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Biology

गैर वायरल जीन थेरेपी के लिए स्तनधारी प्राथमिक वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, और जेनेटिक इंजीनियरिंग

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62145
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 3, 4, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 4Max Delbrück Center for Molecular Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां, विभिन्न स्तनधारियों (चूहों, चूहा, खरगोश, सुअर और गोजातीय) से प्राथमिक आईरिस और रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग और स्थानांतरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। विधि आदर्श रूप से पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए विभिन्न सेट-अप में नेत्र जीन थेरेपी दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है और वीवो अध्ययन में मनुष्यों के लिए हस्तांतरणीय है।

Abstract

उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी) 60 साल > के रोगियों में अंधापन का सबसे लगातार कारण है, जो दुनिया भर में ~ 30 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। एएमडी पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों से प्रभावित एक बहुकार्यात्मक रोग है, जो रेटिना वर्णक एपिथेलियल (आरपीई) कोशिका पतन के कारण रेटिना की कार्यात्मक हानि का कारण बनता है जिसके बाद फोटोरिसेप्टर क्षरण होता है। एक आदर्श उपचार में आरपीई सेल मृत्यु और फोटोरिसेप्टर अध: पतन को रोकने के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों का स्राव करने वाली स्वस्थ आरपीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण शामिल होगा। कार्यात्मक और आनुवंशिक समानताओं और कम आक्रामक बायोप्सी की संभावना के कारण, आईरिस वर्णक एपिथेलियल (आईपीई) कोशिकाओं के प्रत्यारोपण को विकृत आरपीई के विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया था। कम संख्या में सबरेटिनली-प्रत्यारोपित कोशिकाओं द्वारा न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों का स्राव स्लीपिंग ब्यूटी (SB100X)ट्रांसपोसन-मध्यस्थता ट्रांसफैक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें वर्णक एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) और/या ग्रेनुलोसिटे मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के लिए जीन कोडिंग है । हमने कृंतक, सूअर और मवेशियों सहित विभिन्न प्रजातियों से आरपीई और आईपीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और SB100X-मध्यस्थताट्रांसफैक्शन की स्थापना की। ग्लोब्स को हटा दिया जाता है और आईरिस और रेटिना तक पहुंचने के लिए कॉर्निया और लेंस को हटा दिया जाता है। कस्टम-निर्मित स्पैटुला का उपयोग करके, आईपीई कोशिकाओं को अलग आईरिस से हटा दिया जाता है। आरपीई कोशिकाओं को फसल करने के लिए, प्रजातियों के आधार पर एक ट्राइपसिन इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है। फिर, आरपीई-अनुकूलित स्पैटुला का उपयोग करके, कोशिकाओं को मध्यम में निलंबित कर दिया जाता है। सीडिंग के बाद, कोशिकाओं की प्रति सप्ताह दो बार निगरानी की जाती है और संगम तक पहुंचने के बाद, इलेक्ट्रोपाउरेशन से संक्रमित होती है। जीन एकीकरण, अभिव्यक्ति, प्रोटीन स्राव, और समारोह QPCR, पश्चिम बंगाल, एलिसा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और कार्यात्मक परख द्वारा पुष्टि की गई । प्रजातियों के आधार पर, 30,000-5 मिलियन (आरपीई) और 10,000-15 मिलियन (आईपीई) कोशिकाओं को प्रति आंख अलग किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने की क्षमता के साथ महत्वपूर्ण पीडीएफ/जीएम-सीएसएफ ओवरएक्सप्रेशन दिखाती हैं और पूर्व वीवो विश्लेषणों के लिए एक लचीली प्रणाली प्रदान करती हैं और वीवो अध्ययन में मनुष्यों को नेत्र जीन थेरेपी दृष्टिकोण विकसित करने के लिए अनुकूलित करती हैं ।

Introduction

हमारा समूह न्यूरोरेटिनल अध: पतन, यानी एएमडी, आरपीई और आईपीई-आधारित गैर-वायरल जीन थेरेपी के इलाज के लिए पुनर्योजी दृष्टिकोणों के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहा है। इस तरह के उपचारों की पूर्व-नैदानिक स्थापना मनुष्यों के लिए अनुकूल विट्रो मॉडल में आवश्यक है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत अध्ययन का लक्ष्य प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करना है। कई प्रजातियों से पीई कोशिकाओं के अलगाव को स्थापित करने का तर्क दृष्टिकोण की सुरक्षा और दक्षता की मजबूती से पुष्टि करना और इसकी प्रजनन क्षमता और हस्तांतरणीयता में वृद्धि करना है। उपलब्ध मानव आरपीई सेल लाइन ARPE-19 प्राथमिक कोशिकाओं से अलग है (उदाहरण के लिए, वे कम वर्णक हैं) और इसलिए, केवल पूर्व नैदानिक विश्लेषण के लिए सीमित मूल्य का1। इसके अतिरिक्त, गैर-मानव स्तनधारी कोशिकाओं को कम लागत और बड़ी मात्रा में खरीदा जा सकता है; मानव दाता ऊतक विभिन्न नेत्र बैंकों से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन उपलब्धता सीमित और महंगा है। अंत में, नए उन्नत थेरेपी औषधीय उत्पाद (एटएमपी, यानी, सेल, ऊतक, या जीन थेरेपी औषधीय उत्पाद) रोगियों में परीक्षण किए जाने से पहले कम से कम दो विभिन्न प्रजातियों में लागू करने की आवश्यकता होती है और ये वीवो अध्ययन में एलोजेनिक सेल प्रत्यारोपण की तैयारी का अनुरोध करते हैं।

रेटिना न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां औद्योगिक देशों में अंधेपन का प्रमुख कारण हैं, जिसमें एएमडी जैसी सामान्य बीमारियां शामिल हैं, साथ ही रेटिनााइटिस पिगमेंटोसा जैसी दुर्लभ बीमारियां भी शामिल हैं, जिसमें रेटिना सेल डेथ अंततः अंधापन की ओर ले जाती है । आरपीई कोशिकाओं, फोटोरिसेप्टर, और रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) क्षति कुछ मामलों में धीमा किया जा सकता है, लेकिन वर्तमान में कोई उपचारात्मक उपचार उपलब्ध हैं । एटीएमपी जीन दोषों को सही करने, चिकित्सीय जीन को एकीकृत करने या विकृत कोशिकाओं को बदलने की क्षमता प्रदान करते हैं, जिससे एएमडी जैसे रोगों के लिए पुनर्योजी और उपचारात्मक उपचारों का विकास संभव होता है; 13 जीन चिकित्सा पहले से ही RPE65 उत्परिवर्तन से जुड़े रेटिना अध: पतन2,3के इलाज के लिए एक चिकित्सा सहित विपणन अनुमोदन मिला है । पुराने वयस्कों (>60 वर्ष) में, दुनिया भर में ~ 30 मिलियन लोग या तो नियोवैस्कुलर (एनवीएएमडी) या अवस्कुलर (एएमडी) एएमडी4से प्रभावित होते हैं। दोनों रूपों को ऑक्सीडेटिव क्षति, कार्य हानि और आरपीई कोशिकाओं की हानि सहित उम्र से जुड़े ट्रिगर्स से प्रेरित किया जाता है, जिसके बाद फोटोरिसेप्टर क्षरण होता है, दूसरों के बीच (जैसे आनुवंशिक जोखिम एलील्स, धूम्रपान, उच्च रक्तचाप)5,6। एनवीएएमडी में, रोगजनकता एंजियोजेनिक और एंटी-एंजियोजेनिक कारकों के असंतुलन से बढ़ जाती है, जो एंजियोजेनिक वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीजीएफ) के पक्ष में है जो कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) को प्रेरित करता है। आज तक, सीएनवी को दबाने के लिए वीजीएफ प्रोटीन के अवरोधकों के मासिक इंट्राविएट्रियल इंजेक्शन द्वारा केवल एनवीएएमडी का इलाज किया जाता है; कोई प्रभावी उपचार अभी तक AAMD6,7के लिए उपलब्ध है .

