Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للجمع بين التهجين الفلوري في الموقع (FISH) والكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية (IHC) في كل من أقسام دماغ الفأر المجمدة والثابتة الطازجة ، بهدف تحقيق إشارة FISH متعددة العلامات و IHC مضان. استهدفت المدينة العالمية للخدمات الإنسانية البروتينات السيتوبلازمية والأغشية المرفقة.
Abstract
التهجين الفلوري في الموقع (FISH) هو تقنية جزيئية تحدد الوجود والتوزيع المكاني لنسخ الحمض النووي الريبي المحددة داخل الخلايا. عادة ما يتطلب التنميط الظاهري الكيميائي العصبي للخلايا العصبية المحددة وظيفيا وضع علامات متزامنة مع أجسام مضادة متعددة (استهداف البروتين) باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) وتحسين التهجين في الموقع (استهداف الحمض النووي الريبي) ، جنبا إلى جنب. يمكن تحقيق "توقيع كيميائي عصبي" لتوصيف خلايا عصبية معينة ، لكن العوامل المعقدة تشمل الحاجة إلى التحقق من أهداف FISH و IHC قبل الجمع بين الطرق ، والعدد المحدود من الحمض النووي الريبي والبروتينات التي يمكن استهدافها في وقت واحد داخل نفس قسم الأنسجة.
هنا نصف بروتوكولا ، باستخدام كل من مستحضرات دماغ الفأر الطازجة المجمدة والثابتة ، والتي تكتشف العديد من mRNAs والبروتينات في نفس قسم الدماغ باستخدام RNAscope FISH متبوعا بتلطيخ مناعي مضان ، على التوالي. نستخدم الطريقة المدمجة لوصف نمط التعبير عن mRNAs منخفضة الوفرة (على سبيل المثال ، مستقبلات الجالانين 1) و mRNAs عالية الوفرة (على سبيل المثال ، ناقل الجلايسين 2) ، في نوى جذع الدماغ المناعية المحددة كيميائيا.
تمتد الاعتبارات الرئيسية لوضع العلامات البروتينية في اتجاه مجرى اختبار FISH إلى ما هو أبعد من تحضير الأنسجة وتحسين وضع العلامات على مسبار FISH. على سبيل المثال ، وجدنا أن خصوصية ربط الأجسام المضادة ووضع العلامات يمكن أن تتأثر بشكل ضار بخطوة البروتياز داخل فحص مسبار FISH. تحفز البروتياز الانقسام المائي لروابط الببتيد ، مما يسهل دخول مسبار FISH إلى الخلايا ، ومع ذلك قد يهضم أيضا البروتين المستهدف من قبل اختبار IHC اللاحق ، مما ينتج عنه ارتباط خارج الهدف. الموقع تحت الخلوي للبروتين المستهدف هو عامل آخر يساهم في نجاح IHC بعد فحص مسبار FISH. لاحظنا أن خصوصية IHC يجب الاحتفاظ بها عندما يكون البروتين المستهدف مرتبطا بالغشاء ، في حين أن IHC الذي يستهدف البروتين السيتوبلازمي يتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها على نطاق واسع. أخيرا ، وجدنا أن التعامل مع الأنسجة المجمدة الثابتة المثبتة على الشريحة أكثر صعوبة من الأنسجة المجمدة الطازجة ، ولكن جودة IHC كانت أفضل بشكل عام مع الأنسجة المجمدة الثابتة ، عند دمجها مع RNAscope.
Introduction
عادة ما يتم تحديد البروتينات و mRNAs التي تحدد المجموعات الفرعية للخلايا العصبية كيميائيا بمزيج من الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) و / أو التهجين في الموقع (ISH) ، على التوالي. يسهل الجمع بين تقنيات ISH و IHC توصيف أنماط التوطين المشترك الفريدة للخلايا العصبية الوظيفية (الترميز الكيميائي العصبي) من خلال زيادة قدرة وضع العلامات المتعددة إلى أقصى حد.
تتمتع طرق ISH الفلورية (FISH) ، بما في ذلك RNAscope ، بحساسية وخصوصية أعلى مقارنة بطرق الكشف عن الحمض النووي الريبي السابقة مثل ISH المشع و ISH الكروموجيني غير المشع. يتيح FISH تصور نسخ mRNA المفردة كبقع ملطخة مثقوبة1. علاوة على ذلك ، يسمح اختبار RNAscope بتسمية عدد متزايد من أهداف الحمض النووي الريبي في وقت واحد ، باستخدام علامات فلوروفور مختلفة. على الرغم من هذه المزايا ، قد تؤثر القيود التقنية على عدد الفلوروفورات / الكروموجينات التي يمكن استخدامها في تجربة واحدة. وتشمل هذه توافر مجموعات مرشحات المجهر. تتفاقم هذه الاعتبارات عندما يستخدم التحديد الكيميائي العصبي FISH و IHC مجتمعين ، مقارنة باستخدام كل تقنية على حدة ، لأن الخطوات المتأصلة المثلى لطريقة واحدة قد تكون ضارة بالأخرى.
أظهر التطبيق السابق ل FISH جنبا إلى جنب مع IHC التعبير عن أهداف خلوية محددة في الأورام اللمفاوية للخلايا البائيةالبشرية 2 ، وأجنة الفرخ3 ، وأجنة الزرد4 ، وشبكية العين5 للفأر ، وخلايا الأذن الداخليةللفأر 6. في هذه الدراسات ، كان تحضير الأنسجة إما بارافين مثبت بالفورمالين مضمنا (FFPE) 2،3،5 أو حامل كامل طازج4،6. طبقت دراسات أخرى RNAscope كروموجينيك على مستحضرات دماغ الفئران والفئران الثابتة7،8،9. على وجه الخصوص ، Baleriola et al.8 وصفوا مستحضرين مختلفين للأنسجة ل ISH-IHC مجتمعة. أقسام دماغ الفأر الثابتة وأقسام الدماغ البشري FFPE. في منشور حديث ، قمنا بدمج FISH و IHC الفلوري على أقسام مجمدة طازجة ، لتصور mRNA منخفض الوفرة في وقت واحد (مستقبلات الجالانين 1 ، GalR1) ، mRNA عالي الوفرة (ناقل الجلايسين 2 ، GlyT2) وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (vAChT) بروتين10 في تكوين شبكي جذع الدماغ.
