme (figur 3B). Korrelations analyser viste, at SUVMax var positivt korreleret til monitorerings tidspunktet med en koefficient for bestemmelse R2 af 0,7 (figur 3C). Disse data viser pålideligheden af [18F] FDG-PET-scanninger for at overvåge skæbnen for H2052/484 ortotopisk tumorer. Endelig, lunge volumener og [18F] FDG aviditet, henholdsvis analyseret af CT og PET, korrelerer med hinanden med en R2 af 0,6 understøtter styrken af disse målinger til at studere MPM ortotopisk tumorer udvikling (figur 4).
Figur 1: nøgen mus ortotopisk xenograft model. (A) intrapleural (IPL) injektion af humane MPM-celler i det venstre pleural hulrum som beskrevet i protokol afsnittet. (B, C) Mus er bedøvet og læsset i PET/CT seng i en laminar flow hætte derefter overføres til scanneren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: tumor vækst af ortotopisk H2052/484 MPM model overvåges af CT. (A) repræsentative 3D rekonstruktioner af CT-scanninger viser H2052/484 MPM IPL tumorer og deres virkning på lungevolumen (VP) på forskellige tidspunkt i dage efter implantation. Hvide pilespidser viser placeringen af MPM IPL tumorer. B) violin plot, der viser et repræsentativt tidsforløb for lunge volumener (VL), n = 6. En-vejs ANOVA test med Tukey's multiple sammenligninger statistikker er angivet. Bogstaver indikerer betydelige forskelle mellem modeller med a, b, c, d, e, f, der angiver henholdsvis D10, D16, D23, D29, D36 og D44. Tilsvarende p-værdier: x, p < 0,05; XX, s < 0,01; XXX, s < 0,001; xxxx, s < 0,0001. (C) sammenhængen mellem faldet i lungevolumen relateret til IPL MPM udvikling og tid efter injektion. Lineær regression afbildes som en tyk farvet linje og relaterede SD som stiplede sorte linjer. Grafer og statistiske analyser blev udført med software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tumor metabolisme af IPL MPM-modellen efterfulgt af [18F] FDG-micropet/CT. A) repræsentative PET/CT-scanninger,derviser MPM IPL-tumorer. PET/CT billeder viser Trans-aksiale skiver af brystet område, der indeholder [18F] FDG-Avid tumorer, med CT (grå skala) giver anatomiske oplysninger og kæledyr (kalibreret pseudo-farveskala) viser placering og intensitet af høj tumor og orgel glukose udnyttelse. Efter injektion dage er indiceret. CT: CT mediastinale vindue; [18F] FDG-PET/CT: smeltet billede af PET-og CT-scanninger. Hvide pilespidser viser MPM IPL tumorer. L = lunge, H = hjerte, BAT = brunt fedtvæv. (B) violin plot viser en repræsentativ tid løbet af SUVMax knyttet til MPM metabolisme, n = 6. En-vejs ANOVA test med Tukey's multiple sammenligninger statistikker er angivet. Bogstaver indikerer betydelige forskelle mellem modeller med a, b, c, d, e, f, der angiver henholdsvis D10, D16, D23, D29, D36 og D44. Tilsvarende p-værdier: x, p < 0,05; XX, s < 0,01; XXX, s < 0,001; xxxx, s < 0,0001. (C) sammenhængen mellem stigningen i SUVMax i IPL MPM tumorer og tid efter injektion. Lineær regression afbildes som en tyk farvet linje og relaterede SD som stiplede sorte linjer. Grafer og statistiske analyser blev udført med software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: korrelation mellem MPM-udvikling overvåges af lungevolumen og metabolisk tumor aktivitet. Korrelation mellem SUVMax og lungevolumen (VL) vises som en lineær regression plottet som en tyk farvet linje og relaterede SD som stiplede sorte linjer. Grafer og statistiske analyser blev udført med software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en oprindelig ortotopisk model af MPM H2052/484 celler injiceres i pleural hulrum af athymic mus og en metode til overvågning af små dyr PET/CT Imaging. Denne model kan gennemføres med moderat dyre håndtering og kirurgi færdigheder og viser en meget god udvikling sats. Det giver mulighed for en stor eksperimentel vindue på omkring 10 uger i ubehandlede mus og ikke-invasiv langsgående påvisning af tumorer så tidligt som 2 uger efter injektion.
Orthotopic modeller stole på implantation af levende celler eller væv direkte ind i det oprindelige miljø af tumoren. Den væsentligste forskel mellem almindeligt anvendte subkutane eller intraperitoneale MPM-modeller og intrapleural modeller ligger i deres mikromiljø. Faktisk mikromiljø af tumorer indeholder flere stromale celletyper (fibroblaster, leukocytter, makrofager) ud over kræftceller25. Disse stromale celler udskiller vækstfaktorer og cytokiner bidrager til tumor mikromiljø at moduere tumorvækst. Tumorens mikromiljø varierer med det anatomiske sted, hvilket tyder på, at en ortotopisk xenograft vil udvikle sig og reagere forskelligt på en behandling end en subkutan25. Da ortotopiske xenografter er omringet af et sammenligneligt mikromiljø til det, der findes hos MPM-patienter, bør deres adfærd og respons på behandlingen derfor bedre afspejle den kliniske situation17,19.