कई अध्ययनों ने एंटी-वीजीएफ थेरेपी को बदलने के लिए सेल-आधारित उपचारों का मूल्यांकन किया: बाइंडर एट अल द्वारा किए गए अध्ययन, जिसमें ताजा-काटा गया ऑटोलॉगस आरपीई कोशिकाओं कोएनएमडी8,9,10के साथ रोगियों में प्रत्यारोपित किया गया था, मध्यम दृश्य सुधार दिखाया गया, लेकिन केवल रोगियों का एक छोटा समूह पढ़ने को सक्षम करने के लिए पर्याप्त अंतिम दृश्य तीक्ष्णता तक पहुंच गया। हाल ही में, एक चरण मैं नैदानिक अध्ययन एक भ्रूण स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई पैच का इस्तेमाल किया आशाजनक परिणामों के साथ एएमडी का इलाज; यानी, प्रभावकारिता, स्थिरता, और 10 रोगियों में से 2 में 12 महीने तक के लिए आरपीई पैच की सुरक्षा11का इलाज किया . इसके अलावा, कई समूहों ने अध्ययन प्रकाशित किए हैं जिसमें ऑटोलॉगस आरपीई-ब्रुच के झिल्ली-कोरॉइड पैच को परिधीय रेटिना से काटा गया था और मैकुला12,13, 14में प्रत्यारोपित किया गया था; और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न आरपीई पैच प्रत्यारोपण के लिए उत्पन्न किए गए थे15. AAMD के लिए, पूरक मार्ग को लक्षित एंटीबॉडी नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया गया है6,16 और एक चरण मैं अध्ययन एक adeno के एक इंट्राविट्रियल इंजेक्शन का उपयोग कर जुड़े वायरल (AAV) कारक CD59 के लिए जीन कोडिंग (AAVCAGsCD59) भौगोलिक शोष (GA) के साथ रोगियों में पूरा किया गया था17; चरण द्वितीय अध्ययन हाल ही में शुरू कर दिया और उन्नत aAMD के साथ 132 रोगियों की भर्ती और 2 साल के बाद हस्तक्षेप18में परिणाम का मूल्यांकन करना है . अंत में, फोक्यूएस अध्ययन समूह ने एक चरण I/II मल्टीसेंटर नैदानिक परीक्षण शुरू कर दिया है जो एक पुनर्संयोजन गैर-नकल एएवी वेक्टर की सुरक्षा, खुराक प्रतिक्रिया और प्रभावकारिता का मूल्यांकन करता है जो मानव पूरक कारक19को एन्कोडिंग करता है ।

मुख्य रूप से, एक पुनर्योजी एएमडी थेरेपी का लक्ष्य कार्यात्मक आरपीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण है, जो क्षतिग्रस्त या खो गए थे। हालांकि, आईपीई और आरपीई कोशिकाएं कई कार्यात्मक और आनुवंशिक समानताएं (उदाहरण के लिए, फागोसिटोसिस और रेटिनोल मेटाबोलिज्म) साझा करती हैं, और क्योंकि आईपीई कोशिकाएं अधिक व्यवहार्य हैं, उन्हें आरपीई विकल्प20के रूप में प्रस्तावित किया गया है। यद्यपि यह पहले भी प्रदर्शित किया गया है कि आईपीई सेल प्रत्यारोपण पशु मॉडल21,22 में फोटोरिसेप्टर अध: पतन में देरी करता है और अंत-चरण एनवीएएमडी वाले रोगियों में दृश्य कार्य को स्थिर करता है, इन रोगियों में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं देखा गया था23। प्रभावकारिता की कमी प्रत्यारोपित कोशिकाओं की कम संख्या के कारण हो सकती है, और/या न्यूरोप्रोटेक्टिव रेटिना कारकों के असंतुलन के कारण हो सकती है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण संक्रमित वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना होगा जो रेटिना होमोस्टेसिस को बहाल करने, शेष आरपीई कोशिकाओं को बनाए रखने और फोटोरिसेप्टर्स और आरजीसी को पतन से बचाने के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों को अधिक जोड़ते हैं। नतीजतन, हम एक नई थेरेपी का प्रस्ताव करते हैं जिसमें कार्यात्मक आरपीई या आईपीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण शामिल है जो न्यूरोप्रोटेक्टिव और एंटी-एंजियोजेनिक प्रोटीन, जैसे पीडीएफ, जीएम-सीएसएफ या इंसुलिन-जैसे विकास कारकों (आईजीएफ) को स्रावित करने के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग से गुजरी हैं। सेल लाइन, केवल एक प्रजाति, या मानव ऊतक का उपयोग करने के बजाय कई प्रजातियों में इस दृष्टिकोण को विकसित करने और विश्लेषण करने का लाभ यह है: 1) स्वतंत्र प्रयोगशालाओं और विभिन्न प्रजातियों में महसूस किए गए कई अध्ययनों द्वारा दिखाए गए परिणामों की प्रजनन क्षमता और हस्तांतरणशीलता में वृद्धिहुई 1,24,25; 2) सुअर या गोजातीय कोशिकाओं अतिरिक्त जानवरों के बलिदान के बिना संभव डिस्पोजेबल हैं; 3) विशेष रूप से सुअर और गोजातीय कोशिकाओं की उपलब्धता बड़ी परीक्षण श्रृंखला को मजबूत परिणाम देने की अनुमति देती है; 4) ज्यादातर इस्तेमाल किए गए मॉडलों से कोशिकाओं को अलग करने, संस्कृति और आनुवंशिक रूप से संशोधित करने का ज्ञान कई प्रजातियों24, 25,26 में वीवो विश्लेषण में सक्षम बनाता है और इस प्रकार पहले इलाज किए गए रोगियों के लिए एक बेहतर जोखिम-लाभ अनुपात प्रदान करता है; 5) प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लचीलापन विभिन्न मॉडलों और प्रयोगात्मक सेट अप में और आनुवंशिक इंजीनियरिंग के साथ और बिना सभी नेत्र कोशिका आधारित उपचारों के लिए इसके उपयोग की अनुमति देता है। इसके विपरीत, सेल लाइनों या मानव ऊतक के रूप में वैकल्पिक तकनीकों केवल सीमित हस्तांतरणीयता और/या सीमित निपटान के हैं । एआरपीई-19 जैसी सेल लाइनें प्रारंभिक प्रयोगों के लिए आदर्श हैं; हालांकि, कम पिगमेंटेशन और उच्च प्रसार प्राथमिक कोशिकाओं से काफी अलग1. आरपीई और आईपीई कोशिकाएं, जो मानव दाता ऊतक से अलग हैं, विट्रो प्रयोगों में हस्तांतरणीय के लिए एक कीमती स्रोत प्रदान करती हैं; हालांकि, हम एक अमेरिकी-अमेरिकी नेत्र बैंक से मानव ऊतक प्राप्त करते हैं जिसका अर्थ है कि ऊतक कम से कम दो दिन पुराना है (परमाणु के बाद) और एक लंबे और महंगे परिवहन की आवश्यकता होती है, लेकिन स्थानीय दाता ऊतक एक उत्पादक अनुसंधान के लिए पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध नहीं है। प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के लाभ की पुष्टि अन्य समूहों के कई अध्ययनों से होती है27,28.

