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Bioengineering

सैकड़ों सी एल्बिकन कोशिकाओं पर जैव-परमाणु बल माइक्रोस्कोप मापन का स्वचालन

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/61315
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 4, 3,5, 2
1ITAV-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 2LAAS-CNRS, Université de Toulouse, CNRS, Toulouse, France, 3ENCB, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico, 4TBI, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, Toulouse, France, 5CIC, Instituto Politécnico Nacional (IPN), Mexico City, Mexico
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सैकड़ों माइक्रोबियल कोशिकाओं पर एएफएम माप को स्वचालित करना है। सबसे पहले, रोगाणुओं को पीडीएमएस स्टांप माइक्रोस्कोप में स्थिर किया जाता है और फिर सैकड़ों स्थिर कोशिकाओं पर स्वचालित रूप से बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप किया जाता है।

Abstract

इस पेपर में प्रस्तुत विधि का उद्देश्य बायो-एएफएम प्रयोगों और बल घटता की रिकॉर्डिंग को स्वचालित करना है। इस विधि का उपयोग करके, स्वचालित रूप से 4 घंटे में 1000 कोशिकाओं पर बलों घटता रिकॉर्ड करना संभव है। 4 घंटे के विश्लेषण समय को बनाए रखने के लिए, प्रति सेल बल घटता की संख्या 9 या 16 तक कम हो जाती है। विधि एक सिथन आधारित कार्यक्रम और परिभाषित पैटर्न पर कोशिकाओं को कोडांतरण के लिए एक रणनीति को जोड़ती है। एक वाणिज्यिक जैव-एएफएम पर लागू किया गया कार्यक्रम, सरणी के पहले सेल पर टिप को केंद्र में कर सकता है और फिर प्रत्येक सेल पर बल घटता रिकॉर्ड करते हुए सेल से सेल तक स्वचालित रूप से स्थानांतरित हो सकता है। इस पद्धति का उपयोग करके, कोशिकाओं के जैव भौतिक मापदंडों जैसे उनकी कठोरता, उनके चिपकने वाले गुणों आदि तक पहुंचना संभव है। स्वचालन और कोशिकाओं की बड़ी संख्या का विश्लेषण के साथ, एक सेल आबादी के व्यवहार का उपयोग कर सकते हैं । यह बायो-एएफएम क्षेत्र में एक सफलता है जहां डेटा, अब तक, केवल कुछ दसियों कोशिकाओं पर दर्ज किया गया है ।

Introduction

यह काम परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) का उपयोग करके सैकड़ों जीवित कोशिकाओं पर स्वचालित बल माप करने के लिए एक पद्धति प्रदान करता है। यह पीडीएमएस माइक्रोस्ट्रक्चर्ड स्टैंप पर रोगाणुओं को स्थिर करने की एक विधि भी प्रदान करता है जो तरल वातावरण में किए गए एएफएम प्रयोगों के अनुरूप है।

बायो-एएफएम एक अत्यधिक विशिष्ट तकनीक है जो जीव विज्ञान में अनुप्रयोगों के लिए कल्पना की जाती है और फिर जीवित कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती है। इसके लिए एक प्रशिक्षित इंजीनियर की आवश्यकता होती है जो समय पर एक सेल का विश्लेषण कर सके। इन स्थितियों में, विभिन्न कोशिकाओं की संख्या जिनका विश्लेषण किया जा सकता है, 4-5 घंटे में छोटे, विशिष्ट 5 से 10 कोशिकाएं हैं। हालांकि, एक ही कोशिका पर दर्ज बल माप की मात्रा आमतौर पर बहुत अधिक होती है और आसानी से 1000 तक पहुंच सकती है। इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं पर एएफएम बल माप का वर्तमान प्रतिमान सैकड़ों बल घटता (एफसी) को रिकॉर्ड करना है, लेकिन सीमित संख्या में कोशिकाओं पर।

सांख्यिकीय, यह दृष्टिकोण संदिग्ध है, और नमूना के प्रतिनिधिता का मुद्दा उठाता है । दरअसल, यह मुश्किल है, उदाहरण के लिए, केवल कुछ कोशिकाओं को मापने के द्वारा एक सेल आबादी की विषमता का मूल्यांकन करने के लिए, भले ही माप के सैकड़ों इन कुछ कोशिकाओं पर दर्ज कर रहे हैं । हालांकि, इस प्रतिमान के आधार पर बायोफिजिक्स,माइक्रोबायोलॉजी और नैनोमेडिसिन1,2,3में प्रमुख प्रगति हुई है । दरअसल, एकल कोशिकाओं के पैमाने पर नैनोमीटर विश्लेषण ने सेलुलर नैनोमैकेनिक्स पर, ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन के संगठन पर, या एंटीमाइक्रोबियल या एंटीकैंसर दवाओं केएक्शन तंत्र4,5,6, 7पर नई जानकारी प्रदान की है। हाल ही में हालांकि, कोशिकाओं पर किए गए कई उच्च-थ्रूपुट बायोमैकेनिकल परीक्षण8 उभरेहैं, जो इस प्रतिमान को बदलने और सेल जनसंख्या विषमता तक पहुंचने में वैज्ञानिक समुदाय की रुचि दिखा रहे हैं। ये सभी परीक्षण कोशिकाओं को विकृत करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्रणालियों पर भरोसा करते हैं और उनकी समग्र सतह लोचकाअप्रत्यक्ष उपाय प्राप्त करने के लिए तनाव के तहत उनकी विकृति को ऑप्टिकल रूप से मापते हैं । हालांकि, इन तरीकों के साथ एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि वे मोनो-पैरामेट्रिक हैं: केवल सेल लोच की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, वे अनुयायी कोशिकाओं के यांत्रिक मापदंडों के माप की अनुमति नहीं देते हैं, जो उदाहरण के लिए स्तनधारी कोशिकाओं या बायोफिल्म्स के अध्ययन के लिए सीमित हो सकते हैं।

