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Neuroscience

ताजा जमे हुए या निश्चित माउस मस्तिष्क वर्गों पर फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ सीटू संकरण में मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस का संयोजन

Published: June 25, 2021 doi: 10.3791/61709
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, University of New South Wales

Summary

यह प्रोटोकॉल मल्टीलेबल फिश और फ्लोरेसेंस आईएचसी सिग्नल प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ, ताजा जमे हुए और निश्चित माउस मस्तिष्क वर्गों दोनों में फ्लोरेसेंस इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) और फ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के संयोजन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। आईएचसी ने साइटोप्लाज्मिक और झिल्ली से जुड़े प्रोटीन को लक्षित किया।

Abstract

फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण (फिश) एक आणविक तकनीक है जो कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट आरएनए प्रतिलेख की उपस्थिति और स्थानिक वितरण की पहचान करती है। कार्यात्मक रूप से पहचाने गए न्यूरॉन्स के न्यूरोकेमिकल फेनोटाइपिंग को आमतौर पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का उपयोग करके कई एंटीबॉडी (लक्षित प्रोटीन) के साथ समवर्ती लेबलिंग की आवश्यकता होती है और सीटू संकरण (आरएनए को लक्षित करना) का अनुकूलन होता है। विशेष न्यूरॉन्स को चिह्नित करने के लिए एक "न्यूरोकेमिकल हस्ताक्षर" प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि जटिल कारकों में विधियों के संयोजन से पहले फिश और आईएचसी लक्ष्यों को सत्यापित करने की आवश्यकता शामिल है, और सीमित संख्या में आरएनए और प्रोटीन जिन्हें एक ही ऊतक अनुभाग के भीतर एक साथ लक्षित किया जा सकता है।

यहां हम ताजा जमे हुए और निश्चित माउस मस्तिष्क तैयारी दोनों का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो क्रमशः आरएनएस्कोप फिश का उपयोग करके एक ही मस्तिष्क खंड में कई एमआरएनए और प्रोटीन का पता लगाता है। हम इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से पहचाने गए ब्रेनस्टेम नाभिक में कम बहुतायत एमआरएनए (जैसे, गैलानिन रिसेप्टर 1) और उच्च बहुतायत एमआरएनए (जैसे, ग्लाइसिन ट्रांसपोर्टर 2) के अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए संयुक्त विधि का उपयोग करते हैं।

फिश परख के डाउनस्ट्रीम प्रोटीन लेबलिंग के लिए मुख्य विचार ऊतक तैयारी और फिश जांच लेबलिंग के अनुकूलन से परे हैं। उदाहरण के लिए, हमने पाया कि एंटीबॉडी बाइंडिंग और लेबलिंग विशिष्टता फिश जांच परख के भीतर प्रोटीज चरण से हानिकारक रूप से प्रभावित हो सकती है। प्रोटीज पेप्टाइड बॉन्ड के हाइड्रोलाइटिक दरार को उत्प्रेरित करते हैं, जिससे कोशिकाओं में फिश जांच प्रवेश की सुविधा मिलती है, हालांकि वे बाद के आईएचसी परख द्वारा लक्षित प्रोटीन को भी पचा सकते हैं, जिससे लक्ष्य बंधन का उत्पादन होता है। लक्षित प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थान फिश जांच परख के बाद आईएचसी सफलता में योगदान देने वाला एक और कारक है। हमने देखा कि लक्षित प्रोटीन झिल्ली से बंधे होने पर आईएचसी विशिष्टता को बनाए रखा जाता है, जबकि आईएचसी को लक्षित साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन को व्यापक समस्या निवारण की आवश्यकता होती है। अंत में, हमने स्लाइड-माउंटेड फिक्स्ड फ्रोजन ऊतक को ताजा जमे हुए ऊतक की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण पाया, हालांकि आरएनएस्कोप के साथ संयुक्त होने पर आईएचसी गुणवत्ता निश्चित जमे हुए ऊतक के साथ समग्र रूप से बेहतर थी।

Introduction

प्रोटीन और एमआरएनए जो न्यूरोकेमिकल रूप से न्यूरॉन्स की उप-आबादी को परिभाषित करते हैं, आमतौर पर क्रमशः इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और / या सीटू संकरण (आईएसएच) के संयोजन के साथ पहचाने जाते हैं। आईएचसी तकनीकों के साथ आईएसएच का संयोजन मल्टीप्लेक्स लेबलिंग क्षमता को अधिकतम करके कार्यात्मक न्यूरॉन्स (न्यूरोकेमिकल कोडिंग) के लिए अद्वितीय कोलोकलाइजेशन पैटर्न के लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है।

आरएनएस्कोप सहित फ्लोरोसेंट आईएसएच (फिश) विधियों में रेडियोधर्मी आईएसएच और गैर-रेडियोधर्मी क्रोमोजेनिक आईएसएच जैसे पहले आरएनए का पता लगाने के तरीकों की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है। फिश एकल एमआरएनए प्रतिलिपियों के विज़ुअलाइज़ेशन को पुंकेट दाग वाले धब्बेके रूप में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, आरएनएस्कोप परख विभिन्न फ्लोरोफोर टैग का उपयोग करके एक समय में आरएनए लक्ष्यों की बढ़ी हुई संख्या को लेबल करने की अनुमति देता है। इन फायदों के बावजूद, तकनीकी सीमाएं फ्लोरोफोरे / क्रोमोजेन की संख्या को प्रभावित कर सकती हैं जिनका उपयोग एक ही प्रयोग में किया जा सकता है। इनमें माइक्रोस्कोप फिल्टर सेट की उपलब्धता शामिल है; इस तरह के विचार तब जटिल होते हैं जब न्यूरोकेमिकल पहचान अलगाव में प्रत्येक तकनीक का उपयोग करने की तुलना में संयुक्त फिश और आईएचसी का उपयोग करती है, क्योंकि एक विधि के लिए इष्टतम अंतर्निहित कदम दूसरे के लिए हानिकारक हो सकते हैं।

आईएचसी के साथ संयुक्त फिश के पिछले अनुप्रयोग ने मानव बी-सेल लिम्फोमा2, चूजा भ्रूण3, जेब्राफिश भ्रूण4, माउस रेटिना5 और माउस आंतरिक कान कोशिकाओं 6 में विशिष्ट सेलुलर लक्ष्यों की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन कियाहै। इन अध्ययनों में, ऊतक की तैयारी या तो फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) 2,3,5 या ताजा पूरे माउंट 4,6 थी। अन्य अध्ययनों ने निश्चित माउस और चूहे के मस्तिष्क की तैयारी7,8,9 पर क्रोमोजेनिक आरएनएस्कोप लागू किया। विशेष रूप से, बालेरियोला एट अल।8 ने संयुक्त आईएसएच-आईएचसी के लिए दो अलग-अलग ऊतक तैयारी का वर्णन किया; निश्चित माउस मस्तिष्क अनुभाग और एफएफपीई मानव मस्तिष्क खंड। हाल के एक प्रकाशन में, हमने ब्रेनस्टेम रेटिकुलर गठन में कम बहुतायत एमआरएनए (गैलानिन रिसेप्टर 1, जीएलआर 1), उच्च बहुतायत एमआरएनए (ग्लाइसिन ट्रांसपोर्टर 2, ग्लाइटी 2) और वेसिकुलर एसिटाइलकोलाइन ट्रांसपोर्टर (वीएसीएचटी) प्रोटीन10 की कल्पना करने के लिए ताजा जमे हुए वर्गों पर फिश और फ्लोरोसेंट आईएचसी को जोड़ा।

एकान्त पथ (एनटीएस) का नाभिक स्वायत्त कार्य में शामिल एक प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्र है। हिंडब्रेन में स्थित, न्यूरॉन्स की यह विषम आबादी स्वायत्त संकेतों की एक विशाल संख्या को प्राप्त और एकीकृत करती है, जिसमें श्वास को विनियमित करने वाले भी शामिल हैं। एनटीएस कई न्यूरोनल आबादी को आश्रय देता है, जिसे फेनोटाइपिक रूप से एमआरएनए लक्ष्यों के अभिव्यक्ति पैटर्न द्वारा चिह्नित किया जा सकता है जिसमें जीएलआर 1 और ग्लाइट 2 और एंजाइम टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) के लिए प्रोटीन मार्कर और प्रतिलेखन कारक युग्मित-जैसे होमोबॉक्स 2 बी (फोक्स 2 बी) शामिल हैं।

