Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Sarcomere Forkortelse av Pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter ved hjelp av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner.

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62129
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 4, 4, 1, 1
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University
* These authors contributed equally

Summary

Denne metoden kan brukes til å undersøke sarkomerforkortelse ved hjelp av pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter med fluorescerende taggede sarcomere-proteiner.

Abstract

Pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (PSC-CMs) kan produseres fra både embryonale og induserte pluripotente stammeceller (ES/iPS). Disse cellene gir lovende kilder til modellering av hjertesykdom. For kardiomyopatier er sarkomerforkortelse en av de standard fysiologiske vurderingene som brukes med voksne kardiomyocytter for å undersøke sykdommens fenotyper. De tilgjengelige metodene er imidlertid ikke hensiktsmessige for å vurdere kontraktiliteten til PSC-CMs, da disse cellene har underutviklede sarkomer som er usynlige under fasekontrastmikroskopi. For å løse dette problemet og for å utføre sarcomere forkortelse med PSC-CMs, ble fluorescerende merket sarcomere proteiner og fluorescerende levende bildebehandling brukt. Tynne Z-linjer og en M-linje ligger i begge ender og i midten av en sarcomere, henholdsvis. Z-line proteiner – α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) og aktin-assosiert LIM-protein (PDLIM3) – og ett M-linjeprotein – Myomesin-2 (Myom2) – ble merket med fluorescerende proteiner. Disse taggede proteinene kan uttrykkes fra endogene alleler som knock-ins eller fra adeno-assosierte virus (AAVs). Her introduserer vi metodene for å skille mus og menneskelige pluripotente stamceller til kardiomyocytter, for å produsere AAVs, og for å utføre og analysere levende bildebehandling. Vi beskriver også metodene for å produsere polydimetylsiloksan (PDMS) frimerker for en mønstret kultur av PSC-CMs, noe som letter analysen av sarcomere forkortelse med fluorescerende merkede proteiner. For å vurdere sarkomerforkortelse ble tidsforløpbilder av de bankende cellene registrert med høy bildefrekvens (50-100 bilder per sekund) under elektrisk stimulering (0,5-1 Hz). For å analysere sarcomere lengde i løpet av cellekontraksjon, ble de innspilte tidsforløpbildene utsatt for SarcOptiM, en plugin-modul for ImageJ / Fiji. Vår strategi gir en enkel plattform for å undersøke hjertesykdom fenotyper i PSC-CMs.

Introduction

Kardiovaskulære sykdommer er den ledende årsaken til dødelighet over hele verden1 og kardiomyopati representerer den tredje årsaken til hjerterelaterte dødsfall2. Kardiomyopati er en kollektiv gruppe sykdommer som påvirker hjertemuskulaturen. Den nylige utviklingen av induserte pluripotente stamceller (iPS) og rettet differensiering av iPS-celler mot kardiomyocytter (PSC-CMs) har åpnet døren for å studere kardiomyocytter med pasientgenom som en in vitro-modell av kardiomyopati. Disse cellene kan brukes til å forstå patofysiologien til hjertesykdommer, for å belyse deres molekylære mekanismer, og for å teste forskjellige terapeutiske kandidater3. Det er en enorm mengde interesse, og dermed har pasientavledede iPS-celler blitt generert (f.eks. hypertrofisk kardiomyopati [HCM]4,5 ,arytmogenehøyre ventrikulær kardiomyopati [ARVC]6, utvidet kardiomyopati [DCM]7og mitokondrierelaterte kardiomyopatier8,9). Fordi en av egenskapene til kardiomyopati er dysfunksjon og forstyrrelse av sarkomer, er det nødvendig med et gyldig verktøy som jevnt måler sarkomerfunksjon.

Sarcomere forkortelse er den mest brukte teknikken for å vurdere sarcomere-funksjon og kontraktiliteten til voksne kardiomyocytter avledet fra dyremodeller og mennesker. For å utføre sarcomere forkortelse, er det nødvendig med velutviklede sarkomer som er synlige under fasekontrast. PSC-CMer dyrket imidlertid in vitro-skjerm underutviklede og uorganiserte sarkomer, og kan derfor ikke brukes til å måle sarkomere som forkorter10på riktig måte. Denne vanskeligheten med å vurdere kontraktiliteten til PSC-CMs på riktig måte hindrer bruken som en plattform for å vurdere hjertefunksjoner in vitro. For å vurdere PSC-CMs kontraktilitet indirekte, har atomkraftmikroskopi, mikropostmatriser, trekkraftmikroskopi og impedansmålinger blitt brukt til å måle effekten av bevegelsen som utøves av disse cellene på omgivelsene11,12,13. Mer sofistikerte og mindre invasive videomikroskopiopptak av faktisk cellulær bevegelse (f.eks. SI8000 fra SONY) kan brukes til å alternativt vurdere deres kontraktilitet, men denne metoden måler ikke direkte sarcomere bevegelse eller kraftgenerering kinetikk14.

For å måle sarcomere-bevegelse direkte i PSC-CMs, dukker det opp nye tilnærminger, for eksempel fluorescerende merking til sarcomere-protein. Lifeact brukes for eksempel til å merke filamentøs aktin (F-aktin) for å måle sarcomere bevegelse15,16. Genmodifiserte iPS-celler er et annet alternativ for merking av sarcomere-proteiner (f.eks. α-aktinin [ACTN2] og Myomesin-2 [MYOM2]) av fluorescerende protein17,18,19.

