Summary
В этом протоколе описывается метод сочетания флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и флуоресцентной иммуногистохимии (IHC) как в свежезамороженных, так и в фиксированных срезах мозга мышей с целью получения мультиметочного FISH и флуоресцентного сигнала IHC. ИГХ нацелен на цитоплазматические и мембранные присоединенные белки.
Abstract
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это молекулярный метод, который определяет наличие и пространственное распределение специфических транскриптов РНК в клетках. Нейрохимическое фенотипирование функционально идентифицированных нейронов обычно требует одновременного мечения несколькими антителами (белком-мишенью) с использованием иммуногистохимии (ИГХ) и оптимизации гибридизации in situ (таргетная РНК) в тандеме. Может быть достигнута «нейрохимическая сигнатура» для характеристики конкретных нейронов, однако осложняющие факторы включают необходимость верификации мишеней FISH и IHC перед объединением методов, а также ограниченное количество РНК и белков, которые могут быть нацелены одновременно в пределах одного и того же участка ткани.
Здесь мы опишем протокол, использующий как свежезамороженные, так и фиксированные препараты мозга мышей, который обнаруживает несколько мРНК и белков в одном и том же участке мозга с помощью РНК-скопа FISH с последующим флуоресцентным иммуноокрашиванием, соответственно. Мы используем комбинированный метод для описания паттерна экспрессии мРНК с низкой распространенностью (например, рецептор галанина 1) и мРНК с высокой распространенностью (например, транспортер глицина 2) в иммуногистохимически идентифицированных ядрах ствола мозга.
Основные соображения по маркировке белков после анализа FISH выходят за рамки подготовки тканей и оптимизации маркировки зондов FISH. Например, мы обнаружили, что на связывание антител и специфичность маркировки может отрицательно влиять стадия протеазы в анализе FISH-зонда. Протеазы катализируют гидролитическое расщепление пептидных связей, облегчая проникновение FISH-зонда в клетки, однако они также могут переваривать белок, на который нацелен последующий анализ ИГХ, вызывая нецелевое связывание. Субклеточное расположение целевого белка является еще одним фактором, способствующим успеху ИГХ после FISH-анализа. Мы наблюдали, что специфичность ИГХ сохраняется, когда белок-мишень связан с мембраной, в то время как ИГХ, нацеленная на цитоплазматический белок, требует обширного устранения неполадок. Наконец, мы обнаружили, что работа с фиксированной замороженной тканью, установленной на предметном стекле, более сложной, чем со свежезамороженной тканью, однако качество ИГХ было в целом лучше с фиксированной замороженной тканью в сочетании с РНК-скопом.
Introduction
Белки и мРНК, которые нейрохимически определяют субпопуляции нейронов, обычно идентифицируются с помощью комбинации иммуногистохимии (ИГХ) и/или гибридизации in situ (ISH) соответственно. Сочетание ISH с методами ИГХ облегчает характеризацию паттернов колокализации, уникальных для функциональных нейронов (нейрохимическое кодирование), максимизируя способность мультиплексного мечения.
Флуоресцентные методы ISH (FISH), включая RNAscope, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с более ранними методами детектирования РНК, такими как радиоактивный ISH и нерадиоактивный хромогенный ISH. FISH позволяет визуализировать одиночные транскрипты мРНК в виде точечных пятен1. Кроме того, анализ РНК-скопа позволяет одновременно маркировать увеличенное количество мишеней РНК, используя различные метки флуорофора. Несмотря на эти преимущества, технические ограничения могут повлиять на количество флуорофоров/хромогенов, которые могут быть использованы в одном эксперименте. К ним относятся наличие комплектов фильтров для микроскопов; Такие соображения усугубляются, когда нейрохимическая идентификация использует комбинированные FISH и IHC, по сравнению с использованием каждого метода по отдельности, поскольку неотъемлемые шаги, оптимальные для одного метода, могут быть вредными для другого.
Предыдущее применение FISH в сочетании с ИГХ продемонстрировало экспрессию специфических клеточных мишеней в В-клеточных лимфомах человека2, эмбрионах цыплят3, эмбрионах рыбок данио4, сетчатке мыши5 и клетках внутреннего уха мыши6. В этих исследованиях ткань препарировалась либо с помощью фиксированного формалином парафина (FFPE)2,3,5, либо свежего целого монтировки 4,6. В других исследованиях применяли хромогенный РНК-скоп на фиксированных препаратах мозга мышей и крыс 7,8,9. В частности, Baleriola et al.8 описаны два различных тканевых препарата для комбинированного ISH-IHC; фиксированные участки мозга мыши и секции мозга человека FFPE. В недавней публикации мы объединили FISH и флуоресцентный ИГХ на свежезамороженных срезах, чтобы одновременно визуализировать мРНК с низкой распространенностью (рецептор галанина 1, GalR1), мРНК с высокой распространенностью (транспортер глицина 2, GlyT2) и везикулярный транспортер ацетилхолина (vAChT) белка10 в ретикулярной формации ствола мозга.
Ядро солитарного тракта (НТС) является основной областью мозга, участвующей в вегетативной функции. Расположенная в заднем мозге, эта гетерогенная популяция нейронов получает и интегрирует огромное количество вегетативных сигналов, в том числе и тех, которые регулируют дыхание. NTS содержит несколько нейронных популяций, которые могут быть фенотипически охарактеризованы паттерном экспрессии мишеней мРНК, включая GalR1 и GlyT2, а также белковых маркеров фермента тирозингидроксилазы (TH) и транскрипционного фактора Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
Владелец РНКаскопа рекомендует свежезамороженные препараты тканей, но ткани, приготовленные путем транскардиальной перфузионной фиксации цельного животного, наряду с длительной криозащитой (хранение при -20 °C) фиксированных замороженных срезов ткани, распространены во многих лабораториях. Таким образом, мы стремились разработать протоколы для FISH в сочетании с ИГХ с использованием свежезамороженных и фиксированных замороженных тканевых препаратов. Здесь мы приводим свежезамороженные и фиксированные замороженные срезы мозга: (1) протокол комбинированного FISH и флуоресцентного ИГХ, (2) описание качества маркировки мРНК и белков, получаемых при использовании каждого препарата, (3) описание экспрессии GalR1 и GlyT2 в NTS.
Наше исследование показало, что в сочетании с методологией РНК-скопа успех ИГХ варьировался в свежезамороженных и фиксированных замороженных препаратах и зависел от локализации белков-мишеней в клетке. В наших руках мембранно-связанное мечение белков всегда было успешным. В отличие от этого, ВПХ для цитоплазматического белка требовала устранения неполадок даже в тех случаях, когда цитоплазматический белок был чрезмерно экспрессирован у трансгенного животного (Phox2b-GFP)11. Наконец, в то время как GalR1 экспрессируется в некатехоламингических нейронах в NTS, экспрессия GlyT2 отсутствует в NTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Краткое описание этапов предварительной обработки тканей можно найти на рисунке 1. Все процедуры проводились в соответствии с Комитетом по уходу за животными и этике Университета Нового Южного Уэльса в соответствии с руководством по использованию и уходу за животными в научных целях (Австралийский национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям).
1. Пробоподготовка свежезамороженных тканей головного мозга
- Транскардиальная перфузия
- Приготовьте гепаринизированный (2500 Ед/л) 0,1 М фосфатный буфер (ФБ), рН 7,5. Приготовьте суспензию этанола из сухого льда, смешав сухой лед с этанолом. Он будет иметь температуру примерно −72 °C и будет использоваться для немедленного замораживания собранной ткани.
- Усыпляют взрослых мышей C57BL/6 и Phox2b-GFP11 (Mouse Genome Informatics Database ID MGI:5776545) путем обезболивания пентобарбиталом натрия (70 мг/кг, в/в) с помощью 27,5-дюймового игольчатого калибра.
ВНИМАНИЕ: Пентобарбитал является барбитуратом. Он остро токсичен в высоких дозах и может вызвать смерть от остановки дыхания. Перед использованием ознакомьтесь с местными рекомендациями по здравоохранению, правовым нормам и правилам безопасности материалов. - Обнажите сердце и канюлируйте левый желудочек с помощью иглы (23-дюймового калибра). Проводят транскардиальную перфузию гепаринизированным 0,1 М ПБ до очищения крови (2-3 минуты) со скоростью потока 11-13 мл/мин. Определяют очищение крови, контролируя окраску печени и эффузат из правого предсердия12.
- Изолируйте мозг от полости черепа, немедленно поместите его в компаунд с оптимальной температурой резки (OCT) в криомолд или алюминиевую фольгу и поместите в ванну с этанолом с сухим льдом. Храните замороженную встроенную ткань в герметичном контейнере при температуре -80 °C до 3 месяцев.
- Секционирование свежезамороженных тканей
- Установите температуру криостата на -20 °C. Оставьте ткань, внедренную в ОКТ, и криостатный патрон в криостате на ~30 минут, чтобы обеспечить равновесие к новой температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите ткань в замороженном виде; транспортируйте ткань из морозильной камеры с температурой -80 °C в криостат на сухом льду. - Закрепите ткань на предварительно охлажденном патроне криостата с помощью ОКТ-компаунда. В этом протоколе тканевые блоки устанавливались на патрон в корональной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите излишки ОКТ с ткани с помощью бритвенного лезвия, чтобы свести к минимуму количество ОКТ, срезаемого криостатом и впоследствии переносимого на предметное стекло. - Вырежьте корональные срезы толщиной 14 мкм и установите их на предметные стекла для микроскопии.
- Перед монтажом секций нагрейте слайды до комнатной температуры. После того, как секция будет смонтирована, храните салазки в слайд-боксе в криостате.
- Если на одном предметном стекле необходимо установить более одной секции, согрейте область для второй секции, положив палец на противоположную сторону предметного стекла на 5-10 секунд, чтобы облегчить прилегание секции к предметному стеклу. Срез холодной ткани не будет прикреплен к холодному предметному стеклу. Секции должны прилегать к слайдам ровно; Складывание приведет к тому, что они упадут с направляющих во время стирки.
- Если на участках замечены трещины, увеличьте температуру криостата на 1-5 °C, чтобы этого избежать. Особенно важно расположить срезы тканей в непосредственной близости друг от друга на одном предметном стекле. Это предотвратит потерю FISH-зондов и реагентов во время анализа.
- Срезы тканей, прикрепленные к предметным стеклам, храните в герметичном контейнере при температуре -80 °C до 6 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите секции замороженными и избегайте циклов замораживания, чтобы предотвратить деградацию РНК. Транспортируйте слайд-бокс из криостата в морозильную камеру с температурой -80 °C на сухом льду.
- Установите температуру криостата на -20 °C. Оставьте ткань, внедренную в ОКТ, и криостатный патрон в криостате на ~30 минут, чтобы обеспечить равновесие к новой температуре.
- Фиксация свежезамороженных тканей
- В день проведения зондового анализа FISH приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 M PB, pH 7,5 (4% раствор PFA). Фильтруют, пропуская фильтровальную бумагу (класс 1: 11 мкм, таблица материалов) в воронку Бюхнера или тигельный фильтр.
ВНИМАНИЕ: PFA вреден и токсичен при контакте с кожей или вдыхании. Все процедуры с раствором PFA следует проводить в вытяжном шкафу. Отходы раствора PFA следует утилизировать тщательно в соответствии с институциональными протоколами безопасности. - Охладите 4% раствор PFA до 4 °C. Транспортируйте задвиженную ткань из морозильной камеры с температурой -80 °C в сухом льду и сразу же погрузите ее в предварительно охлажденный фиксатор на 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы этот этап фиксации не превышал 15 минут, так как чрезмерная фиксация приведет к неспецифической фоновой маркировке.
- В день проведения зондового анализа FISH приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 M PB, pH 7,5 (4% раствор PFA). Фильтруют, пропуская фильтровальную бумагу (класс 1: 11 мкм, таблица материалов) в воронку Бюхнера или тигельный фильтр.
- Обезвоживание свежезамороженных тканей
- Обезвоживайте срезы тканей, погружая предметные стекла в дифференцированные концентрации этанола. В банку Coplin сначала погрузите 50%, затем 70% и, наконец, абсолютный этанол на 5 минут каждый при комнатной температуре. Повторите окончательную абсолютную инкубацию этанола во второй раз.
- Высушите горки на воздухе и очертите группу секций с помощью гидрофобной барьерной ручки, убедившись, что внутренняя площадь сведена к минимуму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что предметное стекло полностью высохло, прежде чем рисовать гидрофобный барьер. Гидрофобный барьер должен окружать участки ткани полностью без зазоров и должен быть сухим перед дальнейшей обработкой.
2. Пробоподготовка фиксированной замороженной ткани головного мозга
- Фиксация транскардиальной перфузии
- Эвтаназию мышей обезболивали пентобарбиталом натрия (70 мг/кг, в/м) с последующей транскардиальной перфузией, сначала 0,1 М ПБ, затем 4% раствором ПФА. Закрепите 10-минутной перфузией со скоростью 11-13 мл/мин.
- Изолируют мозг от полости черепа после перфузионной фиксации и погружают на ночь в 4% раствор PFA при температуре 4 °C.
- Срезы фиксированных тканей
- Промыть мозг в стерильном 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) перед удалением менингеальных слоев с помощью препарирующего микроскопа с помощью тонких щипцов.
- Разрежьте мозг точно на блоки (отделите ствол мозга от переднего мозга перед разделением вибратомы) с помощью матрицы мозга (таблица материалов). В частности, разрежьте ствол мозга каудально в месте пирамидной декуссации и рассеките мозжечок. Точно так же разрезают передний мозг непосредственно рострально к зрительной хиазме.
- Закрепите ткань на вибрирующем патроне микротома с помощью цианоакрилата и поместите в 2% раствор агара.
- Срезы тканей толщиной 30 мкм вырезать с помощью вибрирующего микротома и хранить срезы в растворе криопротектора (30% безРНКазная сахароза, 30% этиленгликоль, 1% поливинилпирролидон (ПВП-40), в 0,1 М ПБ, рН 7,4). Срезы тканей можно хранить в криопротекторе при температуре -20 °C до 6 месяцев.
- Подготовка фиксированных секций перед FISH
- В день FISH промойте свободно плавающие участки три раза, по 10 минут на каждую стирку, чтобы удалить раствор криопротектора. Для промывки помещают срезы в 0,1 м PBS в 12-луночную планшет для культивирования клеток и перемешивают на вращающемся платформенном шейкере (90 - 100 об/мин).
- После мытья используйте кисть, чтобы закрепить срезы на предметных стеклах для микроскопии и высушить на воздухе не менее 2 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Секции должны плотно прилегать к направляющим, так как любые выраженные складки приведут к их отсоединению во время стирки. - Используя гидрофобную барьерную ручку, нарисуйте барьер вокруг секций, чтобы ограничить реагенты FISH секциями. Опять же, важно свести к минимуму внутреннюю площадь контура, нарисованного барьерной ручкой.
ВОЗМОЖНАЯ ТОЧКА РАЗРЫВА: Срезы можно хранить при комнатной температуре в течение ночи, чтобы продолжить анализ на следующий день.
3. Анализ РЫБЫ
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальная часть протокола относится как к свежезамороженным, так и к фиксированным замороженным тканям.
- Подготовьте реагенты и инструменты для этапов гибридизации и амплификации.
- Установите настольный инкубатор и водяную баню на 40 °C.
- Подготовьте увлажненную, защищенную от света камеру для инкубации предметных стекол. Увлажнение предотвращает пересыхание тканей – предметные стекла надежно расположены над влажным резервуаром. В идеале камера изготовлена из сверхпрочного полистирола, она светонепроницаема и воздухонепроницаема для поддержания насыщенной атмосферы водяного пара. Закрытие камеры основано на минимальном трении, чтобы избежать движения. Мы использовали слайд-бокс, выстланный влажными лабораторными салфетками (Таблица материалов) внизу. Поместите слайд-бокс внутрь инкубатора, чтобы он прогрелся до 40 °C.
- Нагрейте буфер для промывки 50x (таблица материалов) и зонды до 40 °C в течение 10 минут на водяной бане, затем остудите до комнатной температуры.
- Приготовьте 1 л 1x Wash Buffer из 50-кратной концентрации бульона.
- Подготовка смеси зондов (Таблица материалов): зонд C1 готов к использованию при концентрации на складе, в то время как зонды C2 и C3 поставляются с концентрацией 50x и требуют разбавления разбавителем, входящим в комплект.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси зондов можно хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
- Лечение протеазой
- Инкубируйте срезы с Protease III (таблица материалов) при комнатной температуре в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что протеаза III и инкубационные реагенты в последующих процессах (смесь зондов, растворы для амплификации, блокирующий буфер и сыворотки антител) полностью покрывают участки. Наконечник пипетки можно использовать для распределения реагента по участку, чтобы покрыть всю площадь внутри гидрофобного барьера. - Дважды промойте предметные стекла 0,1 м PBS, каждый раз по 2 минуты, в большой пластиковой квадратной чашке Петри. Здесь использовалась квадратная чашка для биопроб размером 245 мм х 245 мм (Таблица материалов). Возьмите с одной стороны блюда и осторожно наклоните 3-5 раз. После промывки смахните излишки 0,1 М PBS с предметного стекла и сразу же добавьте следующий реагент. Не допускайте высыхания срезов ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время каждой стирки предметные стекла погружаются в раствор комнатной температуры. Это рабочий процесс для всех последующих этапов стирки. Фиксированные секции толщиной 30 мкм легче смещаются с предметных стекол, чем секции толщиной 14 мкм, будьте осторожны во время стирки.
- Инкубируйте срезы с Protease III (таблица материалов) при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Гибридизация и амплификация
- Смыв раствор протеазы, поместите предметные стекла в увлажненную, предварительно прогретую камеру. Инкубируйте срезы с зондовой смесью (таблица материалов) в течение 2 часов при температуре 40 °C в настольном инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что для положительных и отрицательных контрольных зондов отведено не менее 2 секций для оценки качества образца РНК и оптимальной пермеабилизации. Положительные контрольные зонды нацелены на гены, отвечающие за ведение домашнего хозяйства; В данном случае это был коктейль из РНК, нацеленных на убиквитин С (UBC; высокая распространенность), пептидилпропилизомеразу B (PPIB; умеренное распространение) и РНК-полимеразу 2a (POLR2A; низкое распространение). Отрицательные контрольные зонды нацелены на бактериальный ген 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатредуктазы (DapB), который обычно отсутствует в образцах мозга мышей. Положительный сигнал DapB указывает на неспецифический сигнал и/или бактериальное загрязнение образца. - После гибридизации с зондовой смесью этапы усиления сигнала состоят из инкубации с усилителем 1-FL (30 минут), затем с усилителем 2-FL (15 минут), затем с усилителем 3-FL (30 минут) и, наконец, с усилителем 4-FL (15 минут) - каждый при 40 °C. С помощью прилагаемых флаконов-капельниц покройте участки тканей раствором для амплификации. Приступайте к анализу ИГХ после последнего этапа амплификации.
- Промывайте предметные стекла буфером для промывки дважды в течение 2 минут между гибридизацией зонда и каждым этапом амплификации.
- Смыв раствор протеазы, поместите предметные стекла в увлажненную, предварительно прогретую камеру. Инкубируйте срезы с зондовой смесью (таблица материалов) в течение 2 часов при температуре 40 °C в настольном инкубаторе.
4. Анализ ИГХ
- Шаг блокировки IHC
- Чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител, инкубируют срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с блокирующим раствором, содержащим 10% нормальной лошадиной сыворотки, 0,3% Tween20 в 1x TBSm (50 мМ Tris-Cl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,05% мертиолят) после анализа FISH. Готовят первичные антитела в буфере для разведения, содержащем 1x TBSm, 5% нормальной лошадиной сыворотки и 0,1% Tween20. Основные поставщики антител перечислены в Таблице материалов.
- Иммуногистохимия
- Удалите излишки блокирующего буфера, щелкнув предметным стеклом, и инкубируйте срезы с первичными антителами в течение ночи при 4 °C.
- Промойте предметные стекла 3 раза (по 5 минут каждый) с 1 TBSm и инкубируйте со вторичными антителами в разбавителе, содержащем 1x TBSm, 1% нормальной лошадиной сыворотки и 0,1% Tween20 в течение 2 часов при комнатной температуре. Вторичные антитела, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.
- Промойте предметные стекла 3 раза с помощью 1x TBSm (5 минут каждая) перед нанесением покрытия монтажным средством с DAPI (таблица материалов) или без него.
5. Визуализация
- Исследуйте иммуноокрашивание под эпифлуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой (подробности см. в таблице материалов ). Получайте репрезентативные изображения с 20-кратным увеличением и сохраняйте их в виде файлов TIFF.
- Экспортируйте репрезентативные изображения в программное обеспечение для обработки изображений (таблица материалов) для регулировки яркости/контрастности для повышения четкости и отражения истинного рендеринга.
6. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Количественный анализ целевых транскриптов
ПРИМЕЧАНИЕ: Это статья о методах, и количественные результаты не предоставляются. Метод количественной оценки, представленный здесь, взят из Dereli et al.10. См.
- Получите изображения из областей интереса, как описано в 5.1, и примените одни и те же настройки микроскопа и камеры (например, время экспозиции и интенсивность света) ко всем изображениям одного и того же флуорофора.
- Постройте график профилей нейронов с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Таблица материалов).
- Выровняйте срезы по уровню Брегмы в соответствии со стереотаксическим атласом мозга13.
- Примените одинаковую яркость и контрастность ко всем изображениям одного и того же флуорофора. Рассматривайте только нейроны с DAPI-окрашенными ядрами.
- Вручную подсчитайте количество мРНК, экспрессирующих белки, мРНК/мРНК, белок/белок и коэкспрессирующих мРНК/белок клеток в интересующей области.
- Чтобы уменьшить систематическую ошибку в экспериментальных результатах, сделайте так, чтобы человек, оценивающий результаты эксперимента, был слеп к экспериментальным группам.
- Примените поправку Аберкромби14 к общему количеству ячеек с помощью следующего уравнения Аберкомби:
Скорректированное количество ячеек = ручное количество ячеек x толщина сечения / (толщина сечения + размер ядра)
Например, для срезов толщиной 14 мкм средняя ширина ядра составляет 7,7 ± 0,3 мкм, а средняя толщина сечения составляет 14 ± 1 мкм из расчета 30 клеток и 10 секций соответственно у 5животных10. Согласно уравнению Аберкромби, скорректированное количество клеток будет ручным подсчетом клеток x 14/(14+7,7).
Рисунок 1: Параллельный рабочий процесс этапов предварительной обработки тканей как для свежезамороженных, так и для параформальдегидных фиксированных тканей. Этапы обработки свежезамороженных тканей отображаются в красных рамках, в то время как этапы обработки фиксированных тканей из параформальдегида (PFA) отображаются в синих рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Краткое описание комбинированной процедуры FISH-зонда и иммуногистохимии. После предварительной обработки ткани ткань, установленную на предметном стекле, обматывают с помощью гидрофобного барьерного пера, как показано на первом кадре, и инкубируют в растворе протеазы при комнатной температуре. После промывки ткань переносят в настольный инкубатор для гибридизации на 2 часа перед последовательными этапами амплификации. В системе гибридизации in situ используется запатентованная конструкция Z-зонда, предусилители и усилители, как показано на кадрах 3-66. После того, как ткань прошла обработку FISH-зондом, ее промывают перед блокировкой обычной лошадиной сывороткой. Первичную инкубацию антител проводят в течение ночи при 4 °C для максимального связывания антитело-антиген. Инкубацию вторичных антител (2 часа) проводили при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В данной работе мы описываем метод комбинирования мультиплексного FISH с флуоресцентным ИГХ для локализации экспрессии мРНК для GalR1 и GlyT2 с использованием свежезамороженных и параформальдегидных фиксированных тканей соответственно в NTS мыши. Конвейер процедур обработки тканей, FISH и IHC, описанных в методах, показан на рисунке 1 и рисунке 2. В таблице 1 приведена сводная информация о комбинациях зондов и антител FISH, используемых на каждом рисунке.
Контрольные зонды регулярно анализируются одновременно с целевым зондом, чтобы обеспечить целостность рабочего процесса и подтвердить качество образца. Отсутствие маркировки DapB подтверждает качество и целостность тканей, а также отсутствие бактериального загрязнения (рис. 3A). Маркировка мРНК с помощью положительных контрольных зондов, нацеленных на убиквитин С (UBC, высокая распространенность), пептидилпропилизомеразу B (PPIB, умеренное распространение) и РНК-полимеразу 2a (POLR2A, низкая распространенность), подтверждает целостность РНК, а сигнал, наблюдаемый между анализами, может быть использован для калибровки межтестовой вариабельности (рис. 3B). Для валидации экспрессии зонда FISH мы использовали контрольные ткани, которые были описаны ранее для экспрессии транскрипта мРНК. Например, экспрессия мРНК GalR1 была подтверждена положительной в таламусе, как было описано ранее 10,15. Распределение мРНК Phox2b дополнительно верифицировали путем комаркировки с антителами Phox2b; мы подтвердили, что мечение FISH присутствовало только в нейронах, которые также были положительно окрашены с помощью антител Phox2b (рис. 5).
Чтобы отличить нейроны GalR1+ в NTS от соседних ядер, мы использовали дополнительные нейрохимические маркеры. TH, Phox2b или Phox2b-GFP иммунореактивность (рис. 4-6) и Phox2b FISH (рис. 5 и 6) дифференцировали NTS от других ядер в дорсальном стволе мозга, поскольку ранее сообщалось, что нейроны NTS экспрессируют Phox2b и TH16,17. Поскольку НТС расположена холинергическими ядрами - дорсально по отношению к подъязычному ядру и дорсальному моторному ядру блуждающего пузыря (DMNX) и вентрально к вестибулярному ядру - мы пометили его совместно с холинергическим маркером vAChT18 (рис. 4). Таким образом, экспрессия GalR1 в NTS оценивалась по отношению к TH и Phox2b, в то время как мечение vAChT способствовало пространственной ориентации относительно рострокаудальных, дорсовентральных и медиолатеральных координат. Мы обнаружили, что все иммунореактивные TH и мРНК-позитивные нейроны GalR1 в NTS были иммунореактивными Phox2b-GFP, но не все иммунореактивные нейроны Phox2b-GFP в NTS были иммунореактивными или GalR1 мРНК-положительными (рис. 4). Кроме того, мы продемонстрировали, что мРНК для рецептора низкой распространенности GalR1 отсутствует в иммунореактивных нейронах TH и vAChT.
В свежезамороженных препаратах, в сочетании с зондовым анализом FISH, успех ВПХ зависел от субклеточного расположения белка-мишени. Например, vAChT (белок, связанный с мембраной синаптического везикула) был четко иммуномечен, в то время как TH и GFP (цитоплазматические белки) были неопределенно иммуномечены и наблюдались лишь слабо (рис. 4). Мы описываем эту неопределенную маркировку как «флокулянтную», потому что клетки не имеют четких очертаний и их трудно отличить от фона. На том же срезе свежезамороженной ткани зонд GalR1 FISH метил цитоплазматическую мРНК GalR1 точечно и отчетливо наблюдал (рис. 4).
Кроме того, поскольку антитела к ТГ и вахт вырабатываются в одном и том же организме, оба белка были помечены с использованием одного и того же вторичного антитела и, следовательно, флуорофора одного и того же цвета (свет возбуждения: 594). Их легко отличить по двум причинам: они никогда не мечатся в одних и тех же нейронах, и субклеточная локализация этих белков различна; вахт в везикулах, имеющих точечный вид, и ТГ в цитоплазме и нейрональных отростках.
Для подтверждения нашей гипотезы о том, что качество ИГХ (в свежезамороженных препаратах) зависит от субклеточной локализации белка, мы сравнили мечение мРНК Phox2b (расположенной в цитоплазме), GFP (сверхэкспрессируемой в цитоплазме) и белка Phox2b (в основном находящегося в ядре) в нейронах. Как и ожидалось, наши результаты показывают перекрытие мечения мРНК Phox2b, GFP и антител Phox2b в отдельных нейронах NTS (рис. 5). Клетки с цитоплазматическим мечением мРНК коррелировали с клетками, демонстрирующими ядерное мечение белка Phox2b, что обеспечивало валидацию комбинированного метода FISH-IHC. Несмотря на то, что цитоплазматический Phox2b-GFP имел хлопьевидный вид, сигнал ядерного белка Phox2b был четким и специфичным. В заключение, при сочетании с FISH на свежезамороженных препаратах мембраносвязанные белки, включая vAChT и Phox2B, демонстрируют более высокое качество иммуномечения, чем цитоплазматические белки.
В отличие от этого, ИГХ была надежной независимо от субклеточной локализации, когда выполнялась на фиксированных замороженных срезах в сочетании с FISH. Мультиплексное исследование FISH для мРНК GlyT2 и мРНК Phox2b прошло успешно, как показано на рисунке 6. МРНК-позитивные нейроны GlyT2 располагались вентрально по отношению к NTS, а не внутри NTS. Нейроны GlyT2+ и Phox2b+ не локализуются. Субпопуляция нейронов Phox2b+ NTS была иммунореактивной и ни одна из них не содержала мРНК GlyT2. Иммунореактивные нейроны TH проявляются на одном и том же участке ткани, демонстрируя положительно меченую сому и нейрональные процессы (рис. 6). Это контрастирует с «флокулянтным» внешним видом иммунореактивных нейронов TH в свежезамороженных срезах ткани. Таким образом, описанный здесь фиксированный замороженный препарат является альтернативным методом подготовки тканей, который позволяет надежно таргетировать цитоплазматические белки иммуногистохимически в сочетании с РНК-скопом.
Рисунок 3: Репрезентативные микроскопические изображения с корональных срезов переднего мозга мышей на уровне латеральной перегородки (от 1,1 до -0,1), показывающие маркировку положительных и отрицательных контрольных зондов . (А) Отсутствие сигнала после ISH с бактериальной 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатредуктазой (DapB) подтверждает отсутствие фоновых сигналов. (B) Маркировка с помощью положительных контрольных зондов, нацеленных на убиквитин С (UBC), пептидилпропилизомеразу B (PPIB) и РНК-полимеразу 2a (POLR2A), иллюстрирует сигнал, который следует ожидать от мишеней с высокой, умеренной и низкой численностью соответственно. Масштабные линейки имеют длину волны 50 мкм. Все изображения были получены с помощью 20-кратного объектива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные микроскопические изображения свежезамороженного коронального среза ствола мозга у мыши Phox2b-GFP, показывающие комбинированное мечение мРНК GalR1 (FISH) и 3 белков (IHC) в ядре области солитарного тракта (NTS). Вставки в А увеличены в В. МРНК GalR1 обозначается точечной маркировкой зонда FISH (стрелками). Антитела, нацеленные на цитоплазматические белки GFP и тирозингидроксилазу (TH), демонстрировали «флокулентную» маркировку (стрелки). Продемонстрирована иммунореактивность везикулярного транспортера ацетилхолина (vAChT) (мечение красным пунктатом) в подъязычном ядре (XII). Масштабные линейки составляют 100 мкм в точке A и 25 мкм в точке B. Все изображения были получены с помощью 20-кратного объектива. Другие сокращения: область пострема (АП), медиальное вестибулярное ядро (МВе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные микроскопические изображения свежезамороженного коронального среза ствола мозга у мыши Phox2b-GFP, иллюстрирующие нацеливание Phox2b в ядре солитарного тракта (NTS) с помощью трех различных подходов: Phox2b мРНК (FISH), GFP (IHC) и белка Phox2b (IHC). Белок Phox2b локализуется в ядре. Вставки в А увеличены в В. Стрелками обозначены нейроны, которые трижды помечены зондом Phox2b (оранжевый-550), антителом GFP (зеленый-488) и антителом Phox2b (красный-647). Масштабные линейки составляют 100 мкм в точке A и 25 мкм в точке B. Все изображения получены с помощью 20-кратного объектива. Другие сокращения: area postrema (AP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Репрезентативные изображения фиксированных замороженных срезов коронального ствола мозга, демонстрирующие успешную FISH в сочетании с надежным иммуномечением цитоплазматических белков (тирозингидроксилаза [ТГ]). Двойной FISH, показывающий мечение мРНК транспортера глицина 2 (GlyT2-red-647, заполненные наконечники стрелок) и Phox2b (желтый-550, стрелки) в ядре области солитарного тракта (NTS). FISH комбинировали с ИГХ для белка TH (blue-346, пустые наконечники стрел). Вставки в A увеличиваются в B. Масштабные линейки составляют 25 мкм. Все изображения были получены с помощью 20-кратного объектива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Первичные антитела или РНК-зонд | Вторичное антитело или Amp 4-FL-Alt Дисплейный модуль |
Возбуждение (нм) | Подготовка тканей | ||
| Рисунок 3 | зонд | ПОЛР2А (С1) | Amp 4-FL-Alt B Дисплейный модуль | 647 | свежезамороженный |
| зонд | PPIB (C2) | Amp 4-FL-Alt B Дисплейный модуль | 488 | ||
| зонд | UBC (C3) | Amp 4-FL-Alt B Дисплейный модуль | 550 | ||
| зонд | DapB (C1, C2, C3) | Amp 4-FL-Alt B Дисплейный модуль | 647, 488, 550 | ||
| ДАПИ | 346 | ||||
| Рисунок 4 | антитело | кролик-анти-GFP | Осел-Анти-Кролик | 488 | свежезамороженный |
| антитело | овцы-анти-ТН | ослик-антиовца | 647 | ||
| антитело | козел-анти-вахт | Осел-Антикоза | 647 | ||
| зонд | GalR1 (C1) | Amp 4-FL-Alt B Дисплейный модуль | 550 | ||
| ДАПИ | 346 | ||||
| Рисунок 5 | антитело | кролик-анти-GFP | Осел-Анти-Кролик | 488 | свежезамороженный |
| антитело | мышь-анти-Phox2b | Осел-Анти-Мышь | 647 | ||
| зонд | Фокс2б (С2) | Amp 4-FL-Alt A Дисплейный модуль | 550 | ||
| ДАПИ | 346 | ||||
| Рисунок 6 | антитело | мышь-анти-ТН | Осел-Анти-Мышь | 346 | неподвижный |
| зонд | ГлиТ2 | Amp 4-FL-Alt A Дисплейный модуль | 647 | ||
| зонд | Phox2b | Amp 4-FL-Alt A Дисплейный модуль | 550 |
Таблица 1: Зонд FISH, антитела и соответствующие комбинации флурофоров, используемые на рисунках 3-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нейронауках FISH и IHC обычно используются для исследования пространственной организации и функциональной значимости мРНК или белков в субпопуляциях нейронов. Протокол, описанный в этом исследовании, повышает способность к одновременному обнаружению мРНК и белков в отделах мозга. Наш комбинированный мультиплексный анализ FISH-IHC позволил провести фенотипическую идентификацию различных субпопуляций нейронов в NTS как в свежезамороженных, так и в фиксированных препаратах мозга. FISH-IHC в фиксированных замороженных тканевых препаратах обеспечивал достоверные результаты ВПХ. Например, мультиплексное исследование FISH для мРНК с низкой и высокой распространенностью (GalR1 и GlyT2 соответственно) и IHC (таргетирование тирозингидроксилазы) показало, что GalR1 и GlyT2 экспрессируются в некатехоламингических нейронах NTS. ИГХ для ТГ не был успешным в свежезамороженных тканях, что подчеркивает ограниченную способность FISH-IHC в свежезамороженных препаратах.
ISH может быть более подходящим, чем IHC, в ряде сценариев. Во-первых, ИГХ может плохо работать при обнаружении белков с низкой распространенностью, таких как рецепторы. Использование ISH для нацеливания на мРНК с относительно высокой численностью для этих белков улучшает обнаруживаемость1. Во-вторых, белки, такие как нейропептиды, часто транспортируются к аксональным окончаниям после трансляции в клеточной соме19. Когда нейропептиды воздействуют на ВПХ, аксональные отростки и терминали клеток помечаются антителом, но не сомой, что снижает способность идентифицировать исходную клетку или проводить количественный анализ количества клеток. Однако, поскольку мРНК, кодирующие все белки, локализованы в соме, метод ISH является преимуществом. Наконец, антитела не всегда доступны для некоторых видов белков, или имеющиеся антитела подходят для других методов протеомики (например, вестерн-блоттинга), но не для ВПХ. В этих условиях методы мечения мРНК оказываются полезными. Предостережение заключается в том, что мРНК не всегда могут быть транстранслированы в белок, и поэтому они обеспечивают только прокси для идентификации белка. Поскольку коммерческие наборы FISH могут быть дорогостоящими, а зонды ISH с меньшей вероятностью будут коммерчески доступны по сравнению с антителами, сочетание FISH с IHC представляет собой эффективную с точки зрения затрат и времени стратегию для увеличения количества мишеней, которые могут быть помечены одновременно.
Препарирование свежезамороженных тканей по сравнению с фиксированными тканями было фактором, обеспечивающим успешное ИГХ после FISH-зондового анализа. Мы протестировали ИГХ с использованием антител, нацеленных на ядерные, везикулярные и цитоплазматические белки, и обнаружили надежное мечение мембраносвязанных белков (vAChT и Phox2b) на свежезамороженных образцах, но не цитоплазматических белков (TH и GFP). Коэкспрессия белка Phox2b и мРНК с «флокулянтной» мечением Phox2b-GFP подтвердила, что нейроны, экспрессирующие транскрипт, также экспрессируют родственный белок, подтверждая нейрохимическую идентичность нейронов (рис. 5). Напротив, фиксированные замороженные тканевые препараты давали надежное мечение ИГХ независимо от субклеточной локализации антигена. Предыдущие исследования показали, что предварительная обработка протеазой (например, проназой 8,20) может оказывать пагубное влияние на ВПХ. Содержимое раствора протеазы, используемого в протоколе RNAscope, является проприетарным, и для доступа зонда RNAscope в клетки рекомендуется пермеабилизация протеазой. Маркировка цитоплазматических белков с помощью описанных здесь антител была ранее проверена на свободно плавающих 30 мкм фиксированных замороженных срезах мозга мышей 10,21,22. Мы установили неподвижные образцы толщиной 30 мкм и выполнили протокол FISH-IHC, в отличие от свежезамороженных срезов толщиной 14 мкм, рекомендованных производителем. При отсутствии модификаций анализа или изменения других переменных (извлечение антигена, более высокая концентрация антител, изменение протеазы) достоверная ВПХ была достигнута на толстых, фиксированных образцах с продемонстрированным мечением цитоплазмы и аксональных процессов вместе с мечением зондов FISH (рис. 6). В то время как аналогичные подходы использовались другими исследовательскими группами 7,8,9, в настоящем исследовании был достигнут комбинированный ISH-IHC на нейронах и во флуоресцентной установке.
В методах был ряд критических шагов, на которые следует обратить внимание. Для свежезамороженного препарата время фиксации не должно превышать 15 минут; Более длительное время фиксации приводило к более высокой фоновой маркировке. Этап протеазы был оптимизирован, так как ткани разной толщины и из разных органов требуют разных типов протеазы для достижения пермеабилизации. Фиксированные замерзшие секции меньше прилипают к предметным стеклам и легче смещаются во время мойки. Следовательно, необходимо проявлять особую осторожность при ручной обработке неподвижных замороженных участков, чтобы избежать потери или повреждения тканей.
Несмотря на то, что мы обнаружили, что комбинированная стратегия FISH и IHC является эффективной, к недостаткам можно отнести стоимость и технически сложные анализы при сочетании этих двух методов. Одним из ограничений исследования является то, что параллельное сравнение двух протоколов подготовки тканей не проводилось. Кроме того, наша оценка результатов была ограничена количеством каналов, которые мог вместить эпифлуоресцентный микроскоп; Настройка позволяла использовать максимум 4 канала одновременно: 346, 488, 550 и 647 нм (возбуждающий свет). Нам удалось добиться мультиплексного мечения 5 мишеней, пометив два белка с разной субклеточной локализацией с помощью одного и того же флурофора (рис. 4, табл. 1). С помощью конфокального микроскопа дискретное возбуждение многих дополнительных флуорофоров может быть использовано для мечения отдельных белков с помощью ИГХ или для визуализации флуоресцентных молекул, экспрессируемых трансгенами.
Комбинация FISH и флуоресцентного ИГХ может снизить надежность каждого метода по отдельности. В будущем мы стремимся улучшить мечение цитоплазматических белков на свежезамороженных тканях с помощью метода извлечения антигена23. Предыдущие исследования показывают, что извлечение антигена, индуцированного теплом, увеличивает доступность белкового эпитопа24,25,26. Термическая обработка расщепляет сшитые и метилольные группы белка и разворачивает антигены в тканях, обнажая эпитопы, которые в противном случае были бы скрыты в третичной белковой структуре в биологических условиях. Такая доступность может повысить успешность мечения белков26,27. Кроме того, мы будем нацеливаться на разные эпитопы одного и того же цитоплазматического белка, чтобы определить, зависит ли успех мечения белок-антитела от конкретных используемых клонов антител.
В заключение, комбинация FISH и IHC полезна для нейрохимической идентификации гетерогенных популяций клеток в головном мозге, таких как в NTS. В этом исследовании представлены два протокола, анализирующих различные препараты тканей ствола мозга мышей - свежезамороженные или фиксированные - для одновременного мультиплексного флуоресцентного мечения мРНК и белков in situ. Оба протокола могут широко применяться для обнаружения паттерна экспрессии мРНК с низкой численностью, таких как GalR1. Толстые (30 мкм) фиксированные замороженные препараты, пермеабилизированные протеазой, обеспечивали более надежное обнаружение цитоплазматических белков и больше проблем с тканями по сравнению с тонкими (14 мкм) свежезамороженными препаратами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована грантом Австралийского исследовательского совета Discovery Project DP180101890 и грантом проекта Фонда медицинских исследований Ребекки Л. Купер PG2018110
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A.
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