आरएनएस्कोप मालिक ताजा जमे हुए ऊतक की तैयारी की सिफारिश करता है, लेकिन पूरे पशु ट्रांसकार्डियल छिड़काव निर्धारण द्वारा तैयार ऊतक, साथ ही निश्चित जमे हुए ऊतक वर्गों के दीर्घकालिक क्रायोप्रोटेक्शन (-20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण) कई प्रयोगशालाओं में आम है। इसलिए, हमने ताजा जमे हुए और निश्चित जमे हुए ऊतक तैयारी का उपयोग करके आईएचसी के साथ संयोजन में फिश के लिए प्रोटोकॉल स्थापित करने की मांग की। यहां, हम ताजा जमे हुए और निश्चित जमे हुए मस्तिष्क वर्गों के लिए प्रदान करते हैं: (1) संयुक्त फिश और फ्लोरोसेंट आईएचसी के लिए एक प्रोटोकॉल (2) प्रत्येक तैयारी का उपयोग करते समय उत्पादित एमआरएनए और प्रोटीन लेबलिंग की गुणवत्ता का विवरण (3) एनटीएस में जीएलआर 1 और ग्लाइटी 2 की अभिव्यक्ति का विवरण।

हमारे अध्ययन से पता चला है कि, जब आरएनएस्कोप पद्धति के साथ जोड़ा जाता है, तो आईएचसी की सफलता ताजा जमे हुए और निश्चित जमे हुए तैयारी में भिन्न होती है और, सेल के भीतर लक्ष्य प्रोटीन के स्थानीयकरण पर निर्भर थी। हमारे हाथों में, झिल्ली बद्ध प्रोटीन लेबलिंग हमेशा सफल रही। इसके विपरीत, साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के लिए आईएचसी को उन मामलों में भी समस्या निवारण की आवश्यकता होती है जहां साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन को ट्रांसजेनिक जानवर (फोक्स 2 बी-जीएफपी) 11 में अतिरंजित किया गया था। अंत में, जबकि GALR1 को NTS में गैर-कैटेकोलामाइनर्जिक न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, NTS में GlyT2 अभिव्यक्ति अनुपस्थित है।

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Protocol

ऊतक पूर्व-प्रसंस्करण चरणों का सारांश चित्र 1 में पाया जा सकता है। वैज्ञानिक उद्देश्यों (ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद) के लिए जानवरों के उपयोग और देखभाल के दिशानिर्देशों के अनुसार न्यू साउथ वेल्स विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और नैतिकता समिति के अनुपालन में सभी प्रक्रियाएं की गईं।

1. ताजा जमे हुए मस्तिष्क ऊतक की नमूना तैयारी

  1. ट्रांसकार्डियल छिड़काव
    1. हेपरिनाइज्ड (2500 यू / एल) 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी), पीएच 7.5 तैयार करें। इथेनॉल के साथ सूखी बर्फ मिलाकर सूखी बर्फ इथेनॉल घोल बनाएं। इसमें लगभग -72 डिग्री सेल्सियस का तापमान होगा और इसका उपयोग कटे हुए ऊतक के तत्काल ठंड के लिए किया जाएगा।
    2. 27.5 इंच सुई गेज का उपयोग करके सोडियम पेंटोबार्बिटल (70 मिलीग्राम / किग्रा, यानी) के साथ एनेस्थेटाइज करके वयस्क सी 57बीएल /6 और फोक्स 2 बी-जीएफपी11 (माउस जीनोम सूचना विज्ञान डेटाबेस आईडी एमजीआई: 5776545) चूहों को इच्छामृत्यु करें।
      चेतावनी: पेंटोबार्बिटल एक बार्बिटुरेट है। यह उच्च खुराक में तीव्र रूप से विषाक्त है और श्वसन गिरफ्तारी से मृत्यु का कारण बन सकता है। उपयोग करने से पहले स्थानीय स्वास्थ्य देखभाल, कानूनी और सामग्री सुरक्षा दिशानिर्देशों से परामर्श करें।
    3. दिल को उजागर करें और बाएं वेंट्रिकल को ड्राइंग-अप सुई (23 इंच गेज) के साथ कैनुलेट करें। हेपरिनाइज्ड 0.1 एमपीबी के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव करें जब तक कि रक्त 11-13 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर (2-3 मिनट) साफ न हो जाए। दाहिने आलिंद12 से यकृत और एफ्यूसेट के रंग की निगरानी करके रक्त समाशोधन का निर्धारण करें।
    4. खोपड़ी गुहा से मस्तिष्क को अलग करें, तुरंत इसे एक क्रायोमोल्ड या एल्यूमीनियम पन्नी में इष्टतम कटिंग तापमान यौगिक (ओसीटी) में एम्बेड करें और इसे सूखी बर्फ इथेनॉल स्नान पर रखें। जमे हुए एम्बेडेड ऊतक को एक एयरटाइट कंटेनर में - 80 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने तक स्टोर करें।
  2. ताजा जमे हुए ऊतक का विभाजन।
    1. क्रायोस्टेट तापमान -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। ओसीटी-एम्बेडेड ऊतक और क्रायोस्टेट चक को क्रायोस्टैट में ~ 30 मिनट के लिए छोड़ दें ताकि नए तापमान में संतुलन की अनुमति मिल सके।
      नोट: ऊतक को हर समय जमे हुए रखें; ऊतक को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से सूखी बर्फ पर क्रायोस्टेट में ले जाएं।
    2. ओसीटी यौगिक का उपयोग करके ऊतक को पूर्व-ठंडा क्रायोस्टैट चक में सुरक्षित करें। इस प्रोटोकॉल में, कोरोनल विमान में चक पर ऊतक ब्लॉक लगाए गए थे।
      नोट: क्रायोस्टैट द्वारा काटे जा रहे ओसीटी की मात्रा को कम करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करके ऊतक से अतिरिक्त ओसीटी को ट्रिम करें और बाद में ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें।
    3. 14 μm मोटी कोरोनल खंडों को काटें और उन्हें चार्ज ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर माउंट करें।
      1. अनुभागों को बढ़ाने से पहले स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर गर्म करें। एक बार अनुभाग माउंट हो जाने के बाद, स्लाइड को क्रायोस्टेट में स्लाइड बॉक्स में रखें।
      2. यदि एक स्लाइड पर एक से अधिक अनुभाग लगाने की आवश्यकता है, तो स्लाइड के अनुभाग के पालन में सहायता के लिए 5-10 सेकंड के लिए स्लाइड के विपरीत तरफ एक उंगली रखकर दूसरे खंड के लिए क्षेत्र को गर्म करें। एक ठंडा ऊतक अनुभाग एक ठंडी स्लाइड से जुड़ा नहीं होगा। अनुभागों को स्लाइड फ्लैट का पालन करना चाहिए; फोल्ड करने से वे वॉश स्टेप्स के दौरान स्लाइड ्स से गिर जाएंगे।
      3. यदि अनुभागों में दरारें देखी जाती हैं, तो इससे बचने के लिए क्रायोस्टेट तापमान को 1-5 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं। एक ही स्लाइड पर ऊतक वर्गों को एक दूसरे के करीब निकटता में रखना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। यह परख के दौरान मछली जांच और अभिकर्मकों की बर्बादी को रोक देगा।
    4. 6 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक एयर-टाइट कंटेनर में ग्लास स्लाइड पर लगाए गए ऊतक वर्गों को स्टोर करें।
      नोट: आरएनए क्षरण को रोकने के लिए अनुभागों को हर समय जमे हुए रखें और फ्रीज पिघलने चक्र से बचें। ड्राई आइस पर क्रायोस्टेट के अंदर से स्लाइड बॉक्स को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ले जाएं।
  3. ताजा जमे हुए ऊतक का निर्धारण
    1. जिस दिन फिश जांच परख का प्रदर्शन किया जाना है, 0.1 एम पीबी, पीएच 7.5 (4% पीएफए समाधान) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें। बुचनर फ़नल या क्रूसिबल फ़िल्टर में फ़िल्टर पेपर (ग्रेड 1: 11 μm, सामग्री की तालिका) के माध्यम से गुजरकर फ़िल्टर करें।
      सावधानी: पीएफए त्वचा के संपर्क या साँस लेने से हानिकारक और विषाक्त है। पीएफए समाधान के साथ सभी प्रक्रियाओं को फ्यूम हुड कैबिनेट में किया जाना चाहिए। पीएफए समाधान अपशिष्ट का निपटान संस्थागत सुरक्षा प्रोटोकॉल का सावधानीपूर्वक पालन करते हुए किया जाना चाहिए।
    2. 4% पीएफए घोल को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। स्लाइड-माउंटेड ऊतक को सूखी बर्फ में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से परिवहन करें और तुरंत इसे 15 मिनट के लिए पूर्व-ठंडा फिक्सेटिव में डुबो दें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि यह निर्धारण चरण 15 मिनट से अधिक न हो क्योंकि अति-निर्धारण के परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि लेबलिंग होगी।
  4. ताजा जमे हुए ऊतक का निर्जलीकरण
    1. इथेनॉल की वर्गीकृत सांद्रता में स्लाइड को डुबोकर ऊतक वर्गों को निर्जलित करें। एक कोप्लिन जार में, पहले 50%, फिर 70% और अंत में पूर्ण इथेनॉल, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए जलमग्न करें। अंतिम पूर्ण इथेनॉल को दूसरी बार इनक्यूबेशन दोहराएं।
    2. एयर ड्राई स्लाइड्स और, हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करके वर्गों के समूह को रेखांकित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि आंतरिक क्षेत्र को कम से कम रखा जाए।
      नोट: सुनिश्चित करें कि हाइड्रोफोबिक बाधा खींचने से पहले ग्लास स्लाइड पूरी तरह से सूखा है। हाइड्रोफोबिक बाधा को अंतराल के बिना ऊतक वर्गों को पूरी तरह से घेरना चाहिए और आगे की प्रक्रिया से पहले सूखा होना चाहिए।

