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Medicine

सारकोमेरे फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का उपयोग करके प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का छोटा होना।

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62129
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 4, 4, 1, 1
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University
* These authors contributed equally

Summary

इस विधि का उपयोग फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन के साथ प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके सारकोमेरे छोटा करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (पीएससी-सीएम) दोनों भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम (ES/iPS) कोशिकाओं से उत्पादित किया जा सकता है । ये कोशिकाएं हृदय रोग मॉडलिंग के लिए आशाजनक स्रोत प्रदान करती हैं। कार्डियोमायोपैथी के लिए, सारकोमेरे छोटा करना मानक शारीरिक आकलन में से एक है जिसका उपयोग वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स के साथ उनकी बीमारी फेनोटाइप की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, उपलब्ध तरीके पीएससी-सीएम की संकुचन का आकलन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि इन कोशिकाओं ने अविकसित साकोमर हैं जो चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत अदृश्य हैं । इस मुद्दे को हल करने और पीएससी-सीएम के साथ सारकोमेरे छोटा करने के लिए, फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन और फ्लोरोसेंट लाइव-इमेजिंग का उपयोग किया गया था। पतली जेड-लाइन और एक एम-लाइन क्रमशः दोनों सिरों और एक सारकोमेरे के केंद्र में रहते हैं। जेड-लाइन प्रोटीन-α-ऐक्टिनिन (ACTN2), Telethonin (TCAP), और ऐक्टिन से जुड़े लिम प्रोटीन (PDLIM3)-और एक एम लाइन प्रोटीन-Myomesin-2 (Myom2)-फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया गया । इन टैग किए गए प्रोटीन को एंडोजेनस एलील्स से नॉक-इन या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) से व्यक्त किया जा सकता है। यहां, हम कार्डियोमायोसाइट्स के लिए माउस और मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, AAVs का उत्पादन करने के लिए, और प्रदर्शन और लाइव इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए तरीकों का परिचय । हम पीएससी-सीएम की एक पैटर्न वाली संस्कृति के लिए पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) टिकटों के उत्पादन के तरीकों का भी वर्णन करते हैं, जो फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन के साथ सारकोमेरे छोटा करने के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। सारकोमेरे छोटा का आकलन करने के लिए, बीटिंग कोशिकाओं की समय-चूक छवियों को विद्युत उत्तेजना (0.5-1 हर्ट्ज) के तहत एक उच्च फ्रेमरेट (50-100 फ्रेम प्रति सेकंड) पर दर्ज किया गया था। सेल संकुचन के दौरान सारकोमेरे लंबाई का विश्लेषण करने के लिए, रिकॉर्ड किए गए समय-चूक छवियों को सारकोप्टिम के अधीन किया गया था, जो इमेजजे/फिजी के लिए प्लग-इन था। हमारी रणनीति पीएससी-सीएम में हृदय रोग फेनोटाइप की जांच के लिए एक सरल मंच प्रदान करती है।

Introduction

हृदय रोग दुनिया भर में मृत्यु का प्रमुख कारण हैं1 और कार्डियोमायोपैथी हृदय से संबंधित मौतों के तीसरे कारण का प्रतिनिधित्व करता है2। कार्डियोमायोपैथी रोगों का एक सामूहिक समूह है जो हृदय की मांसपेशियों को प्रभावित करता है। प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं और कार्डियोमायोसाइट्स (पीएससी-सीएम) की ओर आईपीएस कोशिकाओं के निर्देशित-भेदभाव के हाल के घटनाक्रम कार्डियोमायोपैथी के एक इन विट्रो मॉडल के रूप में रोगी जीनोम के साथ कार्डियोमायोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए दरवाजा खोला है । इन कोशिकाओं का उपयोग हृदय रोगों के रोगविज्ञान को समझने, उनके आणविक तंत्र को स्पष्ट करने और विभिन्न चिकित्सीयउम्मीदवारोंका परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। ब्याज की एक जबरदस्त राशि है, इस प्रकार, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाएं उत्पन्न की गई हैं (उदाहरण के लिए, हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी [एचसीएम]4,5,अतालताजनक सही वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोपैथी [एआरवीसी]6,डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी [डीसीएम]7,और माइटोकॉन्ड्रियल-कार्डियो से संबंधित क्योंकि कार्डियोमायोपैथी की विशेषताओं में से एक सारकोमर की शिथिलता और व्यवधान है, एक वैध उपकरण जो समान रूप से सारकोमेरे कार्य को मापता है।

सारकोमेरे छोटा सारकोमेरे फ़ंक्शन और पशु मॉडल और मनुष्यों से प्राप्त वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स की संकुचन का आकलन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। सरकोमरे को छोटा करने के लिए, चरण-विपरीत के तहत दिखाई देने वाले अच्छी तरह से विकसित सारकोमों की आवश्यकता होती है। हालांकि, पीएससी-सीएम ने विट्रो डिस्प्ले में सुसंस्कृत अविकसित और अव्यवस्थित सारकोमर और इसलिए,10को छोटा करने के लिए सारकोमर को ठीक से मापने के लिए उपयोग करने में असमर्थ हैं। पीएससी-सीएम की संकुचनता का ठीक से आकलन करने में यह कठिनाई विट्रो मेंहृदय कार्यों का आकलन करने के लिए एक मंच के रूप में उनके उपयोग में बाधा डालती है । पीएससी-सीएम की अनुबंध अप्रत्यक्ष रूप से आकलन करने के लिए, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी, माइक्रो-पोस्ट सरणी, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी, और बाधा माप का उपयोग इन कोशिकाओंद्वारा अपने परिवेश11, 12,13पर किए गए गति के प्रभाव को मापने के लिए किया गया है। वास्तविक सेलुलर मोशन (जैसे, सोनी से SI8000) की अधिक परिष्कृत और कम आक्रामक वीडियो-माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग का उपयोग वैकल्पिक रूप से उनकी संकुचन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि, यह विधि सीधे सारकोमेरे गति या बल पीढ़ी की गति14को मापने के लिए नहीं है।

पीएससी-सीएम में सारकोमेरे मोशन को सीधे तौर पर मापने के लिए, फ्लोरोसेंट-टैगिंग से लेकर सरकोमेरे प्रोटीन जैसे नए दृष्टिकोण उभर रहे हैं । उदाहरण के लिए, लाइफएक्ट का उपयोग सारकोमेरे मोशन15, 16को मापने के लिए फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) को लेबल करने के लिए कियाजाताहै। आनुवांशिक रूप से संशोधित आईपीएस कोशिकाएं फ्लोरोसेंट प्रोटीन17, 18, 19द्वारा सारकोमेरे प्रोटीन (जैसे, α-ऐक्टिनिन [ACTN2] और मायोमसिन-2 [MYOM2]) को टैग करने के लिए एक और विकल्प हैं ।

इस पेपर में, हम वर्णन करते हैं कि Myom2-TagRFP (माउस भ्रूणीय स्टेम [ईएस] कोशिकाओं) और ACTN2-mCherry (मानव आईपीएस कोशिकाओं) का उपयोग करके सारकोमरे को छोटा करने के लिए समय-चूक इमेजिंग कैसे करें। हम यह भी बताते हैं कि एक नमूनों वाली संस्कृति सारकोमेरे संरेखण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, हम एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) का उपयोग करके सारकोमेरे लेबलिंग की एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करते हैं, जिसे रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाओं पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. माउस pluripotent स्टेम सेल का भेदभाव

