Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att kombinera fluorescens in situ-hybridisering (FISH) och fluorescensimmunhistokemi (IHC) i både färskfrysta och fixerade mushjärnsnitt, med målet att uppnå multilabel FISH och fluorescens IHC-signal. IHC-riktade cytoplasmatiska och membranbundna proteiner.
Abstract
Fluorescent in situ-hybridisering (FISH) är en molekylär teknik som identifierar närvaron och den rumsliga fördelningen av specifika RNA-transkript i celler. Neurokemisk fenotypning av funktionellt identifierade nervceller kräver vanligtvis samtidig märkning med flera antikroppar (målprotein) med hjälp av immunhistokemi (IHC) och optimering av in situ-hybridisering (målsökande RNA), i tandem. En "neurokemisk signatur" för att karakterisera vissa nervceller kan uppnås, men komplicerande faktorer inkluderar behovet av att verifiera FISH- och IHC-mål innan metoderna kombineras, och det begränsade antalet RNA och proteiner som kan riktas samtidigt inom samma vävnadssnitt.
Här beskriver vi ett protokoll, med både färskfrysta och fixerade mushjärnpreparat, som detekterar flera mRNA och proteiner i samma hjärnsektion med hjälp av RNAscope FISH följt av fluorescensimmunfärgning. Vi använder den kombinerade metoden för att beskriva uttrycksmönstret för mRNA med låg förekomst (t.ex. galaninreceptor 1) och mRNA med hög förekomst (t.ex. glycintransportör 2) i immunhistokemiskt identifierade hjärnstamskärnor.
Viktiga överväganden för proteinmärkning nedströms FISH-analysen sträcker sig bortom vävnadsberedning och optimering av FISH-sondmärkning. Till exempel fann vi att antikroppsbindning och märkningsspecificitet kan påverkas negativt av proteassteget i FISH-testet. Proteaser katalyserar hydrolytisk klyvning av peptidbindningar, vilket underlättar inträde i FISH-sonden i celler, men de kan också smälta proteinet som den efterföljande IHC-analysen riktar in sig på, vilket ger bindning utanför målet. Den subcellulära placeringen av det riktade proteinet är en annan faktor som bidrar till IHC-framgång efter FISH-sondanalys. Vi observerade att IHC-specificiteten bibehölls när målproteinet är membranbundet, medan IHC-riktat cytoplasmatiskt protein krävde omfattande felsökning. Slutligen fann vi att hanteringen av objektglasmonterad fast fryst vävnad var mer utmanande än färskfryst vävnad, men IHC-kvaliteten var överlag bättre med fixerad fryst vävnad i kombination med RNAscope.
Introduction
Proteiner och mRNA som neurokemiskt definierar subpopulationer av nervceller identifieras vanligen med en kombination av immunhistokemi (IHC) och/eller in situ-hybridisering (ISH). Att kombinera ISH med IHC-tekniker underlättar karakteriseringen av samlokaliseringsmönster som är unika för funktionella neuroner (neurokemisk kodning) genom att maximera multiplex märkningskapacitet.
Fluorescerande ISH-metoder (FISH), inklusive RNAscope, har högre sensitivitet och specificitet jämfört med tidigare RNA-detektionsmetoder som radioaktivt ISH och icke-radioaktivt kromogent ISH. FISH möjliggör visualisering av enstaka mRNA-transkript som punkterade färgade fläckar1. Dessutom tillåter RNAscope-analysen att ett ökat antal RNA-mål märks åt gången, med hjälp av olika fluorofortaggar. Trots dessa fördelar kan tekniska begränsningar påverka antalet fluoroforer/kromogener som kan användas i ett enda experiment. Dessa inkluderar tillgång till mikroskopfilteruppsättningar; Sådana överväganden försvåras när neurokemisk identifiering använder kombinerad FISH och IHC, jämfört med att använda varje teknik isolerat, eftersom inneboende steg som är optimala för en metod kan vara skadliga för den andra.
Tidigare användning av FISH i kombination med IHC har visat uttrycket av specifika cellulära mål i humana B-cellslymfom2, kycklingembryon3, zebrafiskembryon4, musnäthinna5 och musceller i innerörat6. I dessa studier bestod vävnadspreparationen antingen av formalinfixerat paraffininbäddat (FFPE)2,3,5 eller färskt helmonte 4,6. Andra studier tillämpade kromogent RNAskop på fixerade mus- och råtthjärnpreparat 7,8,9. I synnerhet Baleriola et al.8 beskrev två olika vävnadspreparat för kombinerad ISH-IHC; fixade sektioner av mushjärnor och FFPE-sektioner av mänskliga hjärnor. I en nyligen publicerad publikation kombinerade vi FISH och fluorescerande IHC på färskfrysta snitt, för att samtidigt visualisera mRNA med låg förekomst (galaninreceptor 1, GalR1), mRNA med hög förekomst (glycintransportör 2, GlyT2) och vesikulärt acetylkolintransportörprotein (vAChT)10 i hjärnstammens retikulära formation.