एएफएम से जुड़े दृष्टिकोण एस श्रेरिंग9 और एम Favre10की टीमों द्वारा विकसित किए गए हैं । फाइब्रोनेक्टिन पैटर्न9पर स्कोरिंग एट अल स्थिर कोशिकाएं, अलग - अलग कोशिकाओं को पैटर्न9का आकार लेने के लिए मजबूर करती हैं। फिर इस टीम ने औसत डेटा, 14 से 18 कोशिकाओं के प्रतिनिधि को परिभाषित करने के लिए कुछ कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को मैप किया। फरवे एट अल द्वारा किए गए विकास का उद्देश्य एएफएम कैंटिलीवर्स10को समानांतर बनाकर मापों को मल्टीप्लेक्स करना था । हमारी जानकारी के लिए, मल्टीप्लेक्सिंग दिशा में इस काम के कारण जीवित कोशिकाओं पर माप नहीं हुआ है।

डुजार्डिन की टीम द्वारा प्रस्तावित एक दिलचस्प दृष्टिकोण कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें कस्टम निर्मित कुओं के तल पर इमेजिंग करने में सक्षम एक स्वचालित एएफएम प्रस्तुत करता है। यद्यपि यह विधि कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी के विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं देती है, यह प्रत्येक अच्छी तरह से11में विभिन्न स्थितियों के स्वचालित परीक्षण की अनुमति देता है।

इस काम में हमारा उद्देश्य अधिक महत्वाकांक्षी है क्योंकि हम कम से १० कोशिकाओं को मापने के लिए नहीं एक औसत सेल का उपयोग करना चाहता था, लेकिन, इसके विपरीत, कोशिकाओं के बीच विषमता । एएफएम का उपयोग करके सेल जनसंख्या विषमता तक पहुंचने के लिए हमने यहां जो रणनीति विकसित की है, वह सैकड़ों कोशिकाओं के विश्लेषण पर आधारित है जिस पर सीमित संख्या में बल घटता दर्ज किया जाता है। सीमित संख्या में कोशिकाओं पर बड़ी संख्या में बल घटता रिकॉर्ड करने के "शास्त्रीय" दृष्टिकोण की तुलना में, इस दृष्टिकोण को पूरक माना जाना चाहिए क्योंकि यह एक ही जानकारी प्रदान नहीं करता है। दरअसल, जबकि ठेठ विधि एक व्यक्तिगत सेल सतह विषमता की जांच करने के लिए अनुमति देता है, हमारे दृष्टिकोण का उपयोग कर, हम पूरे सेल जनसंख्या विषमता का उपयोग करने में सक्षम हैं । इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, हमने एक विधि को संयुक्त किया है जो सीधे पीडीएमएस माइक्रोस्ट्रक्चर्ड स्टैंप12के कुओं में रोगाणुओं (यहां खमीर प्रजाति कैंडिडा एल्बिकान)को स्थिर करता है, और एएफएम टिप को स्वचालित रूप से सेल से सेल13 तक ले जाने और प्रत्येक कोशिका के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए एक मूल कार्यक्रम विकसित करता है।

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Protocol

1. माइक्रोबियल सेल संस्कृति

  1. ग्लिसेरोल स्टॉक से कोशिकाओं को पुनर्जीवित करें।
    नोट: सी एल्बिकान को मार्बल्स पर ग्लिसरोल स्टॉक्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस स्टॉक में एक संगमरमर चुनें और इसे खमीर पेप्टोन डेक्सट्रोस (वाईपीडी) एगर पर रगड़ें। तरल खेती से पहले 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  2. तरल संस्कृतियों को तैयार करें।
    1. बाँझ YPD शोरबा के 5 एमएल के साथ एक संस्कृति ट्यूब भरें और सी एल्बिकान कोशिकाओं की एक कॉलोनी जोड़ें, YPD आगर प्लेट पर उगाया ।
    2. अपकेंद्रित्र (4000 x g,5 मिनट) द्वारा कटाई से पहले 20 घंटे के लिए स्थिर परिस्थितियों में संस्कृति को बढ़ाएं। सुपरनेट को त्यागें और बायोहैजार्ड कचरे के रूप में खत्म करें।
    3. एसीटेट बफर (8 एमएम सोडियम एसीटेट, 1 एमएमएम सीसीएल 2, 1 एमएमएम एमएनएल2,पीएच 5.2) के 10 एमएल के साथ छर्रोंको 2xधोएं। धोने के बीच में सेंट्रलाइज (4000 x ग्राम,5 मिनट) ।
    4. एसीटेट बफर के 2 एमएल में गोली को फिर से रीसुस्पेंड करें और पीडीएमएस स्टैंप पर सेल इम्मोबिलाइजेशन के लिए इस घोल का इस्तेमाल करें।
      नोट: यह निलंबन संग्रहीत नहीं किया जा सकता है और धारा 3 के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए ।