نواة الجهاز الانفرادي (NTS) هي منطقة دماغية رئيسية تشارك في الوظيفة اللاإرادية. تقع هذه المجموعة غير المتجانسة من الخلايا العصبية في الدماغ الخلفي ، وتتلقى وتدمج عددا كبيرا من الإشارات اللاإرادية ، بما في ذلك تلك التي تنظم التنفس. يحتوي NTS على العديد من المجموعات العصبية ، والتي قد تتميز ظاهريا بنمط التعبير عن أهداف mRNA بما في ذلك GalR1 و GlyT2 وعلامات البروتين لإنزيم التيروزين هيدروكسيلاز (TH) وعامل النسخ Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
يوصي مالك RNAscope بتحضير الأنسجة المجمدة الطازجة ، ولكن الأنسجة المحضرة عن طريق تثبيت نضح الدم عبر القلب الحيواني بالكامل ، جنبا إلى جنب مع الحماية بالتبريد على المدى الطويل (التخزين عند -20 درجة مئوية) لأقسام الأنسجة المجمدة الثابتة ، أمر شائع في العديد من المختبرات. ومن ثم ، سعينا إلى وضع بروتوكولات ل FISH بالاشتراك مع المدينة العالمية للخدمات الإنسانية باستخدام مستحضرات الأنسجة الطازجة المجمدة والثابتة. هنا ، نقدم أقسام الدماغ المجمدة الطازجة والمجمدة: (1) بروتوكول ل FISH المشترك و IHC الفلوري (2) وصف لجودة mRNA وعلامات البروتين المنتجة ، عند استخدام كل مستحضر (3) وصف لتعبير GalR1 و GlyT2 في NTS.
كشفت دراستنا أنه عند دمجها مع منهجية RNAscope ، تباين نجاح IHC في المستحضرات الطازجة المجمدة والمجمدة الثابتة ، وكان يعتمد على توطين البروتينات المستهدفة داخل الخلية. في أيدينا ، كان وضع العلامات على البروتين المرتبط بالغشاء ناجحا دائما. في المقابل، تطلب IHC للبروتين السيتوبلازمي استكشاف الأخطاء وإصلاحها حتى في الحالات التي تم فيها التعبير عن البروتين السيتوبلازمي بشكل مفرط في معدل وراثيا (Phox2b-GFP)11. أخيرا ، بينما يتم التعبير عن GalR1 في الخلايا العصبية غير الكاتيكولامينية في NTS ، فإن تعبير GlyT2 غائب في NTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يمكن العثور على ملخص لخطوات المعالجة المسبقة للأنسجة في الشكل 1. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للجنة رعاية والأخلاقيات بجامعة نيو ساوث ويلز وفقا للمبادئ التوجيهية لاستخدام ورعاية للأغراض العلمية (المجلس الوطني الأسترالي للصحة والبحوث الطبية).
1. إعداد عينة من أنسجة المخ المجمدة الطازجة
- التروية عبر القلب
- تحضير الهيبارين (2500 وحدة / لتر) 0.1 M العازلة الفوسفات (PB) ، درجة الحموضة 7.5. اصنع ملاطا إيثانول الثلج الجاف عن طريق خلط الثلج الجاف مع الإيثانول. ستكون درجة حرارة هذا حوالي -72 درجة مئوية وسيتم استخدامه للتجميد الفوري للأنسجة المحصودة.
- القتل الرحيم للبالغين C57BL / 6 و Phox2b-GFP11 (معرف قاعدة بيانات معلوماتية جينوم الماوس MGI: 5776545) عن طريق التخدير باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم (70 مجم / كجم ، i.p.) ، باستخدام مقياس إبرة 27.5 بوصة.
تنبيه: بنتوباربيتال هو باربيتورات. وهو شديد السمية في الجرعات العالية وقد يسبب الوفاة عن طريق توقف التنفس. استشر إرشادات الرعاية الصحية المحلية والقانونية وسلامة المواد قبل الاستخدام. - كشف القلب وقنية البطين الأيسر بإبرة سحب (مقياس 23 بوصة). إجراء التروية عبر القلب مع الهيبارين 0.1 M PB حتى يزول الدم (2-3 دقائق) بمعدل تدفق 11-13 مل / دقيقة. تحديد تطهير الدم من خلال مراقبة لون الكبد والاندفاع من الأذين الأيمن12.
- اعزل الدماغ عن تجويف الجمجمة ، وقم بتضمينه على الفور في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في رقائق كريومولد أو رقائق الألومنيوم وضعه على حمام الإيثانول المثلج الجاف. قم بتخزين الأنسجة المدمجة المجمدة في حاوية محكمة الإغلاق عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- تقسيم الأنسجة الطازجة المجمدة
- اضبط درجة حرارة cryostat على -20 درجة مئوية. اترك الأنسجة المضمنة في OCT وظرف cryostat في cryostat لمدة ~ 30 دقيقة للسماح بالتوازن مع درجة الحرارة الجديدة.
ملاحظة: الحفاظ على الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات; انقل الأنسجة من الفريزر -80 درجة مئوية إلى كريوستات على الثلج الجاف. - ثبت المنديل في ظرف التبريد المبرد مسبقا باستخدام مركب OCT. في هذا البروتوكول ، تم تركيب كتل الأنسجة على ظرف في الطائرة الإكليلية.
ملاحظة: قم بقص OCT الزائد من الأنسجة ، باستخدام شفرة حلاقة ، لتقليل كمية OCT التي يتم قطعها بواسطة cryostat ونقلها لاحقا إلى الشريحة الزجاجية. - قطع مقاطع إكليلية بسمك 14 ميكرومتر وتركيبها على شرائح مجهرية زجاجية مشحونة.
- قم بتسخين الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة قبل تركيب الأقسام. بمجرد تركيب القسم ، احتفظ بالشرائح في مربع شرائح في جهاز التبريد.
- إذا كانت هناك حاجة إلى تركيب أكثر من قسم واحد على شريحة واحدة ، فقم بتدفئة المنطقة للقسم الثاني عن طريق وضع إصبع على الجانب الآخر من الشريحة لمدة 5-10 ثوان للمساعدة في التصاق القسم بالشريحة. لن يعلق قسم الأنسجة الباردة على شريحة باردة. يجب أن تلتصق الأقسام بالشرائح المسطحة ؛ سيؤدي الطي إلى سقوطها من الشرائح أثناء خطوات الغسيل.
- إذا لوحظت تشققات في الأقسام ، فقم بزيادة درجة حرارة cryostat بمقدار 1-5 درجة مئوية لتجنب ذلك. من المهم بشكل خاص وضع أقسام الأنسجة على مقربة من بعضها البعض على نفس الشريحة. هذا سيمنع إهدار مجسات وكواشف FISH أثناء الفحص.
- قم بتخزين أقسام المناديل المثبتة على شرائح زجاجية في حاوية محكمة الغلق عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
ملاحظة: احتفظ بالأقسام مجمدة في جميع الأوقات وتجنب دورات الذوبان بالتجميد ، لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. انقل صندوق الشرائح من داخل cryostat إلى الفريزر -80 درجة مئوية على الثلج الجاف.
