Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

קיצור סרקומר של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62129
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 4, 4, 1, 1
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University
* These authors contributed equally

Summary

שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון קיצור סרקומר באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים עם חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.

Abstract

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים (PSC-CMs) יכולים להיות מיוצרים הן מתאי גזע עובריים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים (ES/iPS). תאים אלה מספקים מקורות מבטיחים למידול מחלות לב. עבור קרדיומיופתיות, קיצור sarcomere היא אחת ההערכות הפיזיולוגיות הסטנדרטיות המשמשות עם קרדיומיוציטים למבוגרים כדי לבחון את פנוטיפים המחלה שלהם. עם זאת, השיטות הזמינות אינן מתאימות להערכת התכווצות של PSC-CMs, שכן לתאים אלה יש סרקומרים לא מפותחים שאינם נראים תחת מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. כדי לטפל בבעיה זו ולבצע קיצור סרקומר עם PSC-CMs, נעשה שימוש בחלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים והדמיה חיה פלואורסצנטית. קווי Z דקים וקו M שוכנים בשני הקצוות ובמרכז סרקומר, בהתאמה. חלבוני קו Z - α-Actinin (ACTN2), טלתונין (TCAP) וחלבון LIM הקשור לאקטין (PDLIM3) - וחלבון קו M אחד - מיומיסין-2 (Myom2) - תויגו בחלבונים פלואורסצנטיים. חלבונים מתויגים אלה יכולים לבוא לידי ביטוי מאללים אנדוגניים כמו דפיקות או מווירוסים הקשורים אדנו (AAVs). כאן, אנו מציגים את השיטות להבדיל בין תאי גזע של עכברים ופלוריפוטנטים אנושיים לקרדיומיוציטים, לייצר AAVs, ולבצע ולנתח הדמיה חיה. אנו מתארים גם את השיטות לייצור חותמות פולידימתילסילוקסן (PDMS) עבור תרבות בדוגמת PSC-CMs, המאפשרת ניתוח של קיצור סרקומר עם חלבונים מתויגים פלואורסצנטית. כדי להעריך קיצור של sarcomere, תמונות זמן לשגות של התאים הפועמים נרשמו בקצב מסגרת גבוה (50-100 פריימים לשנייה) תחת גירוי חשמלי (0.5-1 הרץ). כדי לנתח את אורך הסרקום במהלך התכווצות התא, התמונות המוקלטות של זמן לשגות היו כפופות ל- SarcOptiM, תוסף ל- ImageJ / פיג'י. האסטרטגיה שלנו מספקת פלטפורמה פשוטה לחקירת פנוטיפים של מחלות לב ב- PSC-CMs.

Introduction

מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם1 וקרדיומיופתיה מייצגת את הגורם השלישי למוות הקשור לב2. קרדיומיופתיה היא קבוצה קולקטיבית של מחלות המשפיעות על שרירי הלב. ההתפתחויות האחרונות של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPS) וההבחנה המוכוונת של תאי IPS כלפי קרדיומיוציטים (PSC-CMs) פתחו את הדלת לחקר קרדיומיוציטים עם גנום המטופל כמודל במבחנה של קרדיומיופתיה. תאים אלה יכולים לשמש כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות לב, כדי לרהור המנגנונים המולקולריים שלהם, ולבדוק מועמדים טיפוליים שונים3. יש כמות עצומה של עניין, ולכן, תאי iPS שמקורם בחולה נוצרו (למשל, קרדיומיופתיה היפרטרופית [HCM]4,5 , הפרעות קצבקרדיומיופתיהחדרית ימנית [ARVC]6, קרדיומיופתיה המורחבת [DCM]7,וקרדיומיופתיות הקשורות למיטוכונדריה8,9). כי אחד המאפיינים של קרדיומיופתיה הוא תפקוד לקוי ושיבוש של sarcomeres, כלי תקף המודד באופן אחיד פונקציה sarcomere יש צורך.

קיצור Sarcomere היא הטכניקה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד sarcomere ואת התכווצות של cardiomyocytes למבוגרים נגזר מודלים בעלי חיים ובני אדם. כדי לבצע קיצור סרקומרים, נדרשים סרקומרים מפותחים הנראים תחת ניגודיות פאזה. עם זאת, PSC-CMs מתורבתים במבחנה להציג סרקומרים מפותחים ולא מאורגנים, ולכן, אינם יכולים לשמש כדי למדוד כראוי sarcomere קיצור10. קושי זה להעריך כראוי את התכווצות של PSC-CMs מעכב את השימוש בהם כפלטפורמה להערכת תפקודי הלב במבחנה. כדי להעריך התכווצות PSC-CMs בעקיפין, מיקרוסקופיה כוח אטומי, מערכי מיקרו-פוסט, מיקרוסקופיה כוח המתיחה, ומדידות עקיפה שימשו למדידת ההשפעות של התנועה המופעלת על ידי תאים אלה על סביבתם11,12,13. הקלטות וידאו-מיקרוסקופיה מתוחכמות יותר ופחות פולשניות של תנועה תאית בפועל (למשל, SI8000 מ- SONY) יכולות לשמש לחילופין כדי להעריך את החוזה שלהם, עם זאת, שיטה זו אינה מודדת ישירות תנועה סרקומרית או קינטיקה של יצירת כוח14.

כדי למדוד ישירות את תנועת הסרקומורה ב- PSC-CMs, מתגלות גישות חדשות, כגון תיוג פלואורסצנטי לחלבון סרקומר. לדוגמה, Lifeact משמש לתיוג actin filamentous (F-actin) כדי למדוד תנועת סרקומר15,16. תאי IPS מהונדסים גנטית הם אפשרות נוספת לתיוג חלבוני סרקומר (למשל, α-אקטינין [ACTN2] ומיומיסין-2 [MYOM2]) על ידי חלבון פלואורסצנטי17,18,19.

במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבצע הדמיה בזמן לשגות למדידת קיצור סרקומר באמצעות Myom2-TagRFP (תאי גזע עוברי עכבר [ES] ) ו ACTN2-mCherry (תאי IPS אנושיים). אנו גם מראים שתרבות בדוגמת דפוס מקלה על יישור סרקומר. בנוסף, אנו מתארים שיטה חלופית של תיוג סרקומר, באמצעות וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs), אשר ניתן ליישם באופן נרחב על תאי iPS שמקורם בחולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטים של עכבר

  1. תחזוקה של תאי ES של עכבר
    1. אמצעי תחזוקה: יש לערבב 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 5 מ"ל של L-אלנין-L-גלוטמין, 5 מ"ל של חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 5 מ"ל של 100 מ"ל נתרן פירובט, ו-909 מיקרול של 55 מ"מ 2-מרקפטואתנול עם 450 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי בגלזגו (GMEM). תוספת גורם מעכב לוקמיה (LIF), CHIR-99021, ו PD0325901 בריכוז סופי של 1000 U/mL, 1 μM, ו 3 מיקרומטר, בהתאמה. לחטא את המדיום באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    2. בינוני FBS: לערבב 55 מ"ל של FBS, 5.5 מ"ל של L-אלנין-L-גלוטמין, 5.5 מ"ל של נתרן פירובט, ו 5.5 מ"ל של NEAA עד 500 מ"ל של בינוני נשר שונה של DULBECCO (DMEM) גלוקוז גבוה. מסננים את המדיום באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר.
    3. תרבות SMM18 עכבר ES תאים שבהם TagRFP הוכנס לתוך locus Myom2 על צלחת ג'לטין 6 ס"מ במדיום תחזוקה כפי שתואר בעבר18. מעבר כל 2-3 ימים.
  2. הכנת בינונית של בידול ללא סרום (SFD)
    1. בזאל SFD: לערבב 250 מ"ל של F-12 של האם, 750 מ"ל של המדיום (IMDM) של Iscove, 10 מ"ל של תוסף B27 פחות ויטמין A, 5 מ"ל של תוסף N2, 10 מ"ל של L-אלנין-L-גלוטמין, 5 מ"ל של 10% אלבומין בסרום בקר בתחכוז פוספט (PBS), ו-10 מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין (10,000 U/mL). מסננים דרך מסננת 0.22 מיקרומטר כדי לעקר.
    2. ממיסים חומצה אסקורבית ב 5 מ"ג / מ"ל במים מזוקקים לסנן דרך מסננת 0.22 מיקרומטר כדי לעקר.
    3. לדלל 13 μL של 1-Thioglycerol ל 1 מ"ל של IMDM. להלן, עיין זה מדולל 1-Thioglycerol כמו MTG.
    4. הוסף 10 μL של חומצה אסקורבית (5 מ"ג / מ"ל) ו 3 μL של MTG ל 1 מ"ל של SFD בזאלי ביום השימוש. להלן, עיין בתערובת זו כאל SFD מלא.
  3. יום 0, היווצרות גוף עוברי (EB) לבידול
    1. קציר תאי עכבר SMM18 ES עם פרוטאז דמוי טריפסין רקומביננטי (rTrypsin) וספור את התאים.
    2. צנטריפוגה 5 x 105 תאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (60 °F), resuspend ב 10 מ"ל של SFD מלא, וזרע לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ. תרבית התאים ב 37 °C (5%) ו 5% CO2 עבור 50 שעות.
  4. יום בידול 2
    1. הוסף Activin A, גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי (hVEGF), וחלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4) כדי להשלים SFD בריכוז סופי של 5 ננוגרם / מ"ל, 5 ng/ mL, ו 1.9 ng/ mL, בהתאמה.
      הערה: ריכוזי BMP4 עשויים להשתנות בהתאם למגרש של BMP4. בדוק מספר ריכוזים בניסוי בקנה מידה קטן לפני השימוש במגרש חדש ולקבוע את הריכוז הטוב ביותר עבור הבחנה לב.
    2. מעבירים EBs מצלחת פטרי לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 50-100 x גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F).
    3. בינתיים, מוסיפים את המדיום שהוכן בשלב 1.4.1 לצלחת הפטרי כדי להגן על ה- EBs הנותרים יבשים.
    4. שאפו את supernatant מן צינור 15 מ"ל, resuspend EBs עם המדיום בצלחת פטרי, ולהעביר את פתרון EB בחזרה לצלחת. לאחר מכן, לטפח את EBs ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 46 שעות.
  5. יום בידול 4
    1. ג'לטין מנה 10 ס"מ תרבית רקמות מטופלת עם 5 עד 10 מ"ל של 0.1% ג'לטין לפחות 5 דקות. שאפו ג'לטין ממש לפני זריעת תאים.
    2. הכן בינוני: ערבבו גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF), FGF10 ו-hVEGF כדי להשלים את ה-SFD ב-5 ננוגרם/מ"ל, 25 ננוגרם/מ"ל וריכוזים סופיים של 5 ננוג'/מ"ל, בהתאמה. לצלחת 10 ס"מ, להכין 10 מ"ל.
    3. מעבירים תאים מצלחת הפטרי לצינור של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של PBS לצלחת פטרי, לשטוף מספר פעמים, ולהעביר את הצינור 15 מ"ל כדי לאסוף את התאים הנותרים. צנטריפוגה ב 50-100 x גרם, 4 °C (5 °F), 3 דקות.
    4. שאפו לסופרנאט, הוסיפו 1 מ"ל של rTrypsin, ודגרו ב 37 °C (50 °F) במשך 3 דקות.
    5. מערבולת בקצרה כדי לנתק EBs, להוסיף 9 מ"ל של 10% FBS בינוני, מערבולת שוב, ולספור את התאים.
    6. צנטריפוגה 1.5 x 107 תאים ב 300 x גרם, 4 °C במשך 3 דקות, resuspend עם התקשורת מוכנה בשלב 1.4.2, וזרע לתוך צלחת gelatinized. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2 במשך 2 ימים.
      הערה: ביום 7 או 8, מכות נרחבות של PSC-CMs ניתן לראות.
  6. בחירת סמים בימים בידול 7 ו -9: Refeed התקשורת עם puromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל בריכוז הסופי) כדי לחסל שאינם cardiomyocytes ביום 7 ו 9 של בידול.
    הערה: קו ההורים של SMM18 הוא תאי ES עכבר syNP4, מחסה NCX1 מונחה גנים טיהור-צירין20.
  7. יום 10, תשובה לניסויים עתידיים
    1. יש לצפות צלחת תרבית בתחתית זכוכית או צלחת הדמיה באורך 35 מ"מ המכילה כיסוי פולימרי עם 0.1% ג'לטין. כדי לשפר את ההתבגרות, מצפים את הכלים עם שבר למינין-511 E8 (LN511-E8) ב 1 מיקרוגרם / ס"מ2 במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר18. כדי לתרבות PSC-CMs בדפוסים ספציפיים של עניין, עיין בשלבים 4 ו -5 להכנת בולי פולידימתילסילוקסן (PDMS).
    2. כדי לקצור SMM18 PSC-CMs, לשטוף את המנה פעמיים עם PBS, להחיל 1 מ"ל של rTrypsin, ודגרה 3 דקות ב 37 °C (50 °F).
    3. לאסוף תאים ב 9 מ"ל של 10% FBS בינוני, להשעות, ולספור את התאים. צלחת התאים ב 50,000-100,000 תאים בבאר אחת של צלחת 24-well או 250,000-500,000 תאים בצלחת הדמיה 35 מ"מ.
    4. צנטריפוגה מספר מספיק של תאים (300 x g, 3 דקות) ו resuspend התאים עם SFD מלא בתוספת FBS (ריכוז סופי ב 10%).
    5. לדגור בן לילה ולשנות את המדיום התרבותי כדי להשלים SFD עם puromycin.
    6. מהיום ה -14, לשנות את מדיום התרבות פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע עם SFD מלא עד היום 21-28, כאשר Myom2-RFP הופך בולט. עבור טרנסדוקציה מבוססת AAV של חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטית, אנא עיינו בשלב 3.

2. בידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

  1. הכנת מדיה בידול
    1. RPMI +B27-Ins: לערבב 500 מ"ל של RPMI 1640 בינוני, 10 מ"ל של B27 פחות אינסולין, ו 5.25 מ"ל של L-אלנין-L-גלוטמין.
    2. RPMI +B27+Ins: לערבב 500 מ"ל של RPMI, 10 מ"ל של תוספת B27, ו 5.25 מ"ל של L-אלנין-L-גלוטמין.
  2. תחזוקה של תאי IPS אנושיים
    1. מעבר תאי IPS אנושיים פעמיים בשבוע עם AK02N על LN511-E8 בעקבות שיטה שפורסמה בעבר עם כמה שינויים21.
    2. קציר תאים עם טיפול 3 דקות של rTrypsin ולאסוף לתוך 10% FBS בינוני. לספור תאים צנטריפוגה ב 300 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F). זרע 75,000-125,000 תאים בבאר אחת של 6 צלחת טובה עם 2 מ"ל של AK02N בתוספת LN511-E8 ו Y27632 בריכוז הסופי של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל (0.1 מיקרוגרם / ס"מ2) ו 10 μM, בהתאמה.
    3. דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 ולהחליף את המדיום למחרת עם 2 מ"ל של AK02N ללא כל תוספת. לשנות מדיה כל יומיים עד שלושה ולעבר כל שלושה עד ארבעה ימים.
  3. יום -4: תשובה לפני בידול
    1. מצפים צלחת 6 היטב עם 0.5 מיקרוגרם / ס"מ2 של LN511-E8 מדולל PBS. לאחר מכן, דגירה לפחות 30 דקות ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 או 1 שעה בטמפרטורת החדר. שאפו תמיסה ציפוי ממש לפני זריעת תאים.
    2. קציר תאי IPS אנושיים עם rTrypsin ולספור תאים כמו בשלב 2.2.2.
    3. צנטריפוגה 1.25 x 105 תאים עבור באר של צלחת 6-well ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 °C ו resuspend ב 2 מ"ל של AK02N בתוספת LN511-E8 (ריכוז סופי 0.5 μg / mL או 0.1 מיקרוגרם / ס"מ2) ו Y27632 (ריכוז סופי 10 μM) לכל טוב.
    4. פתרון ציפוי שאפתני, זרעים resuspended תאים לתוך הצלחת מצופה, ודגורה ב 37 °C (5%) ו 5% CO2.
  4. ימים -3 ו-1: החלף בינוני ב- 2 מ"ל של AK02N.
  5. יום 0: החלף בינוני עם 2 מ"ל של RPMI + B27-Ins בתוספת CHIR99021 (ריכוז סופי 6 מיקרומטר) לכל טוב כדי להתחיל בידול.
  6. יום 2: החלף מדיום ב-2 מ"ל של RPMI+B27-Ins ב-WntC59 (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר) לבאר.
  7. יום 4: החלף בינוני ב- 2 מ"ל של RPMI + B27-Ins לבאר.
  8. יום 7 ויום 9: החלף בינוני עם 2 מ"ל של RPMI + B27 + Ins עם puromycin (ריכוז סופי 10 מיקרוגרם / מ"ל) לכל טוב כדי לתרבות סלקטיבית PSC-CMs.
    הערה: קו ACTN2-mCherry, המשמש במחקר זה, יש קלטת של אתר כניסה ריבוזומלי פנימי (IRES), גן עמיד puromycin מוכנס לאזור 3′-untranslated (UTR) של לוקוס TNNT2, ו mcherry החלפת קודון להפסיק של ACTN2. כדי לטהר קרדיומיוצייט ללא נוק-אין, אנא עיין בשלבים 3 ו-4.
  9. יום 10: תגמול לניסויים עתידיים
    1. יש לצפות צלחת הדמיה בקוטר 35 מ"מ עם כיסוי פולימרי עם 0.5-1 מיקרוגרם/ס"מ2 של LN511-E8 מדולל ב-0.1% ג'לטין. דגירה 2-4 שעות בטמפרטורת החדר עבור כדאיות לטווח ארוך. כדי לתרבות PSC-CMs בדפוסים הרצויים, עיין בשלבים 4 ו-5 להכנת חותמות PDMS.
    2. כדי לקצור PSC-CMs אנושי, לשטוף את המנה פעמיים עם PBS, להחיל 1 מ"ל של rTrypsin לבאר, ודגרה 3 דקות ב 37 °C (7 °F).
    3. לאסוף תאים ב 4 מ"ל של 10% FBS בינוני, להשעות, ולספור את התאים. צלחת 250,000-500,000 תאים לכל צלחת הדמיה 35 מ"מ.
    4. צנטריפוגה מספר מספיק של תאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (7 °F), resuspend עם RPMI + B27 + Ins עם puromycin (10 מיקרוגרם / מ"ל), צלחת על צלחת הדמיה מצופה 35 מ"מ.
    5. דגירה בן לילה. למחרת בבוקר, להחליף את המדיום התרבותי עם RPMI + B27 + Ins עם puromycin (10 מיקרוגרם / מ"ל).
    6. מיום 14, שנה את התרבות מדיום 2-3 פעמים בשבוע עם RPMI+B27+Ins עד היום 21-28 להדמיה. עבור טרנסדוקציה מבוססת AAV של חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטית, אנא עיינו בשלב 3.