2. पीडीएमएस स्टांप तैयार

  1. सिलिकॉन मास्टर मोल्ड तैयारी
    1. कंप्यूटर असिस्टेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वांछित माइक्रोस्ट्रक्चर ड्रा करें।
      नोट: डिजाइन किए गए कुएं जाल में जाने के लिए माइक्रोब के समान आकार के होने चाहिए। डिजाइन सूची में कुओं 100 x 100 का एक बड़ा मैट्रिक्स प्रदान करना चाहिए। माइक्रोब के औसत आकार के आसपास थोड़ा अलग आकार के साथ कई सरणी बनाना सबसे अच्छा है।
    2. यदि एक साफ कमरा उपलब्ध है, तो पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 12 के चरण 2 से12का पालन करें । अन्यथा, सिलिकॉन मास्टर मोल्ड वाणिज्यिक स्वच्छ कमरे सुविधाओं से प्राप्त किया जा सकता है।
  2. पीडीएमएस स्टांप मोल्डिंग
    1. पीडीएमएस ओलिगोमर और क्यूरिंग एजेंट(सामग्रीकी तालिका) के 10 से 1, द्रव्यमान अनुपात, द्रव्यमान अनुपात का मिश्रण युक्त 55 ग्राम पीडीएमएस प्रीपॉलिमर समाधान तैयार करें।
    2. वैक्यूम के तहत इस समाधान को मिलाएं और डेगास करें (10-1 -10-2 बार की सीमा में) जब तक कि सभी फंसे हुए बुलबुले पीडीएमएस समाधान (5−10 मिनट) से हटा नहीं दिए जाते हैं।
    3. सिलिकॉन मास्टर मोल्ड और डेगास पर 20 ग्राम डिगास किए गए समाधान को फिर से डालें (10-1 -10-2 बार की सीमा में)।
      नोट: स्टांप मोटाई 2−3 मिमी के आसपास होनी चाहिए।
    4. जब सभी बुलबुले हटा दिए जाते हैं, तो 1 घंटे के दौरान पीडीएमएस को 80 डिग्री सेल्सियस पर रेटिकेट करें।
    5. पीडीएमएस माइक्रोस्ट्रक्चर्ड स्टैंप को एक स्केलपेल (0.5 x 1.5 सेमी2)के साथ दृश्यमान माइक्रोस्ट्रक्चर सरणी के समानांतर दिशा में काटें।
    6. सिलिकॉन मास्टर मोल्ड से स्टांप छील।
    7. इसके ऊपरी हिस्से पर माइक्रोस्ट्रक्चर प्रदर्शित करने के लिए स्टांप वापस करें और इसे ग्लास स्लाइड पर जमा करें। ग्लास स्लाइड से दूर का सामना करना पड़ माइक्रोस्ट्रक्चर है सुनिश्चित करें। ग्लास स्लाइड के पक्ष के साथ स्टांप पर देखे जा सकने वाले माइक्रोस्ट्रक्चर को संरेखित करें, जो बाद में एएफएम स्वचालन प्रक्रिया के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करेगा।
      नोट: इस स्तर पर, पीडीएमएस स्टांप सेल स्थिरीकरण के लिए तैयार है। पीडीएमएस टिकटों को सिलिकॉन मास्टर मोल्ड पर कई महीनों तक स्टोर किया जा सकता है। जब सभी पीडीएमएस मास्टर मोल्ड से हटा दिया जाता है, तो मास्टर मोल्ड पर फिर से एक नया पीडीएमएस स्टांप लगाया जा सकता है (मास्टर मोल्ड को सुरक्षित रखने के लिए, इसे पॉलीयूरेथेन में दोहराना संभव है)14।

3. नमूना तैयार करना

  1. सेल इम्मोबिलाइजेशन
    1. कोशिकाओं से बफर को अलग करने के लिए पुनर्नक्षित सेल समाधान के 600 एक्स जी,5 मिनट) 600 माइक्रोन।
    2. पीडीएमएस स्टैंप पर चरण 3.1.1 से सुपरनेट के पिपेट 200 माइक्रोन, और वैक्यूम के तहत डीगैस (10-1 -10-2 बार की सीमा में) लगभग 40 मिनट के लिए।
      नोट: यह कदम कुओं के अंदर सेल स्थिरीकरण में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है । खमीर सेल दीवार से अणुओं, सुपरनैंट में मौजूद है, शायद इस पूर्व गीला कदम के दौरान पीडीएमएस सतह पर जमा कर रहे हैं । ये अणु, शायद, कोशिकाओं के आसंजन को बढ़ाते हैं और स्टांप भरने की दर में वृद्धि में योगदान देते हैं।
    3. 40 मिनट के बाद, एक पिपेट के साथ, पीडीएमएस सतह से बफर को हटा दें और जमा करें, एक पिपेट के साथ, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए चरण 1.2.4 से सेल समाधान के 200 μL।
    4. कोशिकाओं को संवहनी/केशिका सभा द्वारा स्टांप के माइक्रोस्ट्रक्चर में रखें । इसके लिए, मैन्युअल रूप से 30 और 50 डिग्री के बीच एक कोण के साथ दोनों दिशाओं में एक ग्लास स्लाइड का उपयोग करके स्टांप भर में कोशिकाओं के 200 μL निलंबन फैल गया। उच्च भरने की दर प्राप्त करने के लिए स्टांप पर कई बार ग्लास स्लाइड पास करना आवश्यक हो सकता है।
      नोट: इस विधि का पूरा विवरण उपलब्ध है13।
    5. एक पिपेट के साथ सेल निलंबन निकालें। स्टैंप 3x को एसीटेट बफर, पीएच 5.2 के 1 एमएल के साथ धोएं ताकि उन कोशिकाओं को हटाया जा सके जो फंसी नहीं थीं।
    6. नाइट्रोजन प्रवाह का उपयोग कर स्टांप के पीछे सूखी, ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्टांप सूखी पेट्री डिश का पालन करेगा ।
    7. अंत में कोशिकाओं से भरे पीडीएमएस स्टैंप को पेट्री डिश(सामग्री की तालिका)में जमा करें और तरल माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एसीटेट बफर के 2 एमएल से भरें।
  2. एएफएम चरण पर स्टांप सेट करना
    1. एएफएम संचालन शुरू करते समय 0:0 पर मंच केंद्र।
    2. कैलिब्रेट संवेदनशीलता और कांच पर कैंटिलीवर के वसंत स्थिर और पानी में के रूप में Unsay एट अल में वर्णित है ।15
    3. पेट्री डिश को स्टैंप के साथ लें और इसे एएफएम पेट्री डिश होल्डर में रखें।
    4. पेट्री डिश होल्डर वाई एक्सिस को स्टांप एज लंबवत संरेखित करें।
      नोट: एक स्वीकार्य झुकाव कोण 5 डिग्री के तहत है जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है ।
    5. एएफएम सिर को मंच पर रखें और सावधान रहें कि स्टांप पर दुर्घटनाग्रस्त होने के लिए टिप से बचने के लिए स्टेपर मोटर्स को पर्याप्त रूप से बढ़ाया जाता है।