- اضبط درجة حرارة cryostat على -20 درجة مئوية. اترك الأنسجة المضمنة في OCT وظرف cryostat في cryostat لمدة ~ 30 دقيقة للسماح بالتوازن مع درجة الحرارة الجديدة.
- تثبيت الأنسجة الطازجة المجمدة
- في اليوم الذي سيتم فيه إجراء فحص مسبار FISH ، قم بإعداد 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 0.1 M PB ، pH 7.5 (محلول PFA 4٪). قم بالترشيح عن طريق المرور عبر ورق الترشيح (الدرجة 1: 11 ميكرومتر ، جدول المواد) في قمع Buchner أو مرشح البوتقة.
تنبيه: PFA ضار وسام عن طريق ملامسة الجلد أو استنشاقه. يجب تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام محلول PFA في خزانة غطاء الدخان. يجب التخلص من نفايات محلول PFA بعناية باتباع بروتوكولات السلامة المؤسسية. - قم بتبريد محلول PFA 4٪ إلى 4 درجات مئوية. انقل المنديل المثبت على الشريحة من الفريزر -80 درجة مئوية في الثلج الجاف واغمره على الفور في المثبت المبرد مسبقا لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: من المهم ألا تتجاوز خطوة التثبيت هذه 15 دقيقة لأن التثبيت الزائد سيؤدي إلى وضع علامات خلفية غير محددة.
- في اليوم الذي سيتم فيه إجراء فحص مسبار FISH ، قم بإعداد 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 0.1 M PB ، pH 7.5 (محلول PFA 4٪). قم بالترشيح عن طريق المرور عبر ورق الترشيح (الدرجة 1: 11 ميكرومتر ، جدول المواد) في قمع Buchner أو مرشح البوتقة.
- جفاف الأنسجة الطازجة المجمدة
- تجفيف أقسام الأنسجة عن طريق غمر الشرائح بتركيزات متدرجة من الإيثانول. في جرة كوبلين ، اغمر أولا في 50٪ ، ثم 70٪ وأخيرا الإيثانول المطلق ، لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كرر حضانة الإيثانول المطلقة النهائية مرة ثانية.
- قم بتجفيف الشرائح في الهواء ، وحدد مجموعة الأقسام باستخدام قلم حاجز كاره للماء ، مما يضمن تقليل المساحة الداخلية إلى الحد الأدنى.
ملاحظة: تأكد من أن الشريحة الزجاجية جافة تماما قبل رسم الحاجز الكارهة للماء. يجب أن يحيط الحاجز الكارهة للماء بأقسام الأنسجة تماما دون فجوات ويجب أن يكون جافا قبل المعالجة الإضافية.
2. إعداد عينة من أنسجة المخ المجمدة الثابتة
- تثبيت التروية عبر القلب
- القتل الرحيم للفئران عن طريق التخدير باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم (70 مجم / كجم ، i.p) متبوعا بالتروية عبر القلب ، أولا بمحلول 0.1 M PB ثم 4٪ PFA. ثبت مع 10 دقائق من التروية عند 11-13 مل / دقيقة.
- عزل الدماغ عن تجويف الجمجمة بعد تثبيت التروية والغمر طوال الليل في محلول PFA 4٪ ، عند 4 درجات مئوية.
- تقسيم الأنسجة من الأنسجة الثابتة
- شطف الدماغ في محلول ملحي معقم 0.1 M الفوسفات المخزن (PBS) قبل إزالة الطبقات السحائية ، بمساعدة المجهر تشريح ، باستخدام ملقط دقيق.
- قطع الدماغ بدقة إلى كتل (فصل جذع الدماغ عن الدماغ الأمامي قبل تقسيم الاهتزاز) باستخدام مصفوفة الدماغ (جدول المواد). على وجه التحديد ، قطع جذع الدماغ ذيليا عند الارتباك الهرمي وتشريح المخيخ. وبالمثل ، قطع الدماغ الأمامي على الفور rostral إلى chiasm البصرية.
- ثبت المنديل على ظرف ميكروتوم مهتز باستخدام cyanoacrylate وقم بتضمينه في محلول أجار 2٪.
- قطع أقسام الأنسجة بسمك 30 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم اهتزازي وتخزين المقاطع المقطوعة في محلول واقي من التبريد (30٪ سكروز خال من RNase ، 30٪ إيثيلين جلايكول ، 1٪ بولي فينيل بيروليدون (PVP-40) ، في 0.1 M PB ، درجة الحموضة 7.4). يمكن تخزين أقسام الأنسجة في مادة واقية من البرد عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- تحضير الأقسام الثابتة قبل FISH
- في يوم FISH ، اغسل الأجزاء العائمة الحرة ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق لكل غسلة ، لإزالة محلول الحماية من التبريد. للغسيل ، ضع الأقسام في 0.1 متر PBS في لوحة زراعة خلية 12 بئرا وحركها على شاكر منصة دوارة (90-100 دورة في الدقيقة).
- بعد الغسيل ، استخدم فرشاة الرسم لتركيب أقسام على شرائح مجهرية زجاجية وجفف في الهواء لمدة 2 ساعة على الأقل.
ملاحظة: يجب أن تلتصق الأقسام بشكل مسطح على الشرائح لأن أي طيات واضحة ستؤدي إلى فصلها أثناء الغسيل. - باستخدام قلم حاجز كاره للماء ، ارسم حاجزا حول الأقسام لتقييد كواشف FISH بالأقسام. مرة أخرى ، من المهم تقليل المساحة الداخلية للمخطط المرسوم بقلم الحاجز.
نقطة الانهيار المحتملة: يمكن تخزين الأقسام في درجة حرارة الغرفة ، طوال الليل ، لمواصلة الفحص في اليوم التالي.
3. فحص الأسماك
ملاحظة: ينطبق باقي البروتوكول على كل من الأنسجة الطازجة المجمدة والمجمدة.
- تحضير الكواشف والأدوات لخطوات التهجين والتضخيم.
- اضبط حاضنة الطاولة وحمام مائي على 40 درجة مئوية.
- قم بإعداد غرفة مرطبة ومحمية من الضوء لاحتضان الشرائح. يمنع الترطيب جفاف الأنسجة - توجد الشرائح بشكل آمن فوق خزان رطب. من الناحية المثالية ، الغرفة مصنوعة من البوليسترين شديد التحمل ، وهي مقاومة للضوء ومحكمة الإغلاق للحفاظ على جو بخار الماء المشبع. يعتمد إغلاق الغرفة على الحد الأدنى من الاحتكاك لتجنب الحركة. استخدمنا صندوق شرائح مبطن بمناديل مختبرية مبللة (جدول المواد) في الأسفل. ضع صندوق الشريحة داخل الحاضنة لتسخينه مسبقا إلى 40 درجة مئوية.
