Summary
Detta protokoll syftar till att automatisera AFM-mätningar på hundratals mikrobiella celler. Först immobiliseras mikrober i PDMS-stämpelmikrostrukturer och sedan utförs kraftspektroskopimätningar automatiskt på hundratals immobiliserade celler.
Abstract
Metoden som presenteras i detta dokument syftar till att automatisera Bio-AFM-experiment och registrering av kraftkurvor. Med den här metoden är det möjligt att registrera kraftkurvor på 1000 celler på 4 timmar automatiskt. För att bibehålla en 4 timmars analystid minskas antalet kraftkurvor per cell till 9 eller 16. Metoden kombinerar ett Jython-baserat program och en strategi för att montera celler på definierade mönster. Programmet, som implementeras på en kommersiell Bio-AFM, kan centrera spetsen på matrisens första cell och sedan automatiskt flytta från cell till cell medan du registrerar kraftkurvor på varje cell. Med hjälp av denna metod är det möjligt att komma åt cellernas biofysiska parametrar som deras styvhet, deras självhäftande egenskaper etc. Med automatiseringen och det stora antalet celler analyserade kan man komma åt cellpopulationens beteende. Detta är ett genombrott inom bio-AFM-området där data hittills bara har registrerats på ett fåtal tiotals celler.
Introduction
Detta arbete ger en metodik för att utföra automatiska kraftmätningar på hundratals levande celler med hjälp av ett atomkraftmikroskop (AFM). Det ger också en metod för att immobilisera mikrober på en PDMS-mikrostrukturerad stämpel som är kompatibel med AFM-experiment som utförs i en flytande miljö.
Bio-AFM är en högspecialiserad teknik som utformats för tillämpningar inom biologi och sedan använts för att studera levande celler. Det kräver en utbildad ingenjör som kan analysera en cell vid den tiden. Under dessa förhållanden är antalet olika celler som kan analyseras ganska litet, typiskt 5 till 10 celler på 4-5 timmar. Mängden kraftmätningar som registreras på en enda cell är dock vanligtvis mycket hög och kan lätt nå 1000. Således är det nuvarande paradigmet för AFM-kraftmätningar på levande celler att registrera hundratals kraftkurvor (FCs) men på ett begränsat antal celler.
Statistiskt sett är detta tillvägagångssätt diskutabelt och tar upp frågan om urvalets representativitet. Det är faktiskt svårt att till exempel utvärdera en cellpopulations heterogenitet genom att bara mäta ett fåtal celler, även om hundratals mätningar registreras på dessa få celler. Det är dock på grundval av detta paradigm som stora framsteg har gjorts inom biofysik, mikrobiologi och nanomedicin1,2,3. Nanometeranalys i samma skala som enstaka celler har gett ny information om cellulär nanomekanik, om organisationen av transmembranproteiner eller verkningsmekanismen för antimikrobiella läkemedel eller cancerläkemedel4,5,6,7. Nyligen har dock flera biomekaniska tester med hög genomströmning som utförts på cellerdykt upp 8, vilket visar forskarsamhällets intresse för att ändra detta paradigm och få tillgång till cellpopulationens heterogenitet. Dessa tester är alla beroende av mikrofluidiska system för att deformera celler och optiskt mäta deras deformation under stress för att erhålla ett indirekt mått på deras totala ytelasticitet8. En viktig fråga med dessa metoder är dock att de är monoparmetriska: endast cellelasticitet kan undersökas. Dessutom tillåter de inte mätning av de mekaniska parametrarna för vidhäftande celler, vilket kan vara begränsande för studier av icke-ylekterande däggdjursceller eller biofilmer till exempel.
Metoder som involverar AFM har utvecklats av teamen S. Scheuring9 och M. Favre10. Intrigerande et al. immobiliserade celler på fibronectinmönster9, vilket tvingar enskilda celler att ta formen avmönstret 9. Sedan kartlade det här teamet de mekaniska egenskaperna för några celler för att definiera genomsnittliga data, representativa för 14 till 18 celler. Den utveckling som Utförs av Farve m.fl. syftar till att multiplexera mätningarna genom att parallellisera AFM-kantilevers10. Vår kännedom om detta arbete i multiplexriktningen har inte lett till mätningar på levande celler.