2. निश्चित जमे हुए मस्तिष्क ऊतक की नमूना तैयारी

  1. ट्रांसकार्डियल छिड़काव निर्धारण
    1. सोडियम पेंटोबार्बिटल (70 मिलीग्राम / किग्रा, आई.पी.) के साथ एनेस्थेटाइज करके चूहों को इच्छामृत्यु करें, इसके बाद ट्रांसकार्डियल छिड़काव, पहले 0.1 एमपीबी के साथ फिर 4% पीएफए घोल के साथ। 11-13 एमएल / मिनट पर छिड़काव के 10 मिनट के साथ ठीक करें।
    2. छिड़काव-निर्धारण के बाद खोपड़ी गुहा से मस्तिष्क को अलग करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए समाधान में रात भर डुबोएं।
  2. स्थिर ऊतक का ऊतक विभाजन
    1. मस्तिष्क को बाँझ 0.1 एम फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में कुल्ला करें, मेनिंगियल परतों को हटाने से पहले, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की सहायता से, बारीक बल का उपयोग करके।
    2. मस्तिष्क मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके मस्तिष्क को ठीक से ब्लॉकों में काटें (विब्राटोम सेक्शनिंग से पहले ब्रेनस्टेम को फोरब्रेन से अलग करें)। विशेष रूप से, पिरामिड डिकेशन पर ब्रेनस्टेम को पुच्छल रूप से काटें और सेरिबैलम को दूर करें। इसी तरह, फोरब्रेन को तुरंत ऑप्टिक चियास्म में काट लें।
    3. साइनोएक्रिलेट का उपयोग करके एक कंपन माइक्रोटोम चक पर ऊतक को सुरक्षित करें और 2% एगर समाधान में एम्बेड करें।
    4. एक कंपन माइक्रोटोम का उपयोग करके 30 μm मोटे ऊतक वर्गों को काटें और क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान में कट सेक्शन स्टोर करें (30% RNase मुक्त सुक्रोज, 30% एथिलीन ग्लाइकॉल, 1% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (PVP-40), 0.1 M PB, pH 7.4 में)। ऊतक वर्गों को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रोटेक्टेंट में संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. फिश से पहले निश्चित खंडों की तैयारी
    1. फिश के दिन, क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान को हटाने के लिए, 10 मिनट प्रति वॉश के लिए तीन बार मुफ्त फ्लोटिंग सेक्शन धोएं। धोने के लिए, 12 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में 0.1 एम पीबीएस में अनुभाग रखें और एक घूर्णन प्लेटफ़ॉर्म शेकर (90 - 100 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    2. धोने के बाद, ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर अनुभागों को माउंट करने के लिए पेंटब्रश का उपयोग करें और कम से कम 2 घंटे के लिए हवा में सूखें।
      नोट: अनुभागों को स्लाइड पर सपाट होना चाहिए क्योंकि किसी भी स्पष्ट सिलवटों के कारण वे धोने के दौरान अलग हो जाएंगे।
    3. हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करके, फिश अभिकर्मकों को वर्गों तक सीमित करने के लिए अनुभागों के चारों ओर एक बाधा खींचें। एक बार फिर, बैरियर पेन के साथ खींची गई रूपरेखा के आंतरिक क्षेत्र को कम करना महत्वपूर्ण है।
      संभावित ब्रेक पॉइंट: अगले दिन परख जारी रखने के लिए अनुभागों को रात भर कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. मछली परख