  1. माउस ईएस कोशिकाओं का रखरखाव
    1. रखरखाव माध्यम: भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 मिलीएल मिश्रण, एल-एलेनिन-एल-ग्लूटामाइन के 5 मिलीएल, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए) के 5 मिलीएल, 100 मिलीएम सोडियम पायरुवेट के 5 एमएल, और ग्लासगो मिनिमम एसेंशियल (जीएम) के इथेनॉल के साथ 55 mm 2-Mercapto के 909 माइक्रोन। पूरक ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (एलआईएफ), चिर-99021, और PD0325901 क्रमशः 1000 यू/एमएल, 1 माइक्रोएम, और 3 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से माध्यम बंध्याकरण।
    2. एफबीएस माध्यम: एफबीएस के 55 एमएल, एल-एलेनिन-एल-ग्लूटामाइन के 5.5 एमएल, सोडियम पाइरुवेट के 5.5 एमएल और एनईएए के 5.5 एमएल से दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) हाई ग्लूकोज को मिलाएं। स्टरलाइज करने के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से माध्यम को छान लें।
    3. संस्कृति SMM18 माउस ES कोशिकाओं जिसमें TagRFP रखरखाव माध्यम में एक जिलेटिनीकृत 6 सेमी पकवान पर Myom2 लोकस में खटखटाया गया था के रूप में पहले18वर्णित है । हर 2-3 दिन में मार्ग।
  2. सीरम मुक्त भेदभाव (एसएफडी) माध्यम की तैयारी
    1. बेसल एसएफडी: हैम के एफ-12 के 250 एमएल, इस्कोव के संशोधित डल्बेको मीडियम (आईएमडीएम) के 750 एमएल, बी 27 के 10 एमएल सप्लीमेंट माइनस विटामिन ए, एन 2 सप्लीमेंट की 5 एमएल, एल-एलेनिन-एल-ग्लूटामाइन की 10 एमएल, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 10% गोजातीय सीरम एल्बुमिन की 5 एमएल और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०,००० यू/एमएल) की 10 एमएल । स्टरलाइज करने के लिए 0.22 माइक्रोन छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    2. आसुत पानी में 5 मिलीग्राम/एमएल पर एस्कॉर्बिक एसिड को भंग करें और स्टरलाइज करने के लिए 0.22 माइक्रोन छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    3. आईएमडीएम के 1-थिओग्लिसेरोल से 1 एमएल के तनु 13 माइक्रोन। इसके साथ ही, इस पतला 1-थिओग्लिसेरोल को एमटीजी के रूप में देखें।
    4. उपयोग के दिन 10 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड (5 मिलीग्राम/एमएल) और एमटीजी के 3 माइक्रोन को बेसल एसएफडी के 1 एमएल में जोड़ें। इसके साथ, इस मिश्रण को पूर्ण एसएफडी के रूप में देखें।
  3. 0 दिन, भ्रूण शरीर (ईबी) भेदभाव के लिए गठन
    1. हार्वेस्ट SMM18 माउस ईएस कोशिकाओं को एक रीकॉम्बिनेंट ट्राइप्सिन-जैसे प्रोटीज (आरट्रीप्सिन) के साथ और कोशिकाओं की गिनती करें।
    2. सेंट्रलाइज 5 x 105 कोशिकाएं 300 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस में 3 मिनट के लिए, पूर्ण एसएफडी के 10 एमएल में रीसुस्पेंड और 10-सेमी पेट्री डिश में बीज। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं और 5% सीओ2 के लिए 50 घंटे।
  4. भेदभाव दिवस 2
    1. क्रमशः 5 एनजी/एमएल, 5 एनजी/एमएल, और १.९ एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर एसएफडी को पूरा करने के लिए एक्टिविन ए, ह्यूमन वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (एचवीईजीएफ), और बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 (बीएमपी4) जोड़ें ।
      नोट: BMP4 सांद्रता BMP4 के बहुत पर निर्भर करता है अलग हो सकता है। एक नए लॉट का उपयोग करने से पहले एक छोटे पैमाने पर परीक्षण में कई सांद्रता का परीक्षण करें और हृदय भेदभाव के लिए सबसे अच्छी एकाग्रता निर्धारित करें।
    2. एक पेट्री डिश से 15 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में 50-100 एक्स ग्राम पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ईबीएस ट्रांसफर करें ।
    3. इस बीच, शेष ईबी ड्राई होने की रक्षा के लिए पेट्री डिश में चरण 1.4.1 में तैयार माध्यम जोड़ें।
    4. 15 एमएल ट्यूब से सुपरनेट को एस्पिरेट करें, पेट्री डिश में माध्यम के साथ ईबी को फिर से खर्च करें, और ईबी समाधान को डिश में वापस स्थानांतरित करें। इसके बाद 46 घंटे के लिए ईबी को 37 डिग्री सेल्सियस और 5 फीसदी सीओ2 पर खेती करें।
  5. भेदभाव दिवस 4
    1. जिलेटिन कम से कम 5 मिनट के लिए 0.1% जिलेटिन के 5 से 10 मिलीएल के साथ 10 सेमी ऊतक संस्कृति का इलाज पकवान। सीडिंग कोशिकाओं से ठीक पहले जिलेटिन को एस्पिरेट करें।
    2. मध्यम तैयार करें: क्रमशः 5 एनजी/एमएल, 25 एनजी/एमएल, और 5 एनजी/एमएल अंतिम सांद्रता पर एसएफडी को पूरा करने के लिए बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएमएफजीएफ), एफजीएफ 10, और एचवीईजीएफ को मिलाएं । 10 सेमी डिश के लिए 10 एमएल तैयार करें।
    3. पेट्री डिश से कोशिकाओं को 15-एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। पेट्री डिश में पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें, कई बार धोएं, और शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 15-एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 50-100 x g, 4 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट पर सेंट्रलाइज।
    4. एस्पिरेट सुपरनेट, आरट्रीपिन के 1 एमसीएल जोड़ें, और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. भंवर संक्षेप में ईबी को अलग करने के लिए, 10% एफबीएस माध्यम के 9 मिलीएल जोड़ें, भंवर फिर से, और कोशिकाओं की गिनती।
    6. 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज 1.5 x 107 कोशिकाएं, 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, चरण 1.4.2 में तैयार मीडिया के साथ पुनर्सीम व्यय, और जिलेटिनीकृत पकवान में बीज। 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट।
      नोट: 7 या 8 दिन तक पीएससी-सीएम की व्यापक पिटाई देखी जा सकती है ।
  6. भेदभाव के दिनों में दवा चयन 7 और 9: 7 और 9 दिन में गैर-कार्डियोमायोसाइट्स को खत्म करने के लिए प्यूरोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता में 2 μg/mL) के साथ मीडिया को फिर से शिक्षित करें।
    नोट: SMM18 की पैतृक लाइन syNP4 माउस ES कोशिकाओं है, NCX1 प्रमोटर संचालित प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी जीन20शरण ।
  7. 10 दिन, भविष्य के प्रयोगों के लिए प्रतिशोध
    1. एक ग्लास-बॉटम कल्चर प्लेट या 35 एमएम इमेजिंग डिश को कोट करें जिसमें 0.1% जिलेटिन के साथ पॉलीमर कवरलिप होता है। परिपक्वता बढ़ाने के लिए, कमरे के तापमान 18 पर 30-60 मिनट के लिए 1 μg/सेमी2 पर लैमिनिन-511 E8 टुकड़ा (LN511-E8) के साथ व्यंजन कोट । रुचि के विशिष्ट पैटर्न में पीएससी-सीएम संस्कृति के लिए, कृपया पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) टिकटों को तैयार करने के लिए चरण 4 और 5 का उल्लेख करें।
    2. SMM18 पीएससी-सीएम की फसल के लिए, पीबीएस के साथ दो बार डिश धोएं, आरट्रीप्सिन की 1 एमएल लगाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट इनक्यूबेट करें।
    3. 10% एफबीएस माध्यम के 9 एमएल में कोशिकाओं को इकट्ठा करें, निलंबित करें, और कोशिकाओं की गिनती करें। एक 35 मिमी इमेजिंग डिश में एक 24 अच्छी तरह से प्लेट या 250,000-500000 कोशिकाओं के एक कुएं में 50,000-100,000 कोशिकाओं में कोशिकाओं की थाली।
    4. सेंट्रीफ्यूज पर्याप्त संख्या में कोशिकाएं (300 x ग्राम, 3 मिनट) और एफबीएस (10% पर अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक पूर्ण एसएफडी के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    5. रातोंरात इनक्यूबेट करें और प्यूरोमाइसिन के साथ एसएफडी को पूरा करने के लिए संस्कृति माध्यम को बदलें।
    6. 14 दिन से, संस्कृति माध्यम को 21-28 दिन तक पूर्ण एसएफडी के साथ सप्ताह में दो से तीन बार बदलें, जब Myom2-RFP प्रमुख हो जाता है। फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन के एएवी-आधारित ट्रांसडक्शन के लिए, कृपया चरण 3 का उल्लेख करें।

2. मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव

  1. भेदभाव मीडिया की तैयारी
    1. RPMI +B27-Ins: आरएमआई 1640 मध्यम के 500 एमएल, बी 27 माइनस इंसुलिन के 10 एमएल और एल-एलेनिन-एल-ग्लूटामाइन के 5.25 मिलियन एमएल मिलाएं।
    2. RPMI +B27+Ins: आरएमआई के 500 एमएल, बी 27 पूरक के 10 एमएल और एल-एलेनिन-एल-ग्लूटामाइन के 5.25 मिलियन एमएल मिलाएं।
  2. मानव आईपीएस कोशिकाओं का रखरखाव
    1. कुछ संशोधनों के साथ पहले प्रकाशित विधि के बाद एलएन 511-E8 पर AK02N के साथ सप्ताह में दो बार मानव आईपीएसकोशिकाओंका मार्ग ।
    2. आरट्रीपिन के 3 मिनट के उपचार के साथ हार्वेस्ट कोशिकाएं और 10% एफबीएस माध्यम में एकत्र होती हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र गिनती। बीज 75,000-125,000 कोशिकाओं के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से 2 मिलीएल के साथ AK02N LN511-E8 और Y27632 के अंतिम एकाग्रता में 0.5 μg/mL (0.1 μg/सेमी2)और 10 μM, क्रमशः ।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें और अगले दिन माध्यम को बिना किसी पूरक के AK02N के 2 मिलील के साथ बदलें। हर दो से तीन दिन में मीडिया बदलें और हर तीन से चार दिन में बीतें।
  3. दिन-4: भेदभाव से पहले प्रतिशोध
    1. पीबीएस में पतला LN511-E8 के ०.५ μg/सेमी 2 के साथ एक 6 अच्छीतरह से थाली कोट । फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट और कमरे के तापमान पर 5% सीओ2 या 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सीडिंग कोशिकाओं से ठीक पहले एस्पिरेट कोटिंग समाधान।
    2. आरट्रीप्सिन के साथ मानव आईपीएस कोशिकाओं को काटा और चरण 2.2.2 में कोशिकाओं की गणना करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 3 मिनट के लिए 6-वेल प्लेट के कुएं के लिए सेंट्रलाइज 1.25 x 105 कोशिकाएं और AK02N पूरक के 2 एमएल में रीसुस्पेंड LN511-E8 के साथ ed (अंतिम एकाग्रता ०.५ μg/mL या ०.१ μg/cm2)और Y27632 (अंतिम एकाग्रता 10 μM) प्रति अच्छी तरह से ।
    4. एस्पिरेट कोटिंग समाधान, बीज कोटेड प्लेट में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
  4. दिन -3 और -1: AK02N के 2 एमएल के साथ मध्यम की जगह।
  5. दिन 0: अंतर शुरू करने के लिए प्रति अच्छी तरह से CHIR99021 (अंतिम एकाग्रता 6 μM) के साथ पूरक RPMI + B27-Ins के 2 एमसीएल के साथ मध्यम की जगह ।
  6. दूसरा दिन: मध्यम को आरपीएमटी + बी27-आईएनएस के 2 एमसीएल के साथ WNTC59 (अंतिम एकाग्रता 2 μM) के साथ अच्छी तरह से बदलें।
  7. दिन 4: आरएमआई + B27-Ins के 2 एमएल के साथ माध्यम की जगह अच्छी तरह से ।
  8. दिन 7 और दिन 9: मध्यम को आरएमआई + बी27 + आईएनएस के 2 एमसीएल के साथ प्यूरोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 10 μg/l) के साथ प्रति अच्छी तरह से चुनिंदा संस्कृति पीएससी-सीएम के साथ प्रति की जगह ।
    नोट: ACTN2-mCherry लाइन, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया, आंतरिक राइबोसोमल प्रवेश स्थल (IRES), puromycin प्रतिरोधी जीन TNNT2 लोकस के 3′-अअनुवादित क्षेत्र (यूटीआर) के लिए डाला, और ACTN2 के स्टॉप कोडन की जगह mCherry की एक कैसेट है । नॉक-इन के बिना कार्डियोमायोसाइट को शुद्ध करने के लिए, कृपया चरण 3 और 4 का उल्लेख करें।
  9. 10 दिन: भविष्य के प्रयोगों के लिए प्रतिशोध
    1. कोट एक बहुलक कवरलिप के साथ एक 35 मिमी इमेजिंग डिश 0.5-1 μg/सेमी2 के साथ LN511-E8 0.1% जिलेटिन में पतला। लंबे समय तक व्यवहार्यता के लिए कमरे के तापमान पर 2-4 घंटे इनक्यूबेट। पीएससी-सीएम को वांछित पैटर्न में संस्कृति के लिए, कृपया पीडीएमएस टिकट तैयार करने के लिए चरण 4 और 5 का उल्लेख करें।
    2. मानव पीएससी-सीएम की कटाई के लिए, पीबीएस के साथ दो बार डिश धोएं, प्रति अच्छी तरह से 1 मिलियन आरट्रीपिन लागू करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट को इनक्यूबेट करें।
    3. 10% एफबीएस माध्यम के 4 एमएल में कोशिकाओं को ले लीजिए, निलंबित करें, और कोशिकाओं की गिनती करें। प्लेट 250,000-500,000 कोशिकाओं प्रति 35 मिमी इमेजिंग डिश।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर पर्याप्त संख्या में कोशिकाएं, प्यूरोमाइसिन (10 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ आरपीआई +बी27 + आईएनएस के साथ पुनर्सर्ण और लेपित 35 मिमी इमेजिंग डिश पर प्लेट।
    5. रात भर इनक्यूबेट। अगली सुबह, प्यूरोमाइसिन (10 μg/mL) के साथ आरपीआई + B27 + Ins के साथ संस्कृति माध्यम की जगह ।
    6. 14 दिन से, इमेजिंग के लिए दिन 21-28 तक RPMI + B27 + Ins के साथ एक सप्ताह में 2-3 बार संस्कृति माध्यम बदलें । फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन के एएवी-आधारित ट्रांसडक्शन के लिए, कृपया चरण 3 का उल्लेख करें।