Kärnan i solitärkanalen (NTS) är en viktig hjärnregion som är involverad i autonom funktion. Denna heterogena population av neuroner ligger i bakhjärnan och tar emot och integrerar ett stort antal autonoma signaler, inklusive de som reglerar andningen. NTS hyser flera neuronala populationer, som kan vara fenotypiskt karakteriserade av uttrycksmönstret för mRNA-mål inklusive GalR1 och GlyT2 och proteinmarkörer för enzymet tyrosinhydroxylas (TH) och transkriptionsfaktorn Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
RNAscope-innehavaren rekommenderar färskfrysta vävnadspreparat, men vävnad framställd genom transkardiell perfusionsfixering av hela djur, tillsammans med långtidskryoskydd (förvaring vid -20 °C) av fasta frysta vävnadssnitt, är vanligt i många laboratorier. Därför försökte vi upprätta protokoll för FISH i kombination med IHC med hjälp av färskfrysta och fixerade frysta vävnadspreparat. Här tillhandahåller vi färskfrysta och fixerade frysta hjärnsektioner: (1) ett protokoll för kombinerad FISH och fluorescerande IHC (2) en beskrivning av kvaliteten på mRNA och proteinmärkning som produceras, vid användning av varje preparat (3) en beskrivning av uttrycket av GalR1 och GlyT2 i NTS.
Vår studie visade att, i kombination med RNAscope-metodik, varierade IHC-framgången i färskfrysta och fixerade frysta preparat och var beroende av lokalisering av målproteinerna i cellen. I våra händer har märkningen av membranbundna proteiner alltid varit framgångsrik. Däremot krävde IHC för cytoplasmatiskt protein felsökning även i fall där det cytoplasmatiska proteinet överuttrycktes i ett transgent djur (Phox2b-GFP)11. Slutligen, medan GalR1 uttrycks i icke-katekolaminerga neuroner i NTS, är GlyT2-uttryck frånvarande i NTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En sammanfattning av vävnadsförbehandlingsstegen finns i figur 1. Alla procedurer utfördes i enlighet med Animal Care and Ethics Committee vid University of New South Wales i enlighet med riktlinjerna för användning och skötsel av djur för vetenskapliga ändamål (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Provberedning av färskfryst hjärnvävnad
- Transkardiell perfusion
- Förbered hepariniserad (2500 U/L) 0,1 M fosfatbuffert (PB), pH 7,5. Gör torris etanoluppslamning genom att blanda torris med etanol. Denna kommer att ha en temperatur på cirka −72 °C och kommer att användas för omedelbar frysning av den skördade vävnaden.
- Avliva vuxna möss av typen C57BL/6 och Phox2b-GFP11 (Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) genom bedövning med natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.) med hjälp av en 27,5 tums nålmätare.
VARNING: Pentobarbital är ett barbiturat. Det är akut giftigt i höga doser och kan leda till döden genom andningsstillestånd. Rådgör med lokala hälso- och sjukvårds-, juridiska och materiella säkerhetsriktlinjer före användning. - Exponera hjärtat och kanylera vänster kammare med en uppdragsnål (23 tums mätare). Utför transkardiell perfusion med hepariniserad 0,1 M PB tills blodet klarnar (2-3 minuter) med en flödeshastighet på 11-13 ml/min. Bestäm blodrensning genom att övervaka färgningen av levern och utsöndringen från höger förmak12.
- Isolera hjärnan från skallhålan, bädda omedelbart in den i Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) i en kryomold eller aluminiumfolie och placera den på torrisetanolbadet. Förvara den frysta inbäddade servetten i en lufttät behållare vid -80 °C i upp till 3 månader.
- Snittning av färskfryst vävnad
- Ställ in kryostattemperaturen på -20 °C. Lämna den OCT-inbäddade vävnaden och en kryostatchuck i kryostaten i ~30 minuter för att möjliggöra jämvikt med den nya temperaturen.
OBS: Håll vävnaden fryst hela tiden; transportera vävnaden från frysen på -80 °C till kryostaten på torris. - Fäst vävnaden på den förkylda kryostatchucken med OCT-förening. I detta protokoll monterades vävnadsblock på chucken i koronaplanet.
OBS: Trimma överflödig OCT från vävnaden med hjälp av ett rakblad för att minimera mängden OCT som skärs av kryostaten och därefter överförs till glasglaset. - Skär 14 μm tjocka koronasnitt och montera dem på glasmikroskopiglas.
- Värm objektglasen till rumstemperatur innan du monterar sektionerna. När sektionen har monterats, förvara objektglasen i en glidlåda i kryostaten.
- Om mer än en sektion behöver monteras på en slide, värm området för den andra sektionen genom att placera ett finger på motsatt sida av sliden i 5-10 sekunder för att underlätta vidhäftningen av sektionen till sliden. En kall vävnadssektion kommer inte att fästa på en kall glidning. Sektionerna ska fästa vid rutschbanorna platt; Vikning gör att de faller av objektglasen under tvättstegen.
- Om sprickor upptäcks i sektionerna, öka kryostattemperaturen med 1-5 °C för att undvika detta. Det är särskilt viktigt att placera vävnadssnitt i nära anslutning till varandra på samma objektglas. Detta kommer att förhindra slöseri med FISH-sonder och reagenser under analysen.
- Förvara vävnadssektioner monterade på glasskivor i en lufttät behållare vid -80 °C i upp till 6 månader.
OBS: Håll sektionerna frysta hela tiden och undvik frysningscykler för att förhindra RNA-nedbrytning. Transportera slideboxen från insidan av kryostaten till frysen på -80 °C på torris.
- Ställ in kryostattemperaturen på -20 °C. Lämna den OCT-inbäddade vävnaden och en kryostatchuck i kryostaten i ~30 minuter för att möjliggöra jämvikt med den nya temperaturen.