Mange prækliniske modeller i kræftforskning implicere immundefekt mus for at sikre menneskelig xenograft succes. Nøgne mus ikke besidder moden thymus og mangler en vital del af tumor mikromiljø26. Selvom nøgne mus ikke besidder moden thymus og derfor er mangelfuld i T-celler, de præsenterer modne lymfocytter B, neutrofiler, monocytter og makrofager i deres pleural mikromiljø i modsætning til mere undergivende og meget mangelfuld SCID mus26. I de tidlige stadier af MPM-udvikling har regulatoriske T-celler en vigtig suppressiv rolle. Men i mere avancerede stadier, myeloide celler, herunder neutrofiler og makrofager erstatte Treg celler; i denne funktion er den undertrykkende rolle af regulatoriske T-celler kun vigtig i de tidlige stadier af MPM Development23,27. Selv om undersøgelser, der involverer et fuldstændigt immunrespons (f. eks. immunterapier, der involverer et T-respons), ikke kan undersøgt i den model, som præsenteres her, postulerer vi, at denne ortotopiske model holder al sin interesse for at vurdere nye behandlinger eller nye diagnostiske værktøjer af MPM.
I et metodologisk synspunkt, der er kritiske skridt til at holde sig for øje at maksimere udviklingen af intrapleural MPM tumorer. Før etablering af mus modeller, har adgang til eksponentielt voksende celler (mindre end 80% konfluency, afhængigt af cellelinjer) og til 8 til 10 måneder akklislede mus. Faktisk, injektion yngre små mus er svært og kan resultere i ektopisk injektioner og ændre overlevelse. Under implantationsproceduren bør der træffes standard kirurgi forholdsregler, og stump saks bør anvendes især når incising for at undgå blødning, som kan føre til døden af dyr. Valget af sprøjten (f. eks. den model, der er beskrevet her) og den protokol, der præsenteres her, giver mulighed for præcis og blid injektion af en lille mængde medium indeholdende tumorceller for at sikre intrapleural injektion (30 ° vinkel, 2 – 3 mm dybde).
Langsgående monitorering af ortotopiske MPM-modeller kan kun udføres ikke-invasivt ved billedbehandlings teknik. PET/CT er den rådgivet metode i klinisk praksis at diagnosticere MPM og har derfor været anvendt i dette studie20,21. Sammenlignet med almindeligt anvendt optisk billeddannelse involverer PET/CT-scanning brugen af radioaktive forbindelser og er derfor mere delikat at setup på grund af sikkerheden, logistikken af aktive og dens omkostninger28. Ikke desto mindre er PET/CT Imaging ikke afhængig af genetisk modifikation af tumorceller og giver høj opløsning tomographic, anatomisk og molekylær information. Optisk billeddannelse er også hurtigere end PET/CT, men billedbehandlings systemet præsenteret i denne artikel involverer en 3-mus seng og omkring 20 mus kan scannes pr. dag, hvilket er en rimelig gennemstrømning i betragtning af de indsamlede oplysninger. Brugen af den yderst tilgængelige kliniske radiotracer [18F] FDG garanterer en høj translationel effekt til forskning udført med denne teknik29. Selv om [18F] FDG-Pet Scan aflæsninger og analyser kan kræve nogle erfaringer på grund af den høje optagelse i omgivende hjerte og brune fedtvæv, dets kombination med CT forædler diagnose. Under [18f] FDG PET/CT eksperimenter, fastende og opvarmning mus samt at udføre en optagelsestid på [18f] FDG af 1 h kan betydeligt forbedre visualisering af tumorer, da SCANNINGS forholdene meget indvirkning Pet kontraster som allerede beskrevet24. Yderligere undersøgelser af prækliniske ortotopiske modeller, der involverer andre klinisk anvendte radio Tracers som [18f] Fluorothymidin (flt) eller [18f] Fluoromisonidazol (fmiso), som overvåger henholdsvis spredning og hypoksi, kan give mere information om sådanne pålidelige ortootopiske MPM-modeller29.
Endelig er denne relevante translationelle model kombineret med ikke-invasiv billeddannelse perfekt i overensstemmelse med 3R-konceptet: reduce antallet af dyr, refine til at mindske smerter og ubehag og rErstat dyreforsøg med alternativer22. Inden for det samme sæt dyr kan terapeutisk opfølgning og respons således overvåges ikke-invasivt ved at tillade langsgående målinger gennem hele forsøgene, hvilket reducerer antallet af dyr, der kræves pr. eksperiment. Da hvert enkelt dyr desuden repræsenterer sin egen kontrol over tid, øger ikke-invasiv billeddannelse også stærkt statistisk effekt, hvilket reducerer antallet af nødvendige dyr for at opnå pålidelige data16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Ligue genevoise contre Le cancer (til V.S.-B.) og af Center for Biomedical Imaging (CIBM) af universiteter og hospitaler i Genève og Lausanne (til D.J.C., O.B. og S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
- Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
- Mossman, B. T., Gee, J. B.
- Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
- Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
- LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
- Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
- Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
- Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
- Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
- Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
- Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A.
- Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
- Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
- Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
- Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
- de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
- Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
- Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
- Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
- Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
- Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
- Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).