4. एएफएम कार्यक्रम चलाना

नोट: एएफएम कार्यक्रम एक अनुपूरक सामग्री (AutomatipSoftware2019.pdf)के रूप में प्रदान किया जाता है। इसके लिए मोटराइज्ड स्टेज और जेपीके डेस्कटॉप सॉफ्टवेयर वर्जन 4.3 से लैस जेपीके-ब्रूकर एएफएम नैनोविजार्ड II या III की जरूरत होती है। कार्यक्रम को जेथन के तहत विकसित किया गया है (अजगर 2.7 पर आधारित संस्करण)

  1. डेटा अधिग्रहण
    1. एएफएम ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 4.5 x 4.5 माइक्रोन 2 कुओं (सेल आकार के अनुरूप) केबाएं कोने के शीर्ष पर एएफएम टिप को केंद्र में रखें। यदि एक और अच्छी तरह से आकार की जरूरत है, वांछित कुओं के शीर्ष बाएं कोने पर केंद्र ।
    2. 100 x 100 माइक्रोन ² क्षेत्र में 64 x 64 बल मानचित्र (जेड रेंज = 4 माइक्रोन, टिप वेग =90μm-1, लागू बल 3 से 5 nN) करें। माप मोड ड्रॉप-डाउन बॉक्स से फोर्स मैपिंग मोड का चयन करें। फोर्स कंट्रोल मैपिंग पैनल इनपुट में निम्नलिखित पैरामीटर: रेल सेटपॉइंट = 3 से 5 एनएन; z लंबाई 4 माइक्रोन; जेड आंदोलन: निरंतर अवधि; समय का विस्तार: 0.01s; ext. देरी:0; Retr देरी: 0, देरी मोड: निरंतर बल, नमूना दर 2048 हर्ट्ज; जेड बंद लूप अनियंत्रित; ग्रिड: स्क्वायर इमेज, फास्ट 100 माइक्रोन, स्लो: 100μm, एक्स ऑफसेट: 0 माइक्रोन की जांच करें; वाई ऑफसेट: 0 माइक्रोन; ग्रिड कोण: 0 डिग्री; पिक्सल: 64x64; पिक्सल अनुपात: 1:1
      नोट: एक विशिष्ट परिणाम चित्रा 2में दिखाया गया है । यह छवि दो कुओं के बीच पिच को मापने और सत्यापित करने में मदद करेगी।
    3. शीर्ष छोड़ दिया अच्छी तरह से (W1) के केंद्र के निर्देशांक ध्यान दें और नीचे अच्छी तरह से छोड़ दिया (चित्रा 2पर W2 के रूप में संदर्भित) । ऐसा करने के लिए, कुएं के चारों ओर एक वर्ग बॉक्स बनाएं। बॉक्स के केंद्र का समन्वय एक्स, वाई निर्देशांक बॉक्स में एएफएम सॉफ्टवेयर के बाएं पैनल पर दिखाई देता है।
    4. ऑटोमेशन सॉफ्टवेयर खोलने के लिए(Automatip_scan.py):जेपीके डेस्कटॉप सॉफ्टवेयर में टॉप बार मेन्यू में एडवांस पर क्लिक करें और स्क्रिप्ट ओपन का चयन करें। विंडो में जो खोलता है, वह पूरक डेटा(Automatip_scan.py)में प्रदान की गई स्क्रिप्ट फ़ाइल की ओर रास्ता चुनता है।
    5. Jython स्क्रिप्ट(चित्रा 3)के इनपुट बॉक्स अनुभाग में W1 और W2 समन्वय मूल्यों को लागू करें । इनपुट W1 स्क्रिप्ट के पी 1 वेरिएबल लाइन 239 में निर्देशांक करता है और W2 निर्देशांक पी 2 वेरिएबल लाइन 241 में होता है।
      नोट: प्रारंभिक निर्देशांक (W1 और W2) के रूप में चयनित कुओं स्कैनिंग क्षेत्र किनारे से भी बंद नहीं होना चाहिए । अन्यथा केंद्रित एल्गोरिदम सही ढंग से निष्पादित नहीं होगा क्योंकि इसे अच्छी तरह से प्रत्येक तरफ पीडीएमएस सतह पर ऊंचाई को मापने की आवश्यकता है। एक उदाहरण के लिए, चित्र 4देखें ।
    6. स्क्रिप्ट की पिच वेरिएबल लाइन 245 के लिए पिच वैल्यू का श्रेय दें।
    7. डब्ल्यूएस वेरिएबल लाइन 248 में अच्छी तरह से आयाम इनपुट करें। यह अच्छी तरह से पैटर्न के डिजाइन से जाना जाता है और पिच(चित्रा 2)को सत्यापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही छवि पर जांच की जा सकती है।
    8. मनचाए स्थान पर डाटा को सेव करने के लिए लाइन 251 में सेविंग डायरेक्टरी का रास्ता लिखें।
    9. कुल क्षेत्र चर लाइन 254 100 माइक्रोन की इच्छा कई"एन"के लिए सेट करें (जो इस्तेमाल किए गए एएफएम का अधिकतम स्कैन क्षेत्र है)। कुओं की कुल संख्या है कि जांच की जाएगी इस मूल्य और पिचका उपयोग कर गणना की जा सकतीहै:अधिकतम स्कैन क्षेत्र/
      नोट: चित्रा 3के उदाहरण में, 100 x 100 माइक्रोन2 के 9 क्षेत्रों का विश्लेषण किया जाएगा।
    10. बल घटता मैट्रिक्स, पंक्ति और कॉलम (3, 3 या 4, 4), numScans चर लाइन २५७ में अच्छी तरह से दर्ज की गई सेट करें ।
      नोट: चित्रा 3के उदाहरण में, प्रत्येक अच्छी तरह से 3 x 3 = 9 एफसी का मैट्रिक्स दर्ज किया जाएगा।
    11. कार्यक्रम चलाएं। स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
