Summary
이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.
Abstract
이 논문에 제시된 방법은 Bio-AFM 실험과 힘 곡선 의 기록을 자동화하는 것을 목표로 합니다. 이 방법을 사용하면 4시간 만에 1000셀의 힘 곡선을 자동으로 기록할 수 있습니다. 4시간 분석 시간을 유지하려면 셀당 힘 곡선 수가 9 또는 16으로 줄어듭니다. 이 방법은 Jython 기반 프로그램과 정의된 패턴에 셀을 조립하는 전략을 결합합니다. 상용 Bio-AFM에 구현된 이 프로그램은 어레이의 첫 번째 셀에 있는 팁을 중앙에 누친 다음 각 셀의 힘 곡선을 기록하는 동안 셀에서 셀로 자동으로 이동할 수 있습니다. 이 방법론을 이용하여, 그들의 강성, 그들의 접착 특성 등과 같은 세포의 생물물리학적 파라미터에 접근할 수 있다. 자동화 와 많은 수의 세포가 분석되면 세포 집단의 동작에 접근할 수 있습니다. 이것은 데이터가 있는 Bio-AFM 필드에 있는 돌파구입니다, 지금까지, 단지 수십개의 세포에 기록되었습니다.
Introduction
이 작품은 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 살아있는 세포의 수백에 자동 힘 측정을 수행하는 방법론을 제공합니다. 또한 액체 환경에서 수행된 AFM 실험과 호환되는 PDMS 미세 구조화 스탬프에 미생물을 고정하는 방법을 제공한다.
Bio-AFM은 생물학 응용을 위해 잉태된 다음 살아있는 세포를 연구하는 데 사용되는 고도로 전문화된 기술입니다. 그것은 시간에 하나의 셀을 분석 할 수있는 숙련 된 엔지니어가 필요합니다. 이러한 조건에서, 분석될 수 있는 상이한 세포의 수는 4-5시간 안에 오히려 작고, 전형적인 5-10세포이다. 그러나 단일 셀에 기록된 힘 측정의 양은 일반적으로 매우 높으며 쉽게 1000에 도달 할 수 있습니다. 따라서, 살아있는 세포에 대한 AFM 힘 측정의 현재 패러다임은 수백 개의 힘 곡선(FC)을 기록하지만 제한된 수의 세포에 기록된다.
통계적으로, 이 접근은 의심스럽고, 견본의 대표성의 문제를 제기합니다. 실제로, 예를 들어, 수백 개의 측정이 이 몇몇 세포에 기록되더라도, 단지 몇몇 세포를 측정하여 세포 집단의 이질성을 평가하는 것은 어렵습니다. 그러나, 생물물리학, 미생물학 및 나노의학1,2,3에서중요한 진보가 이루어진 것은 이 패러다임에기초한다. 실제로, 단일 세포의 규모에 나노미터 분석은 세포 나노역학, 막 단백질의 조직, 또는 항균 또는 항암제의 작용기전4,5,6,7에대한 새로운 정보를 제공하고있다. 그러나 최근, 세포에 실시 된 몇 가지 높은 처리량 생체 역학 테스트 등장8,이 패러다임을 변경 하 고 세포 인구 이질성에 액세스에 과학 적인 사회의 관심을 보여주는. 이러한 테스트는 모두 미세 유체 시스템에 의존하여 세포를 변형시키고 스트레스하에서 변형을 광학적으로 측정하여 전체 표면 탄성의간접측정을 8을얻습니다. 그러나 이러한 방법의 중요한 문제는 단색 파라메트릭이라는 것입니다: 세포 탄력만 조사할 수 있습니다. 더욱이, 그(것)들은 예를 들면 비순환 포유류 세포 또는 생물막의 연구를 위해 제한될 수 있는 부착된 세포의 기계적인 파라미터의 측정을 허용하지 않습니다.
