Summary
该方法可用于使用多能干细胞衍生心肌细胞与荧光标记肉瘤蛋白来检查肉瘤缩短。
Abstract
多能干细胞衍生心肌细胞（PSC-CMs）可以同时从胚胎干细胞和诱导多能干细胞（ES/iPS）细胞中产生。这些细胞为心脏病建模提供了有希望的来源。对于心肌病，肉瘤缩短是标准生理评估之一，用于成人心肌细胞检查其疾病表型。然而，现有的方法不适合评估PCS-CM的收缩性，因为这些细胞的肉瘤发育不全，在相对比显微镜下是看不见的。为了解决这个问题，并用PCC-CMs进行肉瘤缩短，使用了荧光标记的肉瘤蛋白和荧光活成像。细 Z 线和 M 线分别位于肉瘤的两端和中心。Z线蛋白 - α-Actinin （ACTN2）、电传素 （TCAP） 和与 ACTIN 相关的 LIM 蛋白 （PDLIM3） 和一种 M 线蛋白-肌素-2 （Myom2） 被标记为荧光蛋白。这些标记的蛋白质可以从内源性等位基因作为敲击或腺相关病毒 （AAV） 表达。在这里，我们介绍了将小鼠和人类多能干细胞分化到心肌细胞、产生 AAV 以及执行和分析活成像的方法。我们还描述了为 PSC-CM 的图案培养物生产聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 邮票的方法，这有助于分析带有荧光标记的蛋白质的肉瘤缩短。为了评估肉瘤缩短，在电刺激（0.5-1 Hz）下，以高帧速率（每秒50-100帧）记录了跳动细胞的延时图像。为了分析细胞收缩过程中的肉瘤长度，录制的延时图像受制于 SarcOptiM，这是 ImageJ/Fiji 的插件。我们的战略为研究 PSC-CMs 中的心脏病表型提供了一个简单的平台。
Introduction
心血管疾病是全世界1人死亡的主要原因，心肌病是心脏相关死亡的第三大原因。心肌病是影响心脏肌肉的一组疾病。诱导多能干细胞（iPS）细胞的最新发展以及iPS细胞对心肌细胞（PSC-CMs）的定向分化，为研究作为心肌病体外模型的患者基因组心肌细胞打开了大门。这些细胞可用于了解心脏病的病理生理学，阐明其分子机制，并测试不同的治疗候选者3。因此，产生了大量的兴趣，因此，产生了患者衍生的iPS细胞（例如，肥大性心肌病[HCM]4，5，心律失常右心室心肌病[ARVC]6，扩张性心肌病[DCM]7，和线粒体相关心肌病8，9）。因为心肌病的特征之一是肉瘤功能障碍和紊乱，因此需要一种能统一测量肉瘤功能的有效工具。
肉瘤缩短是评估肉瘤功能和从动物模型和人类衍生的成人心肌细胞收缩性最广泛使用的技术。要执行肉瘤缩短，需要在相对比下可见的发达肉瘤。然而，PSC-CMs培养的体外显示器不发达和混乱的肉瘤，因此，不能用于正确测量肉瘤缩短10。这种难以正确评估PCS-CMs收缩性的问题阻碍了它们作为体外评估心脏功能的平台的使用。为了间接评估PCS-CMs收缩性，原子力显微镜、微柱阵列、牵引力显微镜和阻抗测量被用来测量这些细胞对周围环境的运动效果。更复杂和侵入性较小的视频显微镜记录的实际细胞运动（例如，SI8000从索尼）可以用来替代评估其收缩性，但是，这种方法不能直接测量肉瘤运动或力生成动能14。
为了直接测量PCC-CMs中的肉瘤运动，新的方法，如荧光标记到肉瘤蛋白，正在出现。例如，Lifeact 用于标记丝状活性素 （F-actin） 来测量肉瘤运动15、16。转基因iPS细胞是另一种选择标记肉瘤蛋白（例如，α-actinin[ACTN2]和Myomesin-2[MYOM2]）由荧光蛋白17，18，19。
在本文中，我们描述了如何使用 Myom2-TagRFP（小鼠胚胎干细胞 [ES] 细胞） 和 ACTN2-mCherry（人类 iPS 细胞）执行测量肉瘤缩短的延时成像。我们还表明，有图案的文化有助于肉瘤的排列。此外，我们使用腺相关病毒 （AAV） 描述肉瘤标记的替代方法，该病毒可广泛应用于患者衍生的 iPS 细胞。
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Protocol
1. 小鼠多能干细胞的分化
- 维护鼠标 ES 单元格