नोट: बाकी प्रोटोकॉल ताजा जमे हुए और निश्चित जमे हुए ऊतक दोनों पर लागू होता है।

  1. संकरण और प्रवर्धन चरणों के लिए अभिकर्मकों और उपकरणों को तैयार करें।
    1. एक बेंचटॉप इनक्यूबेटर सेट करें और 40 डिग्री सेल्सियस पर पानी का स्नान करें।
    2. स्लाइड्स को इंजेक्ट करने के लिए एक ह्यूमिडिफ़ाइड, लाइट-प्रोटेक्टेड चैंबर तैयार करें। आर्द्रीकरण ऊतकों को सूखने से रोकता है - स्लाइड एक नम जलाशय के ऊपर सुरक्षित रूप से स्थित होते हैं। आदर्श रूप से, कक्ष भारी-शुल्क पॉलीस्टाइनिन से बना है, यह संतृप्त जल वाष्प वातावरण को बनाए रखने के लिए हल्के-प्रूफ और एयरटाइट है। चैंबर का बंद होना आंदोलन से बचने के लिए न्यूनतम घर्षण पर निर्भर करता है। हमने नीचे गीले प्रयोगशाला पोंछे (सामग्री की तालिका) के साथ पंक्तिबद्ध एक स्लाइड बॉक्स का उपयोग किया। इसे 40 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए इनक्यूबेटर के अंदर स्लाइड बॉक्स रखें।
    3. 50x वॉश बफर (सामग्री की तालिका) को गर्म करें और पानी के स्नान का उपयोग करके 10 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस तक जांच करें, फिर कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
    4. 50x स्टॉक एकाग्रता से 1x वॉश बफर का 1 एल तैयार करें।
    5. जांच मिश्रण (सामग्री की तालिका) तैयार करें: सी 1 जांच स्टॉक एकाग्रता पर उपयोग करने के लिए तैयार है जबकि सी 2 और सी 3 जांच को 50 x एकाग्रता के रूप में भेज दिया जाता है और किट में आपूर्ति किए गए डिल्यूएंट के साथ कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है।
      नोट: जांच मिश्रण 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. प्रोटीज उपचार
    1. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रोटीज III (सामग्री की तालिका) के साथ अनुभागों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं (जांच मिश्रण, प्रवर्धन समाधान, ब्लॉकिंग बफर और एंटीबॉडी सेरा) में प्रोटीज III और इनक्यूबेशन अभिकर्मक पूरी तरह से वर्गों को कवर करते हैं। हाइड्रोफोबिक बैरियर के अंदर पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए अनुभाग पर अभिकर्मक को फैलाने के लिए एक पाइप टिप का उपयोग किया जा सकता है।
    2. एक बड़े प्लास्टिक स्क्वायर पेट्री डिश में हर बार 2 मिनट के लिए 0.1 एम पीबीएस के साथ स्लाइड को दो बार धोएं। यहां एक 245 मिमी x 245 मिमी वर्ग बायोसेसे डिश का उपयोग किया गया था (सामग्री की तालिका)। पकवान के एक तरफ से पकड़ें और धीरे से 3-5 बार झुकें। धोने के बाद, स्लाइड से अतिरिक्त 0.1 एम पीबीएस फ्लिक करें और तुरंत अगला अभिकर्मक जोड़ें। ऊतक वर्गों को सूखने न दें।
      नोट: प्रत्येक धोने के दौरान, स्लाइड को कमरे के तापमान पर समाधान में डुबोया जाता है। यह बाद के सभी वॉश चरणों के लिए वर्कफ़्लो है. निश्चित 30 μm मोटे खंड 14 μm मोटे खंडों की तुलना में स्लाइड से अधिक आसानी से हट जाते हैं, धोने के दौरान कोमल रहें।
  3. संकरण और प्रवर्धन
    1. प्रोटीज समाधान को धोने के बाद, स्लाइड को ह्यूमिडिफ़ाइड, पहले से गर्म कक्ष में रखें। एक बेंचटॉप इनक्यूबेटर के अंदर 40 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए जांच मिश्रण (सामग्री की तालिका) के साथ अनुभागों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना आरएनए गुणवत्ता और इष्टतम परमेबिलाइजेशन का आकलन करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण जांच के लिए कम से कम 2 खंड अलग रखे गए हैं। सकारात्मक नियंत्रण जांच घर-कीपिंग जीन को लक्षित करती है; यहां, ये यूबिकिटिन सी (यूबीसी; उच्च-बहुतायत), पेप्टिडिलप्रोपाइल आइसोमेरेस बी (पीपीआईबी; मध्यम-बहुतायत) और आरएनए पोलीमरेज़ 2 ए (पीओएलआर 2 ए; कम-बहुतायत) को लक्षित करने वाले आरएनए का कॉकटेल थे। नकारात्मक नियंत्रण जांच बैक्टीरिया 4-हाइड्रॉक्सी-टेट्राहाइड्रोडिपिकोलिनेट रिडक्टेस (डीएपीबी) जीन को लक्षित करती है, जो आमतौर पर माउस मस्तिष्क के नमूनों में अनुपस्थित होती है। सकारात्मक डीएपीबी संकेत नमूने के गैर-विशिष्ट संकेत और / या जीवाणु संदूषण को इंगित करता है।
    2. जांच मिश्रण के साथ संकरण के बाद, सिग्नल प्रवर्धन चरणों में एएमपी 1-एफएल (30 मिनट) के साथ इनक्यूबेशन शामिल हैं, फिर एएमपी 2-एफएल (15 मिनट), इसके बाद एएमपी 3-एफएल (30 मिनट) और अंत में एएमपी 4-एफएल (15 मिनट) - प्रत्येक 40 डिग्री सेल्सियस पर। प्रदान की गई ड्रॉपर बोतलों का उपयोग करके, प्रवर्धन समाधान के साथ ऊतक वर्गों को कवर करें। अंतिम प्रवर्धन चरण के बाद आईएचसी परख के लिए आगे बढ़ें।
    3. जांच संकरण और प्रत्येक प्रवर्धन चरण के बीच 2 मिनट के लिए वॉश बफर के साथ स्लाइड को दो बार कुल्ला करें।

4. आईएचसी परख

  1. आईएचसी ब्लॉकिंग कदम।
    1. एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए, फिश परख के बाद 10% सामान्य घोड़े के सीरम, 1x TBSm में 0.3% ट्वीन 20 (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% मर्थियोलेट) युक्त ब्लॉकिंग समाधान के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अनुभागों को इनक्यूबेट करें। 1x TBSm, 5% सामान्य घोड़े के सीरम और 0.1% ट्वीन 20 युक्त एक कमजोर पड़ने वाले बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। प्राथमिक एंटीबॉडी आपूर्तिकर्ताओं को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।
  2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री।
    1. स्लाइड को फ्लिक करके अतिरिक्त ब्लॉकिंग बफर को हटा दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अनुभागों को इनक्यूबेट करें।
    2. 1x TBSm के साथ 3 बार (5 मिनट प्रत्येक) स्लाइड धोएं और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 1x TBSm, 1% सामान्य घोड़े के सीरम और 0.1% ट्वीन 20 युक्त द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले द्वितीयक एंटीबॉडी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
    3. DAPI (सामग्री की तालिका) के साथ या उसके बिना बढ़ते माध्यम से कवर करने से पहले स्लाइड को 1x TBSm (प्रत्येक 5 मिनट) से 3 बार धोएं।

5. इमेजिंग

  1. कैमरे से लैस एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत इम्यूनोस्टेनिंग की जांच करें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। 20x आवर्धन पर प्रतिनिधि चित्र प्राप्त करें और TIFF फ़ाइलों के रूप में सहेजें।
  2. स्पष्टता बढ़ाने और सच्चे प्रतिपादन को प्रतिबिंबित करने के लिए चमक / कंट्रास्ट समायोजन के लिए प्रतिनिधि छवियों को एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) में निर्यात करें।

6. वैकल्पिक: लक्ष्य प्रतिलेख का मात्रात्मक विश्लेषण

नोट: यह एक विधि लेख है और मात्रात्मक परिणाम प्रदान नहीं किए जाते हैं। यहां प्रस्तुत परिमाणीकरण की विधि डेरेली एट अल से ली गई है।10.

  1. 5.1 में बताए गए अनुसार रुचि के क्षेत्रों से चित्र प्राप्त करें और एक ही फ्लोरोफोरे की सभी छवियों के लिए समान माइक्रोस्कोप और कैमरा सेटिंग्स (जैसे एक्सपोज़र समय और प्रकाश तीव्रता) लागू करें।
  2. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके न्यूरोनल प्रोफाइल को प्लॉट करें।
  3. एक स्टीरियोटैक्सिक मस्तिष्क एटलस13 के अनुसार ब्रेग्मा स्तर के संदर्भ में अनुभागों को संरेखित करें।
  4. एक ही फ्लोरोफोरे की सभी छवियों पर समान चमक और विपरीत लागू करें। केवल DAPI-दाग वाले नाभिक वाले न्यूरॉन्स पर विचार करें।
  5. मैन्युअल रूप से एमआरएनए, प्रोटीन एक्सप्रेसिंग, एमआरएनए / एमआरएनए, प्रोटीन / प्रोटीन और एमआरएनए / प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति कोशिकाओं की संख्या को रुचि के क्षेत्र के भीतर गिनें।
  6. प्रयोगात्मक परिणामों में पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, प्रयोगात्मक परिणामों की मात्रा निर्धारित करने वाले व्यक्ति को प्रयोगात्मक समूहों में अंधा कर दिया जाए।
  7. निम्न एबरकॉम्बी समीकरण का उपयोग करके कुल सेल गणना में एबरक्रॉम्बी सुधार14 लागू करें:
    सही सेल गिनती = मैनुअल सेल गिनती x अनुभाग मोटाई / (अनुभाग मोटाई + परमाणु आकार)
    उदाहरण के लिए, 14 μm मोटे वर्गों के लिए, औसत परमाणु चौड़ाई की गणना 7.7 ± 0.3 μm और औसत खंड मोटाई 14 ± 1 μm क्रमशः 30 कोशिकाओं और 10 खंडों के आधार पर 5 जानवरों10 में की जाती है। एबरक्रॉम्बी समीकरण के अनुसार, सही सेल गिनती मैनुअल सेल काउंट x 14/(14 + 7.7) होगी।

Figure 1
चित्रा 1: ताजा-जमे हुए और पैराफॉर्मलडिहाइड निश्चित ऊतक दोनों के लिए ऊतक पूर्व-प्रसंस्करण चरणों का समानांतर वर्कफ़्लो। ताजा-जमे हुए ऊतक के लिए प्रसंस्करण चरण लाल रेखांकित बक्से में प्रदर्शित होते हैं, जबकि पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) निश्चित ऊतक के लिए नीले रेखांकित बक्से में प्रदर्शित होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: संयुक्त मछली जांच और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रक्रिया का सारांश। ऊतक पूर्व-प्रसंस्करण के बाद, स्लाइड माउंटेड ऊतक को हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करके घेर लिया जाता है, जैसा कि पहले फ्रेम में देखा गया है, और कमरे के तापमान पर प्रोटीज समाधान में इनक्यूबेट किया जाता है। धोने के बाद, ऊतक को अनुक्रमिक प्रवर्धन चरणों से पहले 2 घंटे के लिए संकरण के लिए एक बेंचटॉप इनक्यूबेटर में स्थानांतरित किया जाता है। सीटू संकरण प्रणाली एक मालिकाना 'जेड प्रोब' डिजाइन, प्रीएम्पलीफायरों और एम्पलीफायरों का उपयोग करती है जैसा कि फ्रेम 3-66 में देखा गया है। एक बार जब ऊतक फिश प्रोब प्रोसेसिंग से गुजर जाता है, तो इसे सामान्य घोड़े के सीरम के साथ अवरुद्ध करने से पहले धोया जाता है। एंटीबॉडी-एंटीजन बाइंडिंग को अधिकतम करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जाता है। द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन (2 घंटे) कमरे के तापमान पर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

यहां, हम माउस एनटीएस में क्रमशः ताजा जमे हुए और पैराफॉर्मलडिहाइड निश्चित ऊतकों का उपयोग करके जीएलआर 1 और ग्लाइटी 2 के लिए एमआरएनए अभिव्यक्ति को स्थानीयकृत करने के लिए फ्लोरोसेंट आईएचसी के साथ मल्टीप्लेक्स फिश के संयोजन के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं। विधियों में वर्णित ऊतक प्रसंस्करण, मछली और आईएचसी प्रक्रियाओं की एक पाइपलाइन चित्रा 1 और चित्रा 2 में प्रदर्शित की गई है। तालिका 1 प्रत्येक आंकड़े में उपयोग की जाने वाली फिश जांच और एंटीबॉडी संयोजनों का सारांश प्रदान करती है।

वर्कफ़्लो की अखंडता सुनिश्चित करने और नमूना गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, नियंत्रण जांच को नियमित रूप से लक्ष्य जांच के साथ समवर्ती रूप से जांचा जाता है। डीएपीबी लेबलिंग की अनुपस्थिति ध्वनि ऊतक की गुणवत्ता और अखंडता की पुष्टि करती है, और जीवाणु संदूषण की अनुपस्थिति (चित्रा 3 ए)। यूबिकिटिन सी (यूबीसी, उच्च बहुतायत), पेप्टिडिलप्रोपाइल आइसोमेरेज़ बी (पीपीआईबी, मध्यम बहुतायत) और आरएनए पोलीमरेज़ 2 ए (पीओएलआर 2 ए, कम बहुतायत) एमआरएनए को लक्षित करने वाले सकारात्मक नियंत्रण जांच से लेबलिंग आरएनए अखंडता की पुष्टि करता है और परख के बीच देखे गए संकेत का उपयोग अंतर परख परिवर्तनशीलता को कैलिब्रेट करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 3 बी)। फिश जांच अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए, हमने नियंत्रण ऊतकों का उपयोग किया जिन्हें पहले एमआरएनए प्रतिलेख व्यक्त करने के लिए वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, गैलआर 1 एमआरएनए अभिव्यक्ति, थैलेमस में सकारात्मक होने की पुष्टि की गई थी जैसा कि पहले10,15 वर्णित था। फोक्स 2 बी एमआरएनए वितरण को फोक्स 2 बी एंटीबॉडी के साथ कोलेबलिंग द्वारा भी सत्यापित किया गया था; हमने पुष्टि की कि फिश लेबलिंग केवल न्यूरॉन्स में मौजूद थी जो फोक्स 2 बी एंटीबॉडी (चित्रा 5) का उपयोग करके सकारात्मक रूप से दागदार थे।

पड़ोसी नाभिक से एनटीएस में जीएलआर 1 + न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए, हमने अतिरिक्त न्यूरोकेमिकल मार्करों का उपयोग किया। टीएच, फोक्स 2 बी या फोक्स 2 बी-जीएफपी विकृति (चित्रा 4-6), और फोक्स 2 बी फिश (चित्रा 5 और चित्रा 6) ने एनटीएस को पृष्ठीय मस्तिष्क में अन्य नाभिकों से अलग किया क्योंकि एनटीएस न्यूरॉन्स को पहले फोक्स 2 बी और टीएच 16,17 को व्यक्त करने के लिए रिपोर्ट किया गया है। चूंकि एनटीएस कोलीनर्जिक नाभिक से घिरा हुआ है - यह वेगस (डीएमएनएक्स) के हाइपोग्लोसल नाभिक और पृष्ठीय मोटर नाभिक के पृष्ठीय और वेस्टिबुलर नाभिक के पृष्ठीय होता है - हमने कोलीनर्जिक मार्कर वीएसीएचटी18 (चित्रा 4) के साथ सह-लेबल किया। इसलिए, एनटीएस के भीतर जीएलआर 1 की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन टीएच और फोक्स 2 बी के संबंध में किया गया था, जबकि वीएसीएचटी लेबलिंग ने रोस्ट्रोकॉडल, डोरसोवेंट्रल और मेडियोलेटरल निर्देशांक के संबंध में स्थानिक अभिविन्यास की सहायता की। हमने पाया कि एनटीएस में सभी टीएच इम्यूनोरिएक्टिव और गैलआर 1 एमआरएनए पॉजिटिव न्यूरॉन्स फोक्स 2 बी-जीएफपी इम्यूनोरिएक्टिव थे, लेकिन एनटीएस में सभी फोक्स 2 बी-जीएफपी इम्यूनोरिएक्टिव न्यूरॉन्स टीएच इम्यूनोरिएक्टिव या जीएलआर 1 एमआरएनए पॉजिटिव नहीं थे (चित्रा 4)। इसके अलावा, हमने दिखाया कि कम बहुतायत रिसेप्टर जीएएलआर 1 के लिए एमआरएनए टीएच और वीएसीएचटी इम्यूनोरिएक्टिव न्यूरॉन्स में अनुपस्थित था।

ताजा जमे हुए तैयारी में, जब फिश जांच परख के साथ जोड़ा जाता है, तो आईएचसी की सफलता लक्ष्य प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थान पर निर्भर थी। उदाहरण के लिए, वीएसीएचटी (एक सिनैप्टिक पुटिका झिल्ली-बाध्य प्रोटीन) को स्पष्ट रूप से इम्यूनोलेबल किया गया था, जबकि टीएच और जीएफपी (साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन) अनिश्चित काल तक इम्यूनोलेबल किए गए थे और केवल बेहोश रूप से देखे गए थे (चित्रा 4)। हम इस अनिश्चित लेबलिंग को 'फ्लोक्कुलेंट' के रूप में वर्णित करते हैं क्योंकि कोशिकाओं में एक स्पष्ट रूपरेखा का अभाव था और पृष्ठभूमि से अंतर करना मुश्किल साबित हुआ। उसी ताजा जमे हुए ऊतक खंड पर, साइटोप्लाज्मिक गैलआर 1 एमआरएनए के गैलआर 1 फिश जांच लेबलिंग को स्पष्ट रूप से देखा गया था (चित्रा 4)।

इसके अलावा, चूंकि टीएच और वीएसीएचटी एंटीबॉडी एक ही मेजबान में उठाए जाते हैं, इसलिए दोनों प्रोटीनों को एक ही द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल किया गया था और इसलिए एक ही रंग फ्लोरोफोरे (उत्तेजना प्रकाश: 594)। वे आसानी से दो कारणों से अलग होते हैं: वे कभी भी एक ही न्यूरॉन्स में सह-लेबल नहीं करते हैं, और इन प्रोटीनों के लिए उपकोशिकीय स्थानीयकरण अलग होता है; पुटिकाओं में vACHT एक तीखी उपस्थिति का प्रदर्शन करता है, और साइटोप्लाज्म और न्यूरोनल प्रक्रियाओं में TH।