पीईडीएफ और/या जीएम-सीएसएफ के लिए जीन कोडिंग के साथ प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एसबी100एक्स ट्रांसपोसन प्रणाली का उपयोग करके सेल आधारित गैर-वायरल जीन थेरेपी के विकास के लिए क्रमशः29,30,31,32,हमने पहली बार ARPE-19 सेल1 1 के ट्रांसफेक्शन की स्थापना की . इसके बाद, अलगाव और ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल आसानी से सुलभ गोजातीय और पोर्सिन प्राथमिक कोशिकाओं में स्थापित किए गए थे। अब, पांच विभिन्न प्रजातियों से प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं के अलगाव और ट्रांसफेक्शन की स्थापना की गई है, छोटे (माउस के रूप में) से बड़े स्तनधारियों (मवेशियों के रूप में) । इसकी पुष्टि प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं में मानव दाता आंखों सेप्राप्त 30से की गई थी । एटएमपी के अच्छे विनिर्माण पद्धतियों (जीएमपी) के अनुरूप उत्पादन को मानव दाता ऊतक के साथ-साथ33का उपयोग करके मान्य किया गया था। अंत में, दृष्टिकोण की सुरक्षा और दक्षता दोनों का मूल्यांकन वीवो में तीन अलग-अलग प्रजातियों में किया गया था जिसके लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है: माउस, चूहा और खरगोश। नैदानिक सेट-अप में, रोगी से एक आईरिस बायोप्सी काटा जाएगा और आईपीई कोशिकाओं को अलग किया जाएगा और साफ कमरे में संक्रमित किया जाएगा, इससे पहले कि कोशिकाओं को एक ही मरीज में सबretinally वापस प्रत्यारोपित किया जाएगा । पूरी प्रक्रिया एक शल्य चिकित्सा सत्र के दौरान होगी जो लगभग 60 मिनट तक चलेगी। उपचार दृष्टिकोण के विकास और इसकी दक्षता के मूल्यांकन ने मजबूत और कुशल जीन वितरण विधियों को लागू करने, जीन वितरण, चिकित्सीय प्रोटीन उत्पादन और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभावों की दक्षता का विश्लेषण करने और वीवो1,24, 25, 29,30 में दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए सेल प्रत्यारोपण का उत्पादन करने के लिए उत्कृष्ट इन विट्रो और पूर्व वीवो मॉडल का अनुरोधकिया। . यह उल्लेखनीय है कि चिकित्सा जिनेवा के कैंटन के अनुसंधान के लिए नैतिक आयोग से एक नैदानिक चरण आईबी/IIa परीक्षण के लिए नैतिक अनुमोदन किया है लायक है (संख्या 2019-00250) और वर्तमान में पिछले पूर्व नैदानिक स्विस नियामक अधिकारियों द्वारा प्राधिकरण के लिए अनुरोध डेटा प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं । इस संबंध में, वीवो डेटा में प्री-क्लीनिकल ने सीएनवीऔर उत्कृष्ट सुरक्षा24, 25,31में उल्लेखनीय कमी का प्रदर्शन किया।

यहां, गोजातीय, सुअर, खरगोश, चूहा और माउस से आरपीई/आईपीई कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति, और एक कुशल जीन वितरण विधि के रूप में इलेक्ट्रोपॉशन के साथ संयुक्त एकीकृत SB100X ट्रांसपोसन प्रणाली के उपयोग का वर्णन किया गया है । विशेष रूप से, प्राथमिक पीई कोशिकाओं को पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ को अधिक एक्सप्रेस करने के लिए संक्रमित किया गया था। इन प्रोटोकॉलों का संग्रह इन विट्रो और वीवो अध्ययनों में एटएमपी विकास के सभी पूर्व-नैदानिक चरणों में प्रदर्शन करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, सेट-अप में रुचि और बीमारियों के अन्य जीन के अनुकूल होने की क्षमता है ।

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Protocol

प्रोटोकॉल जिसमें जानवरों को शामिल किया गया था प्रमाणित कर्मियों द्वारा और कैंटोनल Département डे ला sécurité द्वारा प्राधिकरण के बाद, de l'emploi एट डे ला सैंटे (DSES), जिनेवा, स्विट्जरलैंड के डोमेन डे l'expérimentation animale, और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO बयान के अनुसार (अनुमोदन संख्या जीई/94/17) । वयस्क स्वस्थ ब्राउन नॉर्वे चूहों, C57BL/6 चूहों, और ंयूजीलैंड सफेद खरगोशों पेंटोबार्बिटल (१५० मिलीग्राम/किलो) की एक ओवरडोज से इच्छामृत्यु ०.९% NaCl इंजेक्शन इंट्रापेरिटोनियल में पतला और आंखों को बलिदान के तुरंत बाद नाभिित किया गया । पोर्सिन और गोजातीय आंखें बलिदान के 6 घंटे के भीतर एक स्थानीय कसाईघर से प्राप्त किया गया और बर्फ पर प्रयोगशाला में ले जाया गया ।

1. तैयारी से पहले

  1. पूरा माध्यम तैयार (DMEM/हैम F12 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), ८० यू/एमएल पेनिसिलिन/८० μg/mL streptomycin, और २.५ μg/ml एम्फोटेरिसिन बी के साथ पूरक । 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में मध्यम, 1x पीबीएस, और 0.25% ट्राइप्सिन (यदि आवश्यक हो) गर्म करें।
  2. एक असेप्टिक काम करने की जगह तैयार करने के लिए हुड में एक बाँझ कपड़ा रखो। हुड के अंदर सभी आवश्यक बाँझ उपकरणों और सामग्रियों का परिचय दें।
    नोट: केवल आंखों का परमाणु और शेष मांसपेशियों के ऊतकों और त्वचा की सफाई हुड के बाहर की जाने वाली प्रक्रियाएं हैं, बाकी चरण हुड के अंदर किए जाने चाहिए।