- 维护介质：混合 50 mL 的胎儿牛血清 （FBS）、5 mL 的 L-丙氨酸-L-谷氨酰胺、5 mL 的非必需氨基酸 （NEAA）、5 mL 的 100 mM 皮鲁瓦酸钠和 909 μl 的 55 mM 2-默卡普托乙醇与 450 mL 格拉斯哥最低基本介质 （GMEM）.。补充白血病抑制因子 （LIF）、CHIR-99021 和 PD0325901，最终浓度分别为 1000 U/mL、1 μM 和 3 μM。通过 0.22 μm 过滤器对介质进行消毒。
- FBS 介质：混合 55 mL 的 FBS、5.5 mL 的 L-丙氨酸-L-谷氨酸、5.5 mL 的皮鲁瓦酸钠和 5.5 mL 的 NEAA 到 500 mL 的杜尔贝科改性鹰介质 （DMEM） 高葡萄糖。通过 0.22 μm 过滤器将介质过滤器过滤以消毒。
- 培养SMM18小鼠ES细胞，其中TagRFP被敲入 Myom2 细胞在明胶化6厘米的盘在维护介质，如前所述18。每2-3天通过一次。
- 无血清分化 （SFD） 介质的准备
- 基础 SFD： 混合 250 mL 的火腿的 F-12， 750 mL 的伊斯科夫的修改杜尔贝科的中等 （IMDM）， 10 mL 的 B27 补充减去维生素 A， 5 mL 的 N2 补充剂， 10 mL 的 L -丙氨酸-L-谷氨酰胺， 5 mL 的 10% 牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲盐水 （PBS）， 和 10 mL 青霉素和链霉素 （10，000 U/mL）.过滤通过 0.22 μm 过滤器进行消毒。
- 在蒸馏水中以 5 毫克/毫升溶解抗坏坏酸，并通过 0.22 μm 过滤器进行消毒。
- 稀释 13 μL 的 1-硫化醇到 1 mL 的 IMDM。在此处，请将此稀释的 1-硫柳称为 MTG。
- 在使用当天加入 10 μL 的抗坏坏精酸 （5 毫克/兆升） 和 3 μL 的 MTG 至 1 mL 的基础 SFD。在此，请将此混合物称为完整的 SFD。
- 第 0 天， 胚胎体 （EB） 形成进行分化
- 收获SMM18小鼠ES细胞与重组试金素样蛋白酶（rTrypsin），并计算细胞。
- 离心机 5 x 105 细胞在 300 x g 3 分钟在 4 °C， 在 10 mL 的完整 SFD 中重新悬浮， 并种子成 10 厘米的培养皿。在 37 °C 和 5% CO2 下培养细胞，达到 50 小时。
- 差异化第 2 天
- 加入Activin A、人类血管内皮生长因子（hVEGF）和骨形态遗传蛋白4（BMP4），分别以5 ng/mL、5 ng/mL和1.9 ng/mL的最终浓度完成SFD。
注意：BMP4 浓度可能因 BMP4 的批次而异。在使用新批次之前，在小规模试验中测试多个浓度，并确定心脏分化的最佳浓度。 - 将 BB 从培养皿转移到 15 mL 管和离心机 50-100 x g 在 3 分钟在 4 °C。
- 同时，将第 1.4.1 步准备的介质添加到培养皿中，以保护剩余的 BB 干燥。
- 从 15 mL 管中吸气超纳特，用培养皿中的介质重新吸管 EB，并将 EB 溶液传输回盘中。然后，在 37 °C 和 5% CO2 下培养 46 小时的 4B。
- 加入Activin A、人类血管内皮生长因子（hVEGF）和骨形态遗传蛋白4（BMP4），分别以5 ng/mL、5 ng/mL和1.9 ng/mL的最终浓度完成SFD。
- 差异化第 4 天
- 用 5 到 10 mL 的 0.1% 明胶将 10 厘米组织培养处理的菜肴明胶化至少 5 分钟。在播种细胞之前，先吸气明胶。
- 准备介质：混合基本成纤维细胞生长因子 （bFGF）、FGF10 和 hVEGF，分别以 5 ng/mL、25 ng/mL 和 5 ng/mL 的最终浓度完成 SFD。对于 10 厘米的菜肴，准备 10 mL。
- 将细胞从培养皿转移到 15 mL 管中。将 5 mL 的 PBS 添加到培养皿中，洗几次，然后转移到 15 mL 管中收集剩余的细胞。离心机在 50-100 x g， 4 °C， 3 分钟.