हमारी परिकल्पना का समर्थन करने के लिए कि आईएचसी गुणवत्ता (ताजा जमे हुए तैयारी में) प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर निर्भर है, हमने न्यूरॉन्स में फोक्स 2 बी एमआरएनए (साइटोप्लाज्म में स्थित), जीएफपी (साइटोप्लाज्म में अधिक व्यक्त) और फोक्स 2 बी प्रोटीन (मुख्य रूप से नाभिक में पाया जाता है) के लिए लेबलिंग की तुलना की। जैसा कि अपेक्षित था, हमारे परिणाम एनटीएस के व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में फोक्स 2 बी एमआरएनए, जीएफपी और फोक्स 2 बी एंटीबॉडी लेबलिंग के ओवरलैप को दिखाते हैं (चित्रा 5)। साइटोप्लाज्मिक एमआरएनए लेबलिंग वाली कोशिकाएं फोक्स 2 बी प्रोटीन के परमाणु लेबलिंग का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाओं के साथ मेल खाती हैं जो संयुक्त फिश-आईएचसी विधि का सत्यापन प्रदान करती हैं। यद्यपि साइटोप्लाज्मिक फोक्स 2 बी-जीएफपी में एक फ्लोकुलेंट उपस्थिति थी, परमाणु फोक्स 2 बी प्रोटीन सिग्नल स्पष्ट और विशिष्ट था। अंत में, जब ताजा जमे हुए तैयारी पर फिश के साथ जोड़ा जाता है, तो वीएसीएचटी और फोक्स 2 बी सहित झिल्ली-बाध्य प्रोटीन साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन की तुलना में उच्च गुणवत्ता वाले इम्यूनोलेबलिंग का प्रदर्शन करते हैं।

इसके विपरीत, आईएचसी उपकोशिकीय स्थानीयकरण के बावजूद विश्वसनीय था, जब फिश के साथ संयोजन में निश्चित जमे हुए वर्गों पर प्रदर्शन किया जाता था। GlyT2 mRNA और Phox2b mRNA के लिए मल्टीप्लेक्स मछली सफल रही, जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। GlyT2 mRNA पॉजिटिव न्यूरॉन्स NTS के उदर में स्थित थे और NTS के भीतर नहीं थे। GlyT2+ और Phox2b+ न्यूरॉन्स कोलोकलाइज नहीं करते थे। फोक्स 2 बी + एनटीएस न्यूरॉन्स की एक उप-जनसंख्या टीएच इम्यूनोरिएक्टिव थी और किसी में भी ग्लाइटी 2 एमआरएनए नहीं था। टीएच इम्यूनोरिएक्टिव न्यूरॉन्स एक ही ऊतक खंड पर स्पष्ट हैं, सकारात्मक रूप से लेबल किए गए सोमा और न्यूरोनल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं (चित्रा 6)। यह ताजा जमे हुए ऊतक वर्गों में टीएच इम्यूनोरिएक्टिव न्यूरॉन्स की 'फ्लोक्कुलेंट' उपस्थिति के साथ विरोधाभास ी है। इस प्रकार, यहां वर्णित निश्चित जमे हुए तैयारी ऊतक तैयारी की एक वैकल्पिक विधि है जो आरएनएस्कोप के साथ संयोजन में साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से विश्वसनीय लक्ष्यीकरण को सक्षम बनाता है।

Figure 3
चित्रा 3: पार्श्व सेप्टम (ब्रेग्मा 1.1 से -0.1) के स्तर पर कोरोनल माउस फोरब्रेन वर्गों से प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण जांच के लेबलिंग को दर्शाती हैं । (ए) बैक्टीरियल 4-हाइड्रॉक्सी-टेट्राहाइड्रोडिपिकोलिनेट रिडक्टेस (डीएपीबी) के साथ आईएसएच के बाद सिग्नल की कमी पृष्ठभूमि संकेतों की अनुपस्थिति की पुष्टि करती है। (बी) यूबिकिटिन सी (यूबीसी), पेप्टिडिलप्रोपाइल आइसोमेरेज बी (पीपीआईबी) और आरएनए पोलीमरेज़ 2 ए (पीओएलआर 2 ए) को लक्षित करने वाले सकारात्मक नियंत्रण जांच के साथ लेबलिंग क्रमशः उच्च, मध्यम और निम्न बहुतायत लक्ष्यों से अपेक्षित संकेत को दर्शाता है। स्केल सलाखों 50 μm हैं। सभी छवियों को 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक फोक्स 2 बी-जीएफपी माउस से एक ताजा जमे हुए कोरोनल ब्रेनस्टेम खंड की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां एकान्त पथ (एनटीएस) क्षेत्र के नाभिक में जीएलआर 1 एमआरएनए (फिश) और 3 प्रोटीन (आईएचसी) के संयुक्त लेबलिंग को दिखाती हैं। GalR1 mRNA को पंक्टेट फिश प्रोब लेबलिंग (तीर) द्वारा इंगित किया जाता है। साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन जीएफपी और टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी ने "फ्लोक्कुलेंट" लेबलिंग (तीर) का प्रदर्शन किया। वेसिकुलर एसिटाइलकोलाइन ट्रांसपोर्टर (वीएसीएचटी) विकृति हाइपोग्लोसल न्यूक्लियस (XII) में प्रदर्शित की जाती है (लाल पंक्टेट लेबलिंग)। स्केल बार ए में 100 μm और B में 25 μm हैं। सभी छवियों को 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया था। अन्य संक्षेप: क्षेत्र पोस्ट्रेमा (एपी), मेडियल वेस्टिबुलर न्यूक्लियस (एमवीई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक फोक्स 2 बी-जीएफपी माउस से एक ताजा जमे हुए कोरोनल ब्रेनस्टेम सेक्शन की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां, तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों के साथ एकान्त पथ (एनटीएस) के नाभिक में फोक्स 2 बी के लक्ष्यीकरण को दर्शाती हैं: फोक्स 2 बी एमआरएनए (फिश), जीएफपी (आईएचसी) और फोक्स 2 बी प्रोटीन (आईएचसी)। फोक्स 2 बी प्रोटीन नाभिक में स्थानीयकृत है। तीर न्यूरॉन्स को इंगित करते हैं जिन्हें फोक्स 2 बी जांच (नारंगी -550), जीएफपी एंटीबॉडी (ग्रीन -488) और फोक्स 2 बी एंटीबॉडी (लाल -647) के साथ ट्रिपल लेबल किया जाता है। स्केल बार ए में 100 μm और B में 25 μm हैं। सभी छवियों को 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त किया जाता है। अन्य संक्षेप: क्षेत्र पोस्ट्रेमा (एपी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: निश्चित जमे हुए कोरोनल ब्रेनस्टेम वर्गों से प्रतिनिधि छवियां साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन (टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज [टीएच]) के विश्वसनीय इम्यूनोलेबलिंग के साथ संयुक्त सफल फिश का प्रदर्शन करती हैं। डबल मछली जो एकान्त पथ (एनटीएस) क्षेत्र के नाभिक में ग्लाइसिन ट्रांसपोर्टर 2 (ग्लाइटी 2-लाल -647, भरे हुए तीर) और फोक्स 2 बी (पीले -550, तीर) एमआरएनए लेबलिंग दिखाती है। मछली को टीएच प्रोटीन (ब्लू -346, खाली तीर) के लिए आईएचसी के साथ जोड़ा गया था। A में इनसेट को B में बढ़ाया जाता है। स्केल बार 25 μm होते हैं। सभी छवियों को 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राथमिक एंटीबॉडी या आरएनएस्कोप जांच द्वितीयक एंटीबॉडी या
एएमपी 4-एफएल-एएलटी डिस्प्ले मॉड्यूल		 उत्तेजना (nm) ऊतक की तैयारी
चित्र 3 सलाई POLR2A (C1) एएमपी 4-एफएल-एएलटी बी डिस्प्ले मॉड्यूल 647 ताजा जमे हुए
सलाई PPIB (C2) एएमपी 4-एफएल-एएलटी बी डिस्प्ले मॉड्यूल 488
सलाई UBC (C3) एएमपी 4-एफएल-एएलटी बी डिस्प्ले मॉड्यूल 550
सलाई DapB (C1, C2, C3) एएमपी 4-एफएल-एएलटी बी डिस्प्ले मॉड्यूल 647, 488, 550
DAPI 346
चित्र 4 प्रतिपिंड खरगोश-विरोधी जीएफपी गधा-विरोधी खरगोश 488 ताजा जमे हुए
प्रतिपिंड भेड़-विरोधी टीएच गधा-विरोधी भेड़ 647
प्रतिपिंड बकरी-विरोधी vACHT गधा-विरोधी बकरी 647
सलाई GalR1 (C1) एएमपी 4-एफएल-एएलटी बी डिस्प्ले मॉड्यूल 550
DAPI 346
चित्र 5 प्रतिपिंड खरगोश-विरोधी जीएफपी गधा-विरोधी खरगोश 488 ताजा जमे हुए
प्रतिपिंड माउस-एंटी-फोक्स 2 बी गधा-विरोधी माउस 647
सलाई Phox2b (C2) एएमपी 4-एफएल-एएलटी ए डिस्प्ले मॉड्यूल 550
DAPI 346
चित्र 6 प्रतिपिंड माउस-विरोधी TH गधा-विरोधी माउस 346 स्‍थायी
सलाई GlyT2 एएमपी 4-एफएल-एएलटी ए डिस्प्ले मॉड्यूल 647
सलाई Phox2b एएमपी 4-एफएल-एएलटी ए डिस्प्ले मॉड्यूल 550