AFM과 관련된 접근 방식은 S. Scheuring9 및 M. Favre10팀에 의해 개발되었습니다. 슈어링 외. 섬유네틴 패턴 에 고정 된 세포9,패턴 의 모양을 취할 개별 세포를 강제로9. 그런 다음 이 팀은 14~18개의 셀을 대표하는 평균 데이터를 정의하기 위해 몇 셀의 기계적 특성을 매핑했습니다. AFM캔틸레버(10)를병렬화하여 측정을 멀티플렉싱하는 것을 목표로 Farve 등에서 수행한 개발. 우리의 지식에, 멀티 플렉스 방향으로이 작업은 살아있는 세포에 측정으로 이어지지 않았습니다.
Dujardin의 팀이 제안한 흥미로운 접근 방식은 세포를 식별하고 맞춤형 우물의 바닥에서 이미징할 수 있는 자동화된 AFM을 제공합니다. 이 방법은 세포의 큰 집단의 분석을 허용하지 않지만, 각 웰11에서다른 조건의 자동 테스트를 허용한다.
이 일에 있는 우리의 목표는 우리가 평균 세포가 아니라, 반대로, 세포 사이 이질성에 접근하기 위하여 적어도 1000세포를 측정하고 싶었기 때문에 더 야심차다. AFM을 사용하여 세포 인구 이질성에 접근하기 위해 여기에서 개발한 전략은 제한된 수의 힘 곡선이 기록되는 수백 개의 세포의 분석을 기반으로 합니다. 제한된 수의 셀에 많은 수의 힘 곡선을 기록하는 "고전적인" 접근법과 비교하여, 이 접근법은 동일한 정보를 제공하지 않기 때문에 상호 보완적인 것으로 간주되어야 합니다. 실제로, 일반적인 방법은 개별적인 세포 표면 이질성을 탐구하는 것을 허용하는 동안, 우리의 접근을 사용하여, 우리는 전체 세포 집단 이질성에 접근할 수 있습니다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 우리는 직접 PDMS 미세 구조스탬프(12)의우물에 미생물 (여기에 효모 종 칸디다 알비칸)을고정하는 방법을 결합하고, 자동으로, 세포에서 세포(13)에 세포에서, 각 세포의 기계적 특성을 측정AFM 팁을 이동하기위한 원래 프로그램을 개발하고 있다.
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Protocol
1. 미생물 세포 배양
- 글리세롤 육수에서 세포를 되살리십시오.
참고 : C. 알비칸은 구슬에 글리세롤 주식 -80 °C에 저장됩니다.- -80°C 스톡에 대리석을 선택하고 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 한천에 문지릅니다. 액체 재배 전에 30 °C에서 2 일 동안 세포를 성장시면 됩니다.
- 액체 배양을 준비합니다.
- 멸균 YPD 국물의 5mL배양튜브를 채우고 YPD 한천판에서 자란 C. 알비칸스 세포의 단일 식민지를 추가한다.
- 원심분리(4000 x g,5분)로 수확하기 전에 20시간 동안 30°C에서 정전기 조건에서 배양을 늘린다. 상체를 버리고 생물 위험 폐기물로 제거하십시오.
- 아세테이트 버퍼 10mL로 펠릿 2x를 세척하십시오(8mM 아세테이트, 1mM CaCl2,1mM MnCl2,pH 5.2). 심분리기 (4000 x g,5 분) 세탁 사이에.
- 아세테이트 버퍼2mL에서 펠릿을 다시 중단하고 PDMS 스탬프의 세포 고정을 위해 이 솔루션을 사용합니다.
참고: 이 서스펜션은 저장할 수 없으며 섹션 3에 대해 새로 준비해야 합니다.
2. PDMS 스탬프 준비
- 실리콘 마스터 금형 준비
- 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어를 사용하여 원하는 미세 구조를 그립니다.
참고: 디자인된 우물은 트랩하는 미생물과 비슷한 크기여야 합니다. 디자인은 목록에서 우물 100 x 100의 큰 매트릭스를 제공해야합니다. 그것은 미생물의 평균 크기 주위에 약간 다른 크기와 여러 배열을 만드는 것이 가장 좋습니다. - 클린룸을 사용할 수 있는 경우 이전에 게시된 프로토콜12의2단계에서 12단계를 따르십시오. 그렇지 않으면 상업용 클린룸 시설에서 실리콘 마스터 몰드를 획득할 수 있습니다.