2. चूहे/माउस पीई कोशिकाओं का अलगाव

  1. जानवर को इच्छामृत्यु के बाद आंखों को नाभिित करने के लिए घुमावदार कैंची और कोलिबरी संदंश का उपयोग करें। कैंची और संदंश (गैर बाँझ) का उपयोग कर आंखों से शेष मांसपेशियों के ऊतकों और त्वचा को साफ करें।
    नोट: आंखों के परमाणु और सफाई के लिए उपयोग की जाने वाली कैंची और संदंश का आकार प्रजातियों पर निर्भर करता है (उदाहरण के लिए, चूहे और माउस के लिए उपकरण सुअर और मवेशियों के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में छोटे होने जा रहे हैं) (चित्रा S1देखें)।
    1. गैर बाँझ पीबीएस से भरा एक 50 एमएल ट्यूब में आंखों को ले लीजिए और टुकड़ेदार प्रवाह हुड के लिए ट्यूब स्थानांतरित। आयोडीन आधारित समाधान में 2 मिनट के लिए जलमग्न करके आंखों को कीटाणुरहित करें, फिर उन्हें बाँझ पीबीएस से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  2. बल्ब का उद्घाटन
    1. आंखों को बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के बाद, कोलिबरी या नुकीले संदंश के साथ ऑप्टिक तंत्रिका के करीब एक मजबूती से पकड़ें। 18 जी सुई के साथ आईरिस (पार्स प्लाना और ओरा सेराटा के बीच) की सीमा के पास एक छेद पंच करें। छेद में छोटी कैंची डालें और आईरिस के चारों ओर काट लें। पूर्वकाल खंड (कॉर्निया, लेंस और आईरिस) को हटा दें और इसे पेट्री डिश में डाल दें। बल्ब को विट्रियस के साथ छोड़ दें जब तक कि आरपीई कोशिकाएं अलग न हों।
  3. आईपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. लेंस को हटा दें और ठीक संदंश के साथ नाजुक आईपीई कोशिकाओं युक्त आईरिस बाहर खींचो। एक पेट्री डिश में आईरिस रखें, बाँझ पीबीएस के साथ धोएं और इसे पीबीएस में तब तक छोड़ दें जब तक कि अधिक आईरिस तैयार न हो जाए।
    2. उस दिन सभी आंखों को तैयार करने के लिए 2.2.1 से 2.3.1 तक दोहराएं।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.25% ट्राइपसिन प्रति आईरिस और इनक्यूबेट के 50 माइक्रोन जोड़ें। ट्रिप्सिन निकालें, प्रति आईरिस पूर्ण माध्यम के 150 माइक्रोन जोड़ें और आईपीई को एक फ्लैट आग-पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ नाजुक रूप से परिमार्जन करें; ऊतक को स्थिर करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। सेल निलंबन ले लीजिए और एक 1.5 एमएल ट्यूब में डाल दिया। न्यूबॉर चैंबर 34,35 में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ 1:3 कोशिका निलंबन के10माइक्रोन का उपयोग करें ।
    4. यदि तुरंत संक्रमित नहीं है, तो 24-अच्छी प्लेट (100,000 कोशिकाओं/सेमी2)में 200,000 कोशिकाओं /सेमी 2) को पूर्ण माध्यम (10% एफबीएस) (सीडिंग के लिए टेबल 1 देखें) में बीज 200,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) । प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर कल्चर करें ।
      नोट: सीडिंग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए कई आंखों को एक साथ पूल करना आवश्यक हो सकता है।
  4. आरपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. पतली संदंश के साथ पीछे के खंड से vitreous हास्य और रेटिना निकालें। रेटिना वर्णक एपिथेलियम को नुकसान पहुंचाने से बचें।
    2. एक #10 स्केलपेल के साथ आधे में खंड में कटौती करने के लिए दुनिया पूरी तरह से खुला है और बाँझ PBS के साथ धोने ।
    3. प्रति आंख 0.25% ट्राइपसिन का 50 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्राइप्सिन निकालें और प्रति ग्लोब पूर्ण माध्यम के 150 माइक्रोन जोड़ें और आरपीई कोशिकाओं को गोल स्केलपेल के साथ नाजुक रूप से परिमार्जन करें; ऊतक को स्थिर करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। सेल सस्पेंशन को कलेक्ट करें और इसे 1.5 एमएल ट्यूब में डाल दें। सेल निलंबन के 10 माइक्रोल ले लो; न्यूबॉर कक्ष में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ 1:4 पतला करें।
    4. चरण 2.3.4 देखें।
      नोट: सीडिंग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए कई आंखों को एक साथ पूल करना आवश्यक हो सकता है।

3. खरगोश पीई कोशिकाओं का अलगाव

  1. चरण 2.1 से 2.1.1 में वर्णित सफाई और कीटाणुशोधन करें।
  2. एक बाँझ धुंध संपीड़न पर एक आंख रखो और यह मजबूती से ऑप्टिक तंत्रिका के करीब पकड़ो । लिम्बस के नीचे स्केलपेल #11 और कैंची के साथ लगभग 2 मिमी के साथ आंख खोलें। पूर्वकाल खंड (कॉर्निया, लेंस और आईरिस) को हटा दें और इसे पेट्री डिश में डाल दें। बल्ब को विट्रियस के साथ छोड़ दें जब तक कि आरपीई कोशिकाएं अलग न हों।
  3. आईपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. चरण 2.3.1 करें। #10 स्केलपेल से काटकर सिलियरी बॉडी को आइरिस से निकालें।
    2. 2 आईरिस की तैयारी के बाद, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्राइपसिन के 1 मिलील के साथ इनक्यूबेट; इस समय के दौरान, आरपीई कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है (चरण 3.4 देखें)। ट्रिप्पसिन निकालें और आईरिस में 1 एमएलए पूरा माध्यम जोड़ें और एक फ्लैट आग पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ सावधानी से खरोंच करके कोशिकाओं को अलग करें। कोशिकाओं को ध्यान से पाइपिंग करके और कोशिका निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करके पुनर्उत्कार करें। न्यूबॉयर चैंबर में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन लें और 1:3 पतला करें।
    3. चरण 2.3.4 देखें।
  4. आरपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. चरण 2.4.1 करें।
    2. एक बाँझ धुंध एक 12 अच्छी तरह से थाली में डाल दिया और धुंध पर बल्ब डाल दिया ।
    3. पीबीएस के साथ धोएं और चरण 2.4.3 करें।
      नोट: एक घुमावदार आग पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
    4. 120 x ग्रामपर कोशिकाओं को 10 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. चरण 2.3.4 देखें।

4. सुअर पीई कोशिकाओं का अलगाव

  1. चरण 2.1 में वर्णित सफाई करें। पीबीएस से धोएं और आयोडीन आधारित समाधान में 2 मिनट के लिए जलमग्न करके आंखों को कीटाणुरहित करें, पीबीएस के साथ कुल्ला करें। चरण 3.2 के साथ जारी रखें।
  2. आईपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. चरण 3.3.1 करें। 2 आईरिस की तैयारी के बाद, पूर्ण माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और एक फ्लैट आग पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ सावधानी से खरोंच करके कोशिकाओं को अलग करें। सेल निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। न्यूबॉयर चैंबर में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन लें और ट्राइपैन ब्लू के साथ 1:4 पतला करें।
    2. चरण 2.3.4 देखें।
  3. आरपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. चरण 2.4.1 करें। बल्ब को पेट्री डिश में रखें और पीबीएस से धोएं। बल्ब को 1 एमएल कंप्लीट मीडियम से भरें।
    2. घुमावदार आग से पॉलिश किए गए पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके, आरपीई कोशिकाओं को ध्यान से हटा दें। कोरॉयड-ब्रुच के झिल्ली परिसर के नीचे फिसलने से बचने के लिए नीचे से ऊपर तक परिमार्जन करना सुनिश्चित करें। बल्ब के भीतर सेल निलंबन को 1,000 माइक्रोट का उपयोग करके इकट्ठा करें और पुनर्पितरण के लिए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। न्यूबॉयर चैंबर में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ सेल सस्पेंशन का 10 माइक्रोल लें और 1:8 पतला करें।
    3. चरण 2.3.4 देखें।