तालिका 1: आंकड़े 3-6 में उपयोग किए जाने वाले फिश प्रोब, एंटीबॉडी और संबंधित फ्लुरोफोर संयोजन।

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Discussion

तंत्रिका विज्ञान में, फिश और आईएचसी का उपयोग नियमित रूप से न्यूरोनल उप-आबादी के भीतर एमआरएनए या प्रोटीन के स्थानिक संगठन और कार्यात्मक महत्व की जांच करने के लिए किया जाता है। इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल मस्तिष्क वर्गों में एमआरएनए और प्रोटीन का एक साथ पता लगाने की क्षमता को बढ़ाता है। हमारे संयुक्त मल्टीप्लेक्स फिश-आईएचसी परख ने ताजा जमे हुए और निश्चित मस्तिष्क की तैयारी दोनों में एनटीएस में अलग-अलग न्यूरोनल उप-आबादी की फेनोटाइपिक पहचान को सक्षम किया। निश्चित जमे हुए ऊतक की तैयारी में फिश-आईएचसी ने विश्वसनीय आईएचसी परिणामों का उत्पादन किया। उदाहरण के लिए, कम और उच्च बहुतायत वाले एमआरएनए (क्रमशः जीएलआर 1 और ग्लाइट 2) और आईएचसी (टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज को लक्षित करने) के लिए मल्टीप्लेक्स फिश से पता चला है कि जीएलआर 1 और ग्लाइट 2 गैर-कैटेकोलामाइनर्जिक एनटीएस न्यूरॉन्स में व्यक्त किए जाते हैं। टीएच के लिए आईएचसी ताजा जमे हुए ऊतक में सफल नहीं था, जो ताजा जमे हुए तैयारी में फिश-आईएचसी की सीमित क्षमता को उजागर करता है।

आईएसएच परिदृश्यों की एक श्रृंखला में आईएचसी की तुलना में अधिक उपयुक्त हो सकता है। सबसे पहले, रिसेप्टर्स जैसे कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाते समय आईएचसी अच्छा प्रदर्शन नहीं कर सकता है। इन प्रोटीनों के लिए अपेक्षाकृत उच्च बहुतायत एमआरएनए को लक्षित करने के लिए आईएसएच का उपयोग करने से पता लगाने की क्षमता में सुधार होताहै। दूसरा, न्यूरोपैप्टाइड्स जैसे प्रोटीन को अक्सर सेल सोमा19 में अनुवाद के बाद अक्षीय टर्मिनलों में तस्करी की जाती है। जब न्यूरोपैप्टाइड्स को आईएचसी के साथ लक्षित किया जाता है, तो कोशिकाओं की अक्षीय प्रक्रियाएं और टर्मिनल एंटीबॉडी के साथ लेबल होते हैं, लेकिन सोमा नहीं, जिससे मूल कोशिका की पहचान करने या कोशिकाओं की संख्या का मात्रात्मक विश्लेषण करने की क्षमता कम हो जाती है। हालांकि, चूंकि एमआरएनए जो सभी प्रोटीनों के लिए कोड करते हैं, सोमा के लिए स्थानीयकृत पाए जाते हैं, आईएसएच तकनीक फायदेमंद है। अंत में, कुछ प्रोटीन प्रजातियों के लिए एंटीबॉडी आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, या उपलब्ध एंटीबॉडी अन्य प्रोटिओमिक्स तकनीकों (जैसे, पश्चिमी धब्बा) के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन आईएचसी नहीं। इन परिस्थितियों में, एमआरएनए लेबलिंग विधियां उपयोगी साबित होती हैं। एक चेतावनी यह है कि एमआरएनए को हमेशा प्रोटीन में अनुवादित नहीं किया जा सकता है, और इसलिए वे केवल प्रोटीन पहचान के लिए एक प्रॉक्सी प्रदान करते हैं। चूंकि वाणिज्यिक मछली किट महंगी हो सकती हैं और आईएसएच जांच एंटीबॉडी की तुलना में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होने की संभावना कम है, इसलिए आईएचसी के साथ फिश का संयोजन उन लक्ष्यों की संख्या बढ़ाने के लिए एक लागत और समय प्रभावी रणनीति प्रस्तुत करता है जिन्हें एक साथ लेबल किया जा सकता है।

ताजा जमे हुए बनाम निश्चित ऊतक की तैयारी फिश जांच परख के बाद सफल आईएचसी प्रदान करने वाला एक कारक था। हमने परमाणु, वेसिकुलर और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके आईएचसी का परीक्षण किया और ताजा जमे हुए नमूनों पर झिल्ली-बाध्य प्रोटीन (वीएसीएचटी और फोक्स 2 बी) के विश्वसनीय लेबलिंग को पाया, लेकिन साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन (टीएच और जीएफपी) नहीं। 'फ्लोक्कुलेंट' फोक्स 2 बी-जीएफपी लेबलिंग के साथ फोक्स 2 बी प्रोटीन और एमआरएनए की सहअभिव्यक्ति ने पुष्टि की कि प्रतिलेख व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स ने संबंधित प्रोटीन को भी व्यक्त किया, न्यूरॉन्स की न्यूरोकेमिकल पहचान की पुष्टि की (चित्रा 5)। इसके विपरीत, निश्चित जमे हुए ऊतक की तैयारी ने एंटीजन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की परवाह किए बिना विश्वसनीय आईएचसी लेबलिंग प्राप्त की। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रोटीज (जैसे, प्रोनेस 8,20) प्रथागत आईएचसी पर हानिकारक प्रभाव डाल सकता है। आरएनएस्कोप प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीज समाधान की सामग्री मालिकाना है, और कोशिकाओं में आरएनएस्कोप जांच पहुंच के लिए प्रोटीज द्वारा परमेबिलाइजेशन की सिफारिश की जाती है। यहां वर्णित एंटीबॉडी का उपयोग करके साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के लेबलिंग को पहले मुक्त फ्लोटिंग 30 μm फिक्स्ड फ्रोजन माउस मस्तिष्क अनुभाग10,21,22 पर सत्यापित किया गया है। हमने 30 μm मोटी निश्चित नमूने स्लाइड-माउंट किए और निर्माता द्वारा अनुशंसित 14 μm मोटी ताजा जमे हुए वर्गों के विपरीत, FISH-IHC प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। परख संशोधनों की अनुपस्थिति में, या अन्य चर (एंटीजन पुनर्प्राप्ति, उच्च एंटीबॉडी एकाग्रता, प्रोटीज का परिवर्तन) के परिवर्तन के अभाव में, मछली जांच लेबलिंग के साथ साइटोप्लाज्म और अक्षीय प्रक्रियाओं के प्रदर्शन लेबलिंग के साथ मोटे, निश्चित नमूनों पर विश्वसनीय आईएचसी प्राप्त किया गया था (चित्रा 6)। जबकि इसी तरह के दृष्टिकोण अन्य शोध समूहों7,8,9 द्वारा नियोजित किए गए थे, वर्तमान अध्ययन ने न्यूरॉन्स और फ्लोरोसेंट सेट-अप में संयुक्त आईएसएच-आईएचसी हासिल किया।