- 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어를 사용하여 원하는 미세 구조를 그립니다.
- PDMS 스탬프 성형
- PDMS 올리고머 및 경화제(재료표)의 10 대 1, 질량 비율의 혼합물을 포함하는 PDMS 프리폴리머 용액 55g을준비한다.
- 모든 갇힌 거품이 PDMS 용액 (5-10 분)에서 제거 될 때까지 진공 (10-1 -10-2 막대 범위)에서이 솔루션을 혼합하고 탈가스.
- 실리콘 마스터 몰드와 드가 (10-1 -10-2 바의 범위에서) 다시 탈가스 용액20 g을 붓습니다.
참고 : 스탬프 두께는 약 2-3mm여야합니다. - 모든 거품이 제거되면 1 시간 동안 80 °C에서 PDMS를 망설이시게하십시오.
- 가시미세구조 배열과 평행한 방향으로 메스(0.5 x 1.5cm2)로PDMS 미세구조 스탬프를 잘라냅니다.
- 실리콘 마스터 몰드에서 스탬프를 벗깁니다.
- 스탬프를 반환하여 상부에 미세 구조물을 표시하고 유리 슬라이드에 보관합니다. 유리 슬라이드에서 멀리 향하는 미세 구조가 있는지 확인하십시오. 스탬프에서 볼 수 있는 미세 구조를 유리 슬라이드 의 측면과 정렬하면 나중에 AFM 자동화 절차에 대한 참조역할을 합니다.
참고: 이 단계에서 PDMS 스탬프는 셀 고정을 위한 준비가 되었습니다. PDMS 우표는 몇 달 동안 실리콘 마스터 몰드에 저장할 수 있습니다. 모든 PDMS가 마스터 몰드에서 제거되면 새 PDMS 스탬프를 마스터 몰드에 다시 투사할 수 있습니다(마스터 몰드을 안전하게 유지하기 위해 폴리우레탄에서 복제할 수 있음)14.
3. 샘플 준비
- 셀 고정
- 백리액세포 용액의 원심분리기(500xg, 5분) 600 μL은 완충을 세포로부터 분리한다.
- PDMS 스탬프에 3.1.1 단계에서 상체의 파이프 200 μL, 약 40 분 동안 진공 (10-1 -1-10 -2 바의 범위에서) 하에서 드가.
참고: 이 단계는 우물 내부의 세포 고정을 개선하는 데 중요합니다. 상체에 존재하는 효모 세포 벽의 분자는 아마도 이 사전 습윤 단계 도중 PDMS 표면에 증착됩니다. 이러한 분자, 대부분의 경우 세포의 접착력을 향상시키고 우표 충전 속도의 증가에 기여합니다. - 40분 후 파이펫을 사용하면 PDMS 표면에서 버퍼를 제거하고 피펫을 사용하면 실온에서 15분 동안 1.2.4단계에서 셀 용액의 200 μL을 피펫으로 제거합니다.
- 대류/모세관 어셈블리에 의해 세포를 우표의 미세 구조에 넣습니다. 이를 위해 30~50°의 각도로 양방향으로 유리 슬라이드를 사용하여 스탬프에 200 μL의 셀 서스펜션을 수동으로 확산시다. 높은 충전 속도를 달성하기 위해 스탬프에 유리 슬라이드를 여러 번 통과해야 할 수도 있습니다.
참고: 이 방법에 대한 전체 설명은13에서확인할 수 있습니다. - 파이펫으로 셀 서스펜션을 제거합니다. 스탬프를 아세테이트 버퍼 1mL로 3배, pH 5.2로 세척하여 갇혀 있지 않은 세포를 제거합니다.
- 스탬프가 건조 페트리 접시에 부착되도록 하기 위해 질소 흐름을 사용하여 스탬프 뒷면을 건조시하십시오.
