Summary
Denna artikel beskriver generationen av en ortotopisk musmodell av humant pleurautgjutning mesoteliom genom implantation av H2052/484 mesoteliom celler i pleurautgjutning hålighet av immunkomprometterade atymiska möss. Den longitudinella övervakningen av utvecklingen av intrapleural tumörer bedömdes genom icke-invasiv multimodal [18F] -2-fluoro-2-Deoxy-D-glukos positron emissions tomografi och datortomografi Imaging.
Abstract
Malignt pleurautgjutning mesoteliom (MPM) är en sällsynt och aggressiv tumör som uppstår i mesothelium som täcker lungorna, hjärtat, och brösthålan. MPM utveckling är främst förknippad med asbest. Behandlingar ger endast blygsam överlevnad eftersom median överlevnad genomsnittet är 9 – 18 månader från tidpunkten för diagnosen. Därför måste effektivare behandlingar identifieras. De flesta data som beskriver nya terapeutiska mål erhölls från in vitro-experiment och måste valideras i pålitliga in vivo prekliniska modeller. Denna artikel beskriver en sådan pålitlig MPM neobladder modellerar erhållande efter injektion av en människa MPM cell fodrar H2052/484 in i pleurautgjutning hålighet av immunobristfällig atymiska möss. Transplantation i ortotopisk webbplats gör det möjligt att studera utvecklingen av tumören i den naturliga in vivo miljön. Positron emissions tomografi/datortomografi (PET/CT) molekylär avbildning med hjälp av den kliniska [18f] -2-fluoro-2-Deoxy-D-glukos ([18f] FDG) radiotracer är diagnosmetod för att undersöka patienter med MPM. Följaktligen användes [18F] FDG-PET/CT för att longitudinellt övervaka sjukdomsförloppet för H2052/484-ortotopisk modell. Denna teknik har en hög 3R potential (reducera antalet djur, refine att minska smärta och obehag, och rErsätt djur experiment med alternativ) eftersom tumörutveckling kan övervakas icke-invasivt och antalet djur som krävs kan minskas avsevärt.
Denna modell visar en hög utvecklingstakt, en snabb tumörtillväxt, är kostnadseffektiv och möjliggör snabb klinisk översättning. Genom att använda denna neobladder xenograft MPM-modell kan forskarna bedöma biologiska reaktioner av en tillförlitlig MPM-modell efter terapeutiska ingrepp.
Introduction
Malignt pleurautgjutning mesoteliom (MPM) är en cancer som oftast förknippas med exponering för asbestfibrer1,2,3. Även om asbest har förbjudits i de flesta västerländska länder4,5,6, är incidensen av MPM ökar fortfarande7,8. Nyligen tyder exponering av möss till kolnanorör att de kan resultera i betydande hälsorisker hos människor9,10. Data tyder på att exponering för dessa produkter kan framkalla kronisk inflammation och molekylära förändringar (t. ex. förlust av tumör-suppressor vägar) som ligger bakom progression till malignt mesoteliom. För närvarande, flerväggiga kolnanorör är en av de viktigaste produkterna av nanoteknik och alltmer införlivas i olika produkter såsom kompositer, energilagring material, medicin, elektronik, och miljösanering material.
MPM är en cancer med dålig prognos, och de flesta patienter dör inom två år efter diagnosen på grund av en begränsad effekt av nuvarande behandlingsformer11. Valet av behandling för MPM beror på cancer stadiet. För de flesta tidigt stadium MPM (steg 1 och möjligen några steg 2 eller 3 tumörer), den kliniska metoden är en multimodal terapi inklusive kirurgisk resektion av tumörer, associerade till strålbehandling och kemoterapi12. En kombinerad kemoterapi med cisplatin och pemetrexed är indicerat för behandling av de flesta patienter som diagnostiserats med avancerad lokalt invasiv sjukdom, som inte är mottaglig för kirurgisk resektion, eller som annars inte är kandidater för kurativ kirurgi13,14. Det finns därför ett trängande behov av att utveckla effektivare behandlingar för MPM-patienter. Det finns dock få validerade in vivo djurmodeller som återspeglar den kliniska relevansen av MPM. Flera murina MPM modeller har utvecklats, men de flesta av dem inte troget recapitulate de komplexa aspekterna av MPM tumör mikromiljö15,16,17,18. Användningen av asbestinducerad MPM i möss, genetiskt modifierade MPM Mouse-modeller, eller modeller av uterustransplantat-transplantation av murin MPM-cellinjer begränsas av grundläggande fenotypiska och funktionella skillnader och därmed dåligt översätta nya upptäckter till kliniken. Andra prekliniska murina MPM modeller förlitar sig främst på subkutan eller peritonealdialys xenograft av humana cellinjer hos immunofattiga möss. Även om dessa modeller är lätta att övervaka och ge grundläggande data, mikromiljön av dessa xenograft är inte så jämförbar med mänskliga tumörer försämra den translationella kraften i de flesta av dessa prekliniska studier17,19. Omvänt, ortoämne xenograft bättre återspegla patientens tumör beteende och svar på behandling som de är omgivna med en liknande mikromiljö som den som finns i den ursprungliga tumören plats16.