ध्यान देने के तरीकों में महत्वपूर्ण कदमों की एक श्रृंखला थी। ताजा जमे हुए तैयारी के लिए, निर्धारण समय 15 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए; लंबे समय तक निर्धारण समय ने उच्च पृष्ठभूमि लेबलिंग प्राप्त की। प्रोटीज चरण को अनुकूलित किया गया था क्योंकि विभिन्न मोटाई के ऊतकों और विभिन्न अंगों से परमेबिलाइजेशन प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रकार के प्रोटीज की आवश्यकता होती है। फिक्स्ड जमे हुए खंड ग्लास स्लाइड का कम पालन करते हैं और धोने के चरणों के दौरान अधिक आसानी से हटा देते हैं। इसलिए, ऊतक हानि या क्षति से बचने के लिए, निश्चित जमे हुए वर्गों के मैनुअल हैंडलिंग में अतिरिक्त सावधानी बरतनी चाहिए।

यद्यपि हमने संयुक्त मछली और आईएचसी को एक प्रभावी रणनीति पाया, लेकिन नुकसान में दो तरीकों के संयोजन के दौरान लागत और तकनीकी रूप से मांग परख शामिल है। अध्ययन की एक सीमा यह है कि दो ऊतक तैयारी प्रोटोकॉल की साइड-बाय-साइड तुलना नहीं की गई थी। इसके अलावा, परिणामों का हमारा मूल्यांकन एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप द्वारा समायोजित चैनलों की संख्या से सीमित था; सेट-अप ने एक निश्चित समय में अधिकतम 4 चैनलों की अनुमति दी: 346, 488, 550 और 647 एनएम (उत्तेजना प्रकाश)। हम एक ही फ्लुरोफोर का उपयोग करके विभिन्न उपकोशिकीय स्थानीयकरण के साथ दो प्रोटीनों को लेबल करके 5 लक्ष्यों के मल्टीप्लेक्स लेबलिंग को प्राप्त करने में सक्षम थे (चित्रा 4, तालिका 1)। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, कई अतिरिक्त फ्लोरोफोरे के असतत उत्तेजना का उपयोग आईएचसी के माध्यम से व्यक्तिगत प्रोटीन लेबलिंग के लिए किया जा सकता है, या ट्रांसजेन द्वारा व्यक्त फ्लोरोसेंट अणुओं की इमेजिंग के लिए किया जा सकता है।

संयुक्त मछली और फ्लोरोसेंट आईएचसी अलगाव में प्रत्येक तकनीक की विश्वसनीयता को कम कर सकते हैं। भविष्य में, हम एक एंटीजन पुनर्प्राप्ति उपचार23 के साथ ताजा जमे हुए ऊतक पर साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन लेबलिंग में सुधार करना चाहते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि गर्मी प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्रोटीन एपिटोप24,25,26 की पहुंच को बढ़ाती है। गर्मी उपचार प्रोटीन के क्रॉसलिंक और मेथिलोल समूहों को छोड़ देता है और ऊतकों में एंटीजन को उजागर करता है, जिससे एपिटोप्स उजागर होते हैं जो अन्यथा जैविक परिस्थितियों में तृतीयक प्रोटीन संरचना में छिपे होंगे। यह पहुंच प्रोटीन लेबलिंग26,27 की सफलता में सुधार कर सकती है। इसके अतिरिक्त, हम यह निर्धारित करने के लिए एक ही साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के विभिन्न एपिटोप्स को लक्षित करेंगे कि प्रोटीन-एंटीबॉडी लेबलिंग की सफलता उपयोग किए गए विशिष्ट एंटीबॉडी क्लोन पर निर्भर करती है या नहीं।

निष्कर्ष में, संयुक्त फिश और आईएचसी मस्तिष्क में कोशिकाओं की हेटरोजेनस आबादी की न्यूरोकेमिकल पहचान के लिए उपयोगी है, जैसे कि एनटीएस में। यह अध्ययन दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो विभिन्न माउस ब्रेनस्टेम ऊतक तैयारी - ताजा जमे हुए, या तय - सीटू में एमआरएनए और प्रोटीन के एक साथ मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए तैयार हैं। दोनों प्रोटोकॉल को कम बहुतायत वाले एमआरएनए के अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है, जैसे कि जीएएलआर 1। पतली (14 μm) ताजा जमी हुई तैयारी की तुलना में प्रोटीज के साथ मोटी (30 μm) निश्चित जमे हुए तैयारी ने अधिक विश्वसनीय साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन का पता लगाने और अधिक ऊतक हैंडलिंग चुनौतियों को प्रदान किया।

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Acknowledgments

यह काम ऑस्ट्रेलियाई रिसर्च काउंसिल डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट DP180101890 और रेबेका एल कूपर मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था PG2018110

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANIMALS
C57BL/6 mouse Australian BioResources, Moss Vale MGI: 2159769
Phox2b-eGFP mouse Australian BioResources, Moss Vale MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylate Loctite
Ethylene Glycol Sigma-Aldrich 324558
Heparin-Sodium Clifford Hallam Healthcare 1070760 Consult local veterinary supplier or pharmacy.
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection Virbac (Australia) Pty Ltd N/A Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol
Molecular grade agarose powder Sigma Aldrich 5077
OCT Compound, 118mL Scigen Ltd 4586
Paraformaldehyde, prilled, 95% Sigma-Aldrich 441244-1KG
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000  (PVP-40) Sigma-Aldrich PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P36930 With or without DAPI
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) ADV320850 Includes 50x Wash buffer and Protease III
RNase Away Thermo-Fisher Scientific 7003
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859
Tween-20, for molecular biology Sigma-Aldrich P9416
EQUIPMENT
Benchtop incubator Thermoline scientific micro incubator Model: TEI-13G
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm Ted Pella 15050
Cryostat Leica CM1950
Drawing-up needle (23 inch gauge) BD 0288U07
Hydrophobic Barrier Pen Vector labs H-4000
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes Kimberley Clark Professional 34120
Olympus BX51 Olympus BX-51
Peristaltic pump Coleparmer Masterflex L/S Series 
Retiga 2000R Digital Camera QImaging RET-2000R-F-CLR colour camera
SuperFrost Plus Glass Slides (White) Thermo-Fisher Scientific 4951PLUS4
Vibrating Microtome (Vibratome) Leica VT1200S
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter Merck WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW  Corel Corporation Version 7
FIJI (ImageJ Distribution) Open Source/GNU General Public Licence (GPL) N/A ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
PRIMARY ANTIBODIES
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Millipore Sigma AB1542 Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 Millipore Sigma MAB318 Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody Sigma-Aldrich ABN100 Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394
GFP Antibody Novus Biologicals NB600-308 Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058
Phox2b Antibody (B-11) Santa Cruz Biotechnology sc-376997 Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765
SECONDARY ANTIBODIES
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)  Jackson ImmunoResearch 711-545-152 Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 713-155-147 Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 705-175-147 Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 715-175-151 Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) Jackson ImmunoResearch 713-175-147 Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe ACDBio 448821-C1 targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe ACDBio 409741-C3 targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)
Phox2b oligonucleotide probe ACDBio 407861-C2 targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)

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References

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मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन फिश फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री फ्रेश फ्रोजन माउस ब्रेन सेक्शन फिक्स्ड माउस ब्रेन सेक्शन आरएनए ट्रांसक्रिप्ट्स न्यूरोकेमिकल फेनोटाइपिंग एंटीबॉडी प्रोटीन लेबलिंग आरएनएस्कोप फिश फ्लोरेसेंस इम्यूनोस्टेनिंग गैलानिन रिसेप्टर 1 ग्लाइसिन ट्रांसपोर्टर 2 ब्रेनस्टेम न्यूक्लियस
ताजा जमे हुए या निश्चित माउस मस्तिष्क वर्गों पर फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ <em>सीटू</em> संकरण में मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस का संयोजन
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Dereli, A. S., Bailey, E. J., Kumar, N. N. Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (172), e61709, doi:10.3791/61709 (2021).

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