3. एडेनो से जुड़े वायरस का उपयोग कर सारकोमर की फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. एएवी उत्पादन से पहले तैयारी
    1. डीएमईएम में HEK293T कोशिकाओं को 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेट पर एफबीएस (अंतिम एकाग्रता 10%) के साथ पूरक बनाए रखें। सप्ताह में तीन बार पैसेज कोशिकाएं।
    2. 1 मिलीग्राम/एमएल पर पॉलीथीनमाइन (पीई) तैयार करें। इसमें 50 मिलीग्राम पॉलीथीनमाइन मैक्स 40000 और 40 एमएल अल्ट्रापुरे पानी मिलाएं। पीएच को 1 एन नाओएच का उपयोग करके 7.0 पर समायोजित करें। फिर, अल्ट्रापुरे पानी के साथ 50 एमएल तक अंतिम मात्रा बनाएं और 0.22 माइक्रोन छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    3. एक सारकोमेरे लेबलिंग जीन के साथ एक शटल वेक्टर तैयार करें (उदाहरण के लिए, टीकैप या पीडीलिम3 एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन [जीएफपी] के साथ जुड़े हुए, जो कार्डियोमायोसाइट-विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित है, जैसे कार्डियक ट्रोपोनिन टी (सीटीएनटी)22।
      नोट: इस उदाहरण के लिए, हम V163A, S202T, L221V23के उत्परिवर्तन के साथ मोनोमेरिक बढ़ाया GFP का इस्तेमाल किया ।
  2. दिन 0, मार्ग HEK कोशिकाओं
    1. जब कोशिकाएं संकुचन तक पहुंचती हैं, तो 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 20 एमएल के साथ 15 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेट में 2.0 x 107 HEK293T कोशिकाओं को पारित करें।
  3. दिन 1, ट्रांसफैक्शन
    1. शटल वेक्टर के 13.5 माइक्रोन, 26 माइक्रोन ऑफ फीपर (एडेनोवायरस का वेक्टर कोडिंग ई 2ए, ई 4, और वीए), पीआरसी 6 का 16.5 माइक्रोग्राम (एक वेक्टर कोडिंग एवीवी 2 प्रतिनिधि और एवीवी 6 कैप जीन), और सोडियम पाइरवेट (डीएमईएम-पाइर) के बिना डीएमईएम का 1 एम एलएल मिलाएं।
    2. पीई के 224 माइक्रोन (1 मिलीग्राम/एमएल, स्टेप 3.1.2 में तैयार) और डीएमईएम-पायर के 776 माइक्रोन मिलाएं।
    3. प्लाज्मिड समाधान और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पी समाधान को मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    4. स्टेप 3.2 में तैयार HEK293T कोशिकाओं में प्लाज्मिड/पीई समाधान जोड़ें।
  4. दूसरा दिन, मध्यम परिवर्तन
    1. ट्रांसफेक्शन के बाद 24 घंटे में, माध्यम को डीएमईएम-पाइर में बदलें। 7 दिन पर एएवी की कटाई तक संस्कृति कोशिकाएं। एएवी संस्कृति मीडिया में जारी किया जाएगा ।
  5. 7 दिन, एएवी संग्रह, एकाग्रता, और बफर प्रतिस्थापन न्यूनतम शुद्धिकरण विधि का उपयोग करके24
    1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में 1% बीएसए के 5 मिलील के साथ एक अपकेंद्रित्र अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट (100k आणविक वजन कट ऑफ [MWCO]) को इनक्यूबेट करें। फिर, 2 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट को अपकेंद्रित्र करें और फ़िल्टर किए गए और शेष समाधान दोनों को एस्पिरेट करें।
    2. 15 सेमी डिश से मध्यम स्थानांतरण जो एएवी को एक नई 50mL शंकु नली और अपकेंद्रित्र (500 x g, 5 मिनट) में उत्पादित करता है। सेल मलबे को हटाने और अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाई पर निलंबन लागू करने के लिए 0.45 माइक्रोन सिरिंज छन्नी के माध्यम से सुपरनेट को फ़िल्टर करें।
    3. 90 मिनट के लिए 2000 x ग्राम पर या संस्कृति सुपरनैंट 0.5 से 1 मिलियन तक ध्यान केंद्रित करने तक सेंट्रलाइज।
    4. फिलट्रेट को एस्पिरेट करें और अल्ट्राफिल्ट्रेशन यूनिट में पीबीएस के 15 एमएल लागू करें।
    5. जब तक ध्यान 0.5-1 डिग्री हो जाता है अपकेंद्रित्र दोहराएं।
    6. दोहराएं 3.5.4 और 3.5.5.
    7. एक नई 1.5 एमएल ट्यूब पर केंद्रित एएवी स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: AAV P1 सुविधाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन स्थानीय नियमों और विनियमों का पालन करें । एएवी पारंपरिक तरीकों से भी उत्पादित किया जा सकता है।
  6. एएवी टाइटर की गणना
    1. एएवी के 5 माइक्रोन, डीएमईएम-पाइर के 195 माइक्रोन, और बेंजोनेज के 10 यू और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. प्रोटीन के 200 माइक्रोन के बफर (0.02 एम ट्राइस एचसीएल और 1% एसडीएस) और 5 माइक्रोन प्रोटीन के (20 मिलीग्राम/एमएल) और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़ें।
    3. ध्यान से एक 25:24:1 फिनोल/क्लोरोफॉर्म/आइसोअमिल अल्कोहल समाधान, 1 मिनट के लिए भंवर, और 1 मिनट के लिए २०,००० एक्स ग्राम पर अपकेंद्रित्र के ४०० μL तैयार करें ।
    4. जलीय चरण के 200 μL को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, जो मूल एएवी जीनोम का लगभग आधा निकलेगा।
    5. ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम/एमएल) के 1 माइक्रोन को 3 एम सीएच3कोओना (पीएच 5.2) और भंवर के 20 माइक्रोन में जोड़ें। 2-प्रोपेकोल के 250 माइक्रोनल को 100% इथेनॉल और भंवर के 100 माइक्रोन में फिर से जोड़ें।
    6. 15 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रलाइज।
    7. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और ट्यूब में 70% इथेनॉल जोड़ें। फिर, 20,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    8. एस्पिरेट सुपरनेट और हवा सूखी जब तक गोली स्पष्ट हो जाता है।
    9. एएवी जीनोम को हल करने के लिए ट्रिस-एथिलेंडियामाइनेट्राएकेटिक एसिड (टीई; पीएच 8.0) के 200 माइक्रोल जोड़ें। फिर, ते के साथ नमूना 100 गुना पतला करें।
    10. 109 वेक्टर जीनोम (वीजी)/μL प्राप्त करने के लिए ते के साथ 6.5 एनजी/μL पर PAAV-CMV-वेक्टर के साथ एक मानक तैयार करें। इसके बाद टीई के साथ 10 से 108 तक10 गुना कमजोर पड़ने की सीरीज बनाएं।
    11. नमूना डीएनए (या मानकों), प्राइमर (5 माइक्रोन) के 0.4 माइक्रोन, आसुत पानी के 3.6 माइक्रोन, और एसआईबीआर ग्रीन मास्टर मिश्रण के 5 माइक्रोन के 1 माइक्रोन मिलाएं। आईटीआर पर स्थित प्राइमर, 5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3 ' और 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'।
    12. निम्नलिखित शर्तों के साथ वास्तविक समय पीसीआर करें: 60 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक डेनैच, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 40 चक्र, और 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग और विस्तार, इसके बाद पिघलने वाले वक्र।
    13. मानकों और सीटी मानों के आधार पर, एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन एक नमूने के 1 माइक्रोन में वेक्टर जीनोम की कॉपी संख्या प्रदान करती है। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके मूल एएवी टाइटर की गणना करें: वास्तविक समय पीसीआर (vg/μL) x 8 x 103 x 2 द्वारा प्रदान की गई एक कॉपी संख्या, जिसमें एवीवी जीनोम अलगाव के दौरान एक कमजोर पड़ने के कारक के रूप में 8 x10 3, और 2 एएवी (एकल स्ट्रैंड) और प्लाज्मिड (डबल स्ट्रैंड) के अंतर कारक के रूप में।
  7. पीएससी-सीएम में ट्रांसडक्शन
    1. पीएससी-सीएम को अतिरिक्त कुएं या अतिरिक्त पकवान में गिनें।
    2. पीबीएस के साथ 50 माइक्रोन बनाने के लिए तनु एएवी (1 x 104 से 1 x 106 वीजी/सेल) । 1 x 104 से 1 x 106 वीजी/सेल की बहुलता पर एएवी लागू करें पीएससी-सीएम और कल्चर पीएससी-सीएम के लिए संबंधित भेदभाव मीडिया में एएवी के साथ 3 दिन के लिए माउस और ह्यूमन पीएससी-सीएम के लिए इसी विभेदन मीडिया में, फिर मीडिया को बिना एएवी के कल्चर मीडियम में बदलें।
    3. 7 दिन या उससे अधिक पोस्ट-ट्रांसफेक्शन के बाद लाइव सेल इमेजिंग के लिए पीएससी-सीएम का इस्तेमाल करें।