5. गोजातीय पीई कोशिकाओं का अलगाव

  1. चरण 2.1 में वर्णित सफाई करें। पीबीएस से धोएं और आयोडीन आधारित समाधान में 2 मिनट के लिए जलमग्न करके आंखों को कीटाणुरहित करें, पीबीएस के साथ कुल्ला करें। चरण 3.2 के साथ जारी रखें।
  2. आईपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. चरण 3.3.1 करें। दो आईरिस तैयार करने के बाद 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्राइपसिन के 2 मिलील के साथ इनक्यूबेट करें। इस समय के दौरान, आरपीई कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है (चरण 5.3 देखें)।
    2. ट्रिप्पसिन निकालें और आईरिस में 2 एमएल पूरा माध्यम जोड़ें और एक फ्लैट आग पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ सावधानी से खरोंच करके कोशिकाओं को अलग करें। सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 120 x ग्रामपर कोशिकाओं को 10 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें। न्यूबॉयर चैंबर में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन लें और ट्राइपैन ब्लू के साथ 1:4 पतला करें।
    3. यदि तुरंत संक्रमित नहीं है, तो बीज 320,000 कोशिकाओं /अच्छी तरह से पूर्ण माध्यम (10% FBS) के 3 एमएल में एक 6 अच्छी तरह से थाली में (सीडिंग के लिए तालिका 1देखें) । प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर कल्चर करें ।
  3. आरपीई कोशिकाओं का अलगाव
    1. चरण 2.4.1 का पालन करें। बल्ब को पेट्री डिश में रखें और पीबीएस से धोएं। 2 आंखों की तैयारी के बाद बल्ब को ट्राइप्सिन के साथ लगभग 3/4 भरें और बल्बी के शीर्ष पर पेट्री डिश के ढक्कन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. ट्राइप्सिन निकालें और इसमें 1 एमएल कंप्लीट मीडियम डालें। चरण 4.3.2 करें। 120 x ग्रामपर कोशिकाओं को 10 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. चरण 5.2.3 देखें।

6. खेती - मध्यम परिवर्तन

  1. संस्कृति DMEM/हैम F12 में कोशिकाओं, 10% FBS, ८० यू/एमएल पेनिसिलिन/८० μg/mL streptomycin, और २.५ μg/ml amphotericin बी, 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ2 के साथ पूरक एक आर्द्र इनक्यूबेटर में । 3-4 दिनों के बाद गैर-अनुयायी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें और आधी मात्रा को दूसरे कुएं में डाल दें। पूरा माध्यम से 1 एमएल तक भरें।
    नोट: यह सभी कोशिकाओं को संलग्न करने और आउटपुट को अधिकतम करने के लिए अलग करने के लिए पर्याप्त सतह होने की अनुमति देता है।
  2. एक और 3-4 दिनों के बाद सेल संग्रह दोहराने लेकिन इस बार एक अच्छी तरह से दो कुओं से गैर-अनुयायी कोशिकाओं को पूल करके (उदाहरण के लिए, C1 में A1 + B1)। सभी कुओं में मध्यम जोड़ें। कोशिकाओं का निरीक्षण करें और प्रति सप्ताह 2 बार माध्यम को बदलें (6 और 24-अच्छी प्लेटों के लिए क्रमशः 3 और 1 एमएल/वेल का उपयोग करें)। जब कोशिकाएं संगम तक पहुंचती हैं, तो 1% एफबीएस के साथ पूरा माध्यम पर स्विच करें या प्रयोगों (जैसे, ट्रांसफैक्शन) के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।
    नोट: आरपीई और आईपीई कोशिकाओं को क्रमशः 3-4 के बाद, और अलगाव के बाद 4-5 सप्ताह के बाद संकुचित कर रहे हैं । कोशिका संस्कृति शुद्धता को कोशिका आकृति विज्ञान (वर्णक कोशिकाओं) और विशिष्ट मार्कर की जांच करने की पुष्टि की गई थी जैसा कि जॉनन और सहयोगियों द्वारा वर्णित36

7. प्राथमिक पीई कोशिकाओं का विद्युत पात

  1. 1,37से पहले वर्णित विद्युत डीपीओशन करें .
  2. संक्रमित कोशिकाओं की संख्या के आधार पर 6-, 24 या 48-अच्छी तरह से प्लेटें (तालिका 2देखें) एंटीबायोटिक दवाओं या एंटीमाइकोटिक्स के बिना मध्यम में कोशिकाओं को बीज करने के लिए उपयोग करते हैं। अगले 2 हफ्तों के लिए मध्यम युक्त पेनिसिलिन (८० यू/एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (८० μg/mL), और एम्फोटेरिसिन बी (२.५ μg/mL) के साथ एक सप्ताह में दो बार बूंदें जोड़ें । ट्रांसफैक्शन के बाद माध्यम को पूरी तरह से 2 सप्ताह का आदान-प्रदान करें।
  3. सेल विकास, ट्रांसफेक्शन दक्षता और प्रोटीन स्राव निर्धारित करने के लिए, माइक्रोस्कोपी द्वारा साप्ताहिक कोशिकाओं की निगरानी करें और पश्चिमी दाग द्वारा सेल संस्कृति सुपरनाटेंट का विश्लेषण करें। संस्कृति की समाप्ति से पहले, एलिसा द्वारा प्रोटीन स्राव की मात्रा निर्धारित करने के लिए 24 एच सेल संस्कृति सुपरनेट लें, कोशिकाओं को गिनें, छवि-आधारित साइटोमेट्री (वीनस-संक्रमितकोशिकाओं के मामले में) द्वारा फ्लोरेसेंस को मापें, 'सामग्री की तालिकादेखें) का पालन करें, और आरटी-क्यूपीसीआर-आधारित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए सेल पेलेट एकत्र करें।
    नोट: इन तरीकों को वर्तमान कागज में शामिल नहीं किया गया है क्योंकि यह कोशिकाओं के विश्लेषण को विस्तार से समझाने का उद्देश्य नहीं है बल्कि उनका अलगाव है। सेल सीडिंग घनत्व सभी प्रजातियों (१००,००० कोशिकाओं/सेमी2)के लिए समान है, लेकिन क्योंकि अलग कोशिकाओं की संख्या बदलती है, अलग प्लेटों का इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, चूहों, चूहे और खरगोश के लिए सीडिंग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए 2-3 आंखों को पूल करना आवश्यक हो सकता है।
प्रजातियां ट्राइप्सिन उपचार N° आईपीई कोशिकाएं N° आरपीई कोशिकाएं सीडिंग के लिए प्लेट (100,000 कोशिकाएं/
माउस/चूहा हाँ ~50,000 ~ 150,000 24-अच्छी तरह से प्लेटें
खरगोश हाँ ~350,000 ~ 2,500,000 24-अच्छी तरह से प्लेटें
सुअर नहीं ~ 1,000,000 ~ 3,000,000 24-अच्छी तरह से प्लेटें
गोजातीय हाँ ~ 1,700,000 ~ 5,000,000 6-अच्छी प्लेटें

तालिका 1: विभिन्न प्रजातियों से आंखों से अलग प्राथमिक पीई कोशिकाओं की संख्या।

नाम क्षेत्र वॉल्यूम मीडियम ट्राइप्सिन ट्राइपसिन की कार्रवाई को रोकने के लिए वॉल्यूम माध्यम सीडिंग घनत्व
6-अच्छी थाली 9.6 सेमी ² 3.0 एमएल 0.5 एमएल 1.0 एमएल 3x105
24-अच्छी तरह से थाली 2.0 सेमी ² 1.0 एमएल 0.2 एमएल 0.8 एमएल 5x104
48-अच्छी थाली 1.1 सेमी ² 0.5 एमएल 0.1 एमएल 0.4 एमएल 0.5-1x104