- 吸气超高，加入1兆L的瑞普辛，并在37°C孵育3分钟。
- 漩涡短暂分离 BB，加入 9 mL 的 10% FBS 介质，再次旋转，并计算细胞。
- 离心机 1.5 x10 7 细胞在 300 x g， 4 °C 3 分钟， 与媒体重新暂停准备第 1.4.2 步， 和种子到明胶化盘.在 37 °C 和 5% CO 2 下孵育2 天。
注：到第7天或第8天，可以看到PCS-CMs的广泛殴打。
- 药物选择在分化日7和9：用纯霉素（2微克/mL在最终浓度）重新喂养介质，以消除非心肌细胞在第7天和第9天的分化。
注：SMM18的亲系系是syNP4小鼠ES细胞，含有NCX1促进剂驱动的纯霉素耐药基因20。 - 第10天，为未来的实验重新镀板
- 涂上玻璃底培养板或含有聚合物盖片的 35 毫米成像盘，配以 0.1% 的明胶。为了提高成熟度，在室温18下，将盘子涂上层压素-511 E8片段（LN511-E8），在1微克/厘米2下30-60分钟。要培养特定兴趣模式的 PSC-CM，请参阅准备聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 邮票的第 4 步和第 5 步。
- 要收获 SMM18 PSC-CMs，请用 PBS 洗两次菜，涂抹 1 mL 的 rTrypsin，并在 37 °C 下孵育 3 分钟。
- 在 10% FBS 介质的 9 mL 中收集细胞，暂停并计数细胞。将细胞在 50，000-100，000 个细胞中平放在 24 井板的一口井中，或在 35 mm 成像盘中将 250，000-500，000 个细胞镀在一个井中。
- 离心足够的细胞（300 x g，3分钟），并重新使用完整的SFD补充FBS的细胞（最终浓度为10%）。
- 一夜之间孵育，改变培养基，用纯霉素完成SFD。
- 从第 14 天起，每周更改文化介质两到三次，并配备完整的 SFD，直到第 21-28 天，Myom2-RFP 变得突出。有关基于 AAV 的荧光标记肉瘤蛋白的转导，请参阅第 3 步。
2. 人类多能干细胞的分化
- 差异化媒体的准备
- RPMI+B27-Ins：混合500 mL的RPMI 1640中等，10 mL的B27减去胰岛素，和5.25mL的L-丙氨酸-L-谷氨酰胺。
- RPMI+B27+Ins：混合500 mL的RPMI，10mL的B27补充剂，和5.25mL的L-丙氨酸-L-谷氨酰胺。
- 维护人类 iPS 细胞
- 通过人类iPS细胞每周两次与AK02N在LN511-E8遵循先前公布的方法与一些修改21。
- 收获细胞与3分钟治疗的rTrypsin，并收集到10%的FBS介质。在 4 °C 下将细胞和离心机计数在 300 x g 3 分钟。 种子 75，000-125，000 细胞在一井 6 井板与 2 mL AK02N 补充 LN511-E8 和 Y27632 在最终浓度 0.5 μg/mL （0.1 μg/cm2）和 10 μM， 分别.
- 在 37 °C 和 5% CO2 下孵育，第二天在没有任何补充的情况下用 2 mL 的 AK02N 替换介质。每两到三天更换一次媒体，每三到四天通过一次媒体。
- 第 4 天：分化前重新镀
- 涂上 6 井板，在 PBS 中稀释0.5 μg/cm 2 LN511-E8。然后，在 37 °C 下孵育至少 30 分钟，在室温下孵育 5% CO2 或 1 h。播种细胞前的吸气涂层溶液。
- 用 rtrypsin 采集人类 iPS 细胞，并像第 2.2.2 步一样计算细胞。
- 离心机 1.25 x10 5 细胞，用于 300 x g 的 6 井板井，在 4 °C 下 3 分钟，在 2 mL 的 AK02N 补充剂中重新悬浮 LN511-E8（最终浓度为0.5微克/兆升或0.1微克/厘米2）和Y27632（最终浓度为10微米）每口井。
- 吸气涂层溶液，种子将细胞重新吸收到涂层板中，并在37°C和5%CO2下孵育。
- 天 -3 和 -1： 用 2 mL 的 AK02N 替换介质。
- 第 0 天：用 RPMI+B27-Ins 的 2 mL 替换介质，每口井补充 CHIR99021（最终浓度 6 μM），以开始分化。
- 第 2 天：用每口井 2 mL 的 RPMI+B27-Ins 替换介质，并更换为 WntC59（最终浓度 2 μM）。
- 第 4 天：每口井用 2 mL 的 RPMI+B27-Ins 替换介质。
- 第 7 天和第 9 天：用每口井的纯霉素（最终浓度为 10 μg/mL）替换介质，以选择性地培养 PSC-CMs。