- Fixering av färskfryst vävnad
- Samma dag som FISH-sondanalysen ska utföras, förbered 4 % paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB, pH 7,5 (4 % PFA-lösning). Filtrera genom att passera genom filterpapper (klass 1: 11 μm, materialförteckning) i en Buchner-tratt eller degelfilter.
VARNING: PFA är skadligt och giftigt vid hudkontakt eller inandning. Alla procedurer med PFA-lösning bör utföras i ett dragskåp. PFA-lösningsavfall ska kasseras noggrant enligt institutionella säkerhetsprotokoll. - Kyl 4 % PFA-lösningen till 4 °C. Transportera den diaglasmonterade servetten från frysen på -80 °C i torris och sänk omedelbart ner den i det förkylda fixeringsmedlet i 15 minuter.
OBS: Det är viktigt att detta fixeringssteg inte överstiger 15 minuter eftersom överfixering kommer att resultera i icke-specifik bakgrundsmärkning.
- Samma dag som FISH-sondanalysen ska utföras, förbered 4 % paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB, pH 7,5 (4 % PFA-lösning). Filtrera genom att passera genom filterpapper (klass 1: 11 μm, materialförteckning) i en Buchner-tratt eller degelfilter.
- Uttorkning av färskfryst vävnad
- Torka vävnadssnitt genom att sänka objektglasen i graderade koncentrationer av etanol. I en Coplin-burk, sänk först ner i 50 %, sedan 70 % och slutligen absolut etanol, i 5 minuter vardera vid rumstemperatur. Upprepa den slutliga absoluta etanolinkubationen en andra gång.
- Lufttorka rutschkanorna och skissera sektionsgruppen med hjälp av en hydrofob barriärpenna, se till att det inre området hålls till ett minimum.
OBS: Se till att glasskivan är helt torr innan du ritar den hydrofoba barriären. Den hydrofoba barriären ska omge vävnadssnitten helt utan mellanrum och måste vara torr innan vidare bearbetning.
2. Provberedning av fixerad frusen hjärnvävnad
- Fixering av transkardiell perfusion
- Avliva möss genom bedövning med natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p) följt av transkardiell perfusion, först med 0,1 M PB och sedan 4 % PFA-lösning. Fixera med 10 minuters perfusion vid 11-13 ml/min.
- Isolera hjärnan från skallhålan efter perfusionsfixering och sänk ner den över natten i 4 % PFA-lösning vid 4 °C.
- Vävnadssnittning av fixerad vävnad
- Skölj hjärnan i steril 0,1 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innan hjärnhinneskikten avlägsnas med hjälp av ett dissekerande mikroskop med en fin pincett.
- Skär hjärnan exakt i block (separera hjärnstammen från framhjärnan före vibratomsnittet) med hjälp av en hjärnmatris (Table of Materials). Närmare bestämt, skär av hjärnstammen kaudalt vid den pyramidala dekussionen och dissekera bort lillhjärnan. På samma sätt, skär av framhjärnan omedelbart rostral till den optiska chiasmen.
- Fäst vävnaden på en vibrerande mikrotomchuck med cyanoakrylat och bädda in i 2 % agarlösning.
- Skär 30 μm tjocka vävnadssnitt med en vibrerande mikrotom och förvara skurna sektioner i kryoprotektivt lösning (30 % RNasfri sackaros, 30 % etylenglykol, 1 % polyvinylpyrrolidon (PVP-40), i 0,1 M PB, pH 7,4). Vävnadssnitt kan förvaras i kryoprotektivt medel vid -20 °C i upp till 6 månader.
- Förberedelse av fasta sektioner inför FISH
- På dagen för FISH, tvätta fritt flytande sektioner tre gånger, i 10 minuter per tvätt, för att ta bort kryoskyddslösningen. För att tvätta, placera sektioner i 0.1 M PBS i en 12-håls cellodlingsplatta och skaka på en roterande plattformsskakare (90 - 100 rpm).
- Efter tvätt, använd en pensel för att montera sektioner på glasmikroskopiglas och lufttorka i minst 2 timmar.
OBS: Sektionerna ska fästa platt på objektglasen eftersom alla uttalade veck gör att de lossnar under tvättar. - Använd en hydrofob barriärpenna och rita en barriär runt sektionerna för att begränsa FISH-reagenserna till sektionerna. Återigen är det viktigt att minimera det inre området av konturen som ritas med barriärpennan.
MÖJLIG BRYTPUNKT: Sektionerna kan förvaras i rumstemperatur, över natten, för att fortsätta analysen nästa dag.
3. Analys av fisk
OBS: Resten av protokollet gäller både färskfryst och fixerad fryst vävnad.
- Förbered reagenserna och instrumenten för hybridiserings- och amplifieringssteg.
- Ställ in en kuvös och ett vattenbad på 40 °C.
- Förbered en befuktad, ljusskyddad kammare för inkubering av objektglas. Befuktning förhindrar uttorkning av vävnader - objektglasen är säkert placerade ovanför en fuktig behållare. Helst är kammaren gjord av kraftig polystyren, den är ljustät och lufttät för att upprätthålla en mättad vattenångatmosfär. Stängning av kammaren är beroende av minimal friktion för att undvika rörelse. Vi använde en rutschkana fodrad med våta laboratorieservetter (Table of Materials) i botten. Placera rutschkanan inuti inkubatorn för att förvärma den till 40 °C.
- Värm 50x tvättbufferten (materialtabell) och sonderna till 40 °C i 10 minuter, använd vattenbadet och kyl sedan till rumstemperatur.
- Förbered 1 l 1x tvättbuffert från 50x stamkoncentrationen.
- Förbered sondblandningen (materialtabell): C1-sonden är klar att användas vid lagerkoncentration medan C2- och C3-sonderna levereras som 50x koncentration och kräver spädning med spädningsvätskan som medföljer i satsen.
OBS: Sondblandningar kan förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
- Proteasbehandling
- Inkubera sektionerna med Protease III (Table of Materials) i rumstemperatur i 30 minuter.
OBS: Se till att Protease III och inkubationsreagenser i nedströmsprocesser (sondblandning, amplifieringslösningar, blockerande buffert och antikroppsserum) täcker sektionerna helt. En pipettspets kan användas för att sprida reagenset på sektionen så att den täcker hela området innanför den hydrofoba barriären. - Tvätta objektglasen två gånger med 0.1 M PBS, i 2 minuter varje gång, i en stor fyrkantig petriskål av plast. Här användes en 245 mm x 245 mm fyrkantig bioanalysskål (Materialtabell). Håll från ena sidan av skålen och luta försiktigt 3-5 gånger. Efter tvätt, snärta bort överflödigt 0.1 M PBS från objektglaset och tillsätt omedelbart nästa reagens. Låt inte vävnadssnitt torka.
OBS: Under varje tvätt nedsänks objektglasen i lösning vid rumstemperatur. Detta är arbetsflödet för alla efterföljande tvättsteg. De fasta 30 μm tjocka sektionerna lossnar lättare från objektglasen än 14 μm tjocka sektioner, var försiktig under tvättarna.
- Inkubera sektionerna med Protease III (Table of Materials) i rumstemperatur i 30 minuter.
- Hybridisering och förstärkning
- Efter att ha tvättat av proteaslösningen, placera objektglasen i den fuktade, förvärmda kammaren. Inkubera sektionerna med sondblandning (materialtabell) i 2 timmar vid 40 °C i en bänkinkubator.
OBS: Se till att det finns minst 2 sektioner avsatta för positiva och negativa kontrollsonder för att bedöma sample RNA-kvalitet och optimal permeabilisering. Positiva kontrollsonder riktar in sig på hushållsgener; här var dessa en cocktail av RNA riktade mot ubiquitin C (UBC; hög abundans), peptidylpropylisomeras B (PPIB; måttlig abundans) och RNA-polymeras 2a (POLR2A; låg förekomst). Negativa kontrollsonder riktar sig mot den bakteriella 4-hydroxi-tetrahydrodikolinatreduktasgenen (DapB), som normalt saknas i hjärnprover från möss. Positiv DapB-signal indikerar icke-specifik signal och/eller bakteriell kontaminering av provet. - Efter hybridisering med sondblandningen består signalförstärkningsstegen av inkubation med Amp 1-FL (30 minuter), sedan med Amp 2-FL (15 minuter), följt av Amp 3-FL (30 minuter) och slutligen Amp 4-FL (15 minuter) - vardera vid 40 °C. Använd de medföljande droppflaskorna och täck vävnadssektionerna med amplifieringslösning. Fortsätt till IHC-analys efter det sista amplifieringssteget.
- Skölj objektglasen med Wash Buffer två gånger i 2 minuter mellan sondhybridisering och varje amplifiering steg.
- Efter att ha tvättat av proteaslösningen, placera objektglasen i den fuktade, förvärmda kammaren. Inkubera sektionerna med sondblandning (materialtabell) i 2 timmar vid 40 °C i en bänkinkubator.
4. IHC-analys
- Steg för IHC-blockering
- För att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar, inkubera snitten i 1 timme vid rumstemperatur med blockerande lösning innehållande 10 % normalt hästserum, 0,3 % Tween20 i 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05 % mertiolat) efter FISH-analysen. Bered primära antikroppar i en spädningsbuffert innehållande 1x TBSm, 5 % normalt hästserum och 0,1 % Tween20. Primära antikroppsleverantörer listas i materialförteckningen.
- Immunhistokemi
- Avlägsna överflödig blockeringsbuffert genom att snärta till objektglaset och inkubera sektionerna med primära antikroppar över natten vid 4 °C.
- Tvätta objektglasen 3 gånger (5 minuter vardera) med 1x TBSm och inkubera med sekundär antikropp i spädningsvätska innehållande 1x TBSm, 1 % normalt hästserum och 0,1 % Tween20 i 2 timmar i rumstemperatur. Sekundära antikroppar som används i detta protokoll listas i materialförteckningen.
- Tvätta objektglasen 3 gånger med 1x TBSm (5 minuter vardera) innan du täcker med monteringsmedium med eller utan DAPI (Table of Materials).
5. Bildbehandling
- Undersök immunfärgning under ett epifluorescensmikroskop utrustat med en kamera (se materialtabell för detaljer). Skaffa representativa bilder med 20x förstoring och spara som TIFF-filer.
- Exportera representativa bilder till ett bildbehandlingsprogram (Table of Materials) för justering av ljusstyrka/kontrast för att öka klarheten och återspegla sann återgivning.