तालिका 2: सेल संस्कृति की मात्रा और सीडिंग घनत्व।

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Representative Results

विभिन्न स्तनपायी प्रजातियों से पीई अलगाव
उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आईपीई और आरपीई कोशिकाओं को पांच विभिन्न प्रजातियों से सफलतापूर्वक अलग और सुसंस्कृत किया गया था। प्रत्येक प्रक्रिया से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या प्रजातियों और आंखों के आकार(तालिका 1)पर निर्भर करती है। जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, कोशिकाएं विशिष्ट पीई सेल आकृति विज्ञान और पिगमेंटेशन दिखाती हैं (खरगोश कोशिकाओं को छोड़कर, एल्बिनो न्यूजीलैंड व्हाइट (एनजेडडब्ल्यू) खरगोशों से व्युत्पन्न हुई हैं। अलगाव के बाद 21 दिनों में, कोशिकाएं संकुचित होती हैं, आगे के प्रयोगों (जैसे, ट्रांसफैक्शन) के लिए उपयोग करने के लिए तैयार होती हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी प्रजातियों की संस्कृतियों की निगरानी की जाती है और सामान्य आकृति विज्ञान और स्थिर ट्रांसजीन अभिव्यक्ति (डेटा नहीं दिखाए गए) की पुष्टि करते हुए 2 साल तक नियंत्रित किया जाता है।

डिफरेंटेशन, सेलुलर स्ट्रेस और जीन एक्सप्रेशन में बदलाव को आरटी-क्यूपीसीआर और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने बाहर रखा था । जीन के एक पैनल (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) संक्रमित मानव आरपीई कोशिकाओं (ARPE-19 कोशिकाओं) में विश्लेषण सामान्य आरपीई अभिव्यक्ति पैटर्न1की पुष्टि की; जिसे प्राथमिक गोजातीय आईपीई कोशिकाओं में आरपीई 65(चित्रा 2)के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पुष्टि की जा सकती है। इसके अलावा, जॉनन और सहयोगियों ने प्राथमिक पोर्सिन आईपीई और आरपीई कोशिकाओं36में जेडओ-1 इम्यूनोस्टेपिंग की पुष्टि की।

Figure 1
चित्रा 1:अलगाव के बाद 21 दिनों में विभिन्न स्तनधारियों से पीई कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ। माउस, खरगोश (एल्बिनो एनजेडडब्ल्यू खरगोश), सुअर और गोजातीय से आईपीई और आरपीई कोशिकाओं को 21 के बाद अलगाव में दिखाया गया है। सभी प्रजातियों के लिए, दिखाया गया संस्कृतियों को संकुचित किया जाता है। ध्यान दें कि खरगोश पीई कोशिकाओं को वर्णक नहीं किया जाता है (मूल आवर्धन, 50x)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:प्राथमिक आईपीई कोशिकाओं के RPE65 इम्यूनोस्टेपिंग। PFAR4-CMV-PEDF ट्रांसपोसन प्लाज्मिड के साथ संक्रमित गोजातीय आईपीई कोशिकाओं का आरपीई 65 (हरा) धुंधला गैर-संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं (मूल आवर्धन, 200x) की तुलना में 1 x10 4 कोशिकाओं की प्रारंभिक कोशिका संख्या का उपयोग करके। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

संक्रमित प्राथमिक आरपीई की व्यवहार्यता
सेल व्यवहार्यता चित्र 3में दिखाई गई है । इलेक्ट्रोपाउनेशन प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर की संभावित विषाक्तता को बाहर करने के लिए, पूर्व-संस्कारी प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से इलेक्ट्रोपाउनेशन बफर में या एक दवा कंपनी (गोपनीय संरचना) और इलेक्ट्रोपेटेड (ई) (प्लाज्मिड के अलावा) द्वारा विकसित पोषक तत्व बफर में निलंबित कर दिया गया था जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 7 में वर्णित है। निर्माता के निर्देशों का पालन करने वाली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साइटोटॉक्सिकिटी परख किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके 3 ± 1 दिनों के बाद ट्रांसफैक्शन का अध्ययन किया गया था। परख हमेशा बिजली (सह-पी) (इलेक्ट्रोपेटेड नहीं) के बिना नियंत्रण के साथ किया जाता था। परीक्षण किए गए किसी भी बफ़र्स(चित्र 3)के लिए सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं देखा गया था।

Figure 3
चित्र 3-प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं की व्यवहार्यता विभिन्न बफ़र्स में निलंबित। 1 x 104 कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट या पोषक बफर में इलेक्ट्रोपाउनेशन बफर में निलंबित किया गया था। सेल व्यवहार्यता को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साइटोटॉक्सीसिटी परख किट का उपयोग करके 3 ± 1 दिनों के बाद ट्रांसफैक्शन मापा गया था। विभिन्न बफ़र्स के बीच व्यवहार्यता में कोई अंतर नहीं देखा गया; डेटा का प्रतिनिधित्व ± एसडी (n= 2 दाताओं, 3 प्रतिकृति/दाता) के रूप में किया जाता है । ई: इलेक्ट्रोपोटेड कोशिकाएं, सह-पी: बिजली के बिना नियंत्रण। AU: मनमाने ढंग से इकाइयों । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीनस रिपोर्टर जीन के साथ पूर्व संस्कारी पीई कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन
विभिन्न प्रजातियों से 50,000-100,000 पूर्व-सुसंस्कृत पीई कोशिकाएं अतिसक्रिय SB100X ट्रांसपोसन जीन डिलीवरी सिस्टम का उपयोग करके पीले फ्लोरोसेंट वीनस प्रोटीन (pT2-CAGGS-वीनस) से संक्रमित थीं । चित्रा 4 में दिखाए गए माइक्रोग्राफ इस बात की पुष्टि करते हैं कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक संक्रमित किया गया था (21 दिनों के बाद ट्रांसफेक्शन में फ्लोरोसेंट कोशिकाएं)। चित्रा 5 पूर्व संस्कारी सुअर RPE कोशिकाओं में ट्रांसफैक्शन दक्षता की मात्रा से पता चलता है (n = 6 दाताओं, ५०,००० कोशिकाओं/ट्रांसफैक्शन) वीनस (pT2-CAGGS-वीनस) के साथ संक्रमित । फ्लोरोसेंट कोशिकाओं और एमएफआई का प्रतिशत कोशिका संस्कृति की समाप्ति के दिन निर्माता के निर्देशों के बाद छवि-आधारित साइटोमेट्री का उपयोग करके मापा गया था (30 ± 5 दिन बाद-ट्रांसफैक्शन)। फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का औसत प्रतिशत 50 ± 30% था, लेकिन चर 95 ± 6% (दाता 2) से लेकर 28 ± 1% (दाता 4)(चित्रा 5)। सभी प्रयोगों में, संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । इसके अतिरिक्त, ट्रांसफेक्शन दक्षता हमेशा नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना में की जाती थी: सह-पी (बिजली के बिना नियंत्रण [इलेक्ट्रोपॉरेटेड नहीं]) और सीओ + पी (पावर के साथ नियंत्रण [इलेक्ट्रोपेटेड लेकिन प्लाज्मिड्स के अलावा])। प्रयोग आईपीई कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ भी किया गया है।