I dette dokumentet beskriver vi hvordan du utfører tidsforløpavbildning for måling av sarkomereforkortelse ved hjelp av Myom2-TagRFP (musembryonal stamme [ES] celler) og ACTN2-mCherry (humane iPS-celler). Vi viser også at en mønstret kultur legger til rette for sarkomere tilpasning. I tillegg beskriver vi en alternativ metode for sarcomere merking, ved hjelp av adeno-assosierte virus (AAVs), som kan brukes mye på pasientavledede iPS-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Differensiering av mus pluripotente stamceller

  1. Vedlikehold av ES-celler med mus
    1. Vedlikeholdsmedium: Bland 50 ml foster bovint serum (FBS), 5 ml L-alanin-L-glutamin, 5 ml ikke-essensiell aminosyre (NEAA), 5 ml 100 mM natriumpyuvatt og 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol med 450 ml Glasgow Minimum Essential (GMEM). Supplement Leukemia inhibitory factor (LIF), CHIR-99021 og PD0325901 ved en endelig konsentrasjon på henholdsvis 1000 U/ml, 1 μM og 3 μM. Steriliser mediet gjennom et filter på 0,22 μm.
    2. FBS medium: Bland 55 ml FBS, 5,5 ml L-alanin-L-glutamin, 5,5 ml natriumpyuvatt og 5,5 ml NEAA til 500 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) høy glukose. Filtrat mediet gjennom et 0,22 μm filter for å sterilisere.
    3. Kultur SMM18 mus ES celler der TagRFP ble slått inn i Myom2 locus på en gelatinisert 6 cm tallerken i vedlikeholdsmedium som tidligere beskrevet18. Passasje hver 2-3 dager.
  2. Fremstilling av serumfri differensiering (SFD) medium
    1. Basal SFD: Bland 250 ml av Hams F-12, 750 ml Iscoves Modifiserte Dulbeccos medium (IMDM), 10 ml B27 supplement minus vitamin A, 5 ml N2 supplement, 10 ml L-alanin-L-glutamin, 5 ml 10% bovint serumalbumin i fosfatbufret saltvann (PBS) og 10 ml penicillin og streptomycin (10 000 U/ml). Filtrer gjennom 0,22 μm sil for å sterilisere.
    2. Løs opp askorbinsyre ved 5 mg/ml i destillert vann og filtrer gjennom 0,22 μm sil for å sterilisere.
    3. Fortynn 13 μL 1-Thioglyserol til 1 ml IMDM. Heri, referere til denne fortynnet 1-Thioglycerol som MTG.
    4. Tilsett 10 μL askorbinsyre (5 mg/ml) og 3 μL MTG til 1 ml basal SFD på bruksdagen. Heri, se denne blandingen som fullstendig SFD.
  3. Dag 0, embryoid kroppsdannelse (EB) for differensiering
    1. Høst SMM18 mus ES celler med en rekombinant trypsin-lignende protease (rTrypsin) og telle cellene.
    2. Sentrifuge 5 x 105 celler ved 300 x g i 3 min i 4 °C, resuspend i 10 ml komplett SFD, og frø i en 10 cm Petri-tallerken. Kultur cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 50 timer.
  4. Differensieringsdag 2
    1. Tilsett Activin A, human vaskulær endotel vekstfaktor (hVEGF) og benmorfogenetisk protein 4 (BMP4) for å fullføre SFD ved en endelig konsentrasjon på henholdsvis 5 ng/ml, 5 ng/ml og 1,9 ng/ml.
      MERK: BMP4-konsentrasjonene kan variere avhengig av mye BMP4. Test flere konsentrasjoner i en liten studie før du bruker en ny tomt og bestem den beste konsentrasjonen for hjertedifferensiering.
    2. Overfør EB-er fra en Petri-tallerken til et 15 ml rør og sentrifuger ved 50-100 x g i 3 min ved 4 °C.
    3. I mellomtiden legger du til mediet som er tilberedt i trinn 1.4.1 til Petri-parabolen for å beskytte de resterende EB-ene som er tørre.
    4. Aspirer supernatanten fra 15 ml-røret, resuspender EB-ene med mediet i Petri-parabolen, og overfør EB-løsningen tilbake til parabolen. Deretter dyrker du EB-ene ved 37 °C og 5 % CO2 i 46 timer.
  5. Differensieringsdag 4
    1. Gelatiniser en 10 cm vevskulturbehandlet tallerken med 5 til 10 ml 0,1% gelatin i minst 5 min. Aspirat gelatin rett før såddceller.
    2. Forbered medium: Bland grunnleggende fibroblastvekstfaktor (bFGF), FGF10 og hVEGF for å fullføre SFD ved henholdsvis 5 ng/ml, 25 ng/ml og 5 ng/ml endelige konsentrasjoner. For en 10 cm tallerken, lag 10 ml.
    3. Overfør celler fra Petri-parabolen til et 15 ml rør. Tilsett 5 ml PBS i Petri-parabolen, vask flere ganger og overfør til 15 ml-røret for å samle de resterende cellene. Sentrifuge ved 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Aspirat supernatant, tilsett 1 ml rTrypsin, og inkuber ved 37 °C i 3 minutter.
    5. Vortex kort for å dissosiere EBs, legge til 9 ml 10% FBS medium, virvel igjen, og telle cellene.
    6. Sentrifuge 1,5 x 107 celler ved 300 x g, 4 °C i 3 minutter, resuspend med media tilberedt i trinn 1.4.2, og frø inn i den gelatiniserte parabolen. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 2 dager.
      MERK: Ved dag 7 eller 8 kan omfattende slag av PSC-CMer observeres.
  6. Legemiddelvalg på differensieringsdager 7 og 9: Refeed media med puromycin (2 μg / ml ved den endelige konsentrasjonen) for å eliminere ikke-kardiomyocytter på dag 7 og 9 av differensiering.
    MERK: Foreldrelinjen til SMM18 er syNP4 mus ES-celler, som huser NCX1 promotordrevet puromycinresistent gen20.
  7. Dag 10, replate for fremtidige eksperimenter
    1. Strøk en glassbunns kulturplate eller en 35 mm bilderett som inneholder en polymerdekslerlip med 0,1% Gelatin. For å forbedre modningen, belegge oppvasken med laminin-511 E8 fragment (LN511-E8) ved 1 μg/cm2 i 30-60 min ved romtemperatur18. For å dyrke PSC-CMer i spesifikke interessemønstre, se trinn 4 og 5 for å forberede polydimetylsiloksan (PDMS) frimerker.
    2. For å høste SMM18 PSC-CMer, vask parabolen to ganger med PBS, påfør 1 ml rTrypsin og inkuber 3 min ved 37 °C.
    3. Samle celler i 9 ml av 10% FBS medium, suspendere og telle cellene. Plate cellene på 50.000-100.000 celler i en brønn av en 24-brønns plate eller 250.000-500.000 celler i en 35 mm bildebehandlingsfat.
    4. Sentrifuger et tilstrekkelig antall celler (300 x g, 3 min) og resuspend cellene med fullstendig SFD supplert med FBS (sluttkonsentrasjon ved 10%).
    5. Inkuber over natten og endre kulturmediet for å fullføre SFD med puromycin.
    6. Fra dag 14 endrer du kulturmediet to til tre ganger i uken med fullstendig SFD til dag 21-28, når Myom2-RFP blir fremtredende. For AAV-basert transduksjon av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner, se trinn 3.