- قم بتسخين 50x Wash Buffer (جدول المواد) والمجسات إلى 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، باستخدام حمام مائي ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- تحضير 1 لتر من 1x Wash Buffer من تركيز المخزون 50x.
- تحضير خليط المسبار (جدول المواد): المسبار C1 جاهز للاستخدام بتركيز المخزون بينما يتم شحن مجسات C2 و C3 بتركيز 50x وتتطلب تخفيفا مع المادة المخففة المتوفرة في المجموعة.
ملاحظة: يمكن تخزين مخاليط المسبار في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- علاج الأنزيم البروتيني
- احتضان الأقسام مع Protease III (جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تأكد من أن البروتياز الثالث وكواشف الحضانة في العمليات النهائية (خليط المسبار ، محاليل التضخيم ، العازلة المانعة وأمصال الأجسام المضادة) تغطي الأقسام بالكامل. يمكن استخدام طرف ماصة لنشر الكاشف على القسم لتغطية المنطقة بأكملها داخل الحاجز الكارهة للماء. - اغسل الشرائح مرتين باستخدام 0.1 متر PBS ، لمدة 2 دقيقة في كل مرة ، في طبق بتري بلاستيكي مربع كبير. هنا تم استخدام طبق فحص حيوي مربع 245 مم × 245 مم (جدول المواد). امسك من جانب واحد من الطبق وقم بإمالته برفق 3-5 مرات. بعد الغسيل ، نفض الغبار الزائد 0.1 متر PBS من الشريحة وأضف الكاشف التالي على الفور. لا تدع أقسام الأنسجة تجف.
ملاحظة: أثناء كل غسلة ، يتم غمر الشرائح في محلول في درجة حرارة الغرفة. هذا هو سير العمل لجميع خطوات الغسيل اللاحقة. تزيح المقاطع الثابتة بسمك 30 ميكرومتر من الشرائح بسهولة أكبر من المقاطع التي يبلغ سمكها 14 ميكرومتر ، وتكون لطيفة أثناء الغسيل.
- احتضان الأقسام مع Protease III (جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- التهجين والتضخيم
- بعد غسل محلول البروتياز ، ضع الشرائح في الغرفة الرطبة والمدفأة. احتضان الأقسام بخليط مسبار (جدول المواد) لمدة 2 ساعة عند 40 درجة مئوية داخل حاضنة منضدة.
ملاحظة: تأكد من وجود أقسام 2 على الأقل مخصصة لتحقيقات التحكم الإيجابية والسلبية لتقييم جودة عينة الحمض النووي الريبي والنفاذية المثلى. تستهدف مجسات التحكم الإيجابي جينات التدبير المنزلي. هنا ، كانت هذه مزيجا من الحمض النووي الريبي الذي يستهدف يوبيكويتين سي (UBC ؛ وفرة عالية) ، إيزوميراز الببتيد بروبيل B (PPIB ؛ وفرة معتدلة) وبوليميراز الحمض النووي الريبي 2a (POLR2A ؛ وفرة منخفضة). تستهدف مجسات التحكم السلبية جين اختزال 4-هيدروكسي-تتراهيدروديبيكولينات البكتيري (DapB) ، والذي عادة ما يكون غائبا في عينات دماغ الفئران. تشير إشارة DapB الإيجابية إلى إشارة غير محددة و / أو تلوث بكتيري للعينة. - بعد التهجين مع خليط المسبار ، تتكون خطوات تضخيم الإشارة من الحضانة مع Amp 1-FL (30 دقيقة) ، ثم مع Amp 2-FL (15 دقيقة) ، تليها Amp 3-FL (30 دقيقة) وأخيرا Amp 4-FL (15 دقيقة) - كل منها عند 40 درجة مئوية. باستخدام زجاجات القطارة المتوفرة ، قم بتغطية أقسام الأنسجة بمحلول التضخيم. انتقل إلى فحص IHC بعد خطوة التضخيم الأخيرة.
- شطف الشرائح مع Wash Buffer مرتين لمدة 2 دقيقة بين تهجين المسبار وكل خطوة تضخيم.
- بعد غسل محلول البروتياز ، ضع الشرائح في الغرفة الرطبة والمدفأة. احتضان الأقسام بخليط مسبار (جدول المواد) لمدة 2 ساعة عند 40 درجة مئوية داخل حاضنة منضدة.
4. فحص المدينة العالمية للخدمات الإنسانية
- خطوة حظر المدينة العالمية للخدمات الإنسانية
- لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة ، احتضان الأقسام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة بمحلول مانع يحتوي على 10٪ مصل حصان طبيعي ، 0.3٪ Tween20 in 1x TBSm (50 mM Tris-Cl ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ ميرثيولات) بعد فحص FISH. قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية في مخزن مؤقت للتخفيف يحتوي على 1x TBSm و 5٪ مصل حصان عادي و 0.1٪ Tween20. يتم سرد موردي الأجسام المضادة الأولية في جدول المواد.
- الكيمياء الهيستولوجية المناعية
- قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد عن طريق تحريك الشريحة واحتضان الأقسام بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منها) باستخدام 1x TBSm واحتضانها بجسم مضاد ثانوي في مادة مخففة تحتوي على 1x TBSm و 1٪ مصل حصان طبيعي و 0.1٪ Tween20 لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. يتم سرد الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.
- اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام 1x TBSm (5 دقائق لكل منها) قبل الانزلاق مع وسط التثبيت مع أو بدون DAPI (جدول المواد).
5. التصوير
- افحص التلوين المناعي تحت مجهر التألق المصحوب بكاميرا (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). احصل على صور تمثيلية بتكبير 20x واحفظها كملفات TIFF.
- تصدير الصور التمثيلية إلى برنامج معالجة الصور (جدول المواد) لضبط السطوع / التباين لزيادة الوضوح وعكس العرض الحقيقي.
6. اختياري: التحليل الكمي للنصوص المستهدفة
ملاحظة: هذه مقالة طرق ولم يتم توفير النتائج الكمية. طريقة القياس الكمي المعروضة هنا مصدرها Dereli et al.10.
- احصل على صور من مناطق الاهتمام كما هو موضح في 5.1 وقم بتطبيق نفس إعدادات المجهر والكاميرا (مثل وقت التعرض وشدة الضوء) على جميع الصور من نفس الفلوروفور.
- ارسم الملامح العصبية باستخدام برنامج تحليل الصور (جدول المواد).
- قم بمحاذاة الأقسام بالإشارة إلى مستوى Bregma وفقا لأطلس الدماغ التجسيمي13.
- قم بتطبيق نفس السطوع والتباين على جميع صور نفس الفلوروفور. ضع في اعتبارك فقط الخلايا العصبية ذات النوى الملطخة ب DAPI.
- احسب يدويا عدد خلايا mRNA ، والتعبير عن البروتين ، و mRNA / mRNA ، والبروتين / البروتين ، وخلايا التعبير المشترك mRNA / البروتين داخل المنطقة محل الاهتمام.
- لتقليل التحيز في النتائج التجريبية ، اجعل الشخص الذي يحدد النتائج التجريبية أعمى عن المجموعات التجريبية.
- تطبيق تصحيح أبركرومبي14 على إجمالي عدد الخلايا باستخدام معادلة أبيركومبي التالية:
عدد الخلايا المصححة = عدد الخلايا اليدوي × سمك المقطع / (سمك المقطع + الحجم النووي)
على سبيل المثال ، بالنسبة للمقاطع التي يبلغ سمكها 14 ميكرومتر ، يتم حساب متوسط العرض النووي ليكون 7.7 ± 0.3 ميكرومتر ومتوسط سمك المقطع 14 ± 1 ميكرومتر بناء على 30 خلية و 10 أقسام على التوالي في 510. وفقا لمعادلة أبركرومبي ، سيكون عدد الخلايا المصححة هو عدد الخلايا اليدوي × 14 / (14 + 7.7).
الشكل 1: سير العمل المتوازي لخطوات المعالجة المسبقة للأنسجة لكل من الأنسجة الثابتة الطازجة المجمدة والبارافورمالدهايد. يتم عرض خطوات معالجة الأنسجة الطازجة المجمدة في المربعات الحمراء المحددة ، بينما يتم عرض خطوات معالجة الأنسجة الثابتة بارافورمالدهايد (PFA) في المربعات الزرقاء المحددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ملخص مسبار FISH المشترك وإجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية. بعد المعالجة المسبقة للأنسجة ، يتم تطويق الأنسجة المثبتة على الشريحة باستخدام قلم حاجز كاره للماء ، كما هو موضح في الإطار الأول ، ويتم تحضينها في محلول بروتياز في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ، يتم نقل الأنسجة إلى حاضنة منضدة للتهجين لمدة 2 ساعة قبل خطوات التضخيم المتسلسلة. يستخدم نظام التهجين في الموقع تصميم "مسبار Z" الخاص ، ومضخمات أولية ومكبرات صوت كما هو موضح في الإطارات 3-66. بمجرد خضوع الأنسجة لمعالجة مسبار FISH ، يتم غسلها قبل حجبها بمصل الحصان العادي. يتم إجراء حضانة الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية لزيادة ارتباط الأجسام المضادة بالمستضد. تم تنفيذ حضانة الأجسام المضادة الثانوية (2 ساعة) في درجة حرارة الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، نحدد طريقة للجمع بين FISH المتعدد مع IHC الفلوري لتوطين تعبير mRNA ل GalR1 و GlyT2 باستخدام الأنسجة الثابتة الطازجة المجمدة وبارافورمالدهايد على التوالي في NTS الفأر. يتم عرض خط أنابيب لمعالجة الأنسجة وإجراءات FISH و IHC الموضحة في الطرق في الشكل 1 والشكل 2. يقدم الجدول 1 ملخصا لمسبار FISH ومجموعات الأجسام المضادة المستخدمة في كل شكل.
يتم فحص مجسات التحكم بشكل روتيني بالتزامن مع المسبار المستهدف ، لضمان سلامة سير العمل وتأكيد جودة العينة. يؤكد غياب ملصقات DapB جودة الأنسجة السليمة وسلامتها ، وغياب التلوث البكتيري (الشكل 3 أ). يؤكد وضع العلامات من مجسات التحكم الإيجابية التي تستهدف يوبيكويتين C (UBC ، وفرة عالية) ، إيزوميراز الببتيد بروبيل B (PPIB ، وفرة معتدلة) وبوليميراز الحمض النووي الريبي 2a (POLR2A ، وفرة منخفضة) mRNA سلامة الحمض النووي الريبي ويمكن استخدام الإشارة الملاحظة بين المقايسات لمعايرة التباين بين المقايسات (الشكل 3B). للتحقق من صحة تعبير مسبار FISH ، استخدمنا أنسجة التحكم التي تم وصفها مسبقا للتعبير عن نسخة mRNA. على سبيل المثال ، تم تأكيد تعبير GalR1 mRNA ، ليكون إيجابيا في المهاد كما هو موضح سابقا10,15. بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقق من توزيع Phox2b mRNA عن طريق وضع العلامات المشتركة مع الجسم المضاد Phox2b. أكدنا أن وضع العلامات على FISH كان موجودا فقط في الخلايا العصبية التي كانت ملطخة أيضا بشكل إيجابي باستخدام الجسم المضاد Phox2b (الشكل 5).
لتمييز الخلايا العصبية GalR1 + في NTS عن النوى المجاورة ، استخدمنا علامات كيميائية عصبية إضافية. TH ، Phox2b أو Phox2b-GFP النشاط المناعي (الشكل 4-6) ، و Phox2b FISH (الشكل 5 والشكل 6) ميز NTS عن النوى الأخرى في جذع الدماغ الظهري حيث تم الإبلاغ سابقا عن الخلايا العصبية NTS للتعبير عن Phox2b و TH16,17. نظرا لأن NTS تقع بواسطة نوى كولينية - فهي تقع ظهرية للنواة تحت اللسان والنواة الحركية الظهرية للمبهم (DMNX) ، وبطنية للنواة الدهليزية - فقد شاركنا في وضع علامة كولينية vAChT18 (الشكل 4). لذلك ، تم تقييم تعبير GalR1 داخل NTS فيما يتعلق ب TH و Phox2b ، بينما ساعد وضع العلامات vAChT في التوجيه المكاني فيما يتعلق بالإحداثيات الذيلية والظهرية البطنية والمتوسطة. وجدنا أن جميع الخلايا العصبية المناعية و GalR1 mRNA الإيجابية في NTS كانت مناعية Phox2b-GFP ، ولكن لم تكن جميع الخلايا العصبية المناعية Phox2b-GFP في NTS هي TH المناعية أو GalR1 mRNA إيجابية (الشكل 4). أيضا ، أثبتنا أن mRNA لمستقبلات الوفرة المنخفضة GalR1 كان غائبا في الخلايا العصبية المناعية TH و vAChT.
في المستحضرات الطازجة المجمدة ، عندما يقترن بفحص مسبار FISH ، كان نجاح IHC يعتمد على الموقع تحت الخلوي للبروتين المستهدف. على سبيل المثال ، كان vAChT (بروتين مرتبط بغشاء الحويصلة المشبكية) موسوما بشكل مناعي بشكل واضح ، في حين أن TH و GFP (البروتينات السيتوبلازمية) تم تصنيفهما مناعيا إلى أجل غير مسمى ولم يتم ملاحظتهما إلا بشكل ضعيف (الشكل 4). نصف هذا التصنيف غير المحدد بأنه "ندف" لأن الخلايا تفتقر إلى مخطط واضح وثبت أنه من الصعب تمييزها عن الخلفية. في نفس قسم الأنسجة المجمدة الطازجة ، تم وضع علامات على مسبار GalR1 FISH للسيتوبلازم GalR1 mRNA ولوحظ بوضوح (الشكل 4).
علاوة على ذلك ، نظرا لأن الأجسام المضادة TH و vAChT تثار في نفس المضيف ، فقد تم تصنيف كلا البروتينين باستخدام نفس الجسم المضاد الثانوي وبالتالي نفس اللون الفلوروفور (ضوء الإثارة: 594). يمكن تمييزها بسهولة لسببين: فهي لا تشارك أبدا في تسمية نفس الخلايا العصبية ، ويختلف التوطين تحت الخلوي لهذه البروتينات. vAChT في الحويصلات التي تظهر مظهرا مثقوبا ، و TH في السيتوبلازم والعمليات العصبية.
لدعم فرضيتنا القائلة بأن جودة IHC (في المستحضرات الطازجة المجمدة) تعتمد على توطين البروتين تحت الخلوي ، قمنا بمقارنة وضع العلامات على Phox2b mRNA (الموجود في السيتوبلازم) ، GFP (الإفراط في التعبير في السيتوبلازم) وبروتين Phox2b (الموجود بشكل أساسي في النواة) في الخلايا العصبية. كما هو متوقع ، تظهر نتائجنا تداخلا بين وسم الأجسام المضادة Phox2b mRNA و GFP و Phox2b في الخلايا العصبية الفردية ل NTS (الشكل 5). تتوافق الخلايا التي تحمل وسم mRNA السيتوبلازمي مع الخلايا التي تظهر علامات نووية لبروتين Phox2b مما يوفر التحقق من صحة طريقة FISH-IHC المدمجة. على الرغم من أن Phox2b-GFP السيتوبلازمي كان له مظهر ندفي ، إلا أن إشارة بروتين Phox2b النووية كانت واضحة ومحددة. في الختام ، عند دمجها مع FISH على المستحضرات الطازجة المجمدة ، تظهر البروتينات المرتبطة بالغشاء بما في ذلك vAChT و Phox2B علامات مناعية عالية الجودة من البروتينات السيتوبلازمية.
في المقابل ، كان IHC موثوقا به بغض النظر عن التوطين دون الخلوي ، عند إجراؤه على أقسام مجمدة ثابتة بالاشتراك مع FISH. كان تعدد إرسال FISH ل GlyT2 mRNA و Phox2b mRNA ناجحا ، كما هو موضح في الشكل 6. كانت الخلايا العصبية الإيجابية GlyT2 mRNA موجودة بطنية ل NTS وليس داخل NTS. الخلايا العصبية GlyT2 + و Phox2b + لم تتمركز. كانت مجموعة فرعية من الخلايا العصبية Phox2b + NTS هي TH المناعية ولم يحتوي أي منها على GlyT2 mRNA. تظهر الخلايا العصبية المناعية TH في نفس قسم الأنسجة ، وتظهر سوما ذات العلامات الإيجابية والعمليات العصبية (الشكل 6). هذا يتناقض مع المظهر "الندف" للخلايا العصبية المناعية TH في أقسام الأنسجة المجمدة الطازجة. وبالتالي ، فإن المستحضر المجمد الثابت الموصوف هنا هو طريقة بديلة لإعداد الأنسجة التي تتيح الاستهداف الموثوق للبروتينات السيتوبلازمية المناعية الكيميائية ، بالاشتراك مع RNAscope.
الشكل 3: صور مجهرية تمثيلية من أقسام الدماغ الأمامي للفأر الإكليلي على مستوى الحاجز الجانبي (Bregma 1.1 إلى -0.1) تظهر وضع العلامات على مجسات التحكم الإيجابية والسلبية . (أ) يؤكد نقص الإشارة بعد ISH مع اختزال 4-هيدروكسي-تتراهيدروديبيكولينات البكتيري (DapB) عدم وجود إشارات خلفية. (ب) يوضح وضع العلامات باستخدام مجسات التحكم الإيجابية التي تستهدف يوبيكويتين C (UBC) وإيزوميراز الببتيد بروبيل B (PPIB) وبوليميراز الحمض النووي الريبي 2a (POLR2A) الإشارة المتوقعة من أهداف الوفرة العالية والمتوسطة والمنخفضة على التوالي. قضبان المقياس 50 ميكرومتر. تم الحصول على جميع الصور بهدف 20x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور مجهرية تمثيلية لمقطع جذع دماغ إكليلي مجمد طازج من فأر Phox2b-GFP يظهر وضع العلامات المجمعة ل GalR1 mRNA (FISH) و 3 بروتينات (IHC) في نواة منطقة القناة الانفرادية (NTS). يتم تكبير الأجزاء الداخلية في A في B. يشار إلى GalR1 mRNA بواسطة ملصقات مسبار FISH المثقوبة (رؤوس الأسهم). أظهرت الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات السيتوبلازمية GFP وهيدروكسيلاز التيروزين (TH) علامات "ندفية" (أسهم). يظهر النشاط المناعي لناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (vAChT) (وضع العلامات المثقوبة الحمراء) في النواة تحت اللسان (XII). قضبان المقياس هي 100 ميكرومتر في A و 25 μm في B. تم الحصول على جميع الصور بهدف 20x. اختصارات أخرى: منطقة postrema (AP) ، النواة الدهليزية الإنسية (MVe). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور مجهرية تمثيلية لقسم جذع دماغ إكليلي مجمد طازج من فأر Phox2b-GFP ، يوضح استهداف Phox2b في نواة القناة الانفرادية (NTS) بثلاث طرق مختلفة: Phox2b mRNA (FISH) ، GFP (IHC) وبروتين Phox2b (IHC). يتم ترجمة بروتين Phox2b إلى النواة. يتم تكبير الأجزاء الداخلية في A في B. تشير الأسهم إلى الخلايا العصبية التي تحمل علامة ثلاثية بمسبار Phox2b (برتقالي -550) وجسم مضاد GFP (أخضر-488) وجسم مضاد Phox2b (أحمر-647). قضبان المقياس هي 100 ميكرومتر في A و 25 μm في B. يتم الحصول على جميع الصور بهدف 20x. اختصارات أخرى: منطقة postrema (AP). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور تمثيلية من أقسام جذع الدماغ الإكليلي المجمدة الثابتة التي توضح نجاح FISH جنبا إلى جنب مع وضع العلامات المناعية الموثوقة للبروتينات السيتوبلازمية (هيدروكسيلاز التيروزين [TH]). FISH مزدوج يظهر ناقل الجلايسين 2 (GlyT2-red-647 ، رؤوس الأسهم المملوءة) و Phox2b (الأصفر -550 ، الأسهم) mRNA وضع العلامات في نواة منطقة القناة الانفرادية (NTS). تم دمج FISH مع IHC لبروتين TH (أزرق -346 ، رؤوس أسهم فارغة). يتم تكبير الأجزاء الداخلية في A في B. أشرطة المقياس 25 ميكرومتر. تم الحصول على جميع الصور بهدف 20x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مسبار الجسم المضاد الأساسي أو RNAscope | الأجسام المضادة الثانوية أو وحدة عرض Amp 4-FL-Alt |
الإثارة (نانومتر) | تحضير الأنسجة | ||
| الشكل 3 | مجس | POLR2A (C1) | وحدة عرض Amp 4-FL-Alt B | 647 | طازجة مجمدة |
| مجس | PPIB (C2) | وحدة عرض Amp 4-FL-Alt B | 488 | ||
| مجس | جامعة كولومبيا البريطانية (C3) | وحدة عرض Amp 4-FL-Alt B | 550 | ||
| مجس | DAPB (C1 ، C2 ، C3) | وحدة عرض Amp 4-FL-Alt B | 647, 488, 550 | ||
| دابي | 346 | ||||
| الشكل 4 | جسم | أرنب مكافحة GFP | حمار مكافحة الأرنب | 488 | طازجة مجمدة |
| جسم | الأغنام المضادة TH | حمار مكافحة الأغنام | 647 | ||
| جسم | الماعز المضادة vAChT | حمار مضاد للماعز | 647 | ||
| مجس | جال آر 1 (ج1) | وحدة عرض Amp 4-FL-Alt B | 550 | ||
| دابي | 346 | ||||
| الشكل 5 | جسم | أرنب مكافحة GFP | حمار مكافحة الأرنب | 488 | طازجة مجمدة |
| جسم | الماوس المضادة Phox2b | حمار مضاد للفأر | 647 | ||
| مجس | فوكس 2 ب (ج2) | أمبير 4-FL-Alt وحدة عرض | 550 | ||
| دابي | 346 | ||||
| الشكل 6 | جسم | الماوس المضادة TH | حمار مضاد للفأر | 346 | ثابت |
| مجس | جلي تي 2 | أمبير 4-FL-Alt وحدة عرض | 647 | ||
| مجس | فوكس 2 ب | أمبير 4-FL-Alt وحدة عرض | 550 |
الجدول 1: مسبار FISH والأجسام المضادة ومجموعات الفلوروفور المقابلة المستخدمة في الأشكال 3-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في علوم الأعصاب ، يتم استخدام FISH و IHC بشكل روتيني للتحقيق في التنظيم المكاني والأهمية الوظيفية ل mRNA أو البروتينات داخل المجموعات السكانية الفرعية العصبية. يعزز البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة القدرة على الكشف المتزامن عن mRNAs والبروتينات في أقسام الدماغ. مكن فحص FISH-IHC المشترك متعدد الإرسال من تحديد النمط الظاهري للمجموعات الفرعية العصبية المتميزة في NTS في كل من مستحضرات الدماغ الطازجة المجمدة والثابتة. أنتجت FISH-IHC في مستحضرات الأنسجة المجمدة الثابتة نتائج موثوقة من IHC. على سبيل المثال ، كشف FISH المتعدد لل mRNAs منخفضة وعالية الوفرة (GalR1 و GlyT2 على التوالي) و IHC (استهداف هيدروكسيلاز التيروزين) أن GalR1 و GlyT2 يتم التعبير عنهما في الخلايا العصبية NTS غير الكاتيكولامينية. لم يكن IHC ل TH ناجحا في الأنسجة المجمدة الطازجة ، مما يسلط الضوء على السعة المحدودة ل FISH-IHC في المستحضرات المجمدة الطازجة.
قد يكون ISH أكثر ملاءمة من IHC في مجموعة من السيناريوهات. أولا ، قد لا يعمل IHC بشكل جيد عند اكتشاف البروتينات منخفضة الوفرة ، مثل المستقبلات. يؤدي استخدام ISH لاستهداف mRNAs ذات الوفرة العالية نسبيا لهذه البروتينات إلى تحسين قابلية الكشف1. ثانيا ، غالبا ما يتم نقل البروتينات مثل الببتيدات العصبية إلى النهايات المحورية بعد الترجمة في الخليةسوما 19. عندما يتم استهداف الببتيدات العصبية ب IHC ، فإن العمليات المحورية وأطراف الخلايا تلصق بالجسم المضاد ، ولكن ليس السوما ، مما يقلل من القدرة على تحديد خلية المنشأ أو إجراء تحليل كمي لعدد الخلايا. ومع ذلك ، نظرا لأن mRNAs التي ترمز لجميع البروتينات موجودة موضعية في سوما ، فإن تقنية ISH مفيدة. أخيرا ، لا تتوفر الأجسام المضادة بسهولة لبعض أنواع البروتين ، أو أن الأجسام المضادة المتاحة مناسبة لتقنيات البروتينات الأخرى (على سبيل المثال ، اللطخة الغربية) ولكن ليس IHC. في هذه الظروف ، تثبت طرق وضع العلامات على mRNA أنها مفيدة. التحذير هو أن mRNAs قد لا تترجم دائما إلى بروتين ، وبالتالي فهي توفر فقط وكيلا لتحديد البروتين. نظرا لأن مجموعات FISH التجارية يمكن أن تكون مكلفة ومن غير المرجح أن تكون مجسات ISH متاحة تجاريا مقارنة بالأجسام المضادة ، فإن الجمع بين FISH و IHC يمثل استراتيجية فعالة من حيث التكلفة والوقت لزيادة عدد الأهداف التي يمكن تصنيفها في وقت واحد.