Figure 4
चित्रा 4:pT2-CAGGS-वीनस से संक्रमित पूर्व-संस्कारी पीई कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ। शुक्र-संक्रमितखरगोश(ए),गोजातीय(बी),और पोर्सिन(सी)पीई कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन के बाद 21 दिनों में दिखाया जाता है । सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 50,000 ARPE-19 कोशिकाएं वीनस (डी)से संक्रमित थीं। बाएं माइक्रोग्राफ: उज्ज्वल क्षेत्र, सही माइक्रोग्राफ: जीएफपी (480 एनएम) फिल्टर (मूल आवर्धन, 50x)। ट्रांसफेक्शन ट्रिप्लिकेट में किए गए थे और नकारात्मक नियंत्रण शामिल थे: सह-पी (बिजली के बिना नियंत्रण [इलेक्ट्रोपोटेड नहीं]) और सीओ + पी (पावर के साथ नियंत्रण [इलेक्ट्रोपेटेड लेकिन प्लाज्मिड्स के अलावा]) (नहीं दिखाया गया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: शुक्र रिपोर्टर जीन से संक्रमित पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन दक्षता। (क)50,000 प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं को पीटी 2-कैगजीएस-वीनस से संक्रमित किया गया था, समग्र औसत ट्रांसफेक्शन दक्षता 50 ± 30% थी और इसका मतलब एमएफआई सेल संस्कृतियों की समाप्ति के दिन 197 ± 2712 था (30±5 दिन बाद ट्रांसफेक्शन)। ग्राफ 6 विभिन्न जानवरों के ± एसडी (एन = 3 प्रतिकृति) का मतलब दिखाता है। (ख)सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल होने वाली वीनस+ एआरपीई-19 कोशिकाओं का प्रतिशत 98±6 प्रतिशत था और 138 दिनों तक कोशिकाओं का पालन किया गया था। मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) 5,785 ± 1,255 थी। ग्राफ प्रत्येक दिन के लिए ± एसडी (एन = 3 प्रतिकृति) का मतलब दिखाता है। सह-पी (बिजली के बिना नियंत्रण [इलेक्ट्रोपेटेड नहीं]) और सीओ + पी (पावर के साथ नियंत्रण [इलेक्ट्रोपेटेड लेकिन प्लाज्मिड्स के अलावा]) सभी ट्रांसफेक्शन प्रयोगों में शामिल थे (नहीं दिखाया गया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीनस रिपोर्टर जीन के साथ हौसले से पीई कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन
खरगोशों से हौसले से अलग 10,000-50,000 पीई कोशिकाओं को पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस (pFAR4-CMV-वीनस) से संक्रमित किया गया था, और कोशिका संस्कृतियों माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी की गई थी । चित्रा 6 फ्लोरोसेंट कोशिकाओं में 21 के बाद ट्रांसफैक्शन दिन में मनाया जा सकता है। छवि आधारित साइटोमेट्री द्वारा मापा फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का प्रतिशत आईपीई कोशिकाओं के लिए 53 ± 29% और आरपीई कोशिकाओं के लिए 23% ± 28 था (डेटा नहीं दिखाया गया)।

Figure 6
चित्र 6:खरगोश से अलग हौसले से संक्रमित पीई कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ । खरगोश से ५०,००० आईपीई और आरपीई कोशिकाओं pFAR4-CMV-वीनस से संक्रमित थे । फ्लोरेसेंस को 21 पोस्ट-ट्रांसफेक्शन के दिन दिखाया गया है । बाएं माइक्रोग्राफ: उज्ज्वल क्षेत्र, सही माइक्रोग्राफ: जीएफपी (480 एनएम) फिल्टर। सभी मामलों में, ट्रांसफैक्शन ट्रिपलिकेट (मूल आवर्धन, 50x) में किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चिकित्सीय जीन पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के साथ पीई कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन
50,000 पीई कोशिकाओं को पीडीएफ से संक्रमित किया गया था और प्रोटीन स्राव की निगरानी पश्चिम बंगाल(चित्रा 7)द्वारा की गई थी। संक्रमित कोशिकाओं के लिए पश्चिम बंगाल संकेत सभी प्रजातियों और दिनों का अध्ययन के लिए गैर-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में अधिक था; इस समय के भीतर प्रोटीन स्राव में कोई कमी नहीं देखी गई।

Figure 7
चित्रा 7:संक्रमित पीई कोशिकाओं के पीडीएफ स्राव का पश्चिम बंगाल विश्लेषण। सुअर (पूर्व-सुसंस्कृत)(ए),और मवेशी (हौसले)(बी) पीडीएफ-संक्रमितपीई कोशिकाओं से सुपरनेटेंट का डब्ल्यूबी विश्लेषण नियंत्रण (गैर-संक्रमित कोशिकाओं) और समय के साथ स्थिर की तुलना में उच्च पीडीएफ स्राव दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S1:प्रजातियों के आधार पर पीई अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण। (ए)गैर-बाँझ उपकरणों का उपयोग आंखों के नाभि और शेष मांसपेशियों के ऊतकों और त्वचा की सफाई के लिए किया जाता है। सेट 1 का उपयोग चूहे, माउस और खरगोश के लिए किया जाता है, और सेट 2 का उपयोग सुअर और मवेशियों की आंखों के लिए किया जाता है। (ख)बाँझ उपकरणों पीई अलगाव के लिए इस्तेमाल किया । आंखों के आकार के आधार पर उपयोग की जाने वाली कैंची और संदंश के विभिन्न आकार पर ध्यान दें। क्रमशः आरपीई और आईपीई के परिमार्जन के लिए गोल और फ्लैट फायर-पॉलिश पाश्चुर पिपेट का उपयोग किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पीई कोशिकाओं को अलग और संस्कृति के लिए मानकीकृत तरीके होने रेटिना अपक्षयी रोगों के लिए नए चिकित्सा दृष्टिकोण विकसित करने में मौलिक है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, पीई कोशिकाओं को विभिन्न प्रजातियों से सफलतापूर्वक अलग किया जा सकता है और लंबी अवधि के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है (अब तक, सबसे लंबी संस्कृति 2 साल1,38के लिए बनाए रखी गई थी); विशिष्ट पीई सेल आकृति विज्ञान, पिगमेंटेशन और फ़ंक्शन(चित्रा 1, चित्रा 2)मनाया गया था। ध्यान दें कि विशेष रूप से शुद्ध आरपीई संस्कृतियों के लिए, तंत्रिका रेटिना कोशिकाओं के साथ प्रदूषण से बचने के लिए रेटिना को पूरी तरह से निकालना महत्वपूर्ण है; आईपीई कोशिकाओं के लिए, सिलिएरी शरीर को आईरिस से हटा दिया जाना चाहिए जैसा कि प्रोटोकॉल में समझाया गया है। कोशिकाओं का संगम अपेक्षाकृत कम समय (~ 21 दिनों) में प्राप्त किया जाता है, जिसके बाद कोशिकाएं चिकित्सीय जीन के साथ या अन्य प्रयोगों (जैसे, विषाक्त एजेंटों, प्रोटीन आदि के संपर्क में) में उपयोग के लिए तैयार होती हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल न केवल प्री-क्लीनिकल इन विट्रो और वीवो परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं, बल्कि मानव अनुप्रयोग के लिए भी महत्वपूर्ण हैं, यानी, संक्रमित पीई सेल प्रत्यारोपण का सत्यापन; विशेष रूप से हमारे समूह द्वारा विकास के रूप में एएमडी के उपचार के लिए, जहां आईपीई कोशिकाओं को एक आईरिस बायोप्सी से अलग किया जाएगा, तुरंत संक्रमित, और एक शल्य चिकित्सा सत्र के भीतर एक ही रोगी को सबरेटिन रूप से प्रत्यारोपित किया जाएगा। खरगोशों में39 और रोगियों में ऑटोलॉगस आईपीई कोशिकाओं का अलगाव और उपरेटिनल प्रत्यारोपणस्थापितकिया गया था । चूंकि ऑटोलॉगस आईपीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण सफल रहा था, लेकिन दृष्टि को बहाल करने के लिए पर्याप्त नहीं था, इसलिए पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ जैसे न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों को अधिकएक्सप्रेस करने के लिए कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन को दृष्टिकोण में जोड़ा गया था और तीन और प्रजातियों (माउस, चूहा और मवेशियों) में स्थापित किया गया था। पीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और आनुवंशिक संशोधन के लिए यहां वर्णित तरीकों के साथ, संबंधित सेल प्रत्यारोपण अब विभिन्न प्रजातियों से तैयार किया जा सकता है ताकि वीवो मेंदृष्टिकोण की विषाक्तता और दक्षता का परीक्षण किया जा सके।