3. תיוג פלואורסצנטי של סרקומרים באמצעות וירוסים הקשורים לאדנו

  1. הכנה לפני הפקת AAV
    1. לשמור על תאי HEK293T ב- DMEM בתוספת FBS (ריכוז סופי 10%) על צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. תאי מעבר שלוש פעמים בשבוע.
    2. הכן פוליאתילנימין (PEI) ב 1 מ"ג / מ"ל. לערבב 50 מ"ג של פוליאתילנימין MAX 40000 ו 40 מ"ל של מים אולטרה-סבר. כוונן את ה-pH ל-7.0 באמצעות 1 N NaOH. לאחר מכן, להפוך את הנפח הסופי ל 50 מ"ל עם מים אולטרה-pure לסנן דרך מסננת 0.22 מיקרומטר.
    3. הכן וקטור מעבורת עם גן תיוג סרקומר (למשל, TCAP או PDLIM3 התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]), מונע על ידי מקדם ספציפי לקרדיומיוציטים, כגון טרופונין T (cTNT)22.
      הערה: במקרה זה, השתמשנו GFP משופר מונומרי עם מוטציות של V163A, S202T, L221V23.
  2. יום 0, מעבר תאי HEK
    1. כאשר תאים מגיעים למפגש, מעבר 2.0 x 107 HEK293T תאים ללוח תרבית רקמות 15 ס"מ עם 20 מ"ל של DMEM עם 10% FBS.
  3. יום 1, טרנספקטיון
    1. יש לערבב 13.5 מיקרוגרם של וקטור המעבורת, 26 מיקרוגרם של pHelper (קידוד וקטורי E2A, E4 ו-VA של אדנווירוס), 16.5 מיקרוגרם של pRC6 (גנים וקטוריים של קידוד AAV2 Rep ו-AAV6 Cap), ו-1 מ"ל של DMEM ללא נתרן פירובט (DMEM-Pyr).
    2. לערבב 224 μL של PEI (1 מ"ג / מ"ל, מוכן בשלב 3.1.2) ו 776 μL של DMEM-Pyr.
    3. מערבבים ודגרה את פתרון plasmid ואת פתרון PEI בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    4. הוסף את פתרון plasmid /PEI לתאי HEK293T שהוכנו בשלב 3.2.
  4. יום 2, שינוי בינוני
    1. בשעה 24 שעות לאחר ההדבקה, החליפו מדיום ל-DMEM-Pyr. תאי תרבות עד קצירת AAV ביום 7. AAV ישוחרר לתקשורת התרבותית.
  5. יום 7, איסוף, ריכוז ותחליפי חיץ AAV בשיטת טיהור מינימלית24
    1. דגירה על יחידת סינון אולטרה-סינון צנטריפוגלית (100k משקל מולקולרי מנותק [MWCO]) עם 5 מ"ל של 1% BSA ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה יחידת סינון אולטרה ב 500 x g במשך 2 דקות ולשאפת הן פתרונות מסוננים ופתרונות שנותרו.
    2. מעבירים בינוני מהמנה 15 ס"מ שהפיקה AAV לצינור חרוטי חדש 50mL וצנטריפוגה (500 x גרם, 5 דקות). סנן את supernatant באמצעות מסננת מזרק 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת תא ולהחיל השעיה על יחידת סינון אולטרה.
    3. צנטריפוגה ב 2000 x g במשך 90 דקות או עד ריכוז התרבות supernatant 0.5 עד 1 מ"ל.
    4. שאפו את הסינון והחלו 15 מ"ל של PBS על יחידת הסינון האולטרה-סינון.
    5. צנטריפוגה חוזרת עד שהתרכיז הופך ל-0.5-1 מ"ל.
    6. חזור על 3.5.4 ו-3.5.5.
    7. מעבירים AAV מרוכז לצינור חדש של 1.5 מ"ל ומאחסנים ב-4 °C (55°F) או -20 °C (70 °F).
      הערה: ניתן להשתמש ב-AAV במתקני P1 אך לציית לחוקים ולתקנות המקומיים. AAV יכול להיות מיוצר על ידי שיטות קונבנציונליות גם כן.
  6. חישוב של טיטר AAV
    1. לערבב 5 μL של AAV, 195 μL של DMEM-Pyr, ו 10 U של בנזונאז ודגרה ב 37 °C (7 °F) עבור 1 שעה.
    2. יש להוסיף 200 מיקרו-אל של מאגר פרוטאינאז K (0.02 מ' טריס HCl ו-1% SDS) ו-5 מיקרו-לן של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל) ודגרה ב-37 °C למשך שעה אחת.
    3. בזהירות להכין 400 μL של 25:24:1 פנול / כלורופורם / איזואמיל אלכוהול פתרון, מערבולת במשך 1 דקות, וצנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 1 דקות.
    4. העבר 200 μL של השלב מימית צינור חדש 1.5 מ"ל, אשר יניב כמחצית הגנום המקורי AAV.
    5. הוסף 1 μL של גליקוגן (20 מ"ג / מ"ל) כדי 20 μL של 3 M CH3COONa (pH 5.2) ומערבולת. הוסף 250 μL של 2-Propanol כדי 100 μL של 100% אתנול ומערבולת שוב.
    6. דגירה ב -80 °C (70 °F) למשך 15 דקות. ואז צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
    7. שאפו סופר-נט והוסיפו 70% אתנול לצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 20,000 x גרם, 4 °C (5 דקות).
    8. שאפו סופרנט ואוויר יבש עד שהכדור יתבהר.
    9. הוסף 200 μL של חומצה טריס-אתילנדימינטטראקטית (TE; pH 8.0) כדי לפתור את הגנום AAV. לאחר מכן, לדלל את הדגימה פי 100 עם TE.
    10. הכן תקן עם pAAV-CMV-Vector ב 6.5 ng/μL עם TE כדי להשיג 109 גנומים וקטוריים (vg)/ μL. לאחר מכן, בצע סדרה של דילול פי 10 מ- 104 ל-10 8 עם TE.
    11. לערבב 1 μL של DNA מדגם (או הסטנדרטים), 0.4 μL של פריימרים (5 μM), 3.6 μL של מים מזוקקים, ו 5 μL של תערובת מאסטר ירוק SYBR. פריימרים, הממוקמים ב- ITR, הם 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ ו- 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. בצע PCR בזמן אמת עם המצב הבא: denature הראשוני ב 95 °C (60 s), 40 מחזורים של denaturing ב 95 °C (70 °F) עבור 15 s, וחישול והרחבה ב 60 °C (70 °F) עבור 30 s, ואחריו עקומת התכה.
    13. בהתבסס על הסטנדרטים וערכי ה- Ct, מכונת PCR בזמן אמת מספקת את מספר העותק של הגנום הווקטורי ב- 1 μL של מדגם. חשב TITER AAV המקורי באמצעות המשוואה הבאה: מספר עותק שסופק על ידי PCR בזמן אמת (vg/μL) x 8 x 103 x 2, שבו 8 x 103 כגורם דילול במהלך בידוד הגנום AAV, ו 2 כגורם ההבדל של AAV (גדיל יחיד) ו plasmid (גדיל כפול).
  7. התמתן ל- PSC-CMs
    1. ספרו PSC-CMs במנה טובה נוספת או נוספת.
    2. לדלל AAVs (1 x 104 כדי 1 x 106 vg /cell) כדי לפצות על 50 μL עם PBS. החל AAVs בריבוי הזיהום (MOI) של 1 x 104 עד 1 x 106 vg/cell על PSC-CMs ותרבות PSC-CMs במשך 3 ימים עם AAV במדיית הבידול המתאימה עבור עכבר ו- PSC-CMs אנושיים, ולאחר מכן שנה מדיה למדיום תרבות ללא AAV.
    3. השתמש ב- PSC-CMs להדמיה של תאים חיים לאחר 7 ימים או יותר לאחר התמרון.