2. Differensiering av humane pluripotente stamceller

  1. Utarbeidelse av differensieringsmedier
    1. RPMI+B27-Ins: Bland 500 ml RPMI 1640 medium, 10 ml B27 minus insulin og 5,25 ml L-alanin-L-glutamin.
    2. RPMI+B27+Ins: Bland 500 ml RPMI, 10 ml B27-tilskudd og 5,25 ml L-alanin-L-glutamin.
  2. Vedlikehold av humane iPS-celler
    1. Passasje menneskelige iPS celler to ganger i uken med AK02N på LN511-E8 etter tidligere publisert metode med noen modifikasjoner21.
    2. Høst celler med 3 min behandling av rTrypsin og samle inn i 10% FBS medium. Tell celler og sentrifuge ved 300 x g i 3 min ved 4 °C. Frø 75.000-125.000 celler i en brønn på 6 brønnplate med 2 ml AK02N supplert med LN511-E8 og Y27632 ved den endelige konsentrasjonen på henholdsvis 0,5 μg/ml (0,1 μg/cm2) og 10 μM.
    3. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 og skift ut mediet dagen etter med 2 ml AK02N uten tillegg. Bytt media annenhver til tre dager og gå hver tredje til fjerde dag.
  3. Dag -4: replate før differensiering
    1. Strøk en 6 brønnplate med 0,5 μg/cm2 LN511-E8 fortynnet i PBS. Deretter inkuberer du i minst 30 min ved 37 °C og 5 % CO2 eller 1 time ved romtemperatur. Aspiratbeleggløsning rett før såddceller.
    2. Høst humane iPS-celler med rTrypsin og tell celler som i trinn 2.2.2.
    3. Sentrifuge 1,25 x 105 celler for en brønn på en 6-brønns plate ved 300 x g i 3 min ved 4 °C og resuspend i 2 ml AK02N supplement LN511-E8 (sluttkonsentrasjon 0,5 μg/ml eller 0,1 μg/cm2) og Y27632 (sluttkonsentrasjon 10 μM) per brønn.
    4. Aspirat belegg løsning, frø resuspended celler i belagt plate, og inkubere ved 37 °C og 5% CO2.
  4. Dager -3 og -1: Bytt medium med 2 ml AK02N.
  5. Dag 0: Bytt medium med 2 ml RPMI+B27-Ins supplert med CHIR99021 (sluttkonsentrasjon 6 μM) per brønn for å starte differensiering.
  6. Dag 2: Bytt medium med 2 ml RPMI+B27-Ins med WntC59 (sluttkonsentrasjon 2 μM) per brønn.
  7. Dag 4: Bytt medium med 2 ml RPMI+B27-Ins per brønn.
  8. Dag 7 og dag 9: Erstatt medium med 2 ml RPMI + B27 + Ins med puromycin (sluttkonsentrasjon 10 μg / ml) per brønn for selektiv kultur PSC-CMs.
    MERK: ACTN2-mCherry-linjen, som brukes i denne studien, har en kassett med internt ribosomalt inngangssted (IRES), puromycinresistent gen satt inn i den 3′-uoversatte regionen (UTR) av TNNT2-locus, og mCherry erstatter stop codon av ACTN2. For å rense kardiomyocytten uten innslag, se trinn 3 og 4.
  9. Dag 10: replate for fremtidige eksperimenter
    1. Strøk en 35 mm bilderett med polymerdeksler med 0,5-1 μg/cm2 av LN511-E8 fortynnet i 0,1% Gelatin. Inkuber 2-4 timer ved romtemperatur for langsiktig levedyktighet. For å dyrke PSC-CMer i ønskede mønstre, se trinn 4 og 5 for å forberede PDMS-stempler.
    2. For å høste menneskelige PSC-CMer, vask parabolen to ganger med PBS, påfør 1 ml rTrypsin per brønn og inkuber 3 min ved 37 °C.
    3. Samle celler i 4 ml av 10 % FBS-medium, suspender og tell cellene. Plate 250 000-500 000 celler per 35 mm bilderett.
    4. Sentrifuger et tilstrekkelig antall celler ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C, resuspend med RPMI+B27+Ins med puromycin (10 μg/ml) og plate på den belagte 35 mm bildefatet.
    5. Inkuber over natten. Neste morgen erstatter du kulturmediet med RPMI+B27+Ins med puromycin (10 μg/ml).
    6. Fra dag 14 endrer du kulturmediet 2-3 ganger i uken med RPMI +B27+Ins til dag 21-28 for avbildning. For AAV-basert transduksjon av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner, se trinn 3.