      नोट: कार्यक्रम पहले स्वचालित रूप से W1 और W2 कुओं (चरण 1) के केंद्र को बेहतर ी से निर्धारित करने के लिए एक केंद्रित एल्गोरिदम निष्पादित करता है। यह तो स्वचालित रूप से पहले स्कैनिंग क्षेत्र (चरण 2) के प्रत्येक कुएं पर बल घटता (आईसी) मैट्रिक्स प्राप्त करता है । जब उस क्षेत्र के सभी कुओं की जांच की जाती है, तो स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से एएफएम टिप को अगले स्कैनिंग क्षेत्र के पहले कुएं में ले जाती है। टिप मुकर जाता है, माइक्रोस्कोप चरण अगले क्षेत्र में जाता है, टिप फिर से स्टांप पर संपर्क किया जाता है और केंद्र एल्गोरिदम को फिर से निष्पादित किया जाता है ताकि उस क्षेत्र (चरण 3) के पहले कुएं (1') पर स्वचालित रूप से फिर से केंद्र हो सके। पहला क्षेत्र उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किया गया है, दूसरा, दाईं ओर है जब तक एन नहीं पहुंच जाता है। n+1 क्षेत्र एन + 1 के बाईं ओर एन, एन + 2, आदि के नीचे है जब तक कि 2n तक नहीं पहुंच जाता है। 2n + 1 2n के नीचे है, और 2n + 2 2n, आदि पर दाईं ओर है। विश्व स्तर पर, टिप कुल क्षेत्र के माध्यम से टेढ़ा। चरण 2 और 3 स्वचालित रूप से दोहराया जाता है जब तक स्कैनिंग क्षेत्रों की कुल संख्या"एन2"की जांच नहीं की गई है। चित्रा 5 कार्यक्रम के प्रवाह को प्रस्तुत करता है। कार्यक्रम को पूरा करने में ~ 4 एच लगते हैं।
  2. डेटा विश्लेषण
    1. एक फ़ोल्डर में एफसी फ़ाइलों को व्यवस्थित करने के लिए पूरक डेटामें प्रदान की गई "कॉपी फ़ाइलें" अजगर स्क्रिप्ट(Copy_files_L.py)निष्पादित करें। इस स्क्रिप्ट को पायथन 2.7 और SciPy मॉड्यूल के साथ विकसित किया गया था। अजगर स्क्रिप्ट खोलने के लिए विजुअल स्टूडियो कोड सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। सामान्य फ़ोल्डर (पूरक डेटा में प्रदान की गई स्क्रिप्ट की लाइन 67) और जहां इसे संग्रहीत किया जाएगा (लाइन 73) के लिए इनपुट पथ।
    2. बल घटता का विश्लेषण करने के लिए AFM निर्माता डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर खोलें। शीर्ष मेनू फाइलमें ,स्पेक्ट्रोस्कोपी वक्र्स केखुले बैच का चयन करें ।
    3. बैच प्रोसेसिंग विंडो में सप्लीमेंट्री डेटा (StiffnessProcess.jpk-proc-फोर्स)में दी गई प्रक्रिया का चयन करें । प्रक्रिया के अंतिम चरण का चयन करें और सभी पर रखें और लागू करनेपर क्लिक करें । सभी बल घटता एक ही उपचार प्राप्त होगा।
      नोट: प्रक्रिया न्यूटन में अंशांकित बल घटता में विक्षेप घटता परिवर्तित करने के लिए एफसी फ़ाइलों से अंशांकन का उपयोग करता है; एक डेटा चौरसाई एल्गोरिदम लागू किया जाता है (लगातार 3 अंकों का औसत); बेसलाइन का अनुवाद शून्य धुरी पर आराम करने के लिए किया जाता है; संपर्क बिंदु एक्सट्रपलेटेड है और एफसी को समन्वय (0,0) पर संपर्क बिंदु रखने के लिए ऑफसेट किया जाता है; कैंटिलीवर का झुकना एफसीएस को घटाया जाता है, रिऐक्शन स्लोप फिट होता है। डेटा उपचार के अंत में, सॉफ्टवेयर एक फ़ाइल उत्पन्न करता है जिसमें प्रत्येक एफसी के लिए एक टेबल देता है: इसका नाम, युवा मॉड्यूलस, संपर्क बिंदु, आसंजन बल, ढलान आदि।
    4. सभी प्रयोगों के लिए चरण 4.2.1 से 4.2.3 तक दोहराएं। विभिन्न फ़ोल्डरों में डेटा को बचाने के लिए सावधान रहें (यानी: "...\
    5. हिस्टोग्राम और बॉक्स प्लॉट को प्लॉट करने और एवोवा सांख्यिकीय उपचार करने के लिए पूरक डेटा में प्रदान की गई आर स्क्रिप्ट का उपयोग करें।
      1. आर स्क्रिप्ट(DataAnalisys.R)खोलने के लिए, आर स्टूडियो सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (.tsv) के साथ निकाली गई जानकारी वाली फाइलों को लोड करें।
      2. पर्यावरण विंडो पर आयात डेटासेट बटन का उपयोग करें, टेक्स्ट (रीडर) से चयनित सूची से और नई विंडो में ब्राउज़र बटन का चयन करें और .tsv फ़ाइल ढूंढें।
      3. एक बार फ़ाइल लोड हो जाने के बाद, विश्लेषण के लिए शामिल किए जाने वाले कॉलम (कठोरता और आसंजन) का चयन करें। सभी कोड को चलाने के लिए, सीटीआरएल + ऑल्ट + आरदबाएं।
        नोट: स्क्रिप्ट 4 डेटासेट के साथ काम करती है, अनुपचारित और इलाज कोशिकाओं दोनों होने वाले दो प्रयोगों पर विचार करें। स्क्रिप्ट के ब्लॉक निष्पादित करना और यह देखना संभव है कि निष्पादित कार्यों के अनुसार चर कैसे बदलते हैं।