- 마지막으로 페트리 접시(재료의 표)에세포로 채워진 PDMS 스탬프를 입금하고 액체 배지에서 세포를 유지하기 위해 아세테이트 버퍼2 mL로 채웁니다.
- AFM 스테이지에서 스탬프 설정
- AFM 작업을 시작할 때 0:0으로 스테이지를 중앙에 세팅합니다.
- Unsay 외15에 설명된 바와 같이 유리와 물에 캔틸레버의 감도와 스프링 상수를 교정합니다.
- 스탬프가 달린 페트리 요리를 AFM 페트리 접시 홀더에 놓습니다.
- 페트리 접시 홀더 Y 축에 수직으로 스탬프 가장자리를 정렬합니다.
참고: 그림 1에도시된 바와 같이 허용 가능한 기울기 각도가 5° 미만입니다. - AFM 헤드를 무대에 배치하고 스텝퍼 모터가 충분히 확장되어 스탬프에 충돌하는 팁을 피하십시오.
4. AFM 프로그램 실행
참고 : AFM 프로그램은 보충 자료로 제공됩니다(AutomatipSoftware2019.pdf). 그것은 JPK-브루커 AFM 나노 위저드 II 또는 III는 동력 단계와 JPK 데스크탑 소프트웨어 버전 4.3을 갖추고 필요합니다. 이 프로그램은 Jython (파이썬 2.7을 기반으로 버전)에서 개발되었습니다.
- 데이터 수집
- AFM 광학 현미경을 사용하여 4.5 x 4.5 μm2 우물(세포 크기에 해당)의 왼쪽 모서리 위에 AFM 팁을 집중합니다. 또 다른 우물 크기가 필요한 경우 원하는 우물의 왼쪽 상단 모서리를 중심으로 합니다.
- 100 x 100 μm² 면적에 64 x 64 힘 맵(Z 범위 = 4 μm, 팁 속도 = 90μm·s-1,적용 힘 3 ~ 5n)을 수행합니다. 측정 모드 드롭다운 상자에서 힘 매핑 모드를 선택합니다. 힘 제어 매핑 패널 입력 다음 매개 변수: Rel. Setpoint = 3 ~ 5 nN; z 길이 4 μm; Z 이동: 일정한 지속 시간; 연장 시간: 0.01s; 내다. 지연:0; Retr 지연 : 0, 지연 모드 : 일정한 힘, 샘플 속도 2048 Hz; Z 닫기 루프는 검사 취소; 그리드: 체크 스퀘어 이미지, 빠른 100 μm, 느린: 100μm, X 오프셋: 0 μm; Y 오프셋: 0 μm; 그리드 각도: 0도; 픽셀: 64x64; 픽셀 비율: 1:1
참고: 일반적인 결과는 그림 2에표시됩니다. 이 이미지는 두 우물 사이의 피치를 측정하고 확인하는 데 도움이됩니다. - 왼쪽 상단(W1)과 왼쪽 하단의 좌표(그림 2의W2라고 함)의 좌표를 참고합니다. 이렇게하려면 우물 주위에 사각형 상자를 만듭니다. 상자 중앙의 좌표가 X,y 좌표 상자에 AFM 소프트웨어의 왼쪽 패널에 나타납니다.
- 자동화소프트웨어(Automatip_scan.py)를열려면 JPK 데스크톱 소프트웨어에서 상단 바 메뉴에서 사전을 클릭하고 스크립트를 엽니다. 열리는 창에서 보충데이터(Automatip_scan.py)에제공된 스크립트 파일을 향한 경로를 선택합니다.
- Jython 스크립트의 입력 상자 섹션에서 W1 및 W2좌표 값을 구현합니다(그림3). P1 변수 라인(239)에 W1 좌표를 입력하고 P2 가변 선(241)에서 W2 좌표를 입력합니다.
참고: 초기 좌표(W1 및 W2)로 선택한 웰은 스캐닝 영역 가장자리에서 너무 가까워서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 중심 알고리즘은 웰의 각 면에 PDMS 표면의 높이를 측정해야 하기 때문에 올바르게 실행되지 않습니다. 예를 들어 그림 4를참조하십시오. - 피치 값을 스크립트의 피치 변수 라인(245)에 특성을 가합니다.