यह दिखाया गया था कि, अतिसक्रिय SB100X ट्रांसपोसन प्रणाली का उपयोग करते हुए, विभिन्न मूल से पीई कोशिकाओं को पीईडीएफ(चित्रा 7)को अधिक एक्सप्रेस करने के लिए कुशलतापूर्वक संशोधित किया जा सकता है; चूहा आईपीई और आरपीई24 और मानव आरपीई कोशिकाओं का उपयोग करके इसीतरहके परिणाम प्रकाशित किएगए हैं। पीईडीएफ के साथ ट्रांसफेक्शन को वीजीएफ-मध्यस्थता नियोवैस्कुलराइजेशन के अवरोध और आरपीई कोशिकाओं और रेटिना न्यूरॉन्स को ग्लूटामेट और ऑक्सीडेटिव तनाव के साथ-साथ इस्केमिया40, 41से सुरक्षा के अवरोध द्वारा एनवीएएमडी का इलाज करने का प्रस्ताव किया गया है। स्थिर दीर्घकालिक प्रोटीन स्राव की पुष्टि(चित्रा 7)ने पीई कोशिकाओं को एक विश्वसनीय जैविक "दवा वितरण प्रणाली" के रूप में पुष्टि की। इस संबंध में, रिपोर्टर जीन वीनस (चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6)के साथ ट्रांसफेक्शन दक्षता का अध्ययन किया गया, जैसा कि जॉनन एट अल में रिपोर्ट किया गया है ~ 20-100% (प्रजातियां और दाता-निर्भर) की उच्च ट्रांसफेक्शन क्षमता की पुष्टि की गई है। 1.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि उपयोग किए गए प्लाज्मिड का आकार परिवर्तनीय था, पीएफएर मिनीप्लाज्मिड्स (~ 3,000 बीपी) से प्लासमिड्स तक pT2-रीढ़ (~ 5,000 बीपी)30के साथ, ट्रांसफैक्शन क्षमता तुलनात्मक रूप से अधिक थी। ट्रांसफेक्शन दक्षता में देखे गए अंतर शायद ईन्यूक्लियेशन से सेल अलगाव और ऊतक संरक्षण में समय में परिवर्तनशीलता के कारण होते हैं, लेकिन कोशिका आकृति विज्ञान को न तो उस समय में बदलते हैं जब कोशिकाएं संगम तक पहुंचती हैं (अलगाव के बाद ~ 21 दिन), या उस समय कि कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन के बाद पीछा किया गया था। सामान्य तौर पर, एक सफल ट्रांसफैक्शन प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि पीई कोशिकाओं का स्रोत जितना संभव हो उतना ताजा होना चाहिए; यह ताजा अलग पीई कोशिकाओं के साथ ट्रांसफैक्शन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

सेल शीट प्रत्यारोपण के साथ तुलना करते हुए, हमारे समूह की चिकित्सा विकसित हो रही है (संक्रमित कोशिकाओं को कोशिका निलंबन के रूप में उपरेटिन रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है) कम आक्रामक है क्योंकि पहले प्रोलिफेरेटिव विट्रेरेटिनोपैथी और सबरेटिनल फाइब्रोसिस42के संबंधित जोखिमों के साथ बड़े रेटिनोटॉमी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, गीले एएमडी के लिए शीट ग्राफ्ट में सीएनवी के क्षेत्र को आसन्न कोरॉइड के साथ हटा दिया जाता है और इसलिए, भ्रष्टाचार के अस्तित्व को43से समझौता किया जा सकता है। अंत में, एक सेल पैच का उपयोग करने का विचार प्रस्तावित प्रक्रिया के साथ संगत नहीं है, जहां कोशिकाओं का अलगाव, संशोधन और प्रत्यारोपण एक ही शल्य चिकित्सा सत्र के दौरान किया जाता है। दूसरी ओर, सेल निलंबन के रूप में प्रत्यारोपित पीई कोशिकाओं के अंतर्निहित मुद्दों प्रसव के दौरान संभावित सेल मौत, आसंजन की कमी, और सेलुलर वितरण में भिन्नता हैं; लेकिन इन कमियों को ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण42द्वारा दूर किया जा सकता है ; इसके अलावा , सेल अस्तित्वसमर्थक अस्तित्व एजेंटों44, 45, 46,47के उपयोग से सुधार किया जा सकता है . हमारा मानना है कि प्राथमिक पीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों जैसे पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ को सेल निलंबन के रूप में अधिक ले जाना एएमडी के इलाज के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है, और इस चिकित्सा को विकसित करने के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे प्राथमिक पीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और विश्लेषण के मानकीकरण की अनुमति देते हैं।

संक्षेप में, प्रोटोकॉल विकास और प्री-क्लीनिकल इन विट्रो के लिए एक उन्नत मॉडल प्रणाली प्रदान करता है और पांच विभिन्न प्रजातियों में नेत्र उन्नत औषधीय उपचारों के वीवो परीक्षण में, विभिन्न स्रोतों से कोशिका की गुणवत्ता में व्यक्तिगत विचरण की भरपाई करने के लिए पर्याप्त मजबूत होता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एक धन्यवाद ग्रेग Sealy और एलेन कोंटी उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हकदार हैं । इस काम को यूरोपियन कमिशन ने सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम, स्विस नेशनल साइंसेज फाउंडेशन और श्मीडर-बोह्रिश फाउंडेशन के संदर्भ में सपोर्ट किया था । Z.I. यूरोपीय अनुसंधान परिषद, ईआरसी एडवांस्ड [ईआरसी-2011-एडीजी 294742] और बी.M डब्ल्यू से फुलब्राइट रिसर्च ग्रांट और स्विस गवर्नमेंट एक्सीलेंस स्कॉलरशिप से फंडिंग प्राप्त की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 353043
24-well plates Corning 353047
48-well plates ThermoFisher Scientific 150687
6-well plate Greiner 7657160
Betadine Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay Promega G9291
DMEM/Ham`s F12 Sigma-Aldrich D8062
Drape (sterile) Mölnlycke Health Care 800530
Electroporation buffer 3P.14 3P Pharmaceutical
FBS Brunschwig P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress PROMEDICAL AG 25403
NaCl (0.9%) Laboratorium Dr. Bichsel AG 1000090
Needle (18G)  Terumo TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL ThermoFisher Scientific MPK1096
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000S
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Pasteur pipette (fire-polish) Witeg 4100150
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa) Ospedalia AG 31408025
Petri dish ThermoFisher Scientific 150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Pastor et al., 2018
scarpel no. 10 Swann-Morton 501
scarpel no. 11 Swann-Morton 503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer ThermoFisher Scientific T10796
Trypsin 0.25%  ThermoFisher Scientific 25050014
Trypsin 5%/EDTA 2% Sigma-Aldrich T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

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References

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जीव विज्ञान अंक 168 नेत्र जीन थेरेपी रेटिना अध: पतन आरपीई कोशिकाएं आईपीई कोशिकाएं सेल आइसोलेशन स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन गैर-वायरल जीन थेरेपी पीडीएफ जीएम-सीएसएफ
गैर वायरल जीन थेरेपी के लिए स्तनधारी प्राथमिक वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, और जेनेटिक इंजीनियरिंग
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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Wong, B. M., Johnen, S., Izsvák, Z., Thumann, G. Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy. J. Vis. Exp. (168), e62145, doi:10.3791/62145 (2021).

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