3. Fluorescerende merking av sarkomer ved hjelp av adeno-assosierte virus

  1. Klargjøring før AAV-produksjon
    1. Vedlikehold HEK293T-celler i DMEM supplert med FBS (sluttkonsentrasjon 10%) på en 10 cm vevskulturplate. Passasjeceller tre ganger i uken.
    2. Forbered polyetylenimin (PEI) ved 1 mg/ml. Bland 50 mg polyetylenimin MAX 40000 og 40 ml ultrarent vann. Juster pH til 7.0 ved hjelp av 1 N NaOH. Deretter gjør du det endelige volumet til 50 ml med ultrarent vann og filtrerer gjennom en 0,22 μm sil.
    3. Forbered en shuttle vektor med en sarcomere merking gen (f.eks, TCAP eller PDLIM3 smeltet sammen med et grønt fluorescerende protein [GFP]), drevet av en kardiomyocytt-spesifikk promotor, for eksempel hjerte troponin T (cTNT)22.
      MERK: For dette tilfellet brukte vi monomerisk forbedret GFP med mutasjoner av V163A, S202T, L221V23.
  2. Dag 0, passasje HEK celler
    1. Når cellene når samløp, passerer du 2,0 x 107 HEK293T-celler til en 15 cm vevskulturplate med 20 ml DMEM med 10 % FBS.
  3. Dag 1, transfeksjon
    1. Bland 13,5 μg av skyttelvektoren, 26 μg pHelper (en vektorkoding E2A, E4 og VA av adenovirus), 16,5 μg pRC6 (en vektorkoding av AAV2 Rep- og AAV6 Cap-gener), og 1 ml DMEM uten natriumpyuvat (DMEM-Pyr).
    2. Bland 224 μL PEI (1 mg/ml, fremstilt i trinn 3.1.2) og 776 μL DMEM-Pyr.
    3. Bland og inkuber plasmidløsningen og PEI-løsningen ved romtemperatur i 30 minutter.
    4. Tilsett plasmid-/PEI-løsningen i HEK293T-cellene som er fremstilt i trinn 3.2.
  4. Dag 2, middels endring
    1. Ved 24 timer etter transfeksjon, bytt medium til DMEM-Pyr. Kulturceller til høsting av AAV på dag 7. AAV vil bli sluppet ut i kulturmediene.
  5. Dag 7, AAV-innsamling, konsentrasjon og buffererstatning ved hjelp av minimal rensemetode24
    1. Inkuber en sentrifugal ultrafiltreringsenhet (100k molekylvektkutt [MWCO]) med 5 ml 1% BSA i PBS ved romtemperatur i 15 minutter. Sentrifuger deretter ultrafiltreringsenheten på 500 x g i 2 minutter og aspirer både filtrerte og gjenværende løsninger.
    2. Overfør medium fra 15 cm parabolen som produserte AAV til et nytt 50 ml konisk rør og sentrifuge (500 x g, 5 min). Filtrer supernatanten gjennom en 0,45 μm sprøytesil for å fjerne cellerester og påfør suspensjon på ultrafiltreringsenheten.
    3. Sentrifuge ved 2000 x g i 90 min eller til du konsentrerer kulturen supernatant 0,5 til 1 ml.
    4. Aspirer filtratet og påfør 15 ml PBS på ultrafiltreringsenheten.
    5. Gjenta sentrifugering til konsentratet blir 0,5-1 ml.
    6. Gjenta 3.5.4 og 3.5.5.
    7. Overfør konsentrert AAV til et nytt 1,5 ml rør og oppbevar ved 4 °C eller -20 °C.
      MERK: AAV kan brukes i P1-innretninger, men følger lokale regler og forskrifter. AAV kan også produseres ved konvensjonelle metoder.
  6. Beregning av AAV-titer
    1. Bland 5 μL AAV, 195 μL DMEM-Pyr og 10 U benzonase og inkuber ved 37 °C i 1 time.
    2. Tilsett 200 μL proteinase K-buffer (0,02 M Tris HCl og 1% SDS) og 5 μL proteinase K (20 mg/ml) og inkuber ved 37 °C i 1 time.
    3. Forbered forsiktig 400 μL av en 25:24:1 Fenol/kloroform/isoamylalkoholoppløsning, virvel i 1 min og sentrifuger ved 20 000 x g i 1 min.
    4. Overfør 200 μL av den vandige fasen til et nytt 1,5 ml rør, som vil gi omtrent halvparten av de opprinnelige AAV-genomene.
    5. Tilsett 1 μL glykogen (20 mg/ml) til 20 μL 3 M CH3COONa (pH 5,2) og virvel. Tilsett 250 μL 2-Propanol til 100 μL 100% etanol og virvel igjen.
    6. Inkuber ved -80 °C i 15 minutter. Sentrifuger deretter ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C.
    7. Aspirer supernatant og tilsett 70% etanol til røret. Deretter sentrifugerer du ved 20 000 x g, 4 °C i 5 minutter.
    8. Aspirer supernatant og lufttørk til pelletsen blir klar.
    9. Tilsett 200 μL Tris-Etylendiaminetetraacetic acid (TE; pH 8.0) for å løse AAV-genomene. Deretter fortynner du prøven 100 ganger med TE.
    10. Forbered en standard med pAAV-CMV-Vector ved 6,5 ng/μL med TE for å oppnå 109 vektorgenomer (vg)/ μL. Deretter lager du en serie med 10 ganger fortynning fra 104 til 108 med TE.
    11. Bland 1 μL prøve-DNA (eller standardene), 0,4 μL primere (5 μM), 3,6 μL destillert vann og 5 μL SYBR Grønn masterblanding. Primere, som ligger på ITR, er 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ og 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Utfør PCR i sanntid med følgende tilstand: Første protese ved 95 °C i 60 s, 40 sykluser med denaturering ved 95 °C i 15 s, og gløding og forlengelse ved 60 °C i 30 s, etterfulgt av smeltekurve.
    13. Basert på standardene og Ct-verdiene gir en PCR-maskin i sanntid kopinummeret til vektorgenomet i 1 μL av en prøve. Beregn original AAV-titer ved hjelp av følgende ligning: et kopinummer levert av sanntids PCR (vg/μL) x 8 x 103 x 2, hvorav 8 x 103 som fortynningsfaktor under AAV genomisolasjon, og 2 som forskjellsfaktor for AAV (enkeltstreng) og plasmid (dobbel tråd).
  7. Transduksjon til PSC-CMer
    1. Tell PSC-CMer i en ekstra brønn eller ekstra tallerken.
    2. Fortynn AAVer (1 x 104 til 1 x 106 vg/celle) for å utgjøre 50 μL med PBS. Bruk AAVer med mangfoldet av infeksjon (MOI) på 1 x 104 til 1 x 106 vg/celle på PSC-CMer og PSC-CMer for kultur i 3 dager med AAV i de tilsvarende differensieringsmediene for mus og menneskelige PSC-CMer, og endre deretter medier til kulturmedium uten AAV.
    3. Bruk PSC-CMer til live-celle-avbildning etter 7 dager eller mer etter transduksjon.

4. [Valgfritt] AAV-basert rensing av PSC-CMer

  1. Forberedelse av AAV
    1. Forbered AAV som beskrevet i trinn 3 ved hjelp av en shuttle vektor som uttrykker blasticidinresistent gen under kontroll av cTNT promotor.
  2. Transduksjon til differensiering av iPS-celler
    1. Differensiere menneskelige iPS-celler i 4 dager etter protokollen beskrevet i trinn 2 og telle antall celler i en ekstra brønn.
    2. Etter å ha byttet medium på dag 4, bruk AAVer på MOI på 1 x 105 vg/celle for å differensiere PSCer i RPMI+B27-Ins-medier.
    3. På dag 7, oppdater medium med RPMI + B27 + Ins og legg til 2,5-10 μg / ml blasticidin.
    4. På dag 10 er PSC-CMer klare til å plasseres på nytt.

5. Utarbeidelse av PDMS-frimerker

  1. Design enhetsmønsteret på 200 μm strimler sammen med 10-25 μm spor mellom stripene ved hjelp av en dataassistert design (CAD) tegneprogramvare.
  2. Tegn mønsteret av enheter på en kromfotomaske belagt med AZP1350 ved hjelp av UV-lys fra et maskløst litografiverktøy.
  3. Utvikle mønsteret på fotomasken i en serie positive fotoresistutviklere (f.eks. krometerkant) og skyll med DI-vann.
  4. Dehydrer en silisiumskive på en varm plate ved 120 °C i 15 minutter.
  5. La skiven avkjøles til romtemperatur og spin-coat en negativ fotoresist SU-8 3010 for å lage en høyde på 10-20 μm med 1500 rpm i 30 s ved hjelp av en spin-coater.
  6. Myk bakeskiven i to trinn på en varm plate i henhold til produsentens protokoll.
  7. Når skiven er avkjølt til romtemperatur, legger du skiven på maskejusteringen.
  8. Bruk en maskejustering til å justere masken på skiven og utsette skiven for UV-lys.
  9. Før ettereksponeringsbaken til skiven i to trinn på en varm plate i henhold til produsentens protokoll.
  10. Utvikle skiven i en serie SU-8 utvikler og 2-Propanol, tørk deretter waferen med en nitrogenstrøm.
  11. Overfør skiven til en Petri-tallerken av passende størrelse.
  12. Bland PDMS elastomer og herdemiddelet i forholdet 10:1 m/w og hell blandingen i Petri-parabolen.
  13. Degas PDMS i en tørkeapparat til alle luftbobler forsvinner, og herd deretter PDMS på varm plate ved 80 °C i 2 timer.
  14. Fjern den herdede PDMS fra hovedformen ved hjelp av en pinsett, og klipp deretter ut delen med designet som et PDMS-stempel.
    MERK: Formen kan være firkantet, men en åttekantet form overfører mønsteret bedre på kanten.

6. Mønstret kultur av pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

  1. Fjern støv fra overflaten av PDMS-frimerker ved hjelp av mending tape.
  2. Senk frimerkene ned i 70% etanol for å sterilisere. Blås deretter etanol av overflaten av frimerkene ved hjelp av en luftduster.
  3. Påfør 5-10 μL 0,5 wt% 2-methacryloyloxyetylfosforylolin (MPC) polymer / etanol på overflaten av PDMS-frimerker.
    MERK: Ujevn fordeling av MPC-polymer kan forårsake et forstyrret mønster.
  4. Inkuber 10-30 min til MPC-polymeren er helt tørket.
  5. Plasser frimerkene i kontakt med deksler av en glassbunns kulturplate eller en 35 mm bilderett med polymerdeksler og legg en vekt (f.eks. et AAA-batteri) på stempelet i 10 minutter.
  6. Fjern vekten og stemplene. Bekreft deretter at mønsteret er overført under mikroskop.
    MERK: Stemplede tallerkener/tallerkener kan oppbevares opptil 1 uke ved romtemperatur.
  7. Vask de stemplede brønnene/rettene med PBS to ganger.
  8. Fortynn LN511-E8 med PBS ved 2-4 μg/ml og belegge retten med LN511-E8 ved 0,5-1 μg/cm2. For menneskelige PSC-CMer, fortynn LN511-E8 med 0,1% gelatinoppløsning i stedet for PBS. Deretter inkuberer du i minst 1 time (optimalt, mer enn 4 timer).
  9. Plateceller som beskrevet i tidligere seksjoner.