Ett intressant tillvägagångssätt som föreslås av Dujardins team presenterar en automatiserad AFM som kan identifiera celler och avbilda dem längst ner i skräddarsydda brunnar. Även om denna metod inte tillåter analys av en stor population av celler, tillåter den automatisk testning av olika förhållanden i varje brunn11.
Vårt mål i detta arbete är mer ambitiöst eftersom vi ville mäta minst 1000 celler för att få tillgång till inte en genomsnittlig cell, utan tvärtom heterogeniteten mellan celler. Strategin som vi utvecklade här för att få tillgång till cellpopulationens heterogenitet med hjälp av AFM bygger på analys av hundratals celler där ett begränsat antal kraftkurvor registreras. Jämfört med den "klassiska" metoden att registrera ett stort antal kraftkurvor på ett begränsat antal celler, bör detta tillvägagångssätt betraktas som komplement eftersom det inte ger samma information. Medan den typiska metoden tillåter en att undersöka individuell cellyta heterogenitet, med hjälp av vårt tillvägagångssätt, kan vi komma åt hela cellpopulationens heterogenitet. För att uppnå detta mål har vi kombinerat en metod som direkt immobiliserar mikrober (här jästarten Candida albicans) i brunnarna i en PDMS-mikrostruktureradstämpel 12, och utvecklar ett originalprogram för att flytta AFM-spetsen automatiskt från cell till cell13 och mäta de mekaniska egenskaperna hos varje cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrobiell cellkultur
- Återuppliva celler från ett glycerollager.
OBS: C. albicaner lagras vid -80 °C i glycerollager, på kulor.- Välj en marmor i -80 °C-buljongen och gnugga den på jäst peptone dextros (YPD) agar. Odla cellerna i 2 dagar vid 30 °C, före flytande odling.
- Förbered flytande kulturer.
- Fyll ett odlingsrör med 5 ml steril YPD-buljong och tillsätt en enda koloni av C. albicansceller, odlade på YPD-agarplattan.
- Odla kulturen under statiska förhållanden vid 30 °C i 20 timmar före skörd med centrifugering (4000 x g, 5 min). Kassera supernaten och eliminera som biologiskt avfall.
- Tvätta pelletsen 2x med 10 ml acetatbuffert (8 mM natriumacetat, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5.2). Centrifugering (4000 x g, 5 min) mellan tvätterna.
- Återanvänd pelleten i 2 ml acetatbuffert och använd denna lösning för cell immobilisering på PDMS-stämpeln.
OBS: Denna suspension kan inte förvaras och bör beredas färskt för avsnitt 3.
2. PDMS stämpelberedning
- Silikon master mögel förberedelse
- Rita önskade mikrostrukturer med hjälp av CAD-programvara (Computer Assisted Design).
OBS: De brunnar som är konstruerade ska vara av liknande storlek som mikroben som ska fällas. Designen ska ge en stor matris med brunnar 100 x 100 på listan. Det är bäst att göra flera matriser med lite olika storlekar runt mikrobens genomsnittliga storlek. - Om ett rent rum är tillgängligt följer du steg 2 till 12 i det tidigare publicerade protokollet12. Annars kan silikon master mögel förvärvas från kommersiella renrum anläggningar.
- Rita önskade mikrostrukturer med hjälp av CAD-programvara (Computer Assisted Design).
- PDMS stämpel gjutning
- Bered 55 g PDMS prepolymerlösning som innehåller en blandning av 10 till 1, massförhållande, PDMS-oligomerer och härdningsmedel (Materialförteckning).
- Blanda och avgasa denna lösning under vakuum (inom intervallet 10-1 -10-2 bar) tills alla fångade bubblor avlägsnas från PDMS-lösningen (5−10 min).
- Häll 20 g av den avgasade lösningen på silikon master mögel och avgaser igen (i intervallet 10-1-10-2 barer).
OBS: Stämpeltjockleken ska vara cirka 2−3 mm. - När alla bubblor tas bort, retikulera PDMS vid 80 °C under 1 timme.