- Ws 변수 선(248)에서 웰 치수를 입력합니다. 이는 웰 패턴의 설계에서 알려져 있으며 피치를 확인하는 데 사용되는 것과 동일한 이미지로 확인할 수있다(도 2).
- 원하는 위치에 데이터를 저장하려면 251줄에 저장 디렉터리로 경로를 작성합니다.
- totalArea 가변 선(254)을 100 μm의 욕망 배수"n"으로설정합니다(즉, 사용된 AFM의 최대 스캔 영역). 프로브될 총 우물 수는 이 값과 피치를 사용하여 계산할 수 있습니다: 최대 스캔 영역/피치*n2.
참고: 도 3의예에서, 100 x 100 μm2의 9개의 영역이 분석될 것이다. - numScans 변수 선(257)에 잘 기록된 힘 곡선 행렬, 행 및 열(3, 3 또는 4, 4)을 설정합니다.
참고: 그림 3의예에서 3 x 3 = 9 개의 FC의 행렬이 각 우물에 대해 기록됩니다. - 프로그램을 실행합니다. 시작 버튼을 클릭합니다.
참고: 프로그램은 먼저 자동으로 중앙 알고리즘을 실행하여 W1 및 W2 우물의 중심을 더 잘 결정합니다(1단계). 그런 다음 첫 번째 스캐닝 영역(2단계)의 각 웰에서 포스 커브(FORCE Curves) 행렬을 자동으로 획득합니다. 해당 영역의 모든 우물을 프로브하면 스크립트가 자동으로 AFM 팁을 다음 검색 영역의 첫 번째 우물로 이동합니다. 팁은 철회되고, 현미경 단계는 다음 영역으로 이동하고, 팁은 다시 스탬프에 접근하고 센터링 알고리즘은 해당 영역(3단계)의 첫 번째 우물(1')에 자동으로 다시 중심을 다시 중심으로 다시 실행된다. 첫 번째 영역은 사용자가 정의하며, 두 번째 영역은 n에 도달할 때까지 오른쪽에 있습니다. n+1 영역은 n, n+1의 왼쪽에 n+2 아래에 있으며, 2n에 도달할 때까지. 2n+1은 2n 아래에 있으며 2n+2는 2n 등에 오른쪽에 있습니다. 전 세계적으로 팁은 전체 영역을 통해 뱀. 2단계와 3단계는 스캐닝 영역의 총 수"n2"가조사될 때까지 자동으로 반복됩니다. 그림 5는 프로그램의 순서도를 제공합니다. 프로그램을 완료하는 데 ~ 4 시간이 걸립니다.
- 데이터 분석
- "파일 복사" 파이썬스크립트(Copy_files_L.py, 보충 데이터제공)를실행하여 PC 파일을 하나의 폴더로 구성합니다. 이 스크립트는 파이썬 2.7 및 SciPy 모듈로 개발되었습니다. 비주얼 스튜디오 코드 소프트웨어를 사용하여 파이썬 스크립트를 엽니다. 일반 폴더에 대한 입력 경로(보충 데이터에 제공된 스크립트의 줄 67)와 저장위치(73호선).
- AFM 제조업체 데이터 처리 소프트웨어를 열어 힘 곡선을 분석합니다. 상단 메뉴 파일에서분광학 곡선의 일괄 처리를 선택합니다.
- 일괄 처리 창에서 추가데이터(StiffnessProcess.jpk-proc-force)에 제공된 프로세스를 선택합니다. 프로세스의 마지막 단계를 선택하고 유지를 클릭하고 모든 사람에게 적용합니다. 모든 힘 곡선은 동일한 처리를 받게 됩니다.