7. Tidsforløpavbildning av sarkomer under fluorescerende mikroskop

  1. Slå på og koble til mikroskopet, den tilknyttede datamaskinen og også alle nødvendige eksterne enheter.
  2. Hvis du vil utføre tidsforløpavbildning, kan du ta bilder med tidsforløp med den høyeste forstørrelsen (100 ganger objektiv objektiv med oljeutsendelse).
  3. Velg tilstand for direkteavbildning. For å få gode representative data, prøv å justere til høyeste bildefrekvens (minimum 20 ms eller 50 bilder per sekund anbefales). Sett lukkeren åpen og bruk en nødvendig binning (4 X 4) og en beskjæring av anskaffelsesområdet for å oppnå de korteste intervallene mellom bilder under tidsforløpavbildningen.
    MERK: Innstillingen kan variere avhengig av konfigurasjonene til mikroskoper. Kameraet må være høysensitivt og er i stand til å overføre dataene til den tilkoblede PCen raskt nok. For dette formål brukte vi ORCA-blits med kamerakobling. Vi har testet en spinnende konfokal mikroskopi og har skaffet bilder med 400 bilder per sekund.
    1. [Valgfritt] Hvis slaghastigheten til cellene er lav, fremkalle cellene ved elektrisk feltstimulering.
  4. Kjøre tidsforløpposten
    1. Kontroller at de avbildede feltene forblir i fokus under registreringen av bildet for tidsforløp.
    2. Lagre tidsforløpbildene i en passende mappe.

8. Analyse av tidsforløpavbildning ved hjelp av SarcOptiM, en ImageJ / Fiji-plugin

  1. Last inn en serie med tidsforløpbilder i ImageJ. For Olympus VSI-format åpner du filer gjennom OlympusViewer Plugin.
  2. Juster lysstyrken og kontrasten i bildet for å observere sarcomere-mønsteret tydelig (Bilde | Juster | Lysstyrke/kontrast).
  3. Åpne SarcOptiM ved å klikke Flere verktøy -menyen (>>) og velge SarcOptiM.
  4. Kalibrer programmet ved å trykke Ctrl + Skift + P og 1 μm-knappen på verktøylinjen og følge instruksjonene i dialogboksene.
  5. Tegn en linje over sarcomere-regionen som skal brukes til å måle sarcomere-forkortelsen.
  6. Start sarcomere-forkortingsanalysen ved å trykke SingleCell (AVI) på verktøylinjen. Representative data vises i figur 1 og figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling av sarcomere forkortelse ved hjelp av knock-in PSC-CMs reporter linjer. Sarcomere-merkede PSC-CMer ble brukt til å måle sarcomere-forkortelse. Linjene uttrykker Myom2-RFP og ACTN2-mCherry fra endogen loci. TagRFP ble satt inn i Myom2, koding av M-proteiner som lokaliserer til M-linjen, mens mCherry ble slått inn i ACTN2, koding α-Actinin, som lokaliserer til Z-linje18,25. Tidsforløpbilder ble innhentet og brukt til å bestemme sarcomere-forkortelse som presentert i figur 1 og 2 og film 1-3.

For å overvinne den uorganiserte sarkomen til PSC-CMer ble spesifikke PDMS-stempler brukt til å dyrke PSC-CMer i stripemønsteret. Denne mønstrede kulturen fremmet en langstrakt celleform og et mer organisert sarcomere-mønster sammenlignet med celler som var dyrket i ikke-mønsterområdet (Figur 2B og 2C). Med denne fordelen fremmet den mønstrede kulturen bedre sammentrekning av cellene og ga en jevn sarcomere lengdeprofil som vist i Filmer 2 og 3 og Figur 2D.

Fluorescerende merking av Z-linjeprotein ved hjelp av AAV-vektorer. For å visualisere Z-linjen til PSC-CMs uten å generere knock-in iPS-celler, ble fluorescerende merkede Z-linjeproteiner uttrykt ved hjelp av AAV-transduksjon. To av små Z-linjeproteiner, Telethonin (TCAP) og Actin-assosiert LIM-protein (PDLIM3) med GFP, ble merket og pakket ved hjelp av AAV6 capsid (Figur 3A). Når PSC-CMer ble differensiert og renset, ble AAVer transdusert til PSC-CMer (figur 3B). De transinduserte PSC-CMs uttrykte sarkomeriske GFP-signaler langs PSC-CM-ene så tidlig som tre dager etter transduksjon (figur 3C og 3D). Vanligvis er transduksjonen av AAV ved en MOI på 105 vg / celle tilstrekkelig til å visualisere fluorescerende taggede sarkomerproteiner, og en høyere titer kan føre til ikke-spesifikk lokalisering av GFP til cytoplasma selv om det øker den generelle GFP-intensiteten.