6. VALFRITT: Kvantitativ analys av måltranskriptioner
OBS: Detta är en metodartikel och kvantitativa resultat tillhandahålls inte. Den kvantifieringsmetod som presenteras här är hämtad från Dereli et al.10. veckor
- Ta bilder från de intressanta områdena som förklaras i 5.1 och använd samma mikroskop- och kamerainställningar (t.ex. exponeringstid och ljusintensitet) på alla bilder med samma fluorofor.
- Plotta de neuronala profilerna med hjälp av ett bildanalysprogram (Table of Materials).
- Rikta in sektionerna med hänvisning till Bregma-nivån enligt en stereotaktisk hjärnatlas13.
- Använd samma ljusstyrka och kontrast på alla bilder med samma fluorofor. Tänk bara på neuronerna med DAPI-färgade kärnor.
- Räkna manuellt antalet mRNA, proteinuttryckande, mRNA/mRNA, protein/protein och mRNA/proteinsamuttryckande celler inom det intressanta området.
- För att minska bias i de experimentella resultaten, låt personen som kvantifierar experimentella resultat blinda för experimentgrupperna.
- Tillämpa Abercrombie correction14 på det totala antalet celler med hjälp av följande Abercombie-ekvation:
Korrigerat cellantal = manuellt cellantal x snitttjocklek / (snitttjocklek + kärnstorlek)
För 14 μm tjocka snitt beräknas till exempel den genomsnittliga kärnbredden till 7,7 ± 0,3 μm och den genomsnittliga snitttjockleken är 14 ± 1 μm baserat på 30 celler respektive 10 sektioner hos 5 djur10. Enligt Abercrombie-ekvationen skulle korrigerat cellantal vara manuellt cellantal x 14/(14+7,7).
Figur 1: Parallellt arbetsflöde för vävnadsförbehandling för både färskfryst och paraformaldehydfixerad vävnad. Bearbetningsstegen för färskfryst vävnad visas i de röda konturrutorna, medan de för paraformaldehyd (PFA) fixerad vävnad visas i de blå konturerade rutorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Sammanfattning av kombinerad FISH-sond och immunhistokemi. Efter förbehandling av vävnad omges den objektglasmonterade vävnaden med en hydrofob barriärpenna, som i den första bilden, och inkuberas i en proteaslösning vid rumstemperatur. Efter tvätt överförs vävnaden till en bänkinkubator för hybridisering i 2 timmar före sekventiell amplifiering. Hybridiseringssystemet på plats använder en egenutvecklad "Z-sond"-design, förförstärkare och förstärkare som ses i ramarna 3-66. När vävnaden har genomgått FISH-sondbehandling tvättas den innan den blockeras med vanligt hästserum. Den primära inkubationen av antikroppar utförs över natten vid 4 °C för att maximera bindningen av antikroppar och antigen. Den sekundära antikroppsinkubationen (2 timmar) utfördes vid rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi en metod för att kombinera multiplex FISH med fluorescerande IHC för att lokalisera mRNA-uttryck för GalR1 och GlyT2 med hjälp av färskfrysta respektive paraformaldehydfixerade vävnader i musens NTS. En pipeline av vävnadsbearbetning, FISH och IHC-procedurer som beskrivs i metoderna visas i figur 1 och figur 2. Tabell 1 ger en sammanfattning av de kombinationer av FISH-sond och antikroppar som används i varje figur.
Kontrollprober analyseras rutinmässigt samtidigt med målproben för att säkerställa arbetsflödets integritet och bekräfta provkvaliteten. Frånvaron av DapB-märkning bekräftar en sund vävnadskvalitet och integritet och frånvaron av bakteriell kontaminering (figur 3A). Märkning från positiva kontrollprober inriktade på ubiquitin C (UBC, hög förekomst), peptidylpropylisomeras B (PPIB, måttlig mängd) och RNA-polymeras 2a (POLR2A, låg förekomst) mRNA bekräftar RNA-integriteten och signalen som observeras mellan analyserna kan användas för att kalibrera variabiliteten mellan analyserna (figur 3B). För att validera uttrycket av FISH-sonden använde vi kontrollvävnader som tidigare har beskrivits för att uttrycka mRNA-transkriptet. Till exempel bekräftades GalR1 mRNA-uttryck vara positivt i talamus som tidigare beskrivits10,15. Phox2b mRNA-distribution verifierades dessutom genom sammärkning med Phox2b-antikropp; Vi bekräftade att FISH-märkning endast förekom i nervceller som också var positivt färgade med hjälp av Phox2b-antikroppen (Figur 5).
För att särskilja GalR1+-neuroner i NTS från närliggande kärnor använde vi ytterligare neurokemiska markörer. TH, Phox2b eller Phox2b-GFP immunreaktivitet (Figur 4-6) och Phox2b FISH (Figur 5 och Figur 6) differentierade NTS från andra kärnor i den dorsala hjärnstammen eftersom NTS-neuroner tidigare har rapporterats uttrycka Phox2b och TH 16,17. Eftersom NTS är inbäddat av kolinerga kärnor - det ligger dorsalt till den hypoglossala kärnan och dorsala motorkärnan i vagus (DMNX) och ventralt till den vestibulära kärnan - sammärkte vi med den kolinerga markören vAChT18 (figur 4). Därför bedömdes uttrycket av GalR1 inom NTS i förhållande till TH och Phox2b, medan vAChT-märkning underlättade rumslig orientering med avseende på rostrocaudala, dorsoventrala och mediolaterala koordinater. Vi fann att alla TH immunreaktiva och GalR1 mRNA-positiva neuroner i NTS var Phox2b-GFP immunreaktiva, men inte alla Phox2b-GFP immunreaktiva neuroner i NTS var TH immunreaktiva eller GalR1 mRNA-positiva (Figur 4). Vi visade också att mRNA för receptorn GalR1 med låg förekomst saknades i TH- och vAChT-immunreaktiva nervceller.