كان تحضير الأنسجة الطازجة المجمدة مقابل الأنسجة الثابتة عاملا يمنح IHC الناجح بعد فحص مسبار FISH. اختبرنا IHC باستخدام أجسام مضادة تستهدف البروتينات النووية والحويصلية والسيتوبلازمية ووجدنا ملصقات موثوقة للبروتينات المرتبطة بالغشاء (vAChT و Phox2b) على عينات مجمدة طازجة ولكن ليس البروتينات السيتوبلازمية (TH و GFP). أكد التعبير المشترك لبروتين Phox2b و mRNA مع وضع العلامات "الندفية" Phox2b-GFP أن الخلايا العصبية التي تعبر عن النص عبرت أيضا عن البروتين ذي الصلة ، مما يؤكد الهوية الكيميائية العصبية للخلايا العصبية (الشكل 5). في المقابل ، أسفرت مستحضرات الأنسجة المجمدة الثابتة عن وضع علامات موثوقة على IHC بغض النظر عن التوطين تحت الخلوي للمستضد. أظهرت الدراسات السابقة أن المعالجة المسبقة للبروتياز (على سبيل المثال ، pronase8،20) يمكن أن يكون لها تأثير ضار على IHC. محتويات محلول البروتياز المستخدم في بروتوكول RNAscope هي ملكية خاصة ، ويوصى بالنفاذية بواسطة البروتياز للوصول إلى مسبار RNAscope إلى الخلايا. تم التحقق سابقا من وضع العلامات على البروتينات السيتوبلازمية باستخدام الأجسام المضادة الموصوفة هنا على أقسام دماغ الفأر المجمدة الثابتة العائمة 30 ميكرومتر10،21،22. قمنا بتركيب عينات ثابتة بسمك 30 ميكرومتر ونفذنا بروتوكول FISH-IHC ، على عكس الأجزاء الطازجة المجمدة بسمك 14 ميكرومتر الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. في غياب تعديلات المقايسة ، أو تغيير المتغيرات الأخرى (استرجاع المستضد ، تركيز أعلى للأجسام المضادة ، تغيير البروتياز) ، تم تحقيق IHC موثوق به على عينات سميكة وثابتة مع وضع علامات مثبتة على السيتوبلازم والعمليات المحورية جنبا إلى جنب مع وضع العلامات على مسبار FISH (الشكل 6). في حين تم استخدام مناهج مماثلة من قبل مجموعات بحثية أخرى7،8،9 ، حققت الدراسة الحالية مجتمعة ISH-IHC على الخلايا العصبية وفي إعداد الفلورسنت.
كانت هناك سلسلة من الخطوات الحاسمة في الأساليب التي يجب مراعاتها. بالنسبة للتحضير الطازج المجمد ، يجب ألا يتجاوز وقت التثبيت 15 دقيقة ؛ أدت أوقات التثبيت الأطول إلى وضع علامات أعلى في الخلفية. تم تحسين خطوة الأنزيم البروتيني لأن الأنسجة ذات السماكة المختلفة ومن أعضاء مختلفة تتطلب أنواعا مختلفة من البروتياز لتحقيق النفاذية. تلتصق الأقسام المجمدة الثابتة بشكل أقل بالشرائح الزجاجية وتزيح بسهولة أكبر أثناء خطوات الغسيل. وبالتالي ، يجب توخي الحذر الشديد في التعامل اليدوي مع الأقسام المجمدة الثابتة ، لتجنب فقدان الأنسجة أو تلفها.
على الرغم من أننا وجدنا أن FISH و IHC مجتمعة هي استراتيجية فعالة ، إلا أن العيوب تشمل التكلفة والفحص المتطلب تقنيا عند الجمع بين الطريقتين. أحد قيود الدراسة هو أنه لم يتم إجراء مقارنة جنبا إلى جنب بين بروتوكولي تحضير الأنسجة. كما أن تقييمنا للنتائج كان محدودا بعدد القنوات التي يمكن أن يستوعبها المجهر الفلوري. سمح الإعداد بحد أقصى 4 قنوات في وقت معين: 346 و 488 و 550 و 647 نانومتر (ضوء الإثارة). تمكنا من تحقيق وضع علامات متعددة ل 5 أهداف من خلال تسمية بروتينين بتوطين مختلف تحت خلوي باستخدام نفس الفلوروفور (الشكل 4 ، الجدول 1). باستخدام المجهر متحد البؤر ، يمكن استخدام الإثارة المنفصلة للعديد من الفلوروفورات الإضافية لوضع العلامات على البروتين الفردي عبر IHC ، أو لتصوير جزيئات الفلورسنت التي تعبر عنها الجينات المحورة.
يمكن أن يقلل الجمع بين FISH و IHC الفلوري من موثوقية كل تقنية على حدة. في المستقبل ، نهدف إلى تحسين وضع العلامات على البروتين السيتوبلازمي على الأنسجة المجمدة الطازجة مع علاج استرجاع المستضد23. تظهر الدراسات السابقة أن استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة يزيد من إمكانية الوصول إلى حاتمة البروتين24،25،26. تشق المعالجة الحرارية الروابط المتقاطعة ومجموعات الميثيلول من البروتين وتكشف المستضدات في الأنسجة ، وتكشف عن الحواتم التي قد تكون مخبأة في بنية البروتين الثلاثية في ظل الظروف البيولوجية. قد تؤدي إمكانية الوصول هذه إلى تحسين نجاح وضع العلامات على البروتين26,27. بالإضافة إلى ذلك ، سوف نستهدف حوامل مختلفة من نفس البروتين السيتوبلازمي لتحديد ما إذا كان نجاح وضع العلامات على الأجسام المضادة للبروتين يعتمد على استنساخ الأجسام المضادة المحددة المستخدمة.
في الختام ، يعد الجمع بين FISH و IHC مفيدا في التعرف الكيميائي العصبي على مجموعات الخلايا غير المتجانسة في الدماغ ، مثل تلك الموجودة في NTS. تقدم هذه الدراسة بروتوكولين يفحصان مستحضرات مختلفة لأنسجة جذع دماغ الفئران - مجمدة طازجة أو ثابتة - لوضع العلامات الفلورية المتعددة الإرسال في وقت واحد من mRNA والبروتينات في الموقع. يمكن تطبيق كلا البروتوكولين على نطاق واسع للكشف عن نمط التعبير عن mRNAs منخفضة الوفرة ، مثل GalR1. المستحضرات المجمدة الثابتة السميكة (30 ميكرومتر) التي تتخللها البروتياز تمنح كشفا أكثر موثوقية للبروتين السيتوبلازمي والمزيد من تحديات معالجة الأنسجة ، عند مقارنتها بالمستحضرات الطازجة المجمدة الرقيقة (14 ميكرومتر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل منحة مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي DP180101890 ومنحة مشروع مؤسسة ريبيكا إل كوبر للبحوث الطبية PG2018110
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A.
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