- Skär PDMS mikrostrukturerade stämpel med en skalpell (0,5 x 1,5 cm2) i en riktning som är parallell med de synliga mikrostrukturmatriserna.
- Skala stämpeln från silikon master mögel.
- Sätt tillbaka stämpeln för att ställa ut mikrostrukturerna på ovansidan och deponera den på en glasrutschbana. Se till att mikrostrukturerna är vända uppåt från glasrutschbanan. Justera mikrostrukturerna som kan ses på stämpeln med sidan av glasrutschbanan, som senare kommer att fungera som referens för AFM-automatiseringsproceduren.
OBS: I detta skede är PDMS-stämpeln redo för cell immobilisering. PDMS-frimärkena kan lagras på silikon master mögel i flera månader. När alla PDMS tas bort från masterformen kan en ny PDMS-stämpel gjutas igen på masterformen (för att hålla masterformen säker är det möjligt att replikera den i polyuretan)14.
3. Provberedning
- Cell immobilisering
- Centrifugering (500 x g, 5 min) 600 μL av den återanvända celllösningen för att separera bufferten från cellerna.
- Rör 200 μL av supernatanten från steg 3.1.1 till PDMS-stämpeln och avgaser under vakuum (i intervallet 10-1-10-2 barer) i ca 40 min.
OBS: Detta steg är viktigt för att förbättra cell immobiliseringen inuti brunnarna. Molekyler från jästcellväggen, som finns i supernatanten, deponeras förmodligen på PDMS-ytan under detta förtlande steg. Dessa molekyler, troligen, förbättrar cellernas vidhäftning och bidrar till ökningen av stämpelfyllningshastigheten. - Efter 40 min, med en pipett, ta bort bufferten från PDMS-ytan och deponera, med en pipett, 200 μL av celllösningen från steg 1.2.4 i 15 min vid rumstemperatur.
- Placera cellerna i stämpelens mikrostrukturer genom konvektiv/kapillärenhet. För det, sprid manuellt 200 μL celler suspension över stämpeln med en glas glid i båda riktningarna med en vinkel mellan 30 och 50°. Det kan vara nödvändigt att passera glasrutschbanan flera gånger på stämpeln för att uppnå en hög fyllningshastighet.
OBS: En fullständig beskrivning av denna metod finnstillgänglig 13. - Ta bort cellupphängningen med en pipett. Tvätta stämpeln 3x med 1 ml acetatbuffert, pH 5.2 för att ta bort de celler som inte var fångade.
- Torka baksidan av stämpeln med hjälp av kväveflödet för att säkerställa att stämpeln fastnar på den torra Petri-skålen.
- Deponera slutligen PDMS-stämpeln fylld med celler i en petriskål (Table of Materials) och fyll den med 2 ml acetatbuffert för att behålla cellerna i flytande medium.
- Ställa in stämpeln på AFM-scenen
- Centrera scenen klockan 0:0 när du startar AFM-operationer.
- Kalibrera kantilevers känslighet och fjäderkonstant på glas och vatten enligt beskrivningen i Unsay etal.
- Ta Petri-skålen med stämpeln och placera den i AFM Petri-maträtthållaren.
- Rikta stämpelkanten vinkelrätt mot Petri-skålhållaren Y-axeln.
OBS: En acceptabel lutningsvinkel är under 5° enligt figur 1. - Placera AFM-huvudet på scenen och var försiktig så att stegmotorerna är tillräckligt utsträckta för att undvika att spetsen kraschar på stämpeln.
4. Köra AFM-programmet
AFM-programmet tillhandahålls som kompletterande material(AutomatipSoftware2019.pdf). Det kräver en JPK-Bruker AFM Nanowizard II eller III utrustad med en motoriserad scen och JPK desktop software version 4.3. Programmet har utvecklats under Jython (version baserad på python 2.7)
- Datainsamling
- Centrera AFM-spetsen ovanpå det vänstra hörnet av de 4,5 x 4,5 μm2 brunnarna (motsvarande cellstorleken) med hjälp av afm optiskt mikroskop. Om en annan brunnsstorlek behövs, centrera på det övre vänstra hörnet av önskade brunnar.
- Utför en 64 x 64 kraftkarta (Z-område = 4 μm, spetshastighet = 90 μm·s-1, applicerad kraft 3 till 5 nN) över ett 100 x 100 μm² område. Välj Kraftmappningsläge i listrutan Mätläge. I kraftkontrollmappningspanelen matas följande parametrar in: Rel. Börvärde = 3 till 5 nN; z längd 4 μm; Z-rörelse: konstant varaktighet; förlängningstid: 0,01s; ext. fördröjning:0; Retrfördröjning: 0, Fördröjningsläge: Konstant kraft, Samplingshastighet 2048 Hz; Z stängd slinga avmarkera; Rutnät: kontrollera kvadratisk bild, Snabb 100 μm, långsam: 100μm, X offset: 0 μm; Y-förskjutning: 0 μm; rutnätsvinkel: 0 grader; Pixlar: 64x64; pixelförhållande: 1:1
OBS: Ett typiskt resultat visas i figur 2. Den här bilden hjälper till att mäta och verifiera tonhöjden mellan två brunnar. - Observera koordinaterna för mitten av den övre vänstra brunnen (W1) och den nedre vänstra brunnen (kallas W2 på figur 2). För att göra det, gör en fyrkantig låda runt brunnen. Koordinaten för mitten av rutan visas på den vänstra panelen i AFM-programvaran i x y koordinatrutor.
- För att öppna automatiseringsprogrammet (Automatip_scan.py): i JPK-skrivbordsprogrammet klickar du på förskott i den övre barmenyn och väljer öppna skriptet. I fönstret som öppnas väljer du sökvägen till skriptfilen som anges i Kompletterande data (Automatip_scan.py).
- Implementera W1- och W2-koordinatvärden i avsnittet Indata i Jython-skriptet (bild 3). Mata in W1-koordinaterna på variabelraden P1 239 i skriptet och W2-koordinaterna på variabelraden P2 241.
OBS: De brunnar som valts som inledande koordinater (W1 och W2) bör inte vara för nära skanningsområdets kant. Annars skulle mittningsalgoritmen inte fungera korrekt eftersom den måste mäta höjden på PDMS-ytan på varje sida av brunnen. Ett exempel finns i bild 4. - Tillskriv tonhöjdsvärdet till tonhöjdsvariabeln rad 245 i skriptet.
- Mata in brunnsdimensionen på variabelraden Ws 248. Detta är känt från utformningen av brunnsmönstren och kan kontrolleras på samma bild som den som används för att verifiera tonhöjden (Figur 2).
- Skriv sökvägen till sparkatalogen på rad 251 för att spara data på önskad plats.
- Ställ in den totala Variabellinjen Area 254 på önska multipeln "n" på 100 μm (det vill säga det maximala skanningsområdet för den AFM som används). Det totala antalet brunnar som ska undersökas kan beräknas med hjälp av detta värde och tonhöjden: maximalt skanningsområde/tonhöjd*n2.
OBS: I exemplet med figur 3kommer 9 områden på 100 x 100 μm2 att analyseras. - Ställ in kraftkurvorna matris, rad och kolumn (3, 3 eller 4, 4), som registrerats per brunn på variabelraden 257 NumScans.
OBS: I exemplet med figur 3 registrerasen matris på 3 x 3 = 9 FCs för varje brunn. - Kör programmet. Klicka på Start-knappen.
OBS: Programmet kör först automatiskt en centreringsalgoritm för att bättre bestämma mitten av W1- och W2-brunnar (steg 1). Den hämtar sedan automatiskt matrisen Force Curves (FCs) på varje brunn i det första skanningsområdet (steg 2). När alla brunnar i det området undersöks flyttar skriptet automatiskt AFM-spetsen till den första brunnen i nästa skanningsområde. Spetsen dras tillbaka, mikroskopsteget flyttas till nästa område, spetsen närmar sig igen på stämpeln och centreringsalgoritmen körs igen för att automatiskt centrera på den första brunnen (1') i det området (steg 3). Det första området definieras av användaren, det andra, är till höger etc. tills n nås. n+1-området är under n, n+2 till vänster om n+1, etc. tills 2n har uppnåtts. 2n+1 är under 2n, och 2n+2 är till höger på 2n, etc. Globalt serpentinerna genom den totala ytan. Steg 2 och 3 upprepas automatiskt tills det totala antalet "n2" av skanningsområden har undersökts. I bild 5 presenteras programmets flödesschema. Det tar ~4 h att slutföra programmet.