注：本研究中使用的ACTN2-mCherry线有一盒内部核糖体进入部位（IRES），将纯霉素耐药基因插入TNNT2细胞的3+未翻译区域（UTR），并取代了ACTN2的停止结肠。要净化心肌细胞而不敲击，请参阅步骤 3 和 4。 - 第10天：为未来的实验重新镀板
- 用聚合物盖片涂抹 35 毫米成像盘，0.5-1 μg/cm2 的 LN511-E8 稀释成 0.1% 明胶。在室温下孵育 2-4 小时，以获得长期生存能力。要在所需的模式下培养 PSC-CM，请参阅步骤 4 和 5 以准备 PDMS 邮票。
- 要收获人类PSC-CMs，用PBS洗两次菜，每口井涂抹1毫微米脱的瑞普辛，并在37°C下孵育3分钟。
- 以 10% FBS 介质的 4 mL 收集细胞，暂停并计数细胞。每35毫米成像盘的板250，000-500，000个细胞。
- 在 300 x g 下离心足够数量的细胞，在 4 °C 下 3 分钟，用 RPMI+B27+Ins 与纯霉素 （10 μg/mL） 进行再吸纳，并在涂层的 35 毫米成像盘上重新使用板材。
- 孵化过夜。第二天早上，用RPMI+B27+Ins替换培养基，用纯霉素（10微克/mL）。
- 从第 14 天起，每周使用 RPMI+B27+Ins 更改培养介质 2-3 次，直到第 21-28 天进行成像。有关基于 AAV 的荧光标记肉瘤蛋白的转导，请参阅第 3 步。
3. 使用腺相关病毒对肉瘤进行荧光标记
- AAV 生产前的准备
- 在 DMEM 中保持 HEK293T 细胞，在 10 厘米的组织培养板上辅以 FBS（最终浓度 10%）。通道细胞每周三次。
- 以 1 毫克/毫升的速度准备聚乙酰氨基氨基胺 （PEI）。混合50毫克聚苯丙胺MAX 40000和40ml的超纯水。使用 1 N NaOH 将 pH 值调整为 7.0。然后，用超纯水将最终体积达到 50 mL，并通过 0.22 μm 滤网过滤。
- 准备一个穿梭载体与肉瘤标记基因（如，TCAP或PDLIM3融合与绿色荧光蛋白[GFP]），由心肌细胞特异性促进剂，如心脏肌肽T（cTNT）22驱动。
注：在这种情况下，我们使用单体增强GFP与V163A，S202T，L221V23的突变。
- 第 0 天， 通道赫克细胞
- 当细胞到达汇合点时，通过 2.0 x 107 HEK293T 细胞到 15 厘米组织培养板，20 mL DMEM，10% FBS。
- 第 1 天，转染
- 混合 13.5 μg 的穿梭载体，26 μg 的 pHelper（腺病毒的矢量编码 E2A、E4 和 VA）、16.5 μg 的 pRC6（矢量编码 AAV2 代表和 AAV6 Cap 基因）和 1 mL 的 DMEM 无丙状钠 （DMEM-Pyr）。
- 混合 224 μL 的 PEI （1 毫克/mL， 在步骤 3.1.2 中准备） 和 776 μL 的 DMEM-Pyr。
- 在室温下混合并孵育质粒溶液和 PEI 溶液 30 分钟。
- 将质粒/PEI 溶液添加到第 3.2 步准备的 HEK293T 电池中。
- 第 2 天，中等变化
- 转染后 24 小时，将介质更改为 DMEM-皮尔。培养细胞，直到收获AAV的第7天。AAV 将发布到文化媒体中。
- 第 7 天，使用最小纯化方法24进行 AAV 收集、集中和缓冲替代
- 在室温下在 PBS 中用 5 mL 的 1% BSA 孵化离心超滤单元（10 万分子重量切断 [MWCO]），持续 15 分钟。然后，将超滤装置以 500 x g 离心 2 分钟，并吸气过滤和剩余的溶液。
- 将介质从产生 AAV 的 15 厘米盘转移到新的 50mL 圆锥管和离心机（500 x g，5 分钟）。通过 0.45 μm 注射器过滤超强的过滤器，以去除细胞碎片，并将悬浮液应用到超滤单元中。
- 离心机在 2000 x g 90 分钟或直到集中培养超高 0.5 到 1 mL。
- 吸气过滤液，将 15 mL 的 PBS 涂抹到超滤单元中。
- 重复离心，直到浓缩物变成 0.5-1 mL。
- 重复 3.5.4 和 3.5.5。
- 将浓缩 AAV 转移到新的 1.5 mL 管中，并在 4 °C 或 -20 °C 下存储。
注：AAV 可用于 P1 设施，但可遵守当地法规。AAV 也可以用传统方法生产。
- AAV 滴答器的计算
- 混合 5 μL 的 AAV， 195 μL 的 DMEM-皮尔， 和 10 U 的苯甲酸酯和孵育在 37 °C 为 1 小时.