I färskfrysta beredningar, i kombination med FISH-sondanalysen, var IHC-framgången beroende av målproteinets subcellulära lokalisering. Till exempel var vAChT (ett synaptiskt vesikelmembranbundet protein) tydligt immunmärkt, medan TH och GFP (cytoplasmatiska proteiner) var immunomärkta på obestämd tid och endast svagt observerade (Figur 4). Vi beskriver denna obestämda märkning som "flockningsiv" eftersom cellerna saknade en tydlig kontur och visade sig vara svåra att skilja från bakgrunden. På samma färskfrysta vävnadssnitt var GalR1 FISH-sondmärkning av cytoplasmatisk GalR1-mRNA punkterad och tydligt observerad (Figur 4).
Dessutom, eftersom TH- och vAChT-antikropparna är upphöjda i samma värd, märktes båda proteinerna med samma sekundära antikropp och därför samma färg fluorofor (excitationsljus: 594). De är lätta att särskilja av två skäl: de sammärks aldrig i samma neuroner, och den subcellulära lokaliseringen är annorlunda för dessa proteiner; vAChT i vesiklar som uppvisar ett punkterat utseende och TH i cytoplasman och neuronala processer.
För att stödja vår hypotes att IHC-kvaliteten (i färskfrysta beredningar) är beroende av proteinets subcellulära lokalisering, jämförde vi märkning för Phox2b-mRNA (lokaliserat i cytoplasman), GFP (överuttryckt i cytoplasma) och Phox2b-protein (främst i kärnan) i nervceller. Som förväntat visar våra resultat överlappning av Phox2b mRNA, GFP och Phox2b antikroppsmärkning i enskilda neuroner i NTS (Figur 5). Celler med cytoplasmatisk mRNA-märkning motsvarade celler som uppvisade nukleär märkning av Phox2b-proteinet, vilket gav validering av den kombinerade FISH-IHC-metoden. Även om cytoplasmatisk Phox2b-GFP hade ett flockigt utseende, var den nukleära Phox2b-proteinsignalen tydlig och specifik. Sammanfattningsvis, i kombination med FISH på färskfrysta beredningar, uppvisar membranbundna proteiner inklusive vAChT och Phox2B immunmärkning av högre kvalitet än cytoplasmatiska proteiner.
Däremot var IHC tillförlitligt oberoende av subcellulär lokalisering, när det utfördes på fasta frysta sektioner i kombination med FISH. Multiplex FISH för GlyT2 mRNA och Phox2b mRNA var framgångsrikt, vilket visas i figur 6. GlyT2 mRNA-positiva neuroner lokaliserades ventralt till NTS och inte inom NTS. GlyT2+ och Phox2b+ neuroner samlokaliserades inte. En subpopulation av Phox2b+ NTS-neuroner var TH-immunreaktiv och ingen innehöll GlyT2-mRNA. TH immunreaktiva neuroner är uppenbara på samma vävnadssnitt och uppvisar positivt märkta soma och neuronala processer (Figur 6). Detta står i kontrast till det "flockiga" utseendet hos TH-immunreaktiva neuroner i färskfrysta vävnadssnitt. Således är det fasta frysta preparatet som beskrivs här en alternativ metod för vävnadsberedning som möjliggör tillförlitlig målsökning av cytoplasmatiska proteiner immunohistokemiskt, i kombination med RNAscope.
Figur 3: Representativa mikroskopiska bilder från koronamusens framhjärna i nivå med laterala septum (Bregma 1,1 till -0,1) som visar märkning av positiva och negativa kontrollsonder . (A) Avsaknad av signal efter ISH med bakteriellt 4-hydroxitetrahydrodifoliatreduktas (DapB) bekräftar frånvaron av bakgrundssignaler. (B) Märkning med positiva kontrollprober inriktade på ubiquitin C (UBC), peptidylpropylisomeras B (PPIB) och RNA-polymeras 2a (POLR2A) illustrerar den signal som kan förväntas från mål med hög, måttlig respektive låg förekomst. Skalstaplarna är 50 μm. Alla bilder togs med 20x objektiv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa mikroskopiska bilder av ett färskfryst koronalt hjärnstamssnitt från en Phox2b-GFP-mus som visar kombinerad märkning av GalR1 mRNA (FISH) och 3 proteiner (IHC) i kärnan i solitärregionen (NTS). Infällningar i A är förstorade i B. GalR1 mRNA indikeras med punktiv FISH-sondmärkning (pilspetsar). Antikroppar riktade mot cytoplasmaproteinerna GFP och tyrosinhydroxylas (TH) uppvisade "flockningsmärkning" (pilar). Vesikulär acetylkolintransportör (vAChT) immunreaktivitet påvisas (röd punktiv märkning) i den hypoglossala kärnan (XII). Skalstaplar är 100 μm i A och 25 μm i B. Alla bilder togs med 20x objektiv. Andra förkortningar: area postrema (AP), medial vestibulär kärna (MVe). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa mikroskopiska bilder av ett färskfryst koronalsnitt från en Phox2b-GFP-mus, som illustrerar inriktning av Phox2b i solitärkanalens kärna (NTS) med tre olika tillvägagångssätt: Phox2b mRNA (FISK), GFP (IHC) och Phox2b-protein (IHC). Phox2b-protein är lokaliserat till kärnan. Infällningar i A är förstorade i B. Pilar indikerar neuroner som är trippelmärkta med Phox2b-sond (orange-550), GFP-antikropp (grön-488) och Phox2b-antikropp (röd-647). Skalstaplar är 100 μm i A och 25 μm i B. Alla bilder förvärvas med ett 20x objektiv. Andra förkortningar: area postrema (AP). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Representativa bilder från fixerade frysta hjärnstamssnitt som visar framgångsrik FISH i kombination med tillförlitlig immunmärkning av cytoplasmatiska proteiner (tyrosinhydroxylas [TH]). Dubbel FISH som visar glycintransportör 2 (GlyT2-röd-647, fyllda pilspetsar) och Phox2b (gul-550, pilar) mRNA-märkning i kärnan i solitärkanalen (NTS) regionen. FISH kombinerades med IHC för TH-protein (blue-346, tomma pilspetsar). Infällningar i A förstoras i B. Skalstreck är 25 μm. Alla bilder togs med ett 20x objektiv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Primär antikropp eller RNAscope-sond | Sekundär antikropp eller Förstärkare 4-FL-Alt-modul |
Excitation (nm) | Beredning av vävnad | ||
| Figur 3 | sond | POLR2A (C1) | Förstärkare 4-FL-Alt B Display-modul | 647 | färskfryst |
| sond | PPIB (C2) | Förstärkare 4-FL-Alt B Display-modul | 488 | ||
| sond | UBC (C3) | Förstärkare 4-FL-Alt B Display-modul | 550 | ||
| sond | DapB (C1, C2, C3) | Förstärkare 4-FL-Alt B Display-modul | 647, 488, 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 4 | antikropp | kanin- anti-GFP | åsna- anti-kanin | 488 | färskfryst |
| antikropp | får-anti-TH | åsna- anti- får | 647 | ||
| antikropp | get- anti-vAChT | åsna- anti-get | 647 | ||
| sond | GalR1 (C1) | Förstärkare 4-FL-Alt B Display-modul | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 5 | antikropp | kanin- anti-GFP | åsna- anti-kanin | 488 | färskfryst |
| antikropp | mus- anti-Phox2b | åsna- anti- mus | 647 | ||
| sond | Phox2b (C2) | Förstärkare 4-FL-Alt A Display-modul | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 6 | antikropp | mus- anti-TH | åsna- anti- mus | 346 | fast |
| sond | GlyT2 | Förstärkare 4-FL-Alt A Display-modul | 647 | ||
| sond | Phox2b | Förstärkare 4-FL-Alt A Display-modul | 550 |
Tabell 1: FISH-sond, antikroppar och motsvarande fluroforkombinationer som används i figurerna 3–6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inom neurovetenskapen används FISH och IHC rutinmässigt för att undersöka den rumsliga organisationen och den funktionella betydelsen av mRNA eller proteiner inom neuronala subpopulationer. Protokollet som beskrivs i denna studie förbättrar kapaciteten för samtidig detektion av mRNA och proteiner i hjärnsnitt. Vår kombinerade multiplex FISH-IHC-analys möjliggjorde fenotypisk identifiering av distinkta neuronala subpopulationer i NTS i både färskfrysta och fixerade hjärnpreparat. FISH-IHC i fixerade frysta vävnadspreparat gav tillförlitliga IHC-resultat. Till exempel visade multiplex FISH för mRNA med låg och hög förekomst (GalR1 respektive GlyT2) och IHC (som riktar sig mot tyrosinhydroxylas) att GalR1 och GlyT2 uttrycks i icke-katekolaminerga NTS-neuroner. IHC för TH var inte framgångsrik i färskfryst vävnad, vilket belyser den begränsade kapaciteten för FISH-IHC i färskfrysta beredningar.
ISH kan vara lämpligare än IHC i en rad olika scenarier. För det första kan det hända att IHC inte fungerar bra när det gäller att detektera proteiner med låg förekomst, såsom receptorer. Att använda ISH för att rikta in sig på mRNA med relativt hög förekomst för dessa proteiner förbättrar detekterbarheten1. För det andra transporteras proteiner som neuropeptider ofta till axonala terminaler efter translation i cellen soma19. När neuropeptider riktas mot IHC märks cellernas axonala processer och terminaler med antikroppen, men inte soma, vilket minskar förmågan att identifiera ursprungscellen eller utföra kvantitativ analys av antalet celler. Men eftersom mRNA som kodar för alla proteiner finns lokaliserade till soma, är ISH-tekniken fördelaktig. Slutligen är antikroppar inte lättillgängliga för vissa proteinarter, eller så är de tillgängliga antikropparna lämpliga för andra proteomiktekniker (t.ex. western blot) men inte IHC. Under dessa omständigheter visar sig mRNA-märkningsmetoder vara användbara. En invändning är att mRNA kanske inte alltid översätts till protein, och därför ger de bara en proxy för proteinidentifiering. Eftersom kommersiella FISH-kit kan vara kostsamma och det är mindre sannolikt att ISH-sonderna är kommersiellt tillgängliga jämfört med antikroppar, är det en kostnads- och tidseffektiv strategi att kombinera FISH med IHC för att öka antalet mål som kan märkas samtidigt.
Färskfryst kontra fixerad vävnadsberedning var en faktor som gav framgångsrik IHC efter FISH-sondanalys. Vi testade IHC med antikroppar riktade mot nukleära, vesikulära och cytoplasmatiska proteiner och fann tillförlitlig märkning av membranbundna proteiner (vAChT och Phox2b) på färskfrysta prover men inte cytoplasmatiska proteiner (TH och GFP). Samuttryck av Phox2b-protein och mRNA med "flockningsiv" Phox2b-GFP-märkning validerade att neuroner som uttryckte transkriptet också uttryckte det relaterade proteinet, vilket bekräftade neuronernas neurokemiska identitet (Figur 5). Däremot gav fixerade frysta vävnadspreparat tillförlitlig IHC-märkning oavsett subcellulär lokalisering av antigenet. Tidigare studier har visat att förbehandling med proteas (t.ex. pronas 8,20) kan ha en skadlig effekt på IHC. Innehållet i proteaslösningen som används i RNAscope-protokollet är proprietärt, och permeabilisering av proteas rekommenderas för RNAscope-sondåtkomst till celler. Märkning av cytoplasmatiska proteiner med hjälp av de antikroppar som beskrivs här har tidigare verifierats på fritt flytande 30 μm fixerade frysta hjärnsnitt 10,21,22. Vi monterade 30 μm tjocka fasta prover och utförde FISH-IHC-protokollet, i motsats till de 14 μm tjocka färskfrysta sektionerna som rekommenderas av tillverkaren. I frånvaro av analysmodifieringar eller förändring av andra variabler (antigenhämtning, högre antikroppskoncentration, förändring av proteas) uppnåddes tillförlitlig IHC på tjocka, fixerade prover med påvisad märkning av cytoplasman och axonala processer tillsammans med FISH-sondmärkning (figur 6). Medan liknande tillvägagångssätt användes av andra forskargrupper 7,8,9, uppnådde den aktuella studien kombinerad ISH-IHC på neuroner och i en fluorescerande uppsättning.
Det fanns en rad kritiska steg i metoderna att ta hänsyn till. För den färska frysta beredningen bör fixeringstiden inte överstiga 15 minuter; Längre fixeringstider gav högre bakgrundsmärkning. Proteassteget optimerades eftersom vävnader av olika tjocklek och från olika organ kräver olika typer av proteas för att uppnå permeabilisering. Fasta frusna sektioner fastnar mindre på glasskivor och lossnar lättare under tvättsteg. Därför måste extra försiktighet iakttas vid manuell hantering av fasta frysta sektioner, för att undvika vävnadsförlust eller skada.
Även om vi fann att en kombination av FISH och IHC var en effektiv strategi, inkluderar nackdelarna kostnad och tekniskt krävande analys när de två metoderna kombineras. En begränsning med studien är att en jämförelse sida vid sida av de två vävnadspreparationsprotokollen inte utfördes. Vår utvärdering av resultaten begränsades också av antalet kanaler som det epifluorescerande mikroskopet kunde rymma; Inställningen tillät maximalt 4 kanaler vid en given tidpunkt: 346, 488, 550 och 647 nm (excitationsljus). Vi kunde uppnå multiplex märkning av 5 mål genom att märka två proteiner med olika subcellulära lokaliseringar med samma fluroforer (Figur 4, Tabell 1). Genom att använda ett konfokalmikroskop kan diskret excitation av många ytterligare fluoroforer användas för individuell proteinmärkning via IHC, eller för avbildning av fluorescerande molekyler uttryckta av transgener.
Kombinerad FISH och fluorescerande IHC kan minska tillförlitligheten för varje teknik var för sig. I framtiden strävar vi efter att förbättra märkningen av cytoplasmatiska proteiner på färskfryst vävnad med en antigenhämtningsbehandling23. Tidigare studier visar att värmeinducerad antigenhämtning ökar tillgängligheten av proteinepitopen24,25,26. Värmebehandling klyver proteinets tvärbindningar och metylolgrupper och vecklar ut antigenerna i vävnaderna, vilket exponerar epitoper som annars skulle vara dolda i den tertiära proteinstrukturen under biologiska förhållanden. Denna tillgänglighet kan göra proteinmärkningen mer framgångsrik26,27. Dessutom kommer vi att rikta in oss på olika epitoper av samma cytoplasmatiska protein för att avgöra om framgången för protein-antikroppsmärkning beror på de specifika antikroppskloner som används.
Sammanfattningsvis är kombinerad FISH och IHC användbar för neurokemisk identifiering av heterogena populationer av celler i hjärnan, såsom de i NTS. Denna studie presenterar två protokoll som analyserar olika vävnadspreparat av hjärnstamsvävnad från möss - färskfrysta eller fixerade - för samtidig multiplex fluorescerande märkning av mRNA och proteiner in situ. Båda protokollen kan användas i stor utsträckning för att detektera uttrycksmönstret för mRNA med låg förekomst, såsom GalR1. Tjocka (30 μm) fixerade frysta preparat permeabiliserade med proteas gav mer tillförlitlig detektion av cytoplasmatiska proteiner och fler utmaningar med vävnadshantering, jämfört med tunna (14 μm) färskfrysta preparat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Australian Research Council Discovery Project grant DP180101890 och Rebecca L Cooper Medical Research Foundation projektbidrag PG2018110
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A.
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