- Dataanalys
- Kör pythonskriptet "Kopiera filer" (Copy_files_L.py, som finns i kompletterande data) för att ordna FCs-filerna i en mapp. Detta skript utvecklades med Python 2.7 och SciPy-modulen. Använd Visual Studio Code-programvaran för att öppna python-skriptet. Inmatningssökväg till den allmänna mappen (rad 67 i skriptet som tillhandahålls i kompletterande data) och var den ska lagras (rad 73).
- Öppna PROGRAMVARAN för databehandling av AFM-tillverkare för att analysera kraftkurvorna. På den översta menyn Arkivväljer du öppnabatchen med spektroskopikurvor.
- I batchbearbetningsfönstret väljer du den process som anges i Kompletterande data (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Välj det sista steget i processen och klicka på Behåll och tillämpa på alla. Alla kraftkurvor får samma behandling.
OBS: Processen använder kalibreringen från FCs-filerna för att omvandla avböjningskurvorna till kraftkurvor kalibrerade i Newton; En datautjämningsalgoritm tillämpas (i genomsnitt 3 på varandra följande punkter). Baslinjen översätts till vila på nollaxeln. Kontaktpunkten extrapoleras och FC förskjuts för att placera kontaktpunkten vid koordinaten (0,0). Kantilevers böjning subtraheras till FCs, upprullningslutningen monteras. I slutet av databehandlingen genererar programvaran en fil som innehåller en tabell som ger för varje FCs: dess namn, Young Modulus, kontaktpunkt, vidhäftningskraft, sluttningar etc. - Upprepa steg 4.2.1 till 4.2.3 för alla experiment. Var noga med att spara data i olika mappar (dvs. "...\TREATED\" och "...\UNTREATED\")
- Använd R-skriptet i Kompletterande data för att rita histogram och box-tomter och utföra ANOVA-statistiska behandlingar.
- Om du vill öppna R-skriptet (DataAnalisys.R), använd R studio-programvara och ladda filerna som innehåller informationen som extraheras med databehandlingsprogramvaran (.tsv).
- I miljöfönstret använder du knappen Importera datauppsättning, i listan som visas välj från text (avläsare) och i det nya fönstret väljer du knappen Webbläsare och hittar TSV-filen.
- När filen har lästs in väljer du de kolumner (styvhet och vidhäftning) som ska inkluderas för analysen. Om du vill köra all kod trycker du på Ctrl+Alt+R.
OBS: Skriptet fungerar med 4 datamängder, tänk på två experiment som både har obehandlade och behandlade celler. Det är möjligt att köra block av skriptet och se hur variablerna ändras enligt de funktioner som körs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde det beskrivna protokollet för att analysera effekten av caspofungin på de biofysiska egenskaperna hos den opportunistiska mänskliga patogenen C. albicans i dess jästform. Caspofungin är en sista chans svampdödande molekyl som används när andra läkemedel är ineffektiva på grund av de resistensmekanismer celler utvecklas mot svampdödande. Dess verkningsmekanism är baserad på hämningen av underenheten Fks2 av de komplexa fks1/Fks2 som ansvarar för ß glucansyntesen. Eftersom ß glukaner är en viktig komponent i svampcellväggen16,17, förväntade vi oss modifiering av cellväggens biofysiska egenskaper: styvhet och vidhäftning.
Figur 6 presenterar typiska histogram som erhållits när alla protokoll som presenteras ovan tillämpas. Det röda histogrammet representerar styvhetsrepartitionen som registrerats på 957 inhemska celler och den blå på 574 caspofunginbehandlade celler. Den första intressanta iakttagelsen är att båda histogrammen visar en bimodal fördelning av värdena. Denna iakttagelse är möjlig bara för att vi mätte hundratals celler. På mindre prover observerar forskare vanligtvis en enda fördelning och saknar befolkningens heterogenitet. 17,18
Den andra iakttagelsen gäller effekten av caspofungin. Det minskar cellernas styvhet globalt medan det fortfarande finns två subpopulationer. I ett sista steg ger det föreslagna protokollet en ANOVA-jämförelse av de inhemska och behandlade cellerna som presenteras i figur 7. Det visar att de två förhållandena har en annan styvhet och att denna skillnad är mycket signifikant (p värde < 0,001). Detta värde uppnås tack vare det stora antalet celler som analyseras och ger ett större förtroende för de erhållna resultaten.
Vidhäftningen har också extraherats från automatiskt registrerade data och vi fann att vidhäftningskraften mellan den nakna spetsen och de inhemska cellerna var 0,64 ± 0,6 nN. I detta fall konstaterades också två delpopulationer: den första har en genomsnittlig vidhäftningskraft på 0,7 ± 1,4 nN medan den andra av 4,5 ± 1,5 nN. Behandlingen med caspofungin hade oförutsägbara effekter på vidhäftningen. I ett experiment observerades ingen effekt, men i ett annat experiment inducerade caspofungin en minskning av vidhäftningen till spetsen och en minskning av befolkningens vidhäftnings heterogenitet. Dessa resultat extraheras från Proa et al.13, där de presenteras i totalitet.
Figur 1: Godtagbar position för den mikrostrukturerade stämpeln på AFM-scenen.
Lutningsvinkeln på vänster bild (upp till 5°) kan hanteras av programmet men lutningen till höger är viktig (10°). Denna siffra har ändrats från13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Typisk AFM-bild av en fylld PDMS-stämplar som visar de ursprungliga koordinaterna som W1 och W2, skanningsområdets storlek (Δ2), lutningsvinkeln (θ).
Denna siffra har ändrats från13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Avsnittet Användarinmatning i skriptet.
P1 och P2 avser koordinaterna för brunn 1 (W1) och brunn 2 (W2) i figur 2. De andra parametrarna är tonhöjden i μm, brunnsstorleken i μm (Ws), katalogsökvägen för att spara data, den totala kvadratiska ytan som kommer att undersökas av den automatiserade AFM (totalArea är längden i μm på sidan av den totala kvadratytan) och antalet kraftkurvor per brunnar (numScans). Alla enheter är i μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Optisk bild som ger ett exempel på värdefulla (gröna prickar) initiala brunnar.
Den svarta fyrkanten representerar skanningsområdet och de röda fläckarna, initiala brunnar som bättre bör kasseras. Denna siffra har ändrats från13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: Flödesschema för program som visar de 5 steg som automatiskt körs av AFM. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Histogram av medianvärdena för styvhet.
A,B) Visa medianresultaten per cell för inbyggd och caspofunginbehandlad cell. Denna siffra har ändrats från13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Låddiagram som jämför infödda och behandlade med caspofunginceller.
De tre stjärnorna representerar en betydelse av p<0.001. Rutan representerar 90 % av resultaten, den centrala raden är medianvärdet och de lodräta staplarna representerar intervallet för alla data. Denna siffra har ändrats från13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Tidspositionsberoende av värden.
Histogram i mitten är de ursprungliga data som är indelade i de olika undergrupperna som motsvarar de delpopulationer som grundades (blå/gul). A,B) Visa närvaron av de två delpopulationerna varje timme i experimentet. C,D)visa indragspositionerna, på varje position är det möjligt att se förekomsten av subpopulationerna (blå/gul). Undergruppsorganisationen gjordes med hjälp av k-medelalgoritmen. Denna siffra har ändrats från13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9: Det säkra området.
Ett område, inuti PDMS-brunnen, har definierats som det område där pyramidspetsen inte vidrör brunnskanten när den når brunnsbotten (vid en tom brunn). Denna siffra har ändrats från13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande uppgifter. Klicka här för att ladda ner dessa filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den största förbättringen med denna metod är en betydande ökning av antalet uppmätta celler på en bestämd tidsperiod. Motparten är en minskning av antalet uppmätta poäng per cell. Det betyder att den här metoden inte är utformad för att ge en detaljerad analys av en enda cell. Metoden gäller endast celler som får plats i PDMS-stämpeln. Stämpeln är ganska mångsidig, medan den innehåller brunnar på 1,5 x 1,5 μm2 upp till 6 x 6 μm2. Fortfarande är det omöjligt att immobilisera bacillus eller mycket större celler. Stämpeln och kapillärkonvektivt nedfall kan inte användas för att immobilisera däggdjursceller som är mycket större (cirka 100 μm långa).
I detta sammanhang utvecklade Peric et al.19 en smart mikrofluidisk enhet för att immobilisera bacillus som Escherichia coli och bacillus subtilis. Denna anordning gör det möjligt att immobilisera bacillus vid definierade positioner och under fysiologiska förhållanden. Det skulle vara mycket intressant att anpassa programvaran till den specifika storleken på denna enhet.
Tipskontaminering kan också vara ett problem i detta automatiserade system. När det gäller mikrobiella celler är det inte så utbrett, men det är av stor betydelse när det gäller däggdjursceller. Dujardin et al.11 tog itu med problemet genom att lägga till ett rengöringssteg i deras automatiserade protokoll. Detta steg består i att kontrollera lasersumman och aktivera rengöringsproceduren om summan är för låg. Det rena steget består av att doppa spetsen i en brunn fylld med vatten eller etanol.
En fråga som systematiskt uppstår från detta automatiseringsarbete har varit: "kommer heterogeniteten från cellernas utveckling under experimentet?". För att besvara denna fråga ritade vi stelhetsresultaten som en funktion av tiden som presenteras i figur 8A, B. Det visar tydligt att heterogena styvhetsvärden registreras när som helst under experimentet.
I samma sammanhang uppstod frågan om spetsens position under åtgärden. Det kan vara möjligt att kraftkurvor som registreras på kanten av en cell skulle ha en annan styvhet än FC inspelad på toppen av cellerna. För att undvika denna olägenhet definierade vi vad vi kallade det säkra området. Den avbildas i figur 9A,B och representerar ett område inuti brunnarna där spetsen inte kommer att vidröra brunnskanterna under kraftmätning. Med hjälp av detta "säkra område" kunde vi bara spela in FC på celler och högst upp i dem. Som visas i figur 8C,D är spetsens position inom det säkra området inte ansvarig för resultatens heterogenitet eftersom vi hittade båda fenotyperna för varje position på spetsen, i det säkra området.
För att säkerställa att de värden som registreras vid varje position är homogena ritade vi styvhetsvärdena som en funktion av positionen som presenteras i figur 9C,D. Det visar att heterogena styvhetsvärden registreras på varje position i brunnen, vilket innebär att den observerade heterogeniteten inte är en artefakt på grund av spetspositionen i brunnarna.
Protokollet som presenteras i denna artikel representerar ett konceptuellt och metodologiskt genombrott inom området AFM tillämpas inom life science. De stora mängder data som genereras är förenliga med automatisk analys som utan tvekan kommer att möjliggöra klassificering av cellpopulationer enligt nya kriterier. Tillämpningen av detta protokoll på protein- eller sockersystem är fullt genomförbar och kräver endast ett fåtal anpassningar för att ta hänsyn till avståndet mellan intresseområden.
Det är därför ett mångsidigt protokoll som är resultatet av ett starkt tvärvetenskapligt samarbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill erkänna FONCYCYT of CONACYT (Mexiko), Frankrikes utrikesministerium och Université Paris 13, även om det ekonomiska stödet från det internationella samarbetsprojektet ECOS-NORD heter Nano-palpation for diagnosis, No. 263337 (Mexico) och MI5P02 (Frankrike). AMR vill tacka det ekonomiska stödet från SIP-IPN genom projektet Nr. 20195489. SPC stöds av ett doktorandstipendium från CONACYT (nr 288029) och IPN genom cotutelle-avtalet för att erhålla dubbla doktorandcertifikat (IPN-UPS). ED och CFD är forskare vid Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
References
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