- 加入200微升蛋白酶K缓冲液（0.02 M Tris HCl和1%SDS）和5微升蛋白酶K（20毫克/兆升），在37°C孵育1小时。
- 小心地准备 400 μL 的 25：24：1 酚/氯仿/异酰酒精溶液，1 分钟的漩涡和 1 分钟的离心机 20，000 x g。
- 将200微升的输液阶段转移到一个新的1.5mL管，这将产生大约一半的原始AAV基因组。
- 加入 1 μL 的糖原 （20 毫克/兆升） 到 20 μL 的 3 M CH3COONa （pH 5.2） 和漩涡。再次加入 250 μL 的 2-丙醇到 100 μL 的 100% 乙醇和漩涡。
- 在 -80 °C 下孵育 15 分钟。然后离心机在 20，000 x g 30 分钟在 4 °C.
- 吸气超高，并在管中加入70%乙醇。然后，离心机在 20，000 x g， 4 °C 5 分钟。
- 吸气超高，空气干燥，直到颗粒变得清晰。
- 加入200微升的三甲基乙酰酸（TE;pH 8.0）来解决AAV基因组问题。然后，用 TE 稀释样品 100 倍。
- 使用 TE 以 6.5 ng/μL 的速度准备 pAAV-CMV-矢量标准，以获得 109 个向量基因组 （vg）/ μL。然后，用 TE 将 10 倍稀释从 104 到 108 进行一系列。
- 混合 1 μL 的样品 DNA（或标准）、0.4 μL 的引漆 （5 μM）、3.6 μL 蒸馏水和 5 μL 的 SYBR 绿色主混合物。引数位于 ITR 上，是 5+-GGAACCCTAGGGGGT-3+ 和 5+CGGCCTCAGGGAGGG-3+
- 执行具有以下条件的实时 PCR：初始电度为 95 °C（60s），40 周期的变性为 95 °C（15s），退火和延长为 60 °C（30s），然后是熔化曲线。
- 根据标准和 Ct 值，实时 PCR 机器提供样本 1 μL 的矢量基因组副本数。使用以下方程计算原始 AAV 滴答声：由实时 PCR （vg/μL） x 8 x 103 x 2 提供的副本编号，其中 8 x 103 作为 AAV 基因组分离期间的稀释因子，2 作为 AAV（单链）和质粒（双链）的差分因子。
- 转导到 PSC-CM
- 将 PSC-CM 数入额外的井或额外的菜中。
- 稀释 AAV （1 x 104 到 1 x 106 vg/cell）， 以弥补 50 μL 与 PBS。将 AAV 应用于 1 x 104 到 1 x 106 vg/cell 的感染倍数 （MOI）， 在小鼠和人类 PSC-CM 的相应区分介质中使用 AAV 进行 3 天，然后将介质更改为没有 AAV 的文化介质。
- 转导后 7 天或更后使用 PSC-CM 进行活细胞成像。
4. [可选] 基于 AAV 的 PSC-CM 净化
- AAV 的准备
- 使用在 cTNT 促进器控制下表达抗爆霉素基因的穿梭载体准备第 3 步中描述的 AAV。
- 转导到区分 iPS 细胞
- 在第 2 步中描述的协议之后，将人类 iPS 细胞分化 4 天，并计算额外井中的细胞数量。
- 在第 4 天更改介质后，在 1 x 105 vg/cell 的 MOI 中应用 AAV，以区分 RPMI+B27-Ins 介质中的 PSC。
- 在第 7 天，用 RPMI+B27+Ins 刷新介质，并添加 2.5-10 μg/mL 的爆破剂。
- 在第 10 天，PSC-CM 已准备好重新镀版。
5. 准备PDMS邮票
- 使用计算机辅助设计 （CAD） 绘图软件设计 200 μm 条的设备图案以及条带之间的 10-25 μm 凹槽。
- 使用无面具光刻工具的紫外线将设备图案绘制到涂有AZP1350的铬光面上。
- 在一系列正光电图开发人员（例如铬等）中开发光面罩上的图案，并用 DI 水冲洗。
- 在 120 °C 的热板上脱水硅片 15 分钟。
- 允许晶圆冷却到室温，并旋转涂上负光照器 SU-8 3010，使用旋转涂层使高度为 10-20 μm，30s 为 1500 rpm。
- 根据制造商的协议，在热板上用两步软烤晶圆。
- 晶圆冷却到室温后，将晶圆加载到面膜对齐器上。
- 使用面膜对齐器对齐晶圆上的面膜，使晶圆暴露在紫外线下。
- 根据制造商的协议，在热板上分两步进行曝光后的晶圆烘烤。
- 在一系列 SU-8 开发人员和 2-丙醇中开发晶圆，然后用氮流干燥晶圆。
- 将晶圆转移到大小合适的培养皿中。
- 将PDMS弹性体及其固化剂以10：1 w的比例混合，并将混合物倒入培养皿中。
- 将 PDMS 在干燥器中除气，直到所有气泡消失，然后在 80 °C 的热板上治疗 PDMS 2 小时。
- 使用钳子将腌制的 PDMS 从主模具中剥离出来，然后用设计切出该部分作为 PDMS 邮票。
注：形状可以是方形的，但是，八角形在边缘更好地转移图案。
6. 多能干细胞衍生心肌细胞的模式培养
- 使用修补胶带清除 PDMS 邮票表面的灰尘。
- 将邮票浸入 70% 乙醇中消毒。然后，使用空气除尘器将乙醇从邮票表面吹走。
- 在PDMS邮票表面涂抹 5-10 μL 的 0.5 wt% 2 甲基甲基乙基磷酸酯 （MPC） 聚合物/乙醇。
注：MPC聚合物分布不均可能导致模式中断。 - 孵育10-30分钟，直到MPC聚合物完全干燥。
- 将邮票与玻璃底培养板的盖片或带聚合物盖片的 35 毫米成像盘接触，并将重量（例如 AAA 电池）放在邮票上 10 分钟。
- 卸下重量和邮票。然后，确认该模式已在显微镜下传输。
注：在室温下，盖章的盘子/盘子最多可储存1周。 - 用PBS清洗盖章的井/菜两次。
- 稀释 LN511-E8 与 PBS 在 2-4 μg/mL 和涂层与 LN511-E8 在 0.5-1 μg/cm2. 。对于人类 PSC-CM，用 0.1% 明胶溶液（而不是 PBS）稀释 LN511-E8。然后，孵育至少1小时（最好超过4小时）。
- 板细胞，如前几个部分所述。
7. 荧光显微镜下肉瘤的延时成像
- 打开并连接显微镜、相关计算机以及所有所需的外设。
- 要执行延时成像，请用最高放大倍数（带油乳液的 100 倍目标镜头）捕获延时图像。
- 选择实时成像条件。要获得良好的代表性数据，请尝试调整到最高帧速率（建议最低为每秒 20 ms 或 50 帧）。将快门打开并应用必要的装箱（4 X 4）和采集区域的作物，以便在延时成像期间实现图像之间的最短间隔。
注：设置可能因显微镜的配置而异。摄像机需要高灵敏度，并且能够足够快地将数据传输到连接的 PC。为此，我们使用带有相机链接的 ORCA 闪光灯。我们测试了旋转共聚焦显微镜，并以每秒 400 帧的速度获取了图像。- •可选|如果细胞的跳动率较低，则通过电场刺激唤起细胞。
- 运行延时记录
- 在录制延时图像时，确保图像字段保持对焦。
- 将延时图像保存到适当的文件夹中。
8. 使用 SarcOptiM（图像J/Fiji 插件）进行延时成像分析
- 将一系列延时图像加载到 ImageJ 中。对于奥林巴斯 VSI 格式，请通过奥林巴斯查看器插件打开文件。
- 调整图像的亮度和对比度，以清楚地观察肉瘤图案（图像|调整|亮度/对比度） 。
- 通过单击"更多工具"菜单（>>）并选择SarcOptiM，打开 SarcOptiM。
- 通过按工具栏上的 Ctrl + Shift + P 和 1 μm 按钮并遵循对话框的说明来校准程序。
- 划出一条线穿过肉瘤区域，用于测量肉瘤的缩短。
- 通过在工具栏上按单细胞 （AVI）开始肉瘤缩短分析。代表性数据见图1和图2。
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Representative Results
使用敲击 PSC-CMs 记者线测量肉瘤缩短。沙科默标签的 PSC-CM 用于测量肉瘤缩短。线条表达 Myom2 - rfp 和 Actn2 - mcherry 从内源性洛西。TagRFP 入Myom2 ，编码 M 蛋白本地化到 M 线，而 mCherry 被敲入ACTN2 ，编码α - 阿克蒂宁，本地化到 Z 线 18 ， 25 。获得延时图像，并用于确定肉瘤缩短，如图1和2和电影1-3。
为了克服 PSC-CM 的混乱，特定的 PDMS 邮票用于在条纹图案中培养 PSC-CM。与非模式区域培养的细胞（图2B 和 2C）相比，这种模式培养促进了细胞形状的拉长和更有条理的肉瘤模式。凭借这一优势，模式培养促进了细胞更好的收缩，并提供了一个光滑的肉瘤长度配置文件，如 电影2 和 3 和 图2D显示。
使用 AAV 载体对 Z 线蛋白进行荧光标记。 为了可视化PSC-CMs的Z线而不产生敲击iPS细胞，使用AAV转导来表达荧光标记的Z线蛋白。两种小Z线蛋白，Telethonin（TCAP）和Actin相关的LIM蛋白（PDLIM3）与GFP，被标记和包装使用AAV6帽（图3A）。一旦 PSC-CM 被区分和净化，AAV 就会被转换为 PSC-CM（图 3B）。转录的 PSC-CM 早在转录后三天（图 3C 和 3D）就沿 PSC-CM 表示了肉瘤 GFP 信号。通常，AAV 在 105 vg/细胞的 MOI 中转导足以可视化荧光标记肉瘤蛋白，较高的滴答声可能导致 GFP 细胞质的非特定本地化，尽管它增加了总体 GFP 强度。
使用 AAV 载体净化 PSC-CM。目前的方法依赖于已经在PCC-CMs的基因组上的药物选择盒，无论是转基因还是仿制线。然而，从患者衍生的iPS细胞中产生这样的线是劳动密集型的。由于AAV载体已被证明可以驱动荧光标记的Z线蛋白的表达，而无需敲击，我们试图建立纯化方法，而无需敲击（图4）。为此，构建了一个新的AAV载体，在cTNT促进剂的控制下编码抗爆霉素基因（图4A）。AAV （105 vg/细胞的 MOI） 在第 4 天被转换为区分人类 iPS 细胞。然后，细胞在7至9天（图4B）之间用2.5-10微克/兆升的爆破剂（需要为每根细胞线点状）进行治疗。第14天，PSC-CM的纯度超过90%（图4C）。
图1：从Myom2-TagRFP细胞系中提取的鼠标PCC-CM的沙科默尔缩短。A. 鼠标 PSC-CM 分化的时间表。 B. 以黄条表示的测量区域在不同时间点缩短肉瘤的代表图像。秤杆 = 10μm。 C. 在收缩心肌细胞期间，以1 Hz的电刺激的肉瘤长度轮廓。帧速率为每秒 50 帧。像素大小为 0.26 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：代表数据表明，在非模式化和模式化培养中，来自ACTN2-mCherry细胞系的人类PCC-CMs的肉瘤缩短。A. 人类 PSC-CM 分化的时间表。 B. 在非模式化文化中培养的 C. 心肌细胞表现出混乱的肉瘤模式（B），而模式文化促进肉瘤（C）的良好对齐。用黄条表示的测量区域。 D. 在电刺激引起的细胞收缩期间获得的相应肉瘤长度图，速率为 0.5 Hz，每秒帧速率为 100 帧。像素大小 = 0.26 μm， 刻度条 = 10μm。 请点击这里查看此图的较大版本。
图3： AAV转导后3天的鼠标PCS-CMs。A. 用于肉瘤标记的 AAV 示意图向量图。肉瘤蛋白（感兴趣的基因，GOI）与GFP与Gly-Gly-Gly-Ser链接器（L）相连，并在心脏肌肽T（cTNT）促进剂的控制下表达。 B. 鼠标 PSC-CM 分化和 AAV 转导的时间表。 C. 和 D. 代表图像显示清晰的肉瘤定位和相应的肉瘤长度配置文件 TCAP-GFP （C） 和 PDLIM3-GFP （D） 经过 3 天的转导到 PSC-CM 从 Myom2-TagRFP 细胞线生成。秤杆 = 10μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：人类PCC-CM的爆炸性净化，无需敲击。
A. AAV 的示意图矢量图，其中将抗爆西丁基因盒（BSR）插入下游，以 cTNT 促进器。 B. 人类 PSC-CMs 分化、转导和爆破选择的时间表。 C. 显示人类 PSC-CMs 中 cTNT ® 细胞百分比的代表数据（在第 4 天转录 105 vg/细胞 AAV6，然后在第 7 天和第 9 天使用 2.5 μg/mL 爆炸剂进行治疗）。请单击此处查看此图的较大版本。
电影 1： 从Myom2-TagRFP 细胞线生成的鼠标 PSC-CM 的荧光延时视频。RFP 信号在 PSC-CM 培养后显示 28 天的肉瘤模式。当在1Hz的电刺激下，细胞显示同步跳动。延时图像每 20 ms 获得一次，镜头为 100 倍。秤杆 = 5 μm。请点击这里下载这部电影。
电影2：人类PCC-CMs的荧光延时视频，在非图案文化盘上培养ACTN2-mCherry。 在非图案文化盘上表达 ACTN2-mCherry 的 PSC-CMs 不仅表现出肉瘤的混乱，而且还呈现出挥舞的收缩，因此很难确定肉瘤的缩短。这些电池以0.5 Hz的电刺激，图像每10ms获得100倍的镜头。秤杆 = 10μm。请点击这里下载这部电影。
电影 3： 荧光延时视频的人类 Psc - cms 与 Actn2 - mcherry 培养在图案文化盘上。 图案培养促进肉瘤的对齐，并迫使细胞到杆形。这种方法使PCC-CM中的肉瘤缩短更容易确定。该视频是通过在0.5 Hz用电刺激细胞获得的。帧速率为每秒 100 帧。秤杆 = 10μm。请点击这里下载这部电影。
补充 CAD 文件。 CAD 文件用于创建宽度为 200 μm 的邮票，凹槽为 10 μm（Stamp_200x10.dxf）、25 μm（Stamp_200x25.dxf）和 50 μm（Stamp_200x50.dxf）。请点击这里下载此文件。
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Discussion
PSC-CMs具有巨大的潜力，可以作为体外 平台来模拟心脏病和测试药物的效果。然而，必须首先建立一种准确、统一的方法来评估 PSC-CM 功能。大多数功能测试都与 PSC-CMs 配合使用，例如电生理学、钙瞬态和代谢26，而第一批患者衍生的 PSC-CM 研究之一是关于长 QT 综合征27。然而，收缩性是心肌细胞最重要的功能之一，仍然难以评估。成人心肌细胞，肉瘤缩短被广泛使用。相比之下，由于 PSC-CM 的沙科默不发达和混乱，肉瘤缩短的标准方法不适用于这些细胞。因此，我们提出了一种使用荧光标记肉瘤蛋白在PCC-CMs中研究肉瘤缩短的替代方法。如前所述，与荧光蛋白融合的M线（MYOM2）或Z线（ACTN2、TCAP和PDLIM3）融合的蛋白质可用于此方法。我们还表明，荧光标记蛋白可以从内源性叶或AAV表达。AAV 比内源性叶片在表达荧光标记蛋白质方面具有更大的灵活性，因为 AAV 可用于任何类型的患者衍生 PSC-CM。相比之下，表达来自内源性叶的蛋白质对肉瘤功能的影响较小，因为基因的表达水平受到严格控制，也可用于监测PCC-CMs18的成熟。
尽管Myom2-TagRFP、ACTN2-mCherry和Lifeact都用于检查肉瘤缩短16、18、19，但目前还不清楚这些蛋白质是否干扰肉瘤功能。最近，Lifeact被报道扰乱了行为组织和细胞形态28。同样重要的是要注意，聚变模式（即目标蛋白的N-术语或C-术语的GFP聚变位点）也会影响肉瘤功能29。因此，在广泛使用之前，必须彻底评估荧光标记的肉瘤蛋白是否干扰肉瘤功能，以及蛋白质-蛋白质相互作用是否发生在肉瘤体外、体内和/或成人心肌细胞中。这一系列荧光标记肉瘤蛋白为未来的蛋白质工程选择提供了一个良好的起点（即将肉瘤蛋白缩短为仅本地化信号）。选择蛋白质标记是成功的另一个关键。我们用GFP标记了另一种Z线蛋白，但是，这种蛋白质只显示细胞质分布，而不是定位到肉瘤。对于活成像，蛋白质的稳定性也可能起到一定的作用，例如，如果标记的蛋白质不稳定，信号水平会更低。荧光蛋白的光静性也很重要，因为不稳定的蛋白质信号在成像过程中很容易被淬火。
要使用描述以外的方法检查 PSC-CM 的收缩性，可以使用 PSC-CM（例如，微柱阵列、牵引力显微镜）或运动（例如，使用 SI8000 的高分辨率运动检测）11、12、13、14产生的力进行间接测量。我们的方法可以与这些方法或基于染料的行动潜力/钙瞬态测量相结合。组合方法可以提供进一步的信息，说明疾病如何导致患者衍生的 PSC-CM 功能障碍。
在 PSC-CM 中，肉瘤缩短的挑战之一是找到一种线性移动的良好肉瘤，否则，细胞可能很容易脱线，用于肉瘤的肉瘤检测，并导致不稳定的肉瘤缩短结果。在这里，我们证明，使用用PDMS邮票生成的图案文化可以提供一个更稳定和线性的肉瘤运动。模式文化也有助于PSC-CMs16的成熟，这对肉瘤功能很重要。
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Disclosures
H.U. 已申请与此手稿相关的专利。
Acknowledgments
我们感谢济池医科大学再生医学系的所有实验室成员提供有益的讨论和技术援助。这项研究得到了日本医学研究开发厅（AMED）的资助：JP18bm0704012 和 JP20bm0804018），日本科学促进会 （JSPS;JP19KK0219），以及日本流通协会（基础研究补助金）给H.U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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