Molekylär avbildning av [18F] FDG-PET/CT är en metod för val av longitudinellt övervaka sjukdomsprogression hos patienter med MPM20,21. Att tillgripa denna icke-invasiva avbildningsmetod främjar därför kraftigt översättningen av prekliniska studier till kliniska prövningar16,22. Dessutom bidrar det till att minska erforderligt antal djur eftersom varje djur representerar sin egen kontroll över tiden.
I denna artikel presenterar vi en tillförlitlig ortotopisk xenograft MPM-modell som erhålls efter injektion av den humana MPM-celllinjen H2052/484 i pleurahålan hos atymiska-möss. Tillsammans med [18F] FDG-PET/CT Imaging, är denna modell en värdefull och reproducerbar metod för att studera funktionella och mekanistiska effekter av nya diagnostiska strategier och behandlingar för Human MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs nedan godkändes av den institutionella myndigheten för djuromsorg och användning och av veterinärmyndigheten i Genève, Schweiz (bemyndigande GE/106/16). MPM cell line H2052/484 etablerades och karaktäriserades i vårt laboratorium så som beskrivs i artikeln i Colin DJ och et al.23. Kortfattat, H2052/484 cellinjer bildades från en bröstkorg tumör erhålls efter en intrapleural injektion av NCI-H2052 (ATCC) celler till immunobristfällig naken möss.
1. experimentell design
- Bestäm hur många möss som behövs enligt experimentet med statistisk effekt beräkning (t. ex. http://powerandsamplesize.com/calculators/).
- Minst en vecka före implantation, köpa åtta till tio veckor gamla atymiska kvinnliga naken möss Foxn1nu nu/nu och hus dem i en specifik-patogen-fri (SPF) miljö i minst en vecka.
2. beredning av celler för implantation
- Beräkna hur många H2052/484 celler som behövs eftersom varje mus injiceras med 1 x 106 celler (steg 1,1). Förbered ett extra antal celler som injektion till möss kommer att innebära spruta provtagning.
- Odla MPM H2052/484 cellinjer i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% (v/v) foster bovint serum (FBS), 100 enheter/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° c med 5% CO2.
- Kultur celler för implantation till cirka 80% sammanflödet (~ 7 x 106 celler per 15 cm petriskål).
- Ca 1 h före ympning, Förbered cellerna.
- Kassera media, tvätta celler med steril PBS utan kalcium och magnesium (10 mL per 15 cm petriskål) och lossa celler genom att inkuberas i 5 minuter med 0,05% trypsin-2 mM EDTA (2 mL per 15 cm petriskål).
- Samla cellerna i RPMI medium (10 mL per 15 cm petriskål) och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Samla in lämpligt antal celler för det antal möss som ska injiceras med tanke på beräknat enligt steg 1,2.
- Centrifugera vid 300 x g i 3 min, tvätta cellpelleten i 10 ml RPMI-medium utan FBS och centrifugera igen vid 300 x g i 3 min.
- Omsuspendera cellerna i en lämplig volym av RPMI-mediet utan FBS till en koncentration av 1 x 106 celler per 50 μl, eftersom varje mus måste injiceras med en volym på 50 μl.
3. implantation av tumörceller
- Förbered anestesisystemet och det kirurgiska området i ett laminärt flödes skydd före implantationen genom att spraya alla ytor med ett desinfektionsmedel. Förbered sterila eller desinficerade leveranser i laminär Flow Hood inklusive anestesisystemet, värme pad för att upprätthålla mus kroppstemperatur, polyvidon jod lösning, en 30 G Hamilton spruta (t. ex. 705RN spruta, 30 G nål-20 mm-punktstil 4), sterila gasväv och bomullsvabb, sterila engångsskalpeller och kirurgiska instrument samt sterila Mikropipetter och tips.
- Håll och öppna de mikroisolerade SPF-burarna i det desinficerade Flow Hood och bedövas en mus efter den andra enligt ympnings hastigheten. Graftering varaktighet är ca 5-10 min för experimenterade tekniker.
- Anestetisera möss genom att inducera först med 4 – 5% isofluran. Sedan underhålla under anestesi på värmeplattan medan ympning med 3% isofluran. Bestäm djupet av anestesi genom förlusten av rätande reflex med musen.
- När en mus bedövas, injicera subkutant 0,05 mg/kg buprenorfin som en analgetisk/postoperativ smärtlindring.
- Placera musen på dess högra sida (höger lateral Decubitus) på värmeplattan.
- Rengör det kirurgiska området med polyvidon jodlösning och gör ett 5 mm snitt av huden och rensa omgivande fett och muskler med trubbig sax för att exponera revbenen.
- Homogenisera cellsuspensionen vid en koncentration av 1 x 106 celler per 50 μl av RPMI-mediet utan FBS och lasta 50 μl av suspensionen med Hamilton-sprutan. Undvik luftbubblor och torka av nålen med 70% alkohol för att undvika icke-ortotopisk ympning av celler. Homogenisera cellsuspensionen före varje injektion.
- Injicera långsamt cellerna i pleurautgjutning hålighet mellan 6: e och 7: e revbenen med en vinkel på 30 ° och ett djup av 2 – 3 mm precis under interkostal musklerna. Se till att inte injicera i lungorna genom att hålla nålen precis under revbenen. Nålen ska vara synlig genom musklerna (figur 1a).
- Stäng såret med tre till fyra absorberbara suturer.
- Förvara mössen i en värmda miljö tills de vaknar.
- Dagen efter, upprepa buprenorfin injektion. Övervaka möss enligt experimentell design och godkännande.
4. [18F] FDG-PET/CT-avbildning
Anmärkning: Alla procedurer som beskrivs nedan måste godkännas av lokala djur bostäder och bildbehandlings anläggningar. Se till att radioaktiva ämnen importeras, lagras och hanteras i enlighet med lokala Strålsäkerhets regler (t. ex. lagerlösningar, skärmad huv hantering). SPF-villkor kan upprätthållas genom att manipulera djur i en laminär Flow Hood och genom att ladda dem i SPF-kompatibel skanner säng (figur 1B, C).
- Övervaka tumörutveckling utför PET/CT Imaging, en gång i veckan, med början på dag 7 efter implantation av H2052/484 celler. Varje djur representerar sin egen kontroll över tiden.
- Undvik lidande för djur före avbildning genom att transportera möss till Imaging Facility Housing om tillgängligt eller förvara dem nära anläggningen.
- Snabba möss för 12 – 16 timmar före [18F] FDG-PET/CT vilket reducerar bakgrunds signaler. Se Fueger24 som beskrev effekten av djurhantering på [18F] FDG-PET/CT Scans.
- Dekontaminera och förvara möss sängen enligt lokala regler.
- Registrera alla tider av radioaktivitet doser mätningar, injektioner och PET-skanningar för att kunna beräkna stadsjeepar.
- Förvarma möss vid 30 ° c i 30 minuter före injektion av [18F] FDG som reducerar metabolismen av Brun fettvävnad (BAT). Till exempel förvärma i värme kammare, genom att använda Värmekuddar eller med hjälp av infraröda lampor.
- Förbered 3 – 4 MBq doser av [18F] FDG från stamlösning i 150-200 μl av saltlösning i 1 ml insulin sprutor med hjälp av en dos kalibrator. Insulin sprutor har fördelen av att ha nästan ingen död volym och kan undvika mätning av kvarvarande aktivitet efter injektion.
- Anestesisera möss med isofluran enligt beskrivningen i steg 3,3. Väg upp möss och injicera sedan intravenöst 3 – 4 MBq [18F] FDG. Retro-orbital injektion är en metod för val eftersom det är snabbt, enkelt och undviker svans venen injektion frågor eller fördröjd upptag av intraperitoneal injektion.
- Efter injektion, lämna möss vaken för 45 min i sina burar under de varma förhållanden som initieras i steg 3,5. Varaktigheten av [18F] FDG-upptaget är 1 h; 15 min är normalt tillräckligt för att lasta möss på sängen och utföra CT före PET.
- Söva möss med isofluran enligt beskrivningen i steg 3,3 och Lägg dem på skanner bädden (figur 1B).
- Överför sängen till skannern och försöksdjur till en datortomografi centrerad på lungorna. Förvärva skanningar på 80 kVp, 160 μA, 1024 projektioner under en 360 ° rotation, med ett synfält på 74 mm (1,6 x förstoring, exempel på Triumph förvärv) (figur 1C).
- Flytta sängen till PET-undersystemet och starta förvärvet 1 h efter [18F] FDG injektion för en löptid på 15 min. Med mest av sällskapsdjur/CT systemen, sängen kanna bli flyttat automatisk från CT till sällskapsdjur till hålla den FOV centrerat på det samma areal.
- Ta bort mössen från bild kammaren och låt dem återhämta sig i buren.
- Håll möss i ett område som är avsett för radioaktivt sönderfall enligt lokala regler.
5. analyser av [18F] FDG-PET/CT-skanningar
- Rekonstruera datortomografi utförs i de förhållanden som nämns ovan med en matris av 512 och en Voxel storlek på 0,144 mm (filtrerad tillbaka projektion-FBP algoritm, inbyggd programvara). Rekonstruera PET skannar med hjälp av en 20 iterationer av en ordnad delmängd förväntan maximum-3 dimension-OSEM3D algoritm. Kalibrera bilderna i BQ/mL genom att skanna en fantom cylinder. Automatiskt medregistrera CT och PET skannar enligt din inbyggda mjukvarulösning.
- Analysera lungor volymer med hjälp av analysprogram varan (tabell över material).
- Ladda CT-data som referens (Ref) genom att klicka på ikonen öppna data . Då lasta sällskapsdjur datan så insatsen (Inp1) vid klickande på det tillägga datan ikonen.
- Justera färgskalor ("WL") av CT och PET för att kontrastera bilder för visuell inspektion.
- Välj 3D ROI-verktyget från rullgardinsmenyn, klicka på Lägg till ROI och namnge filen lungor. Klicka på Segmenteringsalgoritmer | Neighborhood Thresholding. Definiera indata som bakgrund och bild som Ref. Ange min och Max enligt mus lung densitet värden, typiskt-800 och-300 hu. Inspektera 3D renderade lungor genom att klicka på VTK -ikonen och hämta volymen i tabellen som genereras genom att klicka på ikonen Visa tabell.
- Analysera [18F] FDG upptag i tumörer genom att extrahera maximala värden för standardupptag (SUVmax).
- Konvertera PET-bilder kalibrerade i BQ/mL till SUV genom att välja aritmetik från rullgardinsmenyn, då skalär multiplicera och använda Inp1 som valts och scalar är Bq/ml till SUV faktor beräknas enligt följande: SUV = (Bq/ml)/(Injicerad dos (Bq)/kroppsvikt (g)).
- Välj 3D ROI-verktyget från rullgardinsmenyn, klicka på Lägg ROI och namnge filen tumörer. Klicka på 3D Paint mode | Sfär. Avmarkera endast 2D. Justera storleken på formen och omger tumörer. Se till att inte inkludera några störande signaler som kommer från hjärtat till exempel. Hämta SUVmax-värdet i tabellen som genereras genom att klicka på ikonen Visa tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen H2052/484 neobladder
Orthotopic MPM modeller genom intrathorakala injektion av odlade cancerceller, särskilt H2052/484 celler är relativt lätt att installera. De olika stegen som beskrivs ovan kräver endast blygsam cellkultur kunskap och kirurgi stegen är tillgängliga för måttligt utbildade djur praktiker. Nakna möss och celler bör manipuleras under sterila förhållanden för att maximera resultatet av implantationerna. Genom att noga följa detta protokoll, som innebär kort anestesi och minimal kirurgi, stötte vi bara 1 död bland 266 möss injiceras med olika MPM cellinjer. Inga pneumothorax eller intrapulmonella implantationer av tumörceller observerades bland dessa 266 möss som noggrant injicerats enligt beskrivningen. Specifikt, den ortotopiska tumör utvecklingstakten i H2052/484 cellinjer är hög eftersom 93,8% av injicerade möss utvecklade tumörer (n = 118). H2052/484 tumörer kan upptäckas av PET/CT Imaging från 14 dagar efter injektion och mediantiden för experimentet enligt våra Endpoint kriterier var 31 dagar i ett representativt experiment21. Som vi beskrev i denna andra studie21, tumörerna var lokaliserade i brösthålan, fritt distribueras eller bifogas på lungorna, bröstmusklerna, aortabågen eller sämre Vena Cava. Metastaser hittades inte.
MPM övervakning av [18F] FDG-PET/CT Imaging
Orthotopic MPM övervakades veckovis av kombinerade PET/CT Imaging med den utbredda radiotracer [18F] FDG som ackumuleras i mycket metaboliska tumörer. Longitudinella anatomiska datortomografi får visualisera effekterna av MPM utveckling på morfologin av lungorna. Automatisk segmentering av starkt kontrasterade lungor på datortomografi är enkel på grund av deras låga densitet jämfört med omgivande vävnader. 3D-renderingar ger en överblick över lokaliseringen av tumörer och longitudinella volymer av lungor kan extraheras (figur 2A). Lung volymer mätningar av CT minskade signifikant över tiden efter MPM injektion av möss med intrapleural (IPL) H2052/484 tumörer (figur 2B). I själva verket, MPM tumörer växa inuti pleurautgjutning hålighet och skapa tryck på lungorna, minska deras volymer. Korrelations analyser visade att lung volymerna var omvänt korrelerade till tiden för övervakning med en koefficient för bestämning R2 av 0,8 (figur 2C). Sammantaget visar dessa data tillförlitligheten hos datortomografi för att övervaka utvecklingen av denna MPM-modell.
Kombinerat med CT, en [18F] FDG-Pet scan ger ytterligare och värdefull information om den metabola STATUSEN för MPM tumörer. Medan ibland kan det vara komplicerat att tolka CT och PET skannar bilder av sig själva, särskilt vid tidiga tidpunkter, en kombination av båda formerna ger ytterligare robusthet för diagnos. I själva verket visar representativa longitudinella [18F] FDG-PET/CT-övervakning mellan 10 dagar och 44 dagar med en mus med IPL H2052/484 tumörer att tumörer börjar särskiljas 2 veckor efter ympning (figur 3a). Detta exempel belyser tillväxten och [18F] FDG aviditet av tumörer som ligger i utkanten av brösthålan och längs hjärtat stora fartyg (vita pilar). [18F] FDG upptag i tumörer kvantifierades genom att utvinna SUVMax i Rois dras över tumörer, med hjälp av datortomografi, och visar betydande tidsberoende ökningar av deras glukos metabolism (figur 3B). Korrelations analyser visade att SUVMax var positivt korrelerade till tiden för övervakning med en koefficient för bestämning R2 av 0,7 (figur 3C). Dessa data visar tillförlitligheten hos [18F] FDG-PET-skanningar för att övervaka ödet för H2052/484-ortotopiska tumörer. Slutligen, lung volymer och [18F] FDG avidity, respektive, analyseras av CT och PET, korrelerar med varandra med en R2 av 0,6 stödja styrkan av dessa mätningar för att studera MPM ortotopiska tumörer utveckling (figur 4).
Bild 1: naken mus ortoämne xenograft modell. (A) intrapleural (IPL) injektion av humana MPM-celler i den vänstra pleurahålan som beskrivs i protokoll sektionen. (B, C) Möss är sövda och lastas i PET/CT sängen i ett laminärt flöde huva sedan överföras till skannern. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: tumörtillväxt av ortoämnet H2052/484 MPM-modell som övervakas av CT. (A) representativa 3D-rekonstruktioner av datortomografi som visar H2052/484 MPM IPL-tumörer och deras effekt på lungvolymen (VP) vid olika tidpunkt i dagar efter implantation. Vita pilspetsar visar placeringen av MPM IPL-tumörer. B) fiolintrig som visar en representativ tidsperiod för lung volymer (VL), n = 6. Enkelriktad ANOVA-test med Tukey ' s multipel jämförelser statistik indikeras. Bokstäverna indikerar signifikanta skillnader mellan modellerna med a, b, c, d, e, f som indikerar respektive D10, D16, D23, D29, D36 och D44. Motsvarande p-värden: x, p < 0,05; XX, s < 0,01; XXX, s < 0,001; xxxx, s < 0,0001. (C) korrelation mellan minskningen av lungvolym relaterad till IPL MPM utveckling och tid efter injektion. Linjär regression ritas som en tjock färgad linje och relaterade SD som streckad svarta linjer. Grafer och statistiska analyser utfördes med programvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tumörmetabolism i IPL MPM-modellen följt av [18F] FDG-micropet/CT. (A) representativa PET/CT-skanningar som visar MPM IPL-tumörer. PET/CT bilder visar trans-axiella skivor av bröstet som innehåller [18F] FDG-Avid tumörer, med CT (grå skala) ger anatomisk information och PET (kalibrerad pseudo-färgskala) som visar platsen och intensiteten av hög tumör och organ glukos utnyttjande. Dagar efter injektionen anges. CT: CT mediastinum fönster; [18F] FDG-PET/CT: smält bild av PET och datortomografi. Vita pilspetsar visar MPM IPL tumörer. L = lunga, H = hjärta, BAT = Brun fettvävnad. (B) violin tomt som visar en representativ tid under SUVMax kopplad till MPM metabolism, n = 6. Enkelriktad ANOVA-test med Tukey ' s multipel jämförelser statistik indikeras. Bokstäverna indikerar signifikanta skillnader mellan modellerna med a, b, c, d, e, f som indikerar respektive D10, D16, D23, D29, D36 och D44. Motsvarande p-värden: x, p < 0,05; XX, s < 0,01; XXX, s < 0,001; xxxx, s < 0,0001. (C) korrelation mellan ÖKNINGEN av SUVMax i IPL MPM tumörer och tid efter injektion. Linjär regression ritas som en tjock färgad linje och relaterade SD som streckad svarta linjer. Grafer och statistiska analyser utfördes med programvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: korrelation mellan MPM-utveckling som övervakas av lungvolym och metabolisk tumör aktivitet. Korrelation mellan SUVMax och lungvolym (VL) visas som en linjär regression plottas som en tjock färgad linje och relaterade SD som streckad svarta linjer. Grafer och statistiska analyser utfördes med programvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna uppsats beskriver en ursprunglig ortotopisk modell av MPM H2052/484 celler injiceras i pleurautgjutning hålighet av atymiska möss och en metod för övervakning av små djur Pet/CT Imaging. Denna modell kan implementeras med måttlig djurhantering och kirurgi färdigheter och visar en mycket bra utvecklingstakt. Det möjliggör en stor experimentell fönster av ca 10 veckor i obehandlade möss och icke-invasiv longitudinell detektion av tumörer så tidigt som 2 veckor efter injektion.
Ortotopiska modeller förlitar sig på implantation av levande celler eller vävnader direkt i den initiala miljön av tumören. Den största skillnaden mellan allmänt använda subkutan eller intraperitoneal MPM modeller och intrapleural modeller ligger i deras mikromiljö. Faktum är att mikromiljön av tumörer innehåller flera stromacellstumörer celltyper (fibroblaster, leucocyter, makrofager) förutom cancerceller25. Dessa stromaceller celler utsöndrar tillväxtfaktorer och cytokiner bidrar till tumören mikromiljö som modulera tumörtillväxt. Tumören mikromiljö varierar med anatomiska platsen tyder på att en ortoämne xenograft kommer att utvecklas och reagera annorlunda på en behandling än en subkutan en25. Därför, som ortoämne xenograft är omgiven med en jämförbar mikromiljö till den som finns i MPM patienter, deras beteende och svar på behandling bör bättre återspegla den kliniska situationen17,19.
Många prekliniska modeller inom cancerforskning implerar immunbrist möss för att säkerställa mänsklig xenograft framgång. Naken möss inte besitter mogna bräss och saknar en viktig del av tumören mikromiljö26. Även naken möss inte besitter mogna bräss och är följaktligen bristfällig i T-celler, de presenterar mogna lymfocyter B, neutrofiler, monocyter och makrofager i deras pleurautgjutning mikromiljö i motsats till mer tillåtande och mycket bristfällig scid möss26. I de tidiga stadierna av MPM-utvecklingen har reglerande T-celler en viktig suppressiv roll. Men i mer avancerade stadier, myeloida celler inklusive neutrofiler och makrofager ersätta Treg celler; i denna funktion är reglerande T-cellers suppressiva roll endast viktig under tidiga skeden av MPM-utvecklingen23,27. Även om studier med ett fullständigt immunsvar (t. ex. immunoterapier som inbegriper ett T-svar) inte kan studeras i den modell som presenteras här, förutsätter vi att denna ortotopisk modell behåller allt sitt intresse för att bedöma nya behandlingar eller nya diagnostiska verktyg för MPM.
I en metodologisk synvinkel finns det kritiska steg att tänka på för att maximera utvecklingen av intrapleural MPM tumörer. Innan du upprättar möss modeller, har tillgång till exponentiellt växande celler (mindre än 80% confluency, beroende på cellinjer) och 8 till 10 månader acklimatiserad möss. Faktum är att injicera yngre små möss är svårt och kan resultera i ektopiska injektioner och förändra överlevnad. Under implantations förfarandet, standard kirurgi försiktighetsåtgärder bör vidtas, och trubbig sax bör användas särskilt när av för att undvika blödning, vilket kan leda till döden av djur. Valet av sprutan (t. ex. den modell som beskrivs här) och det protokoll som presenteras här tillåter exakt och skonsam injektion av en liten mängd medium som innehåller tumörceller för att säkerställa intrapleural injektion (30 ° vinkel, 2-3 mm djup).
Longitudinell övervakning av ortotopisk MPM-modeller kan endast utföras icke-invasivt av bildteknik. PET/CT är den rekommenderade metoden i klinisk praxis för att diagnostisera MPM och har därför använts i denna studie20,21. Så jämförde med vida använd optisk tänkbar, sällskapsdjur/CT tänkbar involverar den använda av radioaktiv föreningarna och är därför mer känslig till setup på grund av säkerheten, logistiken av radiotracers och dess kostnad28. Ändå, PET/CT Imaging inte förlita sig på genetisk modifiering av tumörceller och ger högupplöst tomographic, anatomisk och molekylär information. Optisk avbildning är också snabbare än PET/CT men avbildnings systemet som presenteras i denna artikel innebär en 3-möss säng och ca 20 möss kan skannas per dag, vilket är en rimlig genomströmning med tanke på den insamlade informationen. Användningen av den mycket tillgängliga kliniska radiotracer [18F] FDG garanterar en hög translationell effekt till forskning som utförs med denna teknik29. Även om [18F] FDG-Pet scan avläsningar och analyser kan kräva viss erfarenhet på grund av det höga upptaget i omgivande hjärta och bruna fettvävnader, dess kombination med CT förfinar diagnos. Under [18f] FDG PET/CT experiment, fasta och värmande möss samt utför en upptagstid på [18f] FDG av 1 h kan avsevärt förbättra visualiseringen av tumörer eftersom skannings förhållanden starkt påverkar PET-kontraster som redan beskrivits24. Ytterligare studier på prekliniska ortotopiska modeller med andra kliniskt använda radiotracers som [18f] Fluorothymidine (flt) eller [18f] Fluoromisonidazol (fmiso), som övervakar proliferation och hypoxi respektive, kan ge mer information om sådana pålitliga ortoämne MPM modeller29.
Slutligen är denna relevanta translationella modell i kombination med noninvasiv avbildning helt i linje med 3R-konceptet: reducera antalet djur, refine att minska smärta och obehag och rErsätt djurförsök med alternativ22. Inom samma uppsättning djur kan terapeutisk uppföljning och respons övervakas icke-invasivt, vilket möjliggör longitudinella mätningar under hela experimenten, vilket minskar antalet djur som krävs per experiment. Dessutom, eftersom varje djur representerar sin egen kontroll över tid, icke-invasiv avbildning också kraftigt öka statistisk effekt minska antalet nödvändiga djur för att få tillförlitliga data16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Ligue genevoise contre le cancer (till vs-B.) och av centrum för biomedicinsk avbildning (CIBM) av universiteten och sjukhusen i Genève och Lausanne (till D.J.C., O.B. och S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
- Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
- Mossman, B. T., Gee, J. B.
- Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
- Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
- LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
- Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
- Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
- Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
- Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
- Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
- Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A.
- Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
- Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
- Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
- Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
- de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
- Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
- Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
- Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
- Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
- Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
- Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).