Rensing av PSC-CMer ved hjelp av AAV-vektorer. Nåværende metoder er avhengige av legemiddelvalgskassett som allerede er på genomet til PSC-CMs, enten transgene eller knock-in linje. Det er imidlertid arbeidskrevende å produsere en slik linje fra pasientavledede iPS-celler. Ettersom AAV-vektorer har blitt demonstrert for å drive uttrykket av fluorescerende Z-linjeproteiner uten behov for knock-in, forsøkte vi å etablere rensemetoden uten knock-in også (Figur 4). For dette formål ble en ny AAV-vektor, som koder blasticidinresistent gen under kontroll av cTNT-promotor, konstruert (Figur 4A). AAV (MOI på 105 vg/celle) ble transdusert til å differensiere humane iPS-celler på dag 4. Deretter ble celler behandlet med 2,5-10 μg/ml blasticidin (må titrate for hver cellelinje) mellom dag 7 og 9 (figur 4B). På dag 14 var renheten til PSC-CMer mer enn 90 % (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Sarcomere-forkortelse av musen PSC-CMer avledet fra myom2-TagRFP-cellelinjen. A. Tidslinjen for mus PSC-CM differensiering. B. Representative bilder for sarcomere forkortelse i forskjellige tidspunkter med måleregioner som angitt av gule stenger. Skalastang = 10 μm. C. Sarcomere lengdeprofil under sammentrekning av kardiomyocytter som ble stimulert med elektrisitet ved 1 Hz. Bildefrekvensen var 50 bilder per sekund. Pikselstørrelsen var 0,26 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative data som viser sarcomere forkortelse av de menneskelige PSC-CMs avledet fra ACTN2-mCherry cellelinjen i ikke-mønstret og mønstret kultur. A. Tidslinjen for menneskelig PSC-CM differensiering. B. og C. Kardiomyocytter dyrket i ikke-mønstrede kulturer viser uorganiserte sarkomiske mønstre (B) mens mønstrede kulturer fremmer en god tilpasning av sarkomen (C). Måleregioner presentert av gule stenger. D. Tilsvarende sarcomere lengdeprofiler oppnådd under cellekontraksjon indusert av elektrisk stimulering ved 0,5 Hz og en bildefrekvens på 100 bilder per sekund. Pikselstørrelse = 0,26 μm, skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: PSC-CMer for mus etter AAV-transduksjon i 3 dager. A. Skjematisk vektorkart over AAV for sarcomere merking. Et sarcomere protein (gen av interesse, GOI) er knyttet til GFP med en Gly-Gly-Gly-Ser linker (L) og uttrykt under kontroll av hjerte troponin T (cTNT) promotor. B. Tidslinjen for mus PSC-CM differensiering og AAV-transduksjon. C. og D. Representative bilder som viser klar sarcomere-lokalisering og den tilsvarende sarcomere-lengdeprofilen til TCAP-GFP (C) og PDLIM3-GFP (D) etter 3 dagers transduksjon til PSC-CMer generert fra Myom2-TagRFP-cellelinjen. Skalastang = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Blasticidin Rensing av menneskelige PSC-CMer uten innslag. 
A. Skjematisk vektorkart over AAV, der en blasticidin-resistensgenkassett (BSR) settes nedstrøms til cTNT-promotor. B. Tidslinjen for menneskelig PSC-CMs differensiering, transduksjon og blasticidinvalg. C. Representative data som viser prosentandelen av cTNT + celler i humane PSC-CMer (transdusert 105 vg/celle AAV6 på dag 4 og deretter behandlet med 2,5 μg/ml blasticidin på dag 7 og 9). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film 1: Fluorescerende tidsforløpvideo av PSC-CMer for mus generert fra Myom2-TagRFP-cellelinjen. RFP-signaler viste et sarkomermønster etter PSC-CM-kulturen i 28 dager. Cellene viste slag synkront når de ble stimulert med elektrisitet ved 1 Hz. Tidsforløpbildene ble anskaffet hver 20 ms med et 100X objektiv. Skalastang = 5 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Film 2: Fluorescerende tidsforløpvideo av de menneskelige PSC-CMs med ACTN2-mCherry dyrket på en ikke-mønstret kulturrett. PSC-CMs som uttrykte ACTN2-mCherry på en ikke-mønstret kulturrett viste ikke bare uorganisering av sarkom, men presenterte også en viftende sammentrekning, som det er vanskelig å bestemme sarkomereforkortelse for. Cellene ble stimulert med elektrisitet på 0,5 Hz og bilder anskaffet hver 10 ms med en 100X linse. Skalastang = 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Film 3: Fluorescerende tidsforløpvideo av de menneskelige PSC-CM-ene med ACTN2-mCherry dyrket på en mønstret kulturrett. Den mønstrede kulturen fremmet justering av sarkomeren og tvang cellene til en stangform. Denne metoden gjorde det lettere å bestemme sarcomere-forkortelsen i PSC-CMer. Videoen ble oppnådd ved å stimulere cellene med strøm på 0,5 Hz. Bildefrekvensen var 100 bilder per sekund. Skalastang = 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Ekstra CAD-filer. CAD-filer for å lage frimerker med strimler på 200 μm bredde og spor på 10 μm (Stamp_200x10.dxf), 25 μm (Stamp_200x25.dxf) og 50 μm (Stamp_200x50.dxf). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PSC-CMer har et stort potensial for å bli brukt som en in vitro-plattform for å modellere hjertesykdom og for å teste effekten av legemidler. Likevel må det først etableres en nøyaktig, enhetlig metode for å vurdere PSC-CMs-funksjoner. De fleste funksjonstester fungerer med PSC-CMs, for eksempel elektrofysiologi, kalsiumtransient og metabolisme26, og en av de første pasientavledede PSC-CM-studiene handlet om long-QT syndrom27. Imidlertid er kontraktilitet, en av de viktigste funksjonene til en kardiomyocytt, fortsatt vanskelig å vurdere. Med voksne kardiomyocytter er sarcomere forkortelse mye brukt. På grunn av den underutviklede og uorganiserte sarkomen til PSC-CMer fungerer ikke standardmetoden for sarcomere-forkortelse med disse cellene. Derfor har vi presentert en alternativ metode for å undersøke sarkomerforkortelse i PSC-CMs ved hjelp av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner. Som demonstrert kan proteiner lokalisert til M-linjen (MYOM2) eller Z-linjen (ACTN2, TCAP og PDLIM3) smeltet sammen med fluorescerende proteiner brukes til denne tilnærmingen. Vi har også vist at fluorescerende merkede proteiner kan uttrykkes fra endogen loci eller av AAVs. AAVer gir mer fleksibilitet for å uttrykke fluorescerende merkede proteiner enn endogene loci, da AAVer kan brukes på alle typer pasientavledede PSC-CMer. I motsetning kan det å uttrykke proteiner fra endogen loci ha en mindre effekt på sarcomere-funksjonen, da uttrykksnivået til genene er tett regulert og også kan brukes til å overvåke modningen av PSC-CMs18.