4. [אופציונלי] טיהור מבוסס AAV של PSC-CMs

  1. הכנת AAV
    1. הכן AAV כמתואר בשלב 3 באמצעות וקטור מעבורת המבטא גן עמיד בפני blasticidin תחת שליטת מקדם cTNT.
  2. התמרה לבידול תאי IPS
    1. להבדיל בין תאי IPS אנושיים במשך 4 ימים בעקבות הפרוטוקול המתואר בשלב 2 ולספור את מספר התאים בבאר נוספת.
    2. לאחר שינוי בינוני ביום 4, החל AAVs ב- MOI של 1 x 105 vg/cell על מחשבים מבדלים במדיית RPMI + B27-Ins.
    3. ביום 7, רענן בינוני עם RPMI + B27 + Ins ולהוסיף 2.5-10 מיקרוגרם / מ"ל של blasticidin.
    4. ביום 10, PSC-CMs מוכנים לתשובה.

5. הכנת חותמות PDMS

  1. עצב את תבנית ההתקן של 200 רצועות מיקרומטר יחד עם חריצים של 10-25 מיקרומטר בין הרצועות באמצעות תוכנת ציור של עיצוב בעזרת מחשב (CAD).
  2. צייר את התבנית של מכשירים על מסכת צילום כרום מצופה AZP1350 באמצעות אור UV של כלי ליטוגרפיה ללא מסכה.
  3. לפתח את התבנית על מסכת הצילום בסדרה של מפתח פוטוארסיסט חיובי (למשל, חרוט כרום) ולשטוף עם מי DI.
  4. מייבשים רקיק סיליקון על צלחת חמה ב 120 °C (50 °F) במשך 15 דקות.
  5. אפשר לוופל להתקרר לטמפרטורת החדר ולסובב-מעיל SU-8 3010 פוטורסיסט שלילי כדי להפוך גובה של 10-20 מיקרומטר עם 1500 סל"ד עבור 30 s באמצעות ספין מעיל.
  6. רך לאפות את הוופל בשני שלבים על צלחת חמה על פי פרוטוקול היצרן.
  7. לאחר שהופל מתקרר לטמפרטורת החדר, העמיסו את הוופל על קשת המסכה.
  8. השתמש ביישר מסיכה כדי ליישר את המסכה על הוופל ולחשוף את הוופל לאור UV.
  9. יש לבצע את האפייה לאחר החשיפה לופל בשני שלבים על צלחת חמה על פי פרוטוקול היצרן.
  10. לפתח את הוופל בסדרה של מפתח SU-8 ו 2-Propanol, ולאחר מכן לייבש את הוופל עם זרם חנקן.
  11. מעבירים את הוופל לצלחת פטרי בגודל מתאים.
  12. מערבבים את PDMS elastomer ואת סוכן הריפוי שלו ביחס של 10:1 w/w ויוצקים את התערובת לתוך צלחת פטרי.
  13. Degas PDMS במתן עד שכל בועות האוויר נעלמות, ולאחר מכן לרפא PDMS על צלחת חמה ב 80 °C (2 שעות).
  14. מקלפים את ה-PDMS שנרפא מהתבנית הראשית בעזרת פינצטה, ואז חותכים את החלק עם העיצוב כחותמת PDMS.
    הערה: הצורה יכולה להיות מרובעת, עם זאת, צורה מתומנת מעבירה את התבנית טוב יותר בקצה.

6. תרבות דפוס של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים

  1. הסר אבק מפני השטח של חותמות PDMS באמצעות סרט תיקון.
  2. תטביע את הבולים ל-70% אתנול כדי לעקר. לאחר מכן, לפוצץ אתנול מעל פני השטח של הבולים באמצעות מטלית אוויר.
  3. יש למרוח 5-10 מיקרו-אל של 0.5 wt% 2-מתאקרילואילוקסיאתיל זרחן/אתנול (MPC) על פני השטח של בולי PDMS.
    הערה: הפצה לא אחידה של פולימר MPC עלולה לגרום לתבנית משובשת.
  4. דגירה 10-30 דקות עד פולימר MPC מיובש לחלוטין.
  5. מניחים את הבולים במגע עם כיסויים של צלחת תרבות בתחתית זכוכית או צלחת הדמיה 35 מ"מ עם כיסוי פולימר ולשים משקל (למשל, סוללת AAA) על החותמת במשך 10 דקות.
  6. הסר את המשקל ואת הבולים. לאחר מכן, אשר כי התבנית הועברה תחת מיקרוסקופ.
    הערה: ניתן לאחסן צלחות /כלים חתומים עד שבוע בטמפרטורת החדר.
  7. לשטוף את בארות / כלים מוטבעים עם PBS פעמיים.
  8. לדלל LN511-E8 עם PBS ב 2-4 מיקרוגרם / מ"ל ולכסות את המנה עם LN511-E8 ב 0.5-1 מיקרוגרם / ס"מ2. עבור PSC-CMs אנושיים, לדלל LN511-E8 עם פתרון ג'לטין 0.1% במקום PBS. לאחר מכן, דגירה לפחות 1 שעות (אופטימלית, יותר מ 4 שעות).
  9. תאי לוח כמתואר בסעיפים קודמים.