참고: 이 프로세스는 FC 파일의 교정을 사용하여 편향 곡선을 뉴턴에서 보정된 힘 곡선으로 변환합니다. 데이터 스무딩 알고리즘이 적용됩니다(평균 3연속 점); 기준선은 0축에 놓이도록 변환됩니다. 접점은 추정되고 FC는 콘택트포인트를 좌표(0,0)에 배치하기 위해 오프셋됩니다. 캔틸레버의 굽힘은 FC에 구부러지고, 후퇴 경사면이 장착되어 있습니다. 데이터 처리의 끝에서 소프트웨어는 각 PC에 대한 테이블이 포함된 파일을 생성합니다: 이름, 영 모듈러스, 접점, 접착력, 경사등. - 모든 실험에 대해 4.2.1에서 4.2.3단계를 반복합니다. 다른 폴더에 데이터를 저장하려면 주의하십시오(예: "...\TREATED\" 및 "...\처리되지 않은\")
- 보충 데이터에 제공된 R 스크립트를 사용하여 히스토그램및 상자 플롯을 플롯하고 ANOVA 통계 처리를 수행합니다.
- R스크립트(DataAnalisys.R)를열려면 R 스튜디오 소프트웨어를 사용하고 데이터 처리 소프트웨어(.tsv)로 추출된 정보가 포함된 파일을 로드합니다.
- 환경 창에서 텍스트(readr)에서 선택된 목록에서 데이터 집합 가져오기 단추를 사용하고 새 창에서 브라우저 단추를 선택하고 .tsv 파일을 찾습니다.
- 파일이 로드되면 분석에 포함될 열(강성 및 접착)을 선택합니다. 모든 코드를 실행하려면 Ctrl+Alt+R을누릅니다.
참고: 스크립트는 4개의 데이터 집합에서 작동하며 처리되지 않은 셀과 처리되지 않은 두 가지 실험을 고려합니다. 스크립트 블록을 실행하고 실행된 함수에 따라 변수가 어떻게 변경되는지 확인할 수 있습니다.
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Representative Results
우리는 야영형 인간 병원체 C. 알비칸의 생물학적 특성에 대한 카포핑인의 효과를 분석하기 위해 설명된 프로토콜을 사용했다. Caspofungin는 다른 약물 때문에 항진균 세포를 향해 개발 하는 저항 메커니즘의 효과가 있을 때 사용 되는 마지막 기회 항진균 분자. 그것의 작용 기전은 ß 글루칸 합성을 담당하는 복잡한 fks1/Fks2의 서브유닛 Fks2의 억제에 기초한다. ß 글루칸은 곰팡이세포벽(16,17)의주요 성분이기 때문에, 우리는 세포벽의 생물학적 특성의 변형을 기대했다: 강성 및 접착.
도 6은 위에 제시된 모든 프로토콜이 적용될 때 얻어진 전형적인 히스토그램을 제시한다. 적색 히스토그램은 957개의 네이티브 셀에 기록된 강성 재분할을 나타내고 574캐스포풍 처리된 세포에 대한 파란색 세포를 나타낸다. 첫 번째 흥미로운 관찰은 두 히스토그램이 값의 바이모달 분포를 보여 준다는 것입니다. 이 관측은 우리가 세포의 수백을 측정하기 때문에 가능합니다. 작은 견본에, 연구원은 일반적으로 단 하나 분포를 관찰하고 인구 이질성을 놓칩니다. 17,18
두 번째 관측은 카스포풍의 효과에 관한 것입니다. 그것은 전 세계적으로 세포의 강성을 감소 시키면서 여전히 두 개의 하위 인구가 존재합니다. 마지막 단계에서 제안된 프로토콜은 도 7에제시된 네이티브 및 처리된 세포의 ANOVA 비교를 제공한다. 두 조건이 서로 다른 강성을 가지며 이 차이가 매우 중요하다는 것을 보여줍니다(p 값 < 0.001). 이 값은 분석된 많은 수의 세포 덕분에 도달되며 얻어진 결과에 대한 더 큰 확신을 제공합니다.