4. पीएससी-सीएम का एएवी आधारित शुद्धिकरण

  1. एएवी की तैयारी
    1. सीटीएनटी प्रमोटर के नियंत्रण में ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोधी जीन को व्यक्त करते हुए शटल वेक्टर का उपयोग करके स्टेप 3 में वर्णित एएवी तैयार करें।
  2. आईपीएस कोशिकाओं में अंतर करने के लिए स्थानांतरण
    1. चरण 2 में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद 4 दिनों के लिए मानव आईपीएस कोशिकाओं में अंतर करें और एक अतिरिक्त कुएं में कोशिकाओं की संख्या गिनें।
    2. 4 दिन में माध्यम बदलने के बाद, RPMI + B27-Ins मीडिया में पीएससी में अंतर करने के लिए 1 x10 5 vg/सेल के एमओआई पर AAVs लागू करें ।
    3. 7 दिन में, RPMI + B27 + Ins के साथ ताज़ा माध्यम और ब्लास्टिसिडिन के 2.5-10 μg/mL जोड़ें ।
    4. 10 दिन में पीएससी-सीएम को रिलेट करने की तैयारी है ।

5. पीडीएमएस टिकटों की तैयारी

  1. कंप्यूटर-एडेड डिजाइन (सीएडी) ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्ट्रिप्स के बीच में 10-25 माइक्रोन ग्रूव के साथ 200 माइक्रोन स्ट्रिप्स के डिवाइस पैटर्न को डिजाइन करें।
  2. एक मास्कलेस लिथोग्राफी उपकरण की यूवी लाइट का उपयोग करके AZP1350 के साथ लेपित क्रोमियम फोटोमास्क पर उपकरणों के पैटर्न को आकर्षित करें।
  3. सकारात्मक फोटोरेसिस्ट डेवलपर (जैसे, क्रोमियम etchant) की एक श्रृंखला में फोटोमास्क पर पैटर्न विकसित करें और डीआई पानी के साथ कुल्ला करें।
  4. 15 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर एक सिलिकॉन वेफर निर्जलित करें।
  5. वेफर को कमरे के तापमान और स्पिन-कोट को ठंडा करने की अनुमति दें एक नकारात्मक फोटोरेसिस्ट एसयू-8 3010 स्पिन-कोटर का उपयोग करके 30 एस के लिए 1500 आरपीएम के साथ 10-20 माइक्रोन की ऊंचाई बनाने के लिए।
  6. सॉफ्ट ने निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार गर्म प्लेट पर दो चरणों में वेफर को बेक किया।
  7. वेफर कमरे के तापमान के लिए ठंडा होने के बाद, मुखौटा संरेखक पर वेफर लोड करें।
  8. वेफर पर मास्क को संरेखित करने और यूवी प्रकाश के लिए वेफर को बेनकाब करने के लिए एक मुखौटा संरेखक का उपयोग करें।
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक गर्म थाली पर दो चरणों में वेफर के बाद एक्सपोजर सेंकना आचरण करें।
  10. एसयू-8 डेवलपर और 2-प्रोपनॉल की एक श्रृंखला में वेफर विकसित करें, फिर नाइट्रोजन स्ट्रीम के साथ वेफर को सुखाएं।
  11. वेफर को उपयुक्त आकार की पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  12. पीडीएमएस इलास्टोमर और उसके इलाज एजेंट को 10:1 w/w अनुपात में मिलाएं और मिश्रण को पेट्री डिश में डालें ।
  13. एक डक्षेर में पीडीएमएस को तब तक डेगास करें जब तक कि सभी हवा के बुलबुले गायब न हो जाएं, फिर 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर पीडीएमएस का इलाज करें।
  14. ठीक पीडीएमएस को चिमटी का उपयोग करके मास्टर मोल्ड से छील लें, फिर डिजाइन के साथ हिस्से को पीडीएमएस स्टैंप के रूप में काट लें।
    नोट: आकार वर्ग हो सकता है, हालांकि, एक अष्टकोणीय आकार पैटर्न को किनारे पर बेहतर स्थानान्तरण करता है।

6. pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की नमूनों संस्कृति

  1. ठीक टेप का उपयोग कर पीडीएमएस टिकटों की सतह से धूल हटा दें।
  2. बंध्याकरण करने के लिए टिकटों को 70% इथेनॉल में जलमग्न करें। फिर, एक एयर डस्टर का उपयोग कर टिकटों की सतह से इथेनॉल उड़ा।
  3. पीडीएमएस टिकटों की सतह पर 05 डब्ल्यूटी% 2- मेथाक्रिलोक्सीथिल फॉस्फोरिलकोलिन (एमपीसी) पॉलीमर/इथेनॉल के 5-10 माइक्रोन लगाएं।
    नोट: एमपीसी बहुलक के असमान वितरण एक बाधित पैटर्न का कारण बन सकता है ।
  4. एमपीसी बहुलक पूरी तरह से सूख जाने तक 10-30 मिनट इनक्यूबेट करें।
  5. टिकटों को ग्लास-बॉटम कल्चर प्लेट या पॉलीमर कवरस्लिप के साथ 35 एमएम इमेजिंग डिश के कवरस्लिप के संपर्क में रखें और 10 मिनट के लिए स्टांप पर एक वजन (जैसे, एएए बैटरी) डाल दें।
  6. वजन और टिकटों को हटा दें। इसके बाद इस बात की पुष्टि करें कि पैटर्न माइक्रोस्कोप के तहत ट्रांसफर किया गया है।
    नोट: मुद्रांकित प्लेटें/व्यंजन कमरे के तापमान पर 1 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है ।
  7. दो बार पीबीएस के साथ मुहर लगी कुओं/व्यंजनों को धोएं ।
  8. पतला LN511-E8 PBS के साथ 2-4 μg/mL पर और कोट LN511-E8 के साथ डिश 0.5-1 μg/सेमी2पर । मानव पीएससी-सीएम के लिए, पीबीएस के बजाय 0.1% जिलेटिन समाधान के साथ एलएन 511-ई8 को पतला करें। फिर, कम से कम 1 घंटे (इष्टतम, 4 घंटे से अधिक) के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. प्लेट कोशिकाओं के रूप में पिछले वर्गों में वर्णित है।

7. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत सारकोमर की समय-चूक इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप, संबद्ध कंप्यूटर और सभी आवश्यक परिधीयों को चालू करें और कनेक्ट करें।
  2. समय-चूक इमेजिंग करने के लिए, उच्चतम आवर्धन (तेल एमरशन के साथ 100X उद्देश्य लेंस) के साथ समय-चूक छवियों को कैप्चर करें।
  3. लाइव इमेजिंग शर्तों का चयन करें। अच्छा प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए, उच्चतम फ्रेमरेट (न्यूनतम 20 एमएस या 50 फ्रेम प्रति सेकंड की सिफारिश की जाती है) में समायोजित करने का प्रयास करें। शटर को खुला सेट करें और समय-चूक इमेजिंग के दौरान छवियों के बीच सबसे कम अंतराल प्राप्त करने के लिए एक आवश्यक बिनिंग (4 X 4) और अधिग्रहण क्षेत्र की फसल लागू करें।
    नोट: सेटिंग माइक्रोस्कोप के विन्यास के आधार पर भिन्न हो सकती है। कैमरे को उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता है और डेटा को कनेक्टेड पीसी में काफी तेजी से स्थानांतरित करने में सक्षम है। इस उद्देश्य के लिए, हमने कैमरा-लिंक के साथ ORCA फ्लैश का उपयोग किया। हमने एक कताई कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का परीक्षण किया है और प्रति सेकंड 400 फ्रेम पर छवियों का अधिग्रहण किया है।
    1. [वैकल्पिक] यदि कोशिकाओं की धड़कन दर कम है, तो विद्युत क्षेत्र उत्तेजना द्वारा कोशिकाओं को पैदा करें।
  4. समय-चूक रिकॉर्ड चलाएं
    1. सुनिश्चित करें कि समय-चूक छवि रिकॉर्ड करने के दौरान चित्रित फ़ील्ड फोकस में रहें.
    2. एक उपयुक्त फ़ोल्डर में समय-चूक छवियों को सहेजें।

8. SarcOptiM, एक ImageJ/फिजी प्लगइन का उपयोग कर समय चूक इमेजिंग का विश्लेषण

  1. इमेजजे में समय-चूक छवियों की एक श्रृंखला लोड करें। ओलंपस वीवीएसी प्रारूप के लिए, ओलंपसViewer प्लगइन के माध्यम से फाइलें खोलें।
  2. सरकोमेरे पैटर्न को स्पष्ट रूप से देखने के लिए छवि की चमक और विपरीत को समायोजित करें(छवि | | समायोजित करें ब्राइटनेस/कंट्रास्ट)।
  3. अधिक उपकरण मेनू (>>) पर क्लिक करके और SarcOptiM का चयन करके सरकOptiM खोलें।
  4. टूलबार पर सीटीआरएल + शिफ्ट + पी और 1 माइक्रोन बटन दबाकर और संवाद बक्से के निर्देशों का पालन करके कार्यक्रम को कैलिब्रेट करें।
  5. सारकोमेरे के क्षेत्र में एक लाइन खींचें जिसका उपयोग सारकोमेरे छोटा करने के लिए किया जाएगा।
  6. टूलबार पर सिंगलसेल (एवीआई) दबाकर सारकोमेरे छोटा विश्लेषण शुरू करें। प्रतिनिधि डेटा चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है ।

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Representative Results

पीएससी-सीएम रिपोर्टर लाइनों में दस्तक का उपयोग कर sarcomere छोटा मापने । सारकोमेरे-लेबल पीएससी-सीएम का उपयोग सारकोमेरे छोटा करने के लिए किया जाता था । लाइनें अंतर्जात लोकी से Myom2-RFP और ACTN2-mCherry व्यक्त करते हैं । टैगआरएफपी को मायओ 2में डाला गया था, जो एम-लाइन पर स्थानीयकरण करने वाले एम-प्रोटीन को कोडिंग करता है, जबकि रीचेरी को ACTN2में खटखटाया गया था, कोडिंग α-Actinin, जो जेड-लाइन18,25के लिए स्थानीयकरण करता है। समय चूक छवियों को प्राप्त किया गया और के रूप में आंकड़े 1 और 2 और फिल्म 1-3 में प्रस्तुत sarcomere छोटा निर्धारित करने केलिए इस्तेमाल किया ।

पीएससी-सीएम के अव्यवस्थित सरकोने को दूर करने के लिए धारी पैटर्न में पीएससी-सीएम को कल्चर करने के लिए विशिष्ट पीडीएस टिकटों का इस्तेमाल किया गया । इस नमूनों वाली संस्कृति ने गैर-पैटर्न क्षेत्र(आंकड़े 2B और 2C)में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में एक विस्तारित सेल आकार और अधिक संगठित सारकोमेरे पैटर्न को बढ़ावा दिया। इस लाभ के साथ, पैटर्न वाली संस्कृति ने कोशिकाओं के बेहतर संकुचन को बढ़ावा दिया और फिल्मों 2 और 3 और चित्रा 2डी में दिखाए गए एक चिकनी सारकोमेरे लंबाई प्रोफ़ाइल प्रदान की।

एएवी वैक्टर का उपयोग करके जेड-लाइन प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग। नॉक-इन आईपीएस कोशिकाओं को उत्पन्न किए बिना पीएससी-सीएम की जेड-लाइन की कल्पना करने के लिए, फ्लोरोसेंट-टैग किए गए जेड-लाइन प्रोटीन एएवी ट्रांसडक्शन का उपयोग करके व्यक्त किए गए थे । जीएफपी के साथ छोटे जेड-लाइन प्रोटीन, टेलीथोनिन (टीकैप) और ऐक्टिन से जुड़े लिम प्रोटीन (PDLIM3) में से दो को एएवी6 कैप्सिड(चित्रा 3 ए)का उपयोग करके टैग और पैक किया गया था। एक बार पीएससी-सीएम को विभेदित और शुद्ध किया गया, एएवी को पीएससी-सीएम(चित्रा 3B)में स्थानांतरित कर दिया गया । ट्रांसड्यूडेड पीएससी-सीएम ने तीन दिन बाद ट्रांसक्यूशन(आंकड़े 3सी और 3डी)के रूप में पीएससी-सीएम के साथ सारकोमरिक जीएफपी सिग्नल व्यक्त किए । आमतौर पर, 105 वीजी/सेल के एमओआई में एएवी का ट्रांसडक्शन फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमरे प्रोटीन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त है और एक उच्च टाइटर जीएफपी के गैर-विशिष्ट स्थानीयकरण को साइटोप्लाज्म का कारण बन सकता है, हालांकि यह समग्र जीएफपी तीव्रता को बढ़ाता है।

एएवी वैक्टर का उपयोग कर पीएससी-सीएम की शुद्धि। वर्तमान तरीके दवा चयन कैसेट पर भरोसा करते हैं जो पहले से ही पीएससी-सीएम के जीनोम पर है, या तो ट्रांसजेनिक या नॉक-इन लाइन। हालांकि, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाओं से ऐसी लाइन का उत्पादन करना श्रम-प्रधान है। चूंकि एएवी वैक्टर को नॉक-इन की आवश्यकता के बिना फ्लोरोसेंट-लेबल वाले जेड-लाइन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए प्रदर्शित किया गया है, इसलिए हमने नॉक-इन(चित्रा 4)के बिना शुद्धिकरण विधि स्थापित करने की मांग की। इस उद्देश्य के लिए, एक नया एएवी वेक्टर, जो सीटीएनटी प्रमोटर के नियंत्रण में ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोधी जीन को एन्कोड करता है,(चित्र 4 ए)का निर्माण किया गया था। एएवी (105 वीजी/सेल का एमओआई) को 4 दिन में मानव आईपीएस कोशिकाओं में अंतर करने के लिए ट्रांसड्यूस किया गया था । फिर कोशिकाओं को 7 और 9(चित्रा 4B)के बीच ब्लास्टिसिडिन (प्रत्येक सेल लाइन के लिए टि्रेट करने की आवश्यकता) के 2.5-10 μg/mL के साथ इलाज किया गया । 14 दिन में पीएससी-सीएम की शुद्धता 90% से अधिक थी(चित्रा 4C)।

Figure 1
चित्रा 1:Myom2-TagRFP सेल लाइन से व्युत्पन्न माउस पीएससी-सीएमएस के Sarcomere छोटा । A. माउस पीएससी-सीएम भेदभाव के लिए समय रेखा। B. सारकोमेरे के लिए प्रतिनिधि छवियां पीले सलाखों द्वारा इंगित क्षेत्रों को मापने के साथ विभिन्न समय बिंदुओं में छोटा करती हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। सी. कार्डियोमायोसाइट्स के संकुचन के दौरान सारकोमेरे लंबाई प्रोफ़ाइल जिसे 1 हर्ट्ज पर बिजली के साथ उत्तेजित किया गया था। फ्रेमरेट 50 फ्रेम प्रति सेकंड था। पिक्सल का साइज 0.26 माइक्रोन था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:गैर-पैटर्न और पैटर्न वाली संस्कृति में ACTN2-mCherry सेल लाइन से प्राप्त मानव पीएससी-सीएम के सारकोमे को छोटा करने वाले प्रतिनिधि डेटा। A. मानव पीएससी-सीएम भेदभाव के लिए समय रेखा। B. और गैर-पैटर्न वाली संस्कृतियों में सुसंस्कृत सी कार्डियोमायोसाइट्स अव्यवस्थित सारकोमेरे पैटर्न (बी) दिखाते हैं जबकि पैटर्न वाली संस्कृतियां सारकोमेरे (सी) के अच्छे संरेखण को बढ़ावा देती हैं। पीले सलाखों द्वारा प्रस्तुत क्षेत्रों को मापने। डी. इसी सारकोमेरे लंबाई प्रोफाइल 0.5 हर्ट्ज पर विद्युत उत्तेजना द्वारा प्रेरित सेल संकुचन के दौरान प्राप्त की और एक 100 फ्रेम प्रति सेकंड फ्रेम दर। पिक्सेल आकार = 0.26 माइक्रोन, स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: 3दिनों के लिए एएवी ट्रांसडक्शन के बाद माउस पीएससी-सीएम। A. सारकोमेरे लेबलिंग के लिए एएवी का योजनाबद्ध वेक्टर नक्शा। एक सारकोमर प्रोटीन (ब्याज का जीन, भारत सरकार) GFP से एक ग्लाई-ग्लाई-ग्लाई-सेर लिंकर (एल) के साथ जुड़ा हुआ है और कार्डियक ट्रोपोनिन टी (सीटीटीटी) प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया गया है। B. माउस पीएससी-सीएम भेदभाव और एएवी ट्रांसडक्शन के लिए टाइमलाइन । सी और डी । स्पष्ट सारकोमरे स्थानीयकरण और TCAP-GFP (सी) और PDLIM3-GFP (डी) के इसी सारकोमर लंबाई प्रोफ़ाइल दिखाता है पीएससी में स्थानांतरण के 3 दिनों के बाद-CMs Myom2-TagRFP सेल लाइन से उत्पन्न । स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4-बिना दस्तक के मानव पीएससी-सीएम का ब्लास्टिसिडिन शुद्धिकरण। 
A. एएवी का योजनाबद्ध वेक्टर नक्शा, जिसमें सीटीएनटी प्रमोटर को डाउनस्ट्रीम में ब्लास्टिसिडिन-रेजिस्टेंस जीन कैसेट (बीएसआर) डाला जाता है। B. मानव पीएससी-सीएम विभेदन, ट्रांसडक्शन, और ब्लास्टिसिडिन चयन की समय रेखा। सी. मानव पीएससी-सीएम में सीटीएनटी + कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाने वाले प्रतिनिधि आंकड़े (4 दिन में10 5 वीजी/सेल एएवी6 को फिर 7 और 9 दिन में 2.5 माइक्रोन/एमएल ब्लास्टिसिडिन के साथ इलाज किया गया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 1: Myom2-TagRFP सेल लाइन से उत्पन्न माउस पीएससी-सीएमएस का फ्लोरोसेंट टाइम-लैप्स वीडियो। आरएफपी के संकेतों ने 28 दिनों तक पीएससी-सीएम कल्चर के बाद सरकोमेरे पैटर्न दिखाया । कोशिकाओं को समकालिक रूप से पिटाई दिखाया जब 1 हर्ट्ज पर बिजली के साथ उत्तेजित । समय चूक छवियों को एक 100X लेंस के साथ हर 20 एमएस का अधिग्रहण किया गया । स्केल बार = 5 माइक्रोन। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 2: फ्लोरोसेंट समय-ACTN2 के साथ मानव पीएससी-सीएम के चूक वीडियो-mCherry एक गैर नमूनों संस्कृति पकवान पर सुसंस्कृत । पीएससी-सीएम ने एक गैर-पैटर्न वाली संस्कृति डिश पर ACTN2-mCherry व्यक्त करते हुए न केवल सारकोमेरे का विघटन दिखाया बल्कि एक लहराते संकुचन को भी प्रस्तुत किया, जिसके लिए सारकोमेरे छोटा निर्धारित करना मुश्किल है । कोशिकाओं को 0.5 हर्ट्ज पर बिजली के साथ उत्तेजित किया गया था और छवियों को 100X लेंस के साथ हर 10 एमएस का अधिग्रहण किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 3: फ्लोरोसेंट समय-ACTN2 के साथ मानव पीएससी-सीएम के चूक वीडियो-mCherry एक नमूनों संस्कृति पकवान पर सुसंस्कृत । नमूनों की संस्कृति ने सारकोमेरे के संरेखण को बढ़ावा दिया और कोशिकाओं को रॉड आकार में मजबूर किया। इस विधि ने पीएससी-सीएम में सारकोमेरे छोटा करने की अनुमति दी और अधिक आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। वीडियो ०.५ हर्ट्ज पर बिजली के साथ कोशिकाओं उत्तेजक द्वारा प्राप्त किया गया था । फ्रेमरेट 100 फ्रेम प्रति सेकंड था। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक सीएडी फाइलें। 200 माइक्रोन चौड़ाई और 10 माइक्रोन (Stamp_200x10.dxf), 25 माइक्रोन (Stamp_200x25.dxf), और 50 माइक्रोन (Stamp_200x50.dxf) के खांचे की स्ट्रिप्स के साथ टिकट बनाने के लिए सीएडी फाइलें। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पीएससी-सीएम में हृदय रोग को मॉडल करने और दवाओं के प्रभावों को परखने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म के रूप में उपयोग करने की अपार संभावनाएं हैं । फिर भी, पीएससी-सीएम कार्यों का आकलन करने के लिए एक सटीक, एकीकृत विधि पहले स्थापित की जानी चाहिए । अधिकांश कार्यात्मक परीक्षण पीएससी-सीएम के साथ काम करते हैं, उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम क्षणिक, और मेटाबोलिज्म26,और पहले रोगी-व्युत्पन्न पीएससी-सीएम अध्ययनों में से एक लंबे समय से क्यूटी सिंड्रोम27के बारे में था। हालांकि, संकुचन, एक कार्डियोमायोसाइट के सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक, अभी भी आकलन करना मुश्किल है। वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स के साथ, सारकोमेरे छोटा व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसके विपरीत, पीएससी-सीएम के अविकसित और अव्यवस्थित सारकोमेरे के कारण, सारकोमेरे छोटा करने के लिए मानक विधि इन कोशिकाओं के साथ काम नहीं करती है। इसलिए, हमने फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का उपयोग करके पीएससी-सीएम में सारकोमेरे छोटा करने की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रस्तुत किया है। जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, इस दृष्टिकोण के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े एम-लाइन (MYOM2) या जेड-लाइन (ACTN2, TCAP, और PDLIM3) के लिए स्थानीयकृत प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है। हमने यह भी दिखाया है कि फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन को अंतर्जात लोकी या एएवी द्वारा व्यक्त किया जा सकता है। एएवी अंतर्जात लोकी की तुलना में फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं, क्योंकि एएवी को किसी भी प्रकार के रोगी-व्युत्पन्न पीएससी-सीएम पर लागू किया जा सकता है। इसके विपरीत, अंतर्जात लोकी से प्रोटीन व्यक्त करने से सारकोमेरे कार्य पर कम प्रभाव पड़ सकता है, क्योंकि जीन का अभिव्यक्ति स्तर कसकर विनियमित होता है और इसका उपयोग पीएससी-सीएम18की परिपक्वता की निगरानी के लिए भी किया जा सकता है।

हालांकि Myom2-TagRFP, ACTN2-mCherry, और Lifeact सभी काउपयोग16, 18,19को छोटा करने वाले सारकोमरे की जांच करने के लिए कियाजाताथा, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि ये प्रोटीन सारकोमरे समारोह में हस्तक्षेप करते हैं या नहीं। हाल ही में, लाइफएक्ट को ऐक्टिन ऑर्गनाइजेशन और सेलुलर मॉर्फोलॉजी28को डिस्टर्ब करने की सूचना मिली थी । यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फ्यूजन पैटर्न (यानी, एन-टर्म या टारगेट प्रोटीन के सी-टर्म में जीएफपी फ्यूजन साइट) भी सारकोमेरे फंक्शन29को प्रभावित करते हैं । इसलिए, व्यापक रूप से उपयोग किए जाने से पहले, यह अच्छी तरह से आकलन करना महत्वपूर्ण है कि क्या फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमियर प्रोटीन सारकोमर फ़ंक्शन में हस्तक्षेप करते हैं और क्या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विट्रो मेंसारकोमर में होते हैं, वीवो में,और/या वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स में । फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का यह प्रदर्शनों की सूची भविष्य के प्रोटीन-इंजीनियरिंग विकल्पों के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करती है (यानी, सारकोमेरे प्रोटीन को केवल स्थानीयकरण संकेतों को छोटा करना)। टैग करने के लिए प्रोटीन का चयन सफलता की एक और कुंजी है। हमने जीएफपी के साथ एक और जेड-लाइन प्रोटीन को टैग किया है, हालांकि, इस प्रोटीन ने सारकोमरे को स्थानीय बनाने के बजाय केवल एक साइटोप्लाज्मिक वितरण प्रदर्शित किया। लाइव इमेजिंग के लिए, प्रोटीन स्थिरता भी एक भूमिका निभा सकती है, उदाहरण के लिए, यदि टैग किया गया प्रोटीन अस्थिर है, तो सिग्नल का स्तर कम होगा। फ्लोरोसेंट प्रोटीन की फोटोस्थायता भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि इमेजिंग के दौरान अस्थिर प्रोटीन संकेतों को आसानी से बुझाया जाएगा।

वर्णित के अलावा अन्य तरीकों का उपयोग करके पीएससी-सीएम की संकुचन की जांच करने के लिए, पीएससी-सीएम (जैसे, माइक्रो-पोस्ट सरणी, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी) या गति (जैसे, एसआई8000 का उपयोग करके उच्च-संकल्प गति का पता लगाने)11,12,13,14 द्वारा उत्पन्न बल के अप्रत्यक्ष माप का उपयोग किया जा सकता है। हमारी विधि को इन तरीकों के साथ या डाई-आधारित कार्रवाई क्षमता/कैल्शियम क्षणिक मापन के साथ जोड़ा जा सकता है । संयोजन दृष्टिकोण कैसे एक रोग रोगी-व्युत्पन्न पीएससी-सीएम में शिथिलता का कारण बनता है के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।

पीएससी-सीएम में सारकोमेरे छोटा करने में चुनौतियों में से एक एक अच्छा सारकोमियर खोजना है जो रैखिक रूप से चलता है, अन्यथा, कोशिकाएं आसानी से सारकोपितिम के सारकोमेरे का पता लगाने के लिए लाइन से उतर सकती हैं और अस्थिर सारकोमा को छोटा करने के परिणाम पैदा कर सकती हैं। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि पीडीएमएस टिकटों के साथ उत्पन्न एक पैटर्न वाली संस्कृति का उपयोग करना अधिक स्थिर और रैखिक सारकोमेरे आंदोलन प्रदान कर सकता है। एक नमूनों संस्कृति भी पीएससी-सीएम16,जो sarcomere समारोह के लिए महत्वपूर्ण है की परिपक्वता का समर्थन करने के लिए जाना जाता है ।

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Disclosures

एचयू ने इस पांडुलिपि से संबंधित पेटेंट दायर किया है।

Acknowledgments

हम जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी में रिजेनरेटिव मेडिसिन के डिवीजन में सभी लैब सदस्यों को सहायक चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । इस अध्ययन को जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (एएमईडी) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; JP18bm0704012 और JP20bm0804018), विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS; JP19KK0219), और जापानी परिसंचरण सोसायटी (बेसिक रिसर्च के लिए अनुदान) एचयू के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, NOF Corp. LIPIDURE-CM5206
2-Propanol Fujifilm wako 166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) ibidi 81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		 Takara 6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs N.A. We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
B-27 Supplement, minus insulin Thermo Fisher Scientific A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010
Benzonase (25 U/µL) Merck Millipore 70746
Blasticidin S Hydrochloride Fujifilm wako 029-18701
BMP-4, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 314-BP-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59) abcam ab142216
CAD drawing software, Robert McNeel and Associates, WA, USA Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 Sartorius VS2042
CHIR99021 Cayman 13122
Chromium etchant Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan N14B
Chromium mask coated with AZP1350 Clean Surface Technology Co., Japan CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) Takara 9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma-Aldrich D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate Sigma-Aldrich D5796
Ethanol (99.5) Fujifilm wako 057-00456
Fetal Bovine Serum Moregate 59301104
FGF-10, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant Fujifilm wako 060-04543
Gelatin from porcine skin powder Sigma-Aldrich G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates MatTek P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific 11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) Thermo Fisher Scientific 35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Fujifilm wako 196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) Nippi 892012
Mask aligner Union Optical Co., Ltd., Japan PEM-800
Maskless lithography tool NanoSystem Solutions, Inc., Japan D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) Merck Millipore SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18) N.A. Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
PD0325901 Stemgent 04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Petri dish Sansei medical co. Ltd 01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer Dow Corning Corp., MI, USA SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) Polyscience 24765-1
Positive photoresist developer Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
Proteinase K Takara 9034
Puromycin Dihydrochloride Fujifilm wako 166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein R&D Systems, Inc. 338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) Thermo Fisher Scientific 12604-039
RPMI1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875-119
Silicon wafer Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070
Spin-coater Mikasa Co., Ltd., Japan MS-A100
Spininng confocal microscopy Oxford Instruments Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) Fujifilm wako 195-16053
SU-8 3010 Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 3010
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 developer
Tris-EDTA Nippon Gene 314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant Fujifilm wako 226-01781

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References

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मेडिसिन अंक 169 प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल कार्डियोमायोसाइट सारकोमेरे छोटा लाइव इमेजिंग फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग
सारकोमेरे फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का उपयोग करके प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का छोटा होना।
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