Selv om Myom2-TagRFP, ACTN2-mCherry og Lifeact alle ble brukt til å undersøke sarcomere forkortelse16,18,19, er det fortsatt uklart om disse proteinene forstyrrer sarcomere-funksjonen. Nylig ble Lifeact rapportert å forstyrre actin organisasjon og cellulær morfologi28. Det er også viktig å merke seg at fusjonsmønstre (dvs. GFP-fusjonsstedet ved N-term eller C-term av målprotein) også påvirker sarcomere-funksjonen29. Derfor, før de brukes mye, er det viktig å grundig vurdere om fluorescerende merkede sarcomere-proteiner forstyrrer sarcomere-funksjonen og om proteinproteininteraksjoner forekommer i sarkomere in vitro, in vivo, og / eller hos voksne kardiomyocytter. Dette repertoaret av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner gir et godt utgangspunkt for fremtidige proteinteknologiske alternativer (dvs. forkorte sarkomerproteinene til bare lokaliseringssignaler). Å velge proteiner å merke er en annen nøkkel til suksess. Vi har merket et annet Z-line protein med GFP, men dette proteinet viste bare en cytoplasmatisk distribusjon i stedet for å lokalisere til sarcomere. For levende avbildning kan proteinstabilitet også spille en rolle, som for eksempel hvis et merket protein er ustabilt, vil signalnivået være lavere. Foto ustabiliteten til det fluorescerende proteinet er også viktig, da ustabile proteinsignaler lett slukkes under avbildning.

For å undersøke kontraktiliteten til PSC-CMer ved hjelp av andre metoder enn beskrevet, kan indirekte målinger av kraft generert av PSC-CMs (f.eks. mikropostmatriser, trekkraftmikroskopi) eller bevegelse (f.eks. bevegelsesdeteksjon med høy oppløsning ved hjelp av SI8000)11,12,13,14 brukes. Vår metode kan kombineres med disse metodene eller med fargestoffbaserte virkningspotensiale / kalsium forbigående målinger. Den kombinatoriske tilnærmingen kan gi ytterligere informasjon om hvordan en sykdom forårsaker dysfunksjon i pasientavledede PSC-CMer.

En av utfordringene med sarkomerforkortelse i PSC-CMs er å finne en god sarcomere som beveger seg lineært, ellers kan cellene lett komme av linjen for sarcomere deteksjon av SarcOptiM og forårsake ustabile sarcomere forkortelsesresultater. Her viser vi at bruk av en mønstret kultur generert med PDMS-frimerker kan gi en mer stabil og lineær sarkomere bevegelse. En mønstret kultur er også kjent for å støtte modning av PSC-CMs16, noe som er viktig for sarcomere-funksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

H.U. har innlevert et patent relatert til dette manuskriptet.

Acknowledgments

Vi vil gjerne anerkjenne alle laboratoriemedlemmene i Divisjonen for regenerativ medisin ved Jichi Medical University for nyttig diskusjon og teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av tilskuddene fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 og JP20bm0804018), Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), og Det japanske sirkulasjonsselskapet (Stipend for grunnforskning) til H.U.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, NOF Corp. LIPIDURE-CM5206
2-Propanol Fujifilm wako 166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) ibidi 81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		 Takara 6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs N.A. We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
B-27 Supplement, minus insulin Thermo Fisher Scientific A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010
Benzonase (25 U/µL) Merck Millipore 70746
Blasticidin S Hydrochloride Fujifilm wako 029-18701
BMP-4, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 314-BP-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59) abcam ab142216
CAD drawing software, Robert McNeel and Associates, WA, USA Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 Sartorius VS2042
CHIR99021 Cayman 13122
Chromium etchant Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan N14B
Chromium mask coated with AZP1350 Clean Surface Technology Co., Japan CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) Takara 9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma-Aldrich D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate Sigma-Aldrich D5796
Ethanol (99.5) Fujifilm wako 057-00456
Fetal Bovine Serum Moregate 59301104
FGF-10, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant Fujifilm wako 060-04543
Gelatin from porcine skin powder Sigma-Aldrich G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates MatTek P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific 11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) Thermo Fisher Scientific 35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Fujifilm wako 196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) Nippi 892012
Mask aligner Union Optical Co., Ltd., Japan PEM-800
Maskless lithography tool NanoSystem Solutions, Inc., Japan D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) Merck Millipore SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18) N.A. Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
PD0325901 Stemgent 04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Petri dish Sansei medical co. Ltd 01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer Dow Corning Corp., MI, USA SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) Polyscience 24765-1
Positive photoresist developer Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
Proteinase K Takara 9034
Puromycin Dihydrochloride Fujifilm wako 166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein R&D Systems, Inc. 338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) Thermo Fisher Scientific 12604-039
RPMI1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875-119
Silicon wafer Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070
Spin-coater Mikasa Co., Ltd., Japan MS-A100
Spininng confocal microscopy Oxford Instruments Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) Fujifilm wako 195-16053
SU-8 3010 Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 3010
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 developer
Tris-EDTA Nippon Gene 314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant Fujifilm wako 226-01781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Tags

Medisin utgave 169 Pluripotent stamcelle kardiomyocytt sarkomerforkortelse levende avbildning fluorescerende taggede sarcomere-proteiner mikrokontaktutskrift
Sarcomere Forkortelse av Pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter ved hjelp av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai,… More

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai, T., Koiwai, K., Murakami, T., Suzuki, H., Hanazono, Y., Uosaki, H. Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.. J. Vis. Exp. (169), e62129, doi:10.3791/62129 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter