Summary
Denne protokol har til formål at automatisere AFM målinger på hundredvis af mikrobielle celler. For det første er mikrober immobiliseret i PDMS stempel mikrostrukturer og derefter tvinge spektroskopi målinger udføres automatisk på hundredvis af immobiliserede celler.
Abstract
Den metode, der præsenteres i dette papir har til formål at automatisere Bio-AFM eksperimenter og registrering af kraft kurver. Ved hjælp af denne metode er det muligt at registrere kræfter kurver på 1000 celler i 4 timer automatisk. For at opretholde en 4 timers analysetid reduceres antallet af kraftkurver pr. celle til 9 eller 16. Metoden kombinerer et Jython-baseret program og en strategi for samling af celler på definerede mønstre. Programmet, der gennemføres på en kommerciel Bio-AFM, kan centrere spidsen på den første celle i array og derefter flytte, automatisk, fra celle til celle, mens du optager kraft kurver på hver celle. Ved hjælp af denne metode er det muligt at få adgang til cellernes biofysiske parametre såsom deres stivhed, deres klæbende egenskaber osv. Med automatiseringen og det store antal analyserede celler kan man få adgang til cellepopulationens opførsel. Dette er et gennembrud i Bio-AFM feltet, hvor data hidtil er blevet registreret på kun et par snese celler.
Introduction
Dette arbejde giver en metode til at udføre automatiske kraftmålinger på hundredvis af levende celler ved hjælp af et atomkraftmikroskop (AFM). Det giver også en metode til at immobilisere mikrober på et PDMS mikrostruktureret stempel, der er kompatibelt med AFM-eksperimenter udført i et flydende miljø.
Bio-AFM er en højt specialiseret teknologi udtænkt til applikationer i biologi og derefter bruges til at studere levende celler. Det kræver en uddannet ingeniør, der kan analysere en celle på det tidspunkt. Under disse forhold er antallet af forskellige celler, der kan analyseres, ret lille, typisk 5 til 10 celler i 4-5 timer. Mængden af kraftmålinger, der registreres på en enkelt celle, er dog normalt meget høj og kan nemt nå op på 1000. Således er det nuværende paradigme for AFM kraft målinger på levende celler er at registrere hundredvis af kraft kurver (FCs), men på et begrænset antal celler.
Statistisk set er denne fremgangsmåde tvivlsom og rejser spørgsmålet om stikprøvens repræsentativitet. Det er faktisk vanskeligt at vurdere en cellepopulations heterogenitet ved kun at måle nogle få celler, selv om der registreres hundredvis af målinger på disse få celler. Det er dog på baggrund af dette paradigme, at der er gjort store fremskridt inden for biofysik, mikrobiologi og nanomedicin1,2,3. Faktisk nanometeranalyse på skala af enkeltceller har givet nye oplysninger om cellulære nanomekanik, om organiseringen af transmembraneproteiner eller virkningsmekanismen for antimikrobielle eller anticancerlægemidler4,5,6,7. For nylig er der imidlertid opstået flere biomekaniske tests med høj gennemstrømning udført på celler8, der viser det videnskabelige samfunds interesse i at ændre dette paradigme og få adgang til cellepopulationens heterogenitet. Disse test er alle afhængige af mikrofluidiske systemer til at deformere celler og optisk måle deres deformation under stress for at opnå et indirekte mål for deres samlede overfladeelasticitet8. Et vigtigt problem med disse metoder er imidlertid, at de er monoparametriske: kun celleelasticitet kan undersøges. Desuden tillader de ikke måling af de mekaniske parametre for vedhængende celler, hvilket kan være begrænsende for undersøgelser af ikke-cirkulationspatte pattedyrceller eller biofilm for eksempel.
Tilgange, der involverer AFM er blevet udviklet af holdene af S. Scheuring9 og M. Favre10. Scheuring et al. immobiliserede celler på fibronectin mønstre9, tvinger de enkelte celler til at tage form af mønsteret9. Derefter kortlagde dette team de mekaniske egenskaber for nogle få celler for at definere gennemsnitlige data, der er repræsentative for 14 til 18 celler. Farve et al.s udvikling havde til formål at multiplumre målingerne ved at parallelisere AFM cantilevers10. Så vidt vi ved, har dette arbejde i multiplexing retning ikke ført til målinger på levende celler.
En interessant tilgang foreslået af Dujardin's team præsenterer en automatiseret AFM i stand til at identificere celler og billedbehandling dem i bunden af skræddersyede brønde. Selvom denne metode ikke giver mulighed for analyse af en stor population af celler, tillader den automatisk test af forskellige forhold i hverbrønd 11.
Vores mål i dette arbejde er mere ambitiøst, da vi ønskede at måle mindst 1000 celler for at få adgang til ikke en gennemsnitlig celle, men tværtimod heterogeniteten mellem cellerne. Den strategi, vi har udviklet her for at få adgang til cellepopulation heterogenitet ved hjælp af AFM er baseret på analysen af hundredvis af celler, hvor et begrænset antal kraft kurver er registreret. Sammenlignet med den "klassiske" tilgang til registrering af et stort antal kraftkurver på et begrænset antal celler bør denne tilgang betragtes som komplementær, da den ikke giver de samme oplysninger. Faktisk, mens den typiske metode gør det muligt for en at sonde individuelle celle overflade heterogenitet, ved hjælp af vores tilgang, vi er i stand til at få adgang til hele cellepopulation heterogenitet. For at nå dette mål har vi kombineret en metode, der direkte immobiliserer mikrober (her gærarten Candida albicans) i brøndene i et PDMS mikrostruktureret stempel12, og udvikler et originalt program til automatisk at flytte AFM-spidsen fra celle til celle13 og måle de mekaniske egenskaber ved hver celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrobiel cellekultur
- Genoplive celler fra en glycerol bestand.
BEMÆRK: C. Albicans opbevares ved -80 °C i glycerollagre på marmor.- Vælg en marmor i -80 °C lager og gnid det på gær peptone dextrose (YPD) agar. Cellerne dyrkes i 2 dage ved 30 °C, før flydende dyrkning.
- Forbered flydende kulturer.
- Fyld et kulturrør med 5 mL steril YPD bouillon og tilsæt en enkelt koloni af C. albicans celler, dyrket på YPD agar plade.
- Kulturen dyrkes under statiske forhold ved 30 °C i 20 timer, før den høstes ved centrifugering (4000 x g, 5 min). Kassér supernatanten og fjern som biofarligt affald.
- Pellets vaskes 2x med 10 ml acetatbuffer (8 mM natriumacetat, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5.2). Centrifuge (4000 x g, 5 min) i mellem vask.
- Genbrug pellet i 2 ml acetat buffer og bruge denne løsning til celle immobilisering på PDMS stempel.
BEMÆRK: Denne suspension kan ikke opbevares og skal tilberedes frisk til punkt 3.
2. Forberedelse af PDMS-frimærke
- Forberedelse af siliciummesterform
- Tegn de ønskede mikrostrukturer ved hjælp af CAD-software (Computer Assisted Design).
BEMÆRK: De konstruerede brønde skal have samme størrelse som mikroben for at fange. Designet skal give en stor matrix af brønde 100 x 100 på listen. Det er bedst at lave flere arrays med lidt forskellige størrelser omkring mikrobens gennemsnitlige størrelse. - Hvis der er et rent rum til rådighed, skal du følge trin 2 til 12 i den tidligere udgivne protokol12. Ellers kan silicium master skimmelsvamp erhverves fra kommercielle renrum faciliteter.
- Tegn de ønskede mikrostrukturer ved hjælp af CAD-software (Computer Assisted Design).
- PDMS-stempelstøbning
- Der fremstilles 55 g PDMS-præpolymeropløsning indeholdende en blanding af 10 til 1 masseforhold af PDMS-oligomerer og hærdningsmidler (Materialetabel).
- Denne opløsning blandes og afgases under vakuum (i området 10-1-10-2 stænger), indtil alle fangede bobler fjernes fra PDMS-opløsningen (5−10 min).
- Hæld 20 g afgasset opløsning på silicium master skimmel og degas igen (i intervallet 10-1-10-2 barer).
BEMÆRK: Frimærketykkelsen skal være omkring 2−3 mm. - Når alle bobler fjernes, skal PDMS'et omimuleres ved 80 °C i løbet af 1 time.
- Skær PDMS mikrostruktureret stempel med en skalpel (0,5 x 1,5 cm2)i en retning parallelt med de synlige mikrostruktur arrays.
- Skræl stemplet fra silicium master skimmel.
- Sæt stemplet tilbage for at udstille mikrostrukturerne på oversiden og læg det på en glasrutsjebane. Sørg for at have mikrostrukturerne vendt væk fra glasrutsjebanen. Juster de mikrostrukturer, der kan ses på frimærket, med siden af glasrutsjebanen, som senere vil tjene som reference for AFM-automatiseringsproceduren.
BEMÆRK: På nuværende tidspunkt er PDMS-stemplet klar til celle immobilisering. PDMS-frimærkerne kan opbevares på siliciummasterformen i flere måneder. Når alle PDMS er fjernet fra master formen, en ny PDMS stempel kan kastes igen på master skimmel (for at holde master skimmel sikker, er det muligt at kopiere det i polyurethan)14.
3. Prøveforberedelse
- Celle immobilisering
- Centrifuge (500 x g, 5 min) 600 μL af den genanvendelige celleopløsning for at adskille bufferen fra cellerne.
- 200 μL af supernatanten pipetters μL fra trin 3.1.1 på PDMS-stemplet og afgasser under vakuum (i området 10-1-10-2 stænger) i ca. 40 min.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at forbedre celle immobilisering inde i brøndene. Molekyler fra gærcellevæggen, der er til stede i supernatanten, deponeres sandsynligvis på PDMS-overfladen under dette forbestændelige trin. Disse molekyler forbedrer sandsynligvis vedhæftning af cellerne og bidrager til stigningen i stempelfyldningshastigheden. - Efter 40 minutter, med en pipette, fjernes bufferen fra PDMS-overfladen og deponeres med en pipette 200 μL af celleopløsningen fra trin 1.2.4 i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Placer cellerne i frimærkets mikrostrukturer ved hjælp af konvektiv/kapillær samling. Til dette skal du manuelt sprede 200 μL celler, der er suspenderet på tværs af stemplet, ved hjælp af et glasglidning i begge retninger med en vinkel mellem 30 og 50°. Det kan være nødvendigt at passere glasrutschebanen flere gange på stemplet for at opnå en høj påfyldningshastighed.
BEMÆRK: En fuldstændig beskrivelse af denne metode er tilgængelig13. - Fjern celleaffjedringen med en pipette. Stempel 3x vaskes med 1 ml acetatbuffer, pH 5.2 for at fjerne de celler, der ikke er fanget.
- Tør bagsiden af frimærket ved hjælp af nitrogenflowet for at sikre, at stemplet klæber til den tørre petriskål.
- Til sidst deponeres PDMS-stemplet fyldt med celler i en petriskål (Tabel over materialer) og fyld det med 2 ml acetatbuffer for at opretholde cellerne i flydende medium.
- Indstilling af stempel på AFM-scenen
- Centrer stadiet kl. 0:0, når du starter AFM-operationer.
- Kalibrere cantileverens følsomhed og fjederkonstant på glas og i vand som beskrevet i Unsay et al.15
- Tag petriskålen med frimærket og læg den i AFM Petri-fadeholderen.
- Juster frimærkekanten vinkelret på petriskålholderen Y-aksen.
BEMÆRK: En acceptabel hældningsvinkel er under 5° som vist i figur 1. - Placer AFM hovedet på scenen og pas på, at steppermotorerne er tilstrækkeligt udvidede til at undgå, at spidsen går ned på stemplet.
4. Kørsel af AFM-programmet
BEMÆRK: AFM-programmet leveres som et supplerende materiale (AutomatipSoftware2019.pdf). Det kræver en JPK-Bruker AFM Nanowizard II eller III udstyret med en motoriseret scene og JPK desktop software version 4.3. Programmet er udviklet under Jython (version baseret på python 2,7)
- Hent data
- Centrer AFM spidsen på toppen af venstre hjørne af 4,5 x 4,5 μm2 brønde (svarende til cellestørrelsen) ved hjælp af AFM optisk mikroskop. Hvis en anden brøndstørrelse er nødvendig, skal du centrere på øverste venstre hjørne af de ønskede brønde.
- Udfør et kraftkort på 64 x 64 (Z-område = 4 μm, spidshastighed = 90 μm·s-1, anvendt kraft 3 til 5 nN) over et 100 x 100 μm² område. Vælg Gennemtving tilknytningstilstand på rullelisten Måletilstand. I kraftkontrolkortlægningspanelet skal du indtaste følgende parametre: Rel. Setpoint = 3 til 5 nN; z længde 4 μm; Z-bevægelse: konstant varighed; forlænge tid: 0,01s; ext. forsinkelse:0; Forsinkelse: 0, Forsinkelsestilstand: Konstant kraft, prøvehastighed 2048 Hz; Z lukket løkke fjerne markeringen; Gitter: tjek Kvadratisk billede, Hurtig 100 μm, langsom: 100μm, X offset: 0 μm; Y-forskydning: 0 μm; gittervinkel: 0 grader; Pixel: 64x64; pixelforhold: 1:1
BEMÆRK: Et typisk resultat er vist i figur 2. Dette billede vil hjælpe med at måle og kontrollere banen mellem to brønde. - Bemærk koordinaterne for midten af den øverste venstre brønd (W1) og for brønden nederst til venstre (kaldet W2 på figur 2). For at gøre det skal du lave en firkantet kasse rundt om brønden. Koordinaten for midten af boksen vises på venstre panel af AFM-softwaren i x,y koordinatbokse.
- For at åbne automatiseringssoftwaren (Automatip_scan.py): I JPK-desktopsoftwaren skal du klikke på forhånd i menuen øverste linje og vælge åbn scriptet. Vælg stien til den scriptfil, der findes i Supplerende data (Automatip_scan.py), i det vindue, der åbnes.
- Implementer W1- og W2-koordinatværdier i afsnittet Inputs box i Jython-scriptet (Figur 3). Indtast W1-koordinaterne i scriptets P1-variabellinje 239 og W2-koordinaterne i P2-variabellinje 241.
BEMÆRK: De brønde, der vælges som indledende koordinater (W1 og W2), bør ikke være for tæt på scanningsområdets kant. Ellers ville centreringsalgoritmen ikke udføres korrekt, fordi den skal måle højden på PDMS-overfladen på hver side af brønden. Du kan se et eksempel i figur 4. - Tilfør tonehøjdeværdien til tonehøjdevariabellinjen 245 i scriptet.
- Indtast brønddimensionen i Ws-variabellinje 248. Dette er kendt fra udformningen af brønden mønstre og kan kontrolleres på samme billede som den, der anvendes til at kontrollere tonehøjde (Figur 2).
- Skriv stien til den lagringsmappe i linje 251 for at gemme dataene på det ønskede sted.
- Angiv variablen TotalArea linje 254 til ønsket multiplum "n" på 100 μm (dvs. det maksimale scanningsområde for den anvendte AFM). Det samlede antal brønde, der vil blive undersøgt, kan beregnes ved hjælp af denne værdi og tonehøjden: maksimalt scanningsområde/hældning*n2.
BEMÆRK: I eksemplet med figur 3analyseres 9 områder på 100 x 100 μm2. - Indstil kraftkurvematrixen, række og kolonne (3, 3 eller 4, 4), registreret pr. brønd i numScans variable linje 257.
BEMÆRK: I eksemplet med figur 3registreres en matrix på 3 x 3 = 9 FC'er for hver brønd. - Kør programmet. Klik på knappen Start.
BEMÆRK: Programmet udfører først automatisk en centreringsalgoritme for bedre at bestemme midten af W1- og W2-brønde (trin 1). Derefter erhverves matrixen Force Curves (FCs) automatisk på hver brønd i det første scanningsområde (trin 2). Når alle brønde i dette område er sonderet, scriptet automatisk flytter AFM spidsen til den første brønd i det næste scanningsområde. Spidsen trækkes tilbage, mikroskopstadiet flytter til det næste område, spidsen nærmer sig igen på stemplet, og centreringsalgoritmen udføres igen for automatisk at centrere den første brønd (1') i dette område (trin 3). Det første område er defineret af brugeren, det andet, er til højre osv., indtil n er nået. n+1-området er under n, n+2 til venstre for n+1 osv., indtil 2n er nået. 2n+1 er under 2n, og 2n+2 er til højre på 2n osv. Globalt set er spidsen serpentinerne gennem det samlede areal. Trin 2 og 3 gentages automatisk, indtil det samlede antal "n2" scanningsområder er blevet undersøgt. Figur 5 viser programmets rutediagram. Det tager ~ 4 timer at fuldføre programmet.
- Dataanalyse
- Udfør pythonscriptet "Kopier filer" (Copy_files_L.py, der findes i Supplerende data) for at organisere FCs-filerne i én mappe. Dette script blev udviklet med Python 2,7 og SciPy modulet. Brug Visual Studio Code-softwaren til at åbne pythonscriptet. Inputsti til den generelle mappe (linje 67 i scriptet i supplerende data), og hvor den gemmes (linje 73).
- Åbn AFM-producentens databehandlingssoftware for at analysere kraftkurverne. Vælg åbn 'batch af spektroskopikurveri den øverste menu .
- Vælg den proces, der findes i Supplerende data (StiffnessProcess.jpk-proc-force) i vinduet batchafvikling. Vælg det sidste trin i processen, og klik på Bevar og anvendpå alle . Alle kraftkurver vil modtage den samme behandling.
BEMÆRK: Processen bruger kalibreringen fra FCs-filerne til at konvertere deformationskurver til kraftkurver, der er kalibreret i Newton; der anvendes en dataudjævningsalgoritme (gennemsnit på 3 på hinanden følgende punkter) grundlinjen oversættes til at hvile på nulaksen. kontaktpunktet ekstrapoleres, og FC forskydes for at placere kontaktpunktet ved koordinaten (0,0) bøjningen af cantilever trækkes fra FCs, tilbagetrækningshældningen er monteret. I slutningen af databehandlingen genererer softwaren en fil, der indeholder en tabel, der giver for hver FCs: dens navn, Young Modulus, kontaktpunkt, vedhæftningskraft, skråninger osv. - Gentag trin 4.2.1 til 4.2.3 for alle forsøg. Vær omhyggelig med at gemme dataene i forskellige mapper (dvs.: "...\TREATED\" og "...\UNTREATED\")
- Brug R scriptet i Supplerende Data til at plotte histogrammer og boksplotter og udføre ANOVA-statistiske behandlinger.
- Hvis du vil åbne R-scriptet (DataAnalisys.R), skal du bruge R studio-software og indlæse de filer, der indeholder de oplysninger, der er udtrukket med databehandlingssoftwaren (.tsv).
- Brug knappen Importer datasæt i vinduet Miljø, vælg fra tekst (læser) på listen, og vælg knappen Browser i det nye vindue, og find .tsv-filen.
- Når filen er indlæst, skal du vælge de kolonner (stivhed og vedhæftning), der skal medtages til analysen. Tryk på Ctrl+Alt+Rfor at køre hele koden.
BEMÆRK: Scriptet fungerer med 4 datasæt, overveje to eksperimenter, der både har ubehandlet og behandlet celler. Det er muligt at udføre blokke af scriptet og se, hvordan variablerne ændrer sig i henhold til de udførte funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte den beskrevne protokol til at analysere effekten af caspofungin på de biofysiske egenskaber af det opportunistiske menneskelige patogen C. albicans i sin gærform. Caspofungin er en sidste chance svampedræbende molekyle, der anvendes, når andre lægemidler er ineffektive på grund af modstandsmekanismerne celler udvikle sig i retning af svampemidler. Dens virkningsmekanisme er baseret på hæmningen af underenheden Fks2 af den komplekse fks1/Fks2, der er ansvarlig for ß glucansyntesen. Da ß glucaner er en vigtig komponent i svampecellevæggen16,17, forventede vi ændring af cellevæggens biofysiske egenskaber: stivhed og vedhæftning.
Figur 6 præsenterer typiske histogrammer opnået, når alle ovennævnte protokoller anvendes. Det røde histogram repræsenterer stivhedsrepartitionen registreret på 957 indfødte celler og den blå på 574 caspofungin behandlede celler. Den første interessante observation er, at begge histogrammer demonstrerer en bimodal fordeling af værdierne. Denne observation er kun mulig, fordi vi målte hundredvis af celler. På mindre prøver observerer forskere normalt en enkelt fordeling og savner befolkningens heterogenitet. 17,18
Den anden bemærkning vedrører virkningen af caspofungin. Det globalt reducerer stivheden af cellerne, mens der stadig to delpopulationer eksisterer. I et sidste trin giver den foreslåede protokol en ANOVA-sammenligning af de oprindelige og behandlede celler som vist i figur 7. Det viser, at de to betingelser har en anden stivhed, og at denne forskel er meget betydelig (p værdi < 0,001). Denne værdi nås takket være det store antal analyserede celler og giver en større tillid til de opnåede resultater.
Vedhæftningen er også blevet udvundet af de automatisk registrerede data, og vi fandt ud af, at vedhæftningskraften mellem den nøgne spids og indfødte celler var på 0,64 ± 0,6 nN. I dette tilfælde blev der også fundet to delpopulationer: den første har en gennemsnitlig vedhæftningskraft på 0,7 ± 1,4 nN, mens den anden på 4,5 ± 1,5 nN. Behandlingen med caspofungin havde uforudsigelige virkninger på vedhæftningen. I et eksperiment blev der ikke observeret nogen effekt, men i et andet eksperiment fremkaldte caspofungin et fald i vedhæftning til spidsen og en reduktion af befolkningens vedhæftnings heterogenitet. Disse resultater udtrækkes fra Proa et al.13, hvor de præsenteres i sin helhed.
Figur 1: Acceptabel placering af det mikrostrukturerede stempel på AFM-scenen.
Hældningsvinklen på venstre billeder (op til 5°) kan håndteres af programmet, men hældning til højre er vigtig (10°). Dette tal er blevet ændret fra13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Typisk AFM-billede af udfyldte PDMS-frimærker, der viser de første koordinater som W1 og W2, scanningsområdets størrelse (Δ2), hældningsvinklen (θ).
Dette tal er blevet ændret fraden 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Afsnittet Brugerinput i scriptet.
P1 og P2 henviser til koordinaterne for godt 1 (W1) og godt 2 (W2) i figur 2. De øvrige parametre er tonehøjden i μm, brøndstørrelsen i μm (Ws), mappestien til lagring af dataene, det samlede kvadratareal, der vil blive undersøgt af den automatiserede AFM (totalArea er længden i μm af siden af det samlede kvadratareal) og antallet af kraftkurver pr. brønde (numScans). Alle enheder er i μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Optisk billede, der giver et eksempel på værdifulde (grønne prikker) indledende brønde.
Den sorte firkant repræsenterer scanningsområdet og de røde pletter, indledende brønde, der bedre skal kasseres. Dette tal er blevet ændret fra13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Programrutediagram, der viser de 5 trin, der automatisk udføres af AFM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Histogrammer af median stivhedsværdierne.
(A, B) Vis medianresultaterne pr. celle for oprindelig og caspofunginbehandlet celle. Dette tal er blevet ændret fra13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Kasseplotter, der sammenligner oprindelige og behandles med caspofunginceller.
De 3 stjerner repræsenterer en betydning af p<0.001. Boksen repræsenterer 90% af resultaterne, den centrale linje er medianværdien, og de lodrette søjler repræsenterer området for alle data. Dette tal er blevet ændret fra13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Afhængighed af tidsposition for værdier.
Histogrammer i midten er de oprindelige data, som er opdelt i de forskellige undergrupper, der svarer til de fundne underpopulationer (blå/gul). (A,B) Vis tilstedeværelsen af de to underpopulationer hver time i eksperimentet. (C,D) viser indrykningspositionerne på hver position er det muligt at se tilstedeværelsen af delpopulationerne (blå/gul). Undergruppeorganisationen blev udført ved hjælp af k-means-algoritmen. Dette tal er blevet ændret fra13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Det sikre område.
Et område, inde i PDMS godt, er blevet defineret som det område, hvor pyramidespidsen ikke rører godt kanten, mens de når godt bunden (i tilfælde af en tom brønd). Dette tal er blevet ændret fraden 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende data. Klik her for at ned disse filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den største forbedring i denne metode er en betydelig stigning i antallet af målte celler på et bestemt tidsrum. Modstykket er en reduktion af antallet af målte point pr. celle. Det betyder, at denne metode ikke er designet til at give en detaljeret analyse af en enkelt celle. Metoden gælder kun for celler, der kan være i PDMS-stemplets brønde. Stemplet er ret alsidigt, mens det indeholder brønde på 1,5 x 1,5 μm2 op til 6 x 6 μm2. Stadig er det umuligt at immobilisere bacillus eller meget større celler. Stemplet og kapillær konvektive deposition kan ikke bruges til at immobilisere pattedyrsceller, der er meget større (ca. 100 μm i længden).
I denne sammenhæng udviklede Peric et al.19 en smart mikrofluidisk enhed til at immobilisere bacillus som Escherichia coli og bacillus subtilis. Denne anordning gør det muligt at immobilisere bacillus på definerede positioner og under fysiologiske forhold. Det ville være meget interessant at tilpasse softwaren til den særlige størrelse af denne enhed.
Tip forurening kan også være et problem i dette automatiserede system. I tilfælde af mikrobielle celler er det ikke så udbredt, men det er af stor betydning i tilfælde af pattedyrceller. Dujardin et al.11 løste dette problem ved at tilføje et rengøringstrin i deres automatiserede protokol. Dette trin består i at kontrollere lasersummen og aktivere rengøringsproceduren, hvis summen er for lav. Det rene trin består i at nedsænke spidsen i en brønd fyldt med vand eller ethanol.
Et spørgsmål, der systematisk opstår fra dette automatiseringsarbejde, har været: "kommer heterogeniteten fra cellernes udvikling under eksperimentet?". For at besvare dette spørgsmål planlagde vi stivhedsresultaterne som en funktion af tiden som præsenteret i figur 8A, B. Det viser klart, at heterogene stivhedsværdier registreres når som helst under forsøget.
I samme forbindelse opstod spørgsmålet om tippepositionen under foranstaltningen. Det kunne være muligt, at kraftkurver registreret på kanten af en celle ville have en anden stivhed end FC registreret på toppen af cellerne. For at undgå denne ulejlighed definerede vi det, vi kaldte det sikre område. Den er afbildet i figur 9A,B og repræsenterer et område inde i brøndene, hvor spidsen ikke vil røre godt kanterne under kraftmåling. Ved hjælp af dette "sikre område" kunne vi kun optage FC på celler og øverst på dem. Som vist i figur 8C, D er spidsens position i det sikre område ikke ansvarlig for resultaternes heterogenitet, da vi fandt begge fænotyper for hver position af spidsen i det sikre område.
For at sikre, at de værdier, der registreres på hver position, er homogene, afbildede vi stivhedsværdierne som en funktion af positionen som vist i figur 9C, D. Det viser, at heterogene stivhedsværdier registreres på hver position i brønden, hvilket betyder, at den observerede heterogenitet ikke er en artefakt på grund af spidsens position i brøndene.
Protokollen præsenteret i denne artikel repræsenterer et konceptuelt og metodisk gennembrud inden for AFM anvendt i life science. De store mængder data, der genereres, er forenelige med automatisk analyse, som utvivlsomt vil gøre det muligt at klassificere cellepopulationer efter nye kriterier. Anvendelsen af denne protokol på protein- eller sukkersystemer er fuldt ud mulig og kræver kun få tilpasninger for at overveje afstanden mellem interesseområder.
Det er derfor en alsidig protokol, der er resultatet af et stærkt tværfagligt samarbejde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker at anerkende FONCYCYT fra CONACYT (Mexico), Frankrigs udenrigsministerium og Université Paris 13, selv om den finansielle støtte fra det internationale samarbejde ecos-nord-projekt ved navn Nano-palpation til diagnose, No. 263337 (Mexico) og MI5P02 (Frankrig). AMR vil gerne takke den finansielle støtte fra SIP-IPN gennem projektet Nr. 20195489. SPC understøttes af et ph.d.-stipendium fra CONACYT (nr. 288029) og IPN gennem cotutelle-aftalen om at opnå dobbelt ph.d.-certifikat (IPN-UPS). ED og CFD er forskere ved Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
References
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