접착력은 또한 자동으로 기록된 데이터에서 추출되었으며 맨손과 네이티브 셀 사이의 접착력이 0.64 ± 0.6 nN이었다는 것을 발견했습니다. 이 경우 또한 두 개의 하위 인구가 발견되었습니다 : 첫 번째 는 4.5 ± 1.5 nN의 두 번째 동안 0.7 ± 1.4 nN의 평균 접착력을 가지고 있습니다. caspofungin와 치료는 접착에 예측할 수없는 영향을했다. 한 실험에서는 효과가 관찰되지 않았지만, 다른 실험에서는, caspofungin은 팁에 대한 접착의 감소와 인구 접착이 이질성의 감소를 유도하였다. 이러한 결과는 Proa 외13에서추출되며, 여기서 전체적으로 제시됩니다.
그림 1: AFM 스테이지의 미세 구조화 스탬프의 허용 가능한 위치입니다.
왼쪽 그림의 기울기 각도(최대 5°)는 프로그램에서 처리할 수 있지만 오른쪽의 기울기(10°)가 중요합니다. 이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: W1 및 W2, 스캐닝 영역(Δ2),기울기 각도(θ)의 크기로 초기 좌표를 나타내는 채워진 PDMS 스탬프의 전형적인 AFM 이미지.
이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스크립트의 사용자 입력 섹션입니다.
P1 및 P2는 도 2의 잘 1 (W1) 및 잘 2 (W2)의 좌표를 말한다. 다른 파라미터는 μm의 피치, μm(Ws)의 양크기, 데이터를 저장하기 위한 디렉토리 경로, 자동화된 AFM에 의해 조사될 총 제곱면적(totalArea는 총 제곱 면적의 측면의 길이)과 우물당 힘 곡선의 수(numScans)이다. 모든 단위는 μm에 있습니다.
그림 4: 귀중한(녹색 점) 초기 우물의 예를 제공하는 광학 이미지입니다.
검은 색 사각형은 스캔 영역과 붉은 반점, 더 나은 폐기해야 초기 우물을 나타냅니다. 이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: AFM에서 자동으로 실행되는 5단계를 보여주는 프로그램 순서도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 중앙강성 값의 히스토그램.
(A, B) 네이티브 및 caspofungin 처리 된 셀에 대 한 셀 당 중간 결과 표시 합니다. 이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 네이티브및 카스포풍 셀로 처리된 상자 플롯입니다.
3개의 별은 p<0.001의 의미를 나타냅니다. 상자는 결과의 90%를 나타내고, 중앙선은 중앙선이 중앙값이고 세로 막대는 모든 데이터의 범위를 나타냅니다. 이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 값의 시간 위치 종속성입니다.
중앙의 히스토그램은 설립된 하위 집단(파란색/노란색)에 해당하는 상이한 하위 그룹으로 나뉜 원본 데이터입니다. (A,B) 실험에서 매 시간마다 두 하위 인구의 존재를 보여 준다. (C,D)들여쓰기의 위치를 표시; 각 위치에서 하위 모집단(파란색/노란색)의 존재를 볼 수 있다. 하위 그룹 조직은 k-means 알고리즘을 사용하여 수행되었습니다. 이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 안전한 영역입니다.
PDMS 내부의 영역은 피라미드 끝이 우물 바닥에 도달하는 동안 우물 가장자리에 닿지 않는 영역으로 정의되었습니다 (빈 우물의 경우). 이 그림은13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 데이터. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법론에서 제공하는 주요 개선사항은 측정된 시간 단위로 측정된 세포의 수가 현저한 증가입니다. 대응은 셀당 측정된 점수의 감소입니다. 즉, 이 방법은 단일 셀에 대한 자세한 분석을 제공하도록 설계되지 않았습니다. 이 방법은 PDMS 스탬프의 우물에 들어갈 수 있는 셀에만 적용됩니다. 스탬프는 매우 다재다능하며, 1.5 x 1.5 μm2최대 6 x 6 μm 2의 우물을 포함하고있습니다. 여전히 간균 이나 훨씬 더 큰 세포를 고정 하는 것은 불가능. 스탬프와 모세관 대류 증착은 훨씬 더 큰 포유류 세포 (길이 약 100 μm)를 고정하는 데 사용할 수 없습니다.
이러한 맥락에서, Peric외. 19는 대장균 과 간균 subtilis 같이 간균을 고정하기 위하여 똑똑한 미세유체 장치를 개발했습니다. 이 장치는 정의된 위치와 생리학적 조건하에서 간균을 고정할 수 있게 합니다. 이 장치의 특정 크기에 소프트웨어를 적응하는 것은 매우 흥미로할 것입니다.
팁 오염은 이 자동화 된 시스템에서도 문제가 될 수 있습니다. 미생물 세포의 경우, 그렇게 널리 퍼지지 는 않지만 포유류 세포의 경우 매우 중요합니다. Dujardin외. 11 그들의 자동화 된 프로토콜에 청소 단계를 추가 하 여이 문제를 해결. 이 단계는 합계가 너무 낮은 경우 레이저 합계를 확인하고 청소 절차를 활성화하는 것으로 구성됩니다. 깨끗한 단계는 물이나 에탄올로 가득 잘 채워진 팁에 몰입으로 구성됩니다.
이 자동화 작업에서 체계적으로 발생하는 질문은 다음과 같은 것입니다: "이질성은 실험 도중 세포의 진화에서 유래합니까?" 이 질문에 대답하기 위해,우리는 그림 8A, B에제시 된 시간의 함수로 강성 결과를 플롯 . 이질적인 강성 값이 실험 중에 언제든지 기록된다는 것을 명확하게 보여줍니다.
같은 맥락에서 측정 중 팁 위치의 질문이 나타났다. 셀 의 가장자리에 기록 된 힘 곡선세포의 상단에 기록 된 FC와 다른 강성을 가질 수 있습니다. 이러한 불편을 피하기 위해 우리는 안전 영역이라고 부르는 것을 정의했습니다. 그림 9A,B에 묘사되며 힘 측정 중에 팁이 우물 가장자리를 만지지 않는 우물 내부의 영역을 나타냅니다. 이 "안전한 영역"을 사용하면 셀과 그 위에FC를 기록할 수 있습니다. 도 8C에 도시된 바와같이, 안전 영역 내의 팁 위치는 안전한 영역에서 팁의 각 위치에 대한 두 표현형을 모두 발견했기 때문에 결과의 이질성에 대해 책임을 지지 않습니다.
각 위치에 기록된 값이 균일한지 확인하기 위해 그림 9C,D에제시된 위치의 함수로 강성 값을 플롯했습니다. 이질적인 강성 값이 우물의 각 위치에 기록되어 관찰된 이질성이 우물의 팁 위치로 인해 아티팩트가 아니라는 것을 의미한다.
이 문서에 제시된 프로토콜은 생명 과학에 적용되는 AFM 분야의 개념적, 방법론적 돌파구를 나타냅니다. 생성된 대량의 데이터는 의심 할 여지없이 새로운 기준에 따라 세포 집단의 분류를 허용하는 자동 분석과 호환됩니다. 단백질 또는 설탕 배열에 이 프로토콜의 응용은 전적으로 가능하고 관심 있는 지역 사이 간격을 고려하기 위하여 단지 몇몇 적응이 필요합니다.
따라서 강력한 학제 간 협력의 결과인 다목적 프로토콜입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 CONACYT (멕시코), 프랑스 외무부및 유니버시테 파리 13의 FONCYCYT를 인정하고 싶습니다, 국제 협력 ECOS-NORD 프로젝트의 재정 지원하지만 진단나노-palpation, No. 263337 (멕시코) 및 MI5P02 (프랑스). AMR은 프로젝트 No. 20195489 통해 SIP-IPN의 재정 지원에 감사드립니다. SPC는 COtutelle 계약을 통해 CONACYT(no. 288029)와 IPN의 박사 학위 펠로우십에 의해 지원되며, 이중 박사 학위(IPN-UPS)를 획득합니다. ED와 CFD는 센터 내셔널 드 라 레체르체 시엔티피크 (CNRS)의 연구원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
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