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Representative Results

हमने अपने खमीर के रूप में अवसरवादी मानव रोगजनक सी एल्बिकन के जैव भौतिक गुणों पर कैसपोफुंगिन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग किया। Caspofungin एक अंतिम मौका एंटीफंगल अणु का उपयोग किया जाता है जब अन्य दवाएं प्रतिरोध तंत्र कोशिकाओं के एंटीफंगल की ओर विकसित होने के कारण अप्रभावी होती हैं। कार्रवाई का इसका तंत्र ग्लूकन संश्लेषण के लिए जिम्मेदार जटिल fks1/Fks2 के उपइकाइट Fks2 के अवरोध पर आधारित है। चूंकि ग्लूकैन फंगल सेल वॉल16,17का एक प्रमुख घटक है, इसलिए हमने सेल दीवार के जैव भौतिक गुणों में संशोधन की उम्मीद की: कठोरता और आसंजन।

चित्रा 6 विशिष्ट हिस्टोग्राम प्राप्त करता है जब ऊपर प्रस्तुत सभी प्रोटोकॉल लागू किया जाता है। लाल हिस्टोग्राम 957 देशी कोशिकाओं पर दर्ज कठोरता पुनर्विभाजण और 574 कैसपोफुंगिन उपचारित कोशिकाओं पर नीले रंग का प्रतिनिधित्व करता है। पहली दिलचस्प टिप्पणी यह है कि दोनों हिस्टोग्राम मूल्यों के द्विमॉडल वितरण को प्रदर्शित करते हैं। यह अवलोकन केवल इसलिए संभव है क्योंकि हमने सैकड़ों कोशिकाओं को मापा था। छोटे नमूनों पर, शोधकर्ताओं ने आमतौर पर एक ही वितरण का पालन करें और जनसंख्या विषमता याद आती है । 17,18

दूसरी टिप्पणी कैसपोफुंगिन के प्रभाव से संबंधित है। यह विश्व स्तर पर कोशिकाओं की कठोरता को कम करता है जबकि अभी भी दो उपआबादी मौजूद है । अंतिम चरण में प्रस्तावित प्रोटोकॉल चित्र 7में प्रस्तुत देशी और इलाज कोशिकाओं की तुलना प्रदान करता है । यह दर्शाता है कि दो शर्तों में एक अलग कठोरता है और यह अंतर अत्यधिक महत्वपूर्ण है (पी वैल्यू < 0.001)। यह मूल्य विश्लेषण की गई कोशिकाओं की बड़ी संख्या के लिए धन्यवाद तक पहुंच जाता है और प्राप्त परिणामों में अधिक आत्मविश्वास प्रदान करता है।