7. הדמיה בזמן-לשגות של סרקומרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. הפעל וחבר את המיקרוסקופ, המחשב המשויך וגם את כל הציוד ההיקפי הנדרש.
  2. כדי לבצע הדמיה בזמן-לשגות, לכוד תמונות בזמן לשגות עם ההגדלה הגבוהה ביותר (עדשה אובייקטיבית פי 100 עם emersion שמן).
  3. בחר תנאי הדמיה חיה. כדי להשיג נתונים מייצגים טובים, נסה להתאים את עצמו לקצב המסגרות הגבוה ביותר (מומלץ לבצע לפחות 20 אלפיות השנייה או 50 פריימים לשנייה). הגדר את התריס פתוח והחיל binning הכרחי (4 X 4) ויבול של אזור הרכישה כדי להשיג את המרווחים הקצרים ביותר בין תמונות במהלך הדמיה זמן לשגות.
    הערה: ההגדרה עשויה להשתנות בהתאם לתצורות של מיקרוסקופים. המצלמה צריכה להיות רגישה מאוד ומסוגלת להעביר את הנתונים למחשב המחובר מספיק מהר. כדי לשים קץ, השתמשנו בהבזק ORCA עם קישור למצלמה. בדקנו מיקרוסקופיה קונפוקלית מסתובבת ורכשנו תמונות במהירות של 400 פריימים לשנייה.
    1. [אופציונלי] אם קצב ההכאה של התאים נמוך, לעורר את התאים על ידי גירוי שדה חשמלי.
  4. הפעלת רשומת הזמן-לשגות
    1. ודא שהשדות שהתמונה נשארת במוקד במהלך הקלטת תמונת הזמן.
    2. שמור את התמונות של זמן לשגות בתיקיה מתאימה.

8. ניתוח הדמיה בזמן לשגות באמצעות SarcOptiM, תוסף ImageJ /פיג'י

  1. טענו סדרה של תמונות בזמן לשגות לתוך ImageJ. עבור פורמט Olympus VSI, פתח קבצים באמצעות תוסף OlympusViewer.
  2. כוונן את הבהירות ואת הניגודיות של התמונה כדי לבחון בבירור את דוגמת המילוי של הסרקום(תמונה | כוונון | בהירות/ניגודיות).
  3. פתח את SarcOptiM על ידי לחיצה על תפריט כלים נוספים (>>) ובחירת SarcOptiM.
  4. כייל את התוכנית על-ידי הקשה על Ctrl + Shift + P ו- 1 מיקרומטר בסרגל הכלים וציות להוראות תיבות הדו-שיח.
  5. צייר קו על פני אזור הסרקומר שישמש למדידת קיצור הסרקום.
  6. התחל ניתוח קיצור סרקומר על-ידי הקשה על SingleCell (AVI) בסרגל הכלים. הנתונים הייצוגית מוצגים באיור 1 ובאיור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידת קיצור סרקומר באמצעות שורות כתב PSC-CMs. PSC-CMs שכותרתו Sarcomere שימשו למדידת קיצור סרקומר. הקווים מבטאים את Myom2-RFP ו ACTN2-mCherry מלוצי אנדוגני. TagRFP הוכנס ל Myom2, קידוד M-חלבונים כי לוקליזציה לקו M, בעוד mCherry היה דפק ב ל ACTN2, קידוד α-Actinin, אשר לוקליזציה לקו Z18,25. תמונות של זמן לשגות הושגו ושימשו לקביעת קיצור סרקומר כפי שמוצג באיורים 1 ו-2 ובסרט 1-3.

כדי להתגבר על הסרקומר הלא מאורגן של PSC-CMs, בולי PDMS ספציפיים שימשו לתרבות PSC-CMs בתבנית הפסים. תרבות דפוס זו קידמה צורת תא מוארכת ותבנית סרקומר מאורגנת יותר בהשוואה לתאים בתרבית באזור שאינו דפוס (איורים 2B ו- 2C). עם יתרון זה, התרבות בדוגמת קידם התכווצות טובה יותר של התאים וסיפקה פרופיל אורך סרקומר חלק כפי שמוצג בסרטים 2 ו -3 ובאיור 2D.

תיוג פלואורסצנטי של חלבון קו Z באמצעות וקטורים AAV. כדי להמחיש את קו ה-Z של PSC-CMs מבלי ליצור תאי iPS דופקים, חלבוני קו Z מתויגים פלואורסצנטית באו לידי ביטוי באמצעות התמרת AAV. שני חלבונים קטנים מסוג Z- line, טלתונין (TCAP) וחלבון LIM הקשור לאקטין (PDLIM3) עם GFP, תויגו ונארזו באמצעות קפסיד AAV6(איור 3A). לאחר PSC-CMs הובדלו וטוהרו, AAVs הועברו PSC-CMs(איור 3B). ה- PSC-CMs שהועברו הביעו אותות GFP סרקומריים לאורך ה- PSC-CMs כבר שלושה ימים לאחר התמרה (איורים 3C ו- 3D). בדרך כלל, התמרה של AAV ב- MOI של 105 vg / תא מספיק כדי לדמיין חלבוני סרקומר מתויג פלואורסצנט טיטר גבוה יותר עלול לגרום לוקליזציה לא ספציפית של GFP כדי ציטופלסמה למרות שהוא מגביר את עוצמת GFP הכוללת.

טיהור PSC-CMs באמצעות וקטורים AAV. השיטות הנוכחיות מסתמכות על קלטת בחירת הסמים שכבר נמצאת בגנום של PSC-CMs, מהונדסות או בתור נוק-אין. עם זאת, זה עבודה אינטנסיבית לייצר קו כזה מתאי iPS שמקורם בחולה. כפי שהודגמו וקטורים של AAV כדי להניע את הביטוי של חלבוני Z-line בעלי תווית פלואורסצנטית ללא צורך בנוק-אין, ביקשנו להקים את שיטת הטיהור גם ללא נוק-אין (איור 4). ולשם כך נבנה וקטור AAV חדש, המקודד גן עמיד לבלסתידין תחת שליטת מקדם cTNT (איור 4A). AAV (MOI של 105 vg/ תא) הועבר להבדיל תאי IPS אנושיים ביום 4. לאחר מכן טופלו תאים עם 2.5-10 מיקרוגרם/מ"ל של בלסטיסידין (צריך לתייג עבור כל קו תא) בין ימים 7 ל-9(איור 4B). ביום 14, הטוהר של PSC-CMs היה יותר מ -90%(איור 4C).