आसंजन भी स्वचालित रूप से दर्ज डेटा से निकाला गया है और हमने पाया कि नंगे टिप और देशी कोशिकाओं के बीच आसंजन बल ०.६४ ± ०.६ nN का था । इस मामले में भी दो उपआबादी पाई गई: पहले एक 0.7 ± 1.4 nN का एक मतलब आसंजन बल है, जबकि 4.5 ± 1.5 nN के दूसरे। कैस्पोफुंगिन के साथ उपचार आसंजन पर अप्रत्याशित प्रभाव पड़ा। एक प्रयोग में कोई प्रभाव नहीं देखा गया था, लेकिन एक अन्य प्रयोग में, कैसपोफुंगिन ने टिप के आसंजन में कमी और जनसंख्या आसंजन विषमता में कमी को प्रेरित किया। ये परिणाम Proa et al.13से निकाले जाते हैं, जहां उन्हें समग्रता में प्रस्तुत किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एएफएम चरण पर माइक्रोस्ट्रक्चर्ड स्टैंप की स्वीकार्य स्थिति।
बाएं चित्रों पर झुकाव कोण (5 डिग्री तक) कार्यक्रम द्वारा संभाला जा सकता है लेकिन दाईं ओर झुकाव महत्वपूर्ण (10 डिग्री) है। इस आंकड़े को13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: W1 और W2 के रूप में प्रारंभिक निर्देशांक दिखाने वाले भरे हुए पीडीएमएस टिकटों की विशिष्ट एएफएम छवि, स्कैनिंग क्षेत्र(12),झुकाव कोण (θ) का आकार।
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Figure 3
चित्रा 3: स्क्रिप्ट का उपयोगकर्ता इनपुट अनुभाग।
पी 1 और पी 2 अच्छी तरह से 1 (W1) और अच्छी तरह से 2 (W2) चित्रा 2 के निर्देशांक को संदर्भित करता है । अन्य पैरामीटर μm में पिच, μm (Ws) में अच्छी तरह से आकार, डेटा को बचाने के लिए निर्देशिका पथ, कुल वर्ग क्षेत्र है कि स्वचालित AFM द्वारा जांच की जाएगी (कुल क्षेत्र कुल वर्ग क्षेत्र के पक्ष के μm में लंबाई है) और कुओं प्रति बल घटता की संख्या (numScans) हैं । सभी इकाइयां माइक्रोन में हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ऑप्टिकल छवि मूल्यवान (हरे डॉट्स) प्रारंभिक कुओं का एक उदाहरण प्रदान करते हैं ।
ब्लैक स्क्वायर स्कैनिंग क्षेत्र और लाल धब्बे, प्रारंभिक कुओं का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें बेहतर तरीके से छोड़ दिया जाना चाहिए। इस आंकड़े को13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एएफएम द्वारा स्वचालित रूप से निष्पादित 5 चरणों को दिखाने वाले प्रोग्राम फ्लोचार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: औसत कठोरता मूल्यों के हिस्टोग्राम।
(ए, बी) देशी और कैसपोफुंगिन उपचारित कोशिका के लिए प्रति सेल औसत परिणाम दिखाएं। इस आंकड़े को13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: बॉक्स देशी की तुलना भूखंडों और caspofungin कोशिकाओं के साथ इलाज किया ।
3 सितारे पी<0.001 के महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। बॉक्स परिणामों का 90% प्रतिनिधित्व करता है, केंद्रीय रेखा औसत मूल्य है और ऊर्ध्वाधर बार सभी डेटा की सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8: मूल्यों की समय-स्थिति निर्भरता।
केंद्र में हिस्टोग्राम मूल डेटा हैं जो स्थापित उप-जनसंख्या (नीला/पीला) के अनुरूप विभिन्न उपसमूहों में विभाजित हैं। (A,B) प्रयोग में हर घंटे में दो उप-आबादी की उपस्थिति दिखाएं। (C,D)इंडेंटेशन की स्थिति दिखाते हैं; प्रत्येक स्थिति पर उपआबादी (नीला/पीला) की उपस्थिति देखना संभव है। उपसमूह संगठन कश्मीर का मतलब एल्गोरिथ्म का उपयोग किया गया था । इस आंकड़े को13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: सुरक्षित क्षेत्र।
पीडीएमएस के अंदर अच्छी तरह से एक क्षेत्र, उस क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है जहां पिरामिड टिप अच्छी तरह से नीचे तक पहुंचने के दौरान अच्छी तरह से किनारे को नहीं छूता है (एक खाली कुएं के मामले में)। इस आंकड़े को13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़े। कृपया इन फाइलों को नीचे करने के लिए यहां क्लिक करें । 

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Discussion

इस पद्धति द्वारा प्रदान किया गया मुख्य सुधार निर्धारित समय में मापा कोशिकाओं की संख्या में एक महत्वपूर्ण वृद्धि है। समकक्ष प्रति सेल मापा अंकों की संख्या में कमी है । इसका मतलब है कि यह विधि एक एकल कोशिका का विस्तृत विश्लेषण प्रदान करने के लिए डिज़ाइन नहीं की गई है। विधि केवल उन कोशिकाओं पर लागू होती है जो पीडीएमएस स्टैंप के कुओं में फिट हो सकती हैं। स्टांप काफी बहुमुखी है, जबकि इसमें 1.5 x 1.5 माइक्रोन 2 से6 x 6 माइक्रोन2तक के कुएं हैं। फिर भी बेसिलस या बहुत बड़ी कोशिकाओं को स्थिर करना असंभव है। स्टांप और केशिका संवहनी बयान का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए नहीं किया जा सकता है जो बहुत बड़े हैं (लंबाई में लगभग 100 माइक्रोन)।

इस संदर्भ में, पेरिक एट अल19 ने एस्चेरिचिया कोलाई और बेसिलस सबटिलिस जैसे बेसिलस को स्थिर करने के लिए एक स्मार्ट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विकसित किया। यह डिवाइस परिभाषित स्थितियों में और शारीरिक परिस्थितियों में बेसिलस को स्थिर करना संभव बनाता है। सॉफ्टवेयर को इस डिवाइस के विशेष आकार में अनुकूलित करना बहुत दिलचस्प होगा।

टिप संदूषण भी इस स्वचालित प्रणाली में एक समस्या हो सकती है। माइक्रोबियल कोशिकाओं के मामले में, यह इतना प्रचलित नहीं है, लेकिन स्तनधारी कोशिकाओं के मामले में इसका उच्च महत्व है। दुजार्डिन एट अल11 ने अपने स्वचालित प्रोटोकॉल में एक सफाई कदम जोड़कर इस मुद्दे को संबोधित किया। इस चरण में लेजर राशि की जांच और सफाई प्रक्रिया को सक्रिय करने के होते हैं यदि राशि बहुत कम है। साफ कदम एक पानी या इथेनॉल से भरा एक अच्छी तरह से टिप विसर्जित करने के होते हैं।

एक सवाल है कि व्यवस्थित इस स्वचालन काम से उठता है गया है: "क्या विषमता प्रयोग के दौरान कोशिकाओं के विकास से आता है?" । इस सवाल का जवाब देने के लिए, हमने समय के एक समारोह के रूप में कठोरता परिणामों की साजिश रची जैसा कि चित्र 8ए, बीमें प्रस्तुत किया गया था। यह स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि प्रयोग के दौरान किसी भी समय विषम कठोरता मूल्य दर्ज किए जाते हैं।

उसी संदर्भ में उपाय के दौरान टिप स्थिति का प्रश्न उभरा । यह संभव हो सकता है कि एक कोशिका के किनारे पर दर्ज बल घटता कोशिकाओं के शीर्ष पर दर्ज एफसी से एक अलग कठोरता होगा । इस असुविधा से बचने के लिए, हम परिभाषित क्या हम सुरक्षित क्षेत्र कहा जाता है । यह चित्रा 9ए, बी में चित्रित किया गया है और कुओं के अंदर एक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जहां टिप बल माप के दौरान अच्छी तरह से किनारों को नहीं छू जाएगा । इस "सुरक्षित क्षेत्र" का उपयोग करके हम केवल कोशिकाओं पर और उनमें से शीर्ष पर एफसी रिकॉर्ड कर सकते हैं। जैसा कि चित्रा 8सी में दिखाया गयाहै, डी सुरक्षित क्षेत्र के भीतर टिप स्थिति परिणामों की विषमता के लिए जिम्मेदार नहीं है क्योंकि हमें सुरक्षित क्षेत्र में टिप की प्रत्येक स्थिति के लिए दोनों फेनोटाइप मिले हैं।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक स्थिति में दर्ज मूल्य सजातीय हैं, हमने चित्र 9सी, डीमें प्रस्तुत स्थिति के एक समारोह के रूप में कठोरता मूल्यों की साजिश रची । यह दिखाता है कि विषम कठोरता मूल्यों को कुएं में प्रत्येक स्थिति पर दर्ज किया जाता है, जिसका अर्थ है कि कुओं में टिप स्थिति के कारण मनाया गया विषमता विरूपण साक्ष्य नहीं है।

इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल जीवन विज्ञान में लागू एएफएम के क्षेत्र में एक वैचारिक और पद्धतिगत सफलता का प्रतिनिधित्व करता है। उत्पन्न डेटा की बड़ी मात्रा स्वचालित विश्लेषण के साथ संगत हैं जो निस्संदेह नए मानदंडों के अनुसार सेल आबादी के वर्गीकरण की अनुमति देगी। प्रोटीन या चीनी सरणी के लिए इस प्रोटोकॉल का आवेदन पूरी तरह से संभव है और ब्याज के क्षेत्रों के बीच अंतर पर विचार करने के लिए केवल कुछ अनुकूलन की आवश्यकता है।

इसलिए यह एक बहुमुखी प्रोटोकॉल है जो मजबूत अंतःविषय सहयोग का परिणाम है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम CONACYT (मेक्सिको), फ्रांस के विदेश मामलों के मंत्रालय और Université पेरिस 13 के FONCYCYT स्वीकार करना चाहते हैं, हालांकि अंतरराष्ट्रीय सहयोगी ECOS-NORD परियोजना की वित्तीय सहायता नैनो नाम निदान के लिए टटोलना, नंबर 263337 (मेक्सिको) और MI5P02 (फ्रांस) । एएमआर प्रोजेक्ट नंबर 20195489 के जरिए एसआईपी-आईपीएन की वित्तीय मदद का शुक्रिया अदा करना चाहेगा। डबल पीएचडी प्रमाण पत्र (आईपीएन-यूपीएस) प्राप्त करने के लिए कोटुटेल समझौते के माध्यम से CONACYT (नंबर 288029) और आईपीएन से पीएचडी फैलोशिप द्वारा SPC समर्थित है। ईडी और सीएफडी सेंटर नेशनल डी ला रेचेचे Scientifique (CNRS) में शोधकर्ता हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever Bruker AFM probes MLCT The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m
AFM data analysis JPK-Bruker JPK Data processing version minimum 5.1.8 Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount
AFM Petri dishes WPI FluoroDish FD35-100 The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Atomic force Microscope (AFM) JPK-Bruker Nanowizard II or III the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage
Caspofungin Sigma-Aldrich SML0425-5MG Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Code editor Microsoft Visual Studio Code version 1.40.1 https://code.visualstudio.com/
Cryobeads IFU CB12
Dessicator/Degassing chamber Fisherbrand 15594635 The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.
Petri dish heater JPK-Bruker PetriDishHeater This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Sodium acetate buffer pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899 The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months
Statistical analysis language https://www.r-project.org R version 3.6.1 R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment
Statistical analysis software https://rstudio.com R studio version 1.1.463 collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028 Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set
Yeast Peptone D Broth Difco 242820
YPD Agar Difco DF0427-17-6

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References

  1. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  2. Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
  3. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
  4. Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
  5. Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
  6. Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
  7. Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
  8. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  9. Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
  10. Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
  11. Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
  12. Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
  13. Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
  14. Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
  15. Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
  16. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  17. Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
  18. El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
  19. Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).

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Severac, C., Proa-Coronado, S., Formosa-Dague, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells. J. Vis. Exp. (170), e61315, doi:10.3791/61315 (2021).

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