Figure 1
איור 1: קיצור ה-PSC-CMs של העכבר שמקורו בקו התא Myom2-TagRFP. א. ציר הזמן לבידול PSC-CM של העכבר. ב. תמונות מייצגות עבור קיצור sarcomere בנקודות זמן שונות עם אזורי מדידה כפי שצוין על ידי פסים צהובים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. ג. פרופיל אורך Sarcomere במהלך התכווצות של cardiomyocytes כי היה מגורה עם חשמל ב 1 הרץ. קצב המסגרות היה 50 פריימים לשנייה. גודל הפיקסלים היה 0.26 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: נתונים מייצגים המראים קיצור סרקומר של ה-PSC-CMs האנושיים הנגזרים מקו התא ACTN2-mCherry בתרבות שאינה מעוצבת ותבנית. א. ציר הזמן לבידול PSC-CM אנושי. ב. ו- C. Cardiomyocytes המתורבתים בתרבויות לא מעוצבות מציגים דפוסי סרקומר לא מאורגנים (B) בעוד שתרבויות בדוגמת קידום יישור טוב של הסרקומר (C). אזורי מדידה המוצגים על-ידי פסים צהובים. ד. פרופילי אורך סרקומר מתאימים שהושגו במהלך התכווצות התא הנגרמת על ידי גירוי חשמלי ב 0.5 הרץ וקצב פריימים של 100 פריימים לשנייה. גודל פיקסל = 0.26 מיקרומטר, סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עכבר PSC-CMs לאחר התמרה AAV במשך 3 ימים. א. מפה וקטורית סכמטית של AAV לתיוג סרקומר. חלבון סרקומר (גן מעניין, GOI) מקושר ל- GFP עם מקשר גלי-גלי-סר (L) ומתבטא בשליטת מקדם טרופונין T (cTNT). ב. ציר הזמן לבידול PSC-CM של העכבר ולהעברת AAV. ג' ו-ד. תמונות מייצגות המציגות לוקליזציה ברורה של סרקומר ופרופיל אורך הסרקום המתאים של TCAP-GFP (C) ו- PDLIM3-GFP (D) לאחר 3 ימים של טרנס-החלפה ל- PSC-CMs שנוצרו מקו התא Myom2-TagRFP. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: טיהור בלסטישידין של PSC-CMs אנושי ללא נוק-אין. 
א. מפה וקטורית סכמטית של AAV, שבה קלטת גנים עמידה בפני blasticidin (BSR) מוכנס במורד הזרם למקדם cTNT. ב. ציר הזמן של הבחנה, טרנסדוקציה ובחירת בסטיפיצידין אנושית. ג. נתונים מייצגים המציגים אחוז של cTNT + תאים PSC-CMs אנושי (transduced 105 vg / תא AAV6 ביום 4 ואז מטופלים עם 2.5 מיקרוגרם / mL blasticidin בימים 7 ו -9). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט 1: וידאו זמן לשגות פלואורסצנטי של עכבר PSC-CMs שנוצר מקו התא Myom2-TagRFP. אותות RFP הראו דפוס סרקומר לאחר תרבות PSC-CM במשך 28 ימים. התאים הראו מכות סינכרוניות כאשר מגורה עם חשמל ב 1 הרץ. התמונות של זמן לשגות נרכשו כל 20 ms עם עדשת 100X. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט 2: וידאו שקיעת זמן פלואורסצנטית של PSC-CMs האנושי עם ACTN2-mCherry תרבות על צלחת תרבות לא דפוס. PSC-CMs המביע ACTN2-mCherry על צלחת תרבות לא דפוס לא רק הראה חוסר ארגון של sarcomere, אלא גם הציג התכווצות מנופפת, אשר קשה לקבוע קיצור sarcomere. התאים היו מגורה עם חשמל ב 0.5 Hz ותמונות שנרכשו כל 10 ms עם עדשת 100X. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט 3: וידאו זמן לשגות פלואורסצנטית של PSC-CMs האנושי עם ACTN2-mCherry תרבות על צלחת תרבות בדוגמת. התרבות בדוגמת קידם יישור של sarcomere והכריח את התאים לצורת מוט. שיטה זו אפשרה את קיצור הסרקום ב- PSC-CMs להיקבע בקלות רבה יותר. הסרטון הושג על ידי גירוי התאים עם חשמל ב 0.5 הרץ. קצב המסגרות היה 100 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

קבצי CAD משלימים. קבצי CAD ליצירת בולים עם רצועות ברוחב 200 מיקרומטר וחריצים של 10 מיקרומטר (Stamp_200x10.dxf), 25 מיקרומטר (Stamp_200x25.dxf) ו 50 מיקרומטר (Stamp_200x50.dxf). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PSC-CMs יש פוטנציאל גדול להיות מנוצל כפלטפורמת מביהה כדי מודל מחלות לב ולבדוק את ההשפעות של תרופות. עם זאת, יש לקבוע תחילה שיטה מדויקת ומאוחדת להערכת פונקציות PSC-CMs. רוב הבדיקות התפקודיות עובדות עם PSC-CMs, למשל, אלקטרופיזיולוגיה, סידן ארעי, ומטבוליזם26, ואחד המחקרים הראשונים שמקורם בחולה PSC-CM היה על תסמונת QT ארוכה27. עם זאת, התכווצות, אחד התפקידים החשובים ביותר של cardiomyocyte, עדיין קשה להעריך. עם קרדיומיוציטים למבוגרים, קיצור sarcomere נמצא בשימוש נרחב. לעומת זאת, בשל סרקומר לא מפותח ולא מאורגן של PSC-CMs, השיטה הסטנדרטית לקיצור sarcomere אינה פועלת עם תאים אלה. לכן, הצגנו שיטה חלופית לבחינת קיצור סרקומר ב- PSC-CMs באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים. כפי שהודגם, חלבונים המותאמים לקו M (MYOM2) או Z-line (ACTN2, TCAP ו- PDLIM3) מותכים לחלבונים פלואורסצנטיים עבור גישה זו. הראינו גם כי חלבונים מתויגים פלואורסצנטית יכולים לבוא לידי ביטוי מלוצי אנדוגני או על ידי AAVs. AAVs מספקים גמישות רבה יותר להבעת חלבונים מתויגים פלואורסצנטית מאשר loci אנדוגני, כמו AAVs ניתן להחיל על כל סוג של PSC-CMs שמקורם בחולה. לעומת זאת, הבעת חלבונים מלוצי אנדוגני עשויה להיות בעלת השפעה פחותה על תפקוד הסרקומר, שכן רמת הביטוי של הגנים מוסדרת היטב ויכולה לשמש גם לניטור ההבשלה של PSC-CMs18.

למרות Myom2-TagRFP, ACTN2-mCherry, ו Lifeact שימשו כולם כדי לבחון את קיצור sarcomere16,18,19, עדיין לא ברור אם חלבונים אלה להפריע לתפקוד sarcomere. לאחרונה, Lifeact דווח להפריע ארגון actin ומורפולוגיה הסלולר28. חשוב גם לציין כי דפוסי היתוך (כלומר, אתר ההיתוך GFP ב- N-term או C-term של חלבון היעד) משפיעים גם על פונקציית הסרקום29. לכן, לפני שנעשה בהם שימוש נרחב, חשוב להעריך ביסודיות אם חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטי להפריע לתפקוד sarcomere והאם אינטראקציות חלבון חלבון להתרחש סרקומרים במבחנה, ב vivo, ו /או cardiomyocytes למבוגרים. רפרטואר זה של חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטית מספק נקודת התחלה טובה לאפשרויות עתידיות של הנדסת חלבונים (כלומר, קיצור חלבוני הסרקום לאותות לוקליזציה בלבד). בחירת חלבונים לתיוג היא מפתח נוסף להצלחה. תייגנו חלבון קו Z נוסף עם GFP, עם זאת, חלבון זה הציג רק הפצה ציטופלסמית במקום לוקליזציה לסרקומר. עבור הדמיה חיה, יציבות החלבון עשויה גם לשחק תפקיד, כמו, למשל, אם חלבון מתויג אינו יציב, רמת האות תהיה נמוכה יותר. הצילומים של החלבון הפלואורסצנטי חשובים גם הם, שכן אותות חלבון לא יציבים יורוו בקלות במהלך ההדמיה.

כדי לבחון את ההתכווצות של PSC-CMs באמצעות שיטות אחרות מאשר המתוארות, מדידות עקיפות של כוח שנוצר על ידי PSC-CMs (למשל, מערכי מיקרו-פוסט, מיקרוסקופיה כוח המתיחה) או תנועה (למשל, זיהוי תנועה ברזולוציה גבוהה באמצעות SI8000)11,12,13,14 ניתן להשתמש. השיטה שלנו יכולה להיות משולבת עם שיטות אלה או עם פוטנציאל פעולה מבוסס צבע / מדידות חולפות סידן. הגישה הקומבינטורית עשויה לספק מידע נוסף על האופן שבו מחלה גורמת לתפקוד לקוי ב- PSC-CMs שמקורם בחולים.

אחד האתגרים בצריכת sarcomere ב- PSC-CMs הוא למצוא סרקומר טוב שנע ליניארית, אחרת, התאים עשויים בקלות לרדת מהקו לגילוי sarcomere של SarcOptiM ולגרום לתוצאות קיצור סרקומר לא יציב. כאן, אנו מדגימים כי שימוש בתרבות בדוגמת שנוצרה עם חותמות PDMS עשוי לספק תנועת סרקומר יציבה וליניארית יותר. תרבות בדוגמת ידועה גם כדי לתמוך את ההתבגרות של PSC-CMs16, אשר חשוב עבור פונקציית sarcomere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

H.U. הגיש פטנט הקשור לכתב יד זה.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה באגף לרפואה רגנרטיבית באוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י על הדיון המועיל והסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי המענקים של הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED; JP18bm0704012 ו JP20bm0804018), האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS; JP19KK0219), וחברת התפוצה היפנית (המענק למחקר בסיסי) ל- H.U.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, NOF Corp. LIPIDURE-CM5206
2-Propanol Fujifilm wako 166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) ibidi 81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		 Takara 6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs N.A. We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
B-27 Supplement, minus insulin Thermo Fisher Scientific A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010
Benzonase (25 U/µL) Merck Millipore 70746
Blasticidin S Hydrochloride Fujifilm wako 029-18701
BMP-4, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 314-BP-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59) abcam ab142216
CAD drawing software, Robert McNeel and Associates, WA, USA Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 Sartorius VS2042
CHIR99021 Cayman 13122
Chromium etchant Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan N14B
Chromium mask coated with AZP1350 Clean Surface Technology Co., Japan CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) Takara 9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma-Aldrich D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate Sigma-Aldrich D5796
Ethanol (99.5) Fujifilm wako 057-00456
Fetal Bovine Serum Moregate 59301104
FGF-10, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant Fujifilm wako 060-04543
Gelatin from porcine skin powder Sigma-Aldrich G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates MatTek P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific 11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) Thermo Fisher Scientific 35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Fujifilm wako 196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) Nippi 892012
Mask aligner Union Optical Co., Ltd., Japan PEM-800
Maskless lithography tool NanoSystem Solutions, Inc., Japan D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) Merck Millipore SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18) N.A. Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
PD0325901 Stemgent 04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Petri dish Sansei medical co. Ltd 01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer Dow Corning Corp., MI, USA SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) Polyscience 24765-1
Positive photoresist developer Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
Proteinase K Takara 9034
Puromycin Dihydrochloride Fujifilm wako 166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein R&D Systems, Inc. 338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) Thermo Fisher Scientific 12604-039
RPMI1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875-119
Silicon wafer Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070
Spin-coater Mikasa Co., Ltd., Japan MS-A100
Spininng confocal microscopy Oxford Instruments Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) Fujifilm wako 195-16053
SU-8 3010 Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 3010
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 developer
Tris-EDTA Nippon Gene 314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant Fujifilm wako 226-01781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Tags

Medicine גיליון 169 תאי גזע פלוריפוטנטים קרדיומיוציט קיצור סרקומר הדמיה חיה חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים הדפסת מיקרו-קונטקט
קיצור סרקומר של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai,… More

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai, T., Koiwai, K., Murakami, T., Suzuki, H., Hanazono, Y., Uosaki, H. Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.. J. Vis. Exp. (169), e62129, doi:10.3791/62129 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter