Summary
여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.
Abstract
노화관련 황반 변성(AMD)은 전 세계적으로 3천만 명에게 영향을 미치는 >60년 환자에서 가장 빈번한 실명 원인입니다. AMD는 환경 및 유전적 요인에 의해 영향을 받는 다인성 질환으로, 망막 색소 상피(RPE) 세포 변성으로 인한 망막의 기능적 손상으로 이어지는 후 광수용체 분해가 뒤따릅니다. 이상적인 치료는 RPE 세포 사멸과 광수용체 변성을 방지하기 위해 신경 보호 인자를 분비 건강한 RPE 세포의 이식을 포함 할 것이다. 기능적 및 유전적 유사성 및 덜 침습적인 생검의 가능성으로 인해 홍채 색소 상피 (IPE) 세포의 이식은 퇴화 된 RPE를 대신할 수 있도록 제안되었습니다. 낮은 수의 피하 이식 된 세포에 의한 신경 보호 인자의 분비는 안료 상피 유래 인자 (PEDF) 및 /또는 과립구 대식세포 -콜로니 자극 인자 (GM-CSF)에 대한 코딩 유전자와 함께 슬리핑 뷰티 (SB100X)트랜스 포손 매개 형 경화에 의해 달성 될 수있다. 설치류, 돼지, 가축 등 다양한 종에서 RPE 및 IPE 세포의 격리, 문화 및 SB100X매개 형 트랜스퍼를 설립했습니다. 글로브는 짜고 각막과 렌즈가 제거되어 홍채와 망막에 접근합니다. IPE 세포는 사용자 정의 주걱을 사용하여 격리 된 홍채에서 제거됩니다. RPE 세포를 수확하기 위해 종에 따라 트립신 배큐어가 필요할 수 있습니다. 그런 다음 RPE 사용자 지정 주걱을 사용하여 세포가 중간으로 일시 중단됩니다. 파종 후, 세포는 일주일에 두 번 모니터링되며, 합류에 도달 한 후 전기 화에 의해 감염됩니다. 유전자 통합, 발현, 단백질 분비 및 기능은 qPCR, WB, ELISA, 면역형성 및 기능성 분석서에 의해 확인되었다. 종에 따라 30,000-5백만 개의 RPE 및 10,000-150만 개의 세포가 눈당 격리될 수 있습니다. 유전자 변형 된 세포는 산화 스트레스를 감소시키는 능력으로 상당한 PEDF / GM-CSF 과발현을 나타내며 전 생체 분석 및 인체에 전달 가능한 생체 내 연구를위한 유연한 시스템을 제공하여 안구 유전자 치료 접근법을 개발합니다.
Introduction
우리 그룹은 RPE-및 IPE 기반 비 바이러스 유전자 치료에 의해 신경 망후 변성을 치료하는 재생 접근법의 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 치료의 전 임상 설립은 인간에게 양도 할 수있는 체외 모델을 필요로한다. 따라서, 여기에서 제시된 연구 결과의 목표는 1 차적인 RPE 및 IPE 세포의 격리, 문화 및 유전 공학을 위한 프로토콜을 전달하는 것입니다. 여러 종에서 PE 세포의 격리를 확립하는 근거는 접근의 안전성과 효율성을 강력하게 확인하고 재현성과 전달성을 높이는 것입니다. 사용 가능한 인간 RPE 세포주 ARPE-19는 1차 세포(예를 들어, 덜 색소)와 다르며, 따라서 전임상 분석에 대한 제한된값만이다. 추가적으로, 비 인간 포유류 세포는 더 적은 비용 및 더 큰 양으로 살 수 있습니다; 인간 기증자 조직은 다양한 눈 은행에서 얻을 수 있지만 가용성은 제한적이고 비용이 많이 듭니다. 마지막으로, 새로운 고급 치료 약용 제품 (ATMP, 즉, 세포, 조직, 또는 유전자 치료 약용 제품)은 환자에서 테스트되기 전에 적어도 두 개의 다른 종에 적용되어야하며 생체 내 연구는 동종 세포 이식의 준비를 요청합니다.
망막 신경 퇴행성 질환은 AMD와 같은 일반적인 질병뿐만 아니라 망막 세포 사망이 결국 실명으로 이어지는 망막 색소증과 같은 희귀 질환을 포함하는 선진국의 주요 실명 원인입니다. RPE 세포, 광수용체 및 망막 신경절 세포 (RGC) 손상은 어떤 경우에는 느려질 수 있지만 현재 치료 요법은 없습니다. ATMpPs는 유전자 결함을 정정하고, 치료 유전자를 통합하거나, 퇴화세포를 대체할 수 있는 잠재력을 제공하므로 AMD와 같은 질병에 대한 재생 및 치료 요법의 개발을 가능하게 합니다. 13개의 유전자 치료는 이미 RPE65 돌연변이 관련 망막 변성을 치료하는 치료를 포함하여 마케팅 승인을 얻었다2,3. > 전 세계적으로 3천만~3,000만 명의 노인중 에서 신생아(nvAMD) 또는 혈관(aAMD) AMD4의영향을 받습니다. 두 형태 는 산화 손상을 포함하는 연령 관련 트리거에 의해 유도된다, 기능 장애 및 광수용체 저하 다음 RPE 세포의 손실, 그 외 (예를 들어, 유전 위험 알레일, 흡연, 고혈압)5,6. nvAMD에서, 병원성 은 혈관 신생 및 항 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 찬성 하는 혈관 신생 및 항 혈관 형성 인자의 불균형에 의해 악화 (CNV). 현재까지, 만 nvAMD는 CNV를 억제하기 위해 VEGF 단백질의 억제제의 월간 인트라비티리얼 주사에 의해 치료할 수 있습니다; AAMD6,7에대한 효과적인 치료는 아직 사용할 수 없습니다.
몇몇 연구 결과는 반대로 VEGF 치료를 대체하기 위하여 세포 기지를 둔 치료를 평가했습니다: 새로 수확한 자가 RPE 세포가 nAMD8,9,10을가진 환자로 이식된 바인더 외에 의한 연구 결과는 적당한 시각 개선을 보여주었습니다, 그러나 환자의 단지 작은 단은 독서를 가능하게 하기에 충분히 높은 최종 적인 시력에 도달했습니다. 최근에는, 1상 임상 연구는 유망한 결과로 AMD를 취급하기 위하여 배아 줄기 세포 유래 RPE 패치를 이용했습니다; 즉, 10명의 환자 중 2명이11명으로최대 12개월 동안 RPE 패치의 효능, 안정성 및 안전성 및 효능, 안정성 및 안전성. 또한, 여러 그룹은 자가 RPE-Bruch의 막-choroid 패치가 말초 망막에서 수확되고 황반12,13,14로이식되는 연구를 발표했습니다. 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)-유래 RPE 패치는이식용(15)을위해 생성되었다. aAMD의 경우, 보완 경로를 표적으로 하는 항체는 시험6,16 및 단계 I연구에서 시험된 시험은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 단일 인트라비탈 주입을 사용하여 지리 위축(GA)을 가진 환자에서 CD59(AAVCAGsCD59)를 코딩하는 유전자를 코딩하였다. 단계 II 연구는 최근에 시작하고 고급 aAMD를 가진 132명의 환자를 모집하고 2 년 후 개입18에서결과를 평가하는 것을 목표로 합니다. 마지막으로, FocuS 연구그룹은 인간 보체인19를인코딩하는 재조합 비복제 AAV 벡터의 안전성, 용량 반응 및 효능을 평가하는 단계 I/II 다중센터 임상 시험을 시작했다.
주로, 재생 AMD 치료의 목표는 손상되거나 분실된 기능적인 RPE 세포의 이식입니다. 그러나, IPE 및 RPE 세포는 많은 기능적 및 유전적 유사성(예를 들어, phagocytosis 및 망막 대사)을 공유하고, IPE 세포가 더 태아에게 수확되기 때문에, 그들은 RPE 대체20으로제안되었다. IPE 세포 이식이 동물모델(21,22)에서 광수용체 변성을 지연시키고 말기 nvAMD 환자에서 시각 기능을 안정화시키는 것으로 입증되었지만, 이들환자(23)에서는유의한 개선이 관찰되지 않았다. 효능의 부족은 이식 된 세포의 낮은 수 때문일 수 있습니다., 및/또는 신경 보호 망막 요인의 불균형. 다른 접근법은 망막 항상성을 복원하고, 남은 RPE 세포를 유지하고, 광수용체와 RG를 변성으로부터 보호하기 위해 신경 보호 인자를 과발적으로 표현하는 전감염된 안료 상피 세포를 이식하는 것입니다. 따라서, 우리는 PEDF, GM-CSF 또는 인슐린 같이 성장 인자 (IGFs)와 같은 신경 보호 및 항 혈관신생 단백질을 분비하기 위하여 유전 공학을 겪은 기능적인 RPE 또는 IPE 세포의 이식을 포함하는 새로운 치료를 제안합니다. 세포주 대신 여러 종에서 이러한 접근법을 개발하고 분석하는 이점, 단 하나의 종, 또는 인간 조직: 1) 독립적인 실험실 및 다른 종1,24,25에서실현된 수많은 연구에 의해 나타난 바와 같이 결과의 재현성 및 전달성이 향상된다. 2) 돼지 또는 소 세포는 추가 동물의 희생없이 가능한 일회용; 3) 특히 돼지와 소 세포의 가용성은 강력한 결과를 생성하는 큰 테스트 시리즈를 허용; 4) 주로 사용되는 모델으로부터 세포를 분리, 배양 및 유전적으로 수정하는 지식은24,25,26의 다중 종에서 생체 내 분석을 가능하게 하고 따라서 첫번째 치료된 환자를 위한 향상된 위험 이득 비율을 제공합니다; 5) 제시 된 프로토콜의 유연성은 다양한 모델및 실험 설정 및 유전 공학유무에 관계없이 모든 안구 세포 기반 치료법에 사용할 수 있게합니다. 대조적으로, 세포주 또는 인간 조직으로 대체 기술은 제한된 전달 가능성 및/또는 제한된 단화성의 뿐입니다. ARPE-19와 같은 세포주들은 예비 실험에 이상적입니다. 그러나, 낮은 색소 침착 및 높은 증식은 1차 세포1과크게 다릅니다. 인간 기증자 조직으로부터 분리되는 RPE 및 IPE 세포는 체외 실험을 양도할 수 있는 귀중한 원천을 제공합니다. 그러나, 우리는 조직이 적어도 이틀 (enucleation 후에) 오래되고 비싼 수송을 필요로 한다는 것을 의미하는 미국-미국 안과 은행에서 인간 적인 조직을 얻고, 그러나 현지 기증자 조직은 생산적인 연구를 위한 충분한 양으로 유효하지 않습니다. 1차 세포의 사용의 장점은다른 그룹(27,28)으로부터의 여러 연구에 의해 확인된다.
EBF 및/또는 GM-CSF를 코딩하는 유전자를 가진 1차 RPE 및 IPE 세포를 이식하기 위한 SB100X 트랜스포슨 시스템을 이용한 세포 기반 비바이러스 유전자 치료의 개발을 위해 각각29,30,31,32,ARPE-19 세포의 트랜스페션을 최초로확립했습니다. . 다음으로, 쉽게 접근할 수 있는 소와 돼지 1차 세포에서 격리 및 경질 프로토콜이 확립되었다. 지금, 5개의 다른 종에서 1 차적인 RPE 및 IPE 세포의 격리 그리고 transfection는 작은 (마우스로) 큰 포유동물 (가축으로)에, 설치되었습니다. 인간 기증자눈(30)으로부터유래된 1차 RPE 및 IPE 세포에서 확인되었다. ATMP의 우수 제조 관행(GMP)준수 생산은 인간 기증자 조직뿐만 아니라33을사용하여 검증되었다. 마지막으로, 접근법의 안전성과 효율성은 프로토콜이 조정된 세 가지 다른 종에서 생체 내에서 평가되었습니다: 마우스, 쥐 및 토끼. 임상 설정에서, 홍채 생검은 환자에게서 수확되고 IPE 세포는 세포가 같은 환자로 다시 피복되기 전에, 깨끗한 방에서 격리되고 전염될 것입니다. 전체 과정은 약 60 분 지속되는 단일 수술 세션 중에 진행됩니다. 치료 접근법의 개발 및 그 효율성의 평가는 견고하고 효율적인 유전자 전달 방법을 구현하고, 유전자 전달의 효율을 분석하고, 치료 단백질 생산 및 신경 보호 효과를 분석하고, 생체 내 접근법을 시험하기 위해 세포 이식을 생산하기 위해 시험관 및 전 생체 내 모델에서우수한 것을 요구하였다1,24,25,29,30 . 이 치료법은 제네바 주(2019-00250호) 연구를 위한 윤리위원회에서 임상 단계 Ib/IIa 임상 시험에 대한 윤리적 승인을 받았으며 현재 스위스 규제 당국이 승인요청받은 마지막 전임상 데이터가 제시된 프로토콜을 사용하여 수집된다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 이와 관련하여, 생체 내 전 임상 데이터는 CNV의 현저한 감소와 우수한안전(24,25,31)을입증했다.
여기서, 소, 돼지, 토끼, 쥐 및 마우스로부터 RPE/IPE 세포의 분리 및 배양, 그리고 효율적인 유전자 전달 방법으로 전기기와 결합된 통합 SB100X 트랜스포슨 시스템의 사용이 설명된다. 특히, 1차 PE 세포는 PEDF 및 GM-CSF를 과발현하기 위해 전형되었다. 이러한 프로토콜의 수집은 ATMP 개발의 모든 전임상 단계에서 시험관 내 및 생체 내 연구를 수행할 수 있게 한다. 더욱이, 셋업은 관심과 질병의 그밖 유전자에 적응될 가능성이 있습니다.
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Protocol
동물이 연루된 프로토콜은 공인 인력에 의해 수행되었으며, 스위스 제네바의 도멘 드 l'expémentation 동물인 de l'emploi et de la santé(DSES), 도멘 드 l'expémentation animale, 그리고 Ophalmic 및 비전 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 승인된 후에 수행되었습니다. GE/94/17). 성인 건강한 갈색 노르웨이 쥐, C57BL/6 마우스, 뉴질랜드 흰 토끼는 펜토바르비탈(150 mg/kg)의 과다 복용으로 안락사되었고, 0.9% NaCl주입인 역류및 눈은 희생 직후에 방출되었다. 돼지와 소의 눈은 희생 후 6시간 이내에 현지 도살장에서 얻어져 얼음 위에 있는 실험실로 이송되었다.
1. 준비하기 전
- 완전한 매체(DMEM/Ham's F12+10% 태아소 혈청(FBS), 80 U/mL 페니실린/80 μg/mL 연쇄절제술증, 2.5 μg/mL 암포테리신 B로 보충한다. 37°C 수조에서 배지, 1x PBS 및 0.25%의 트립신(필요한 경우)을 가열합니다.
- 무균 커튼을 후드에 넣어 무균 작업 장소를 준비합니다. 후드 내부에 필요한 모든 멸균 기기와 재료를 소개합니다.
참고: 눈의 핵형성과 남은 근육 조직과 피부의 청소만이 후드 외부에서 수행되는 절차이며, 나머지 단계는 후드 내부에서 수행해야 합니다.
2. 쥐 / 마우스 PE 세포의 격리
- 구부러진 가위와 대장균 집게를 사용하여 동물을 안락사한 후 눈을 방출합니다. 가위와 집게 (비 멸균)를 사용하여 눈에서 나머지 근육 조직과 피부를 청소합니다.
참고: 눈의 이핵 및 세척에 사용되는 가위와 집게의 크기는 종에 따라 달라집니다 (예를 들어, 쥐와 마우스의 경우 악기가 돼지와 가축에 사용되는 것보다 작을 것입니다)(그림 S1참조).- 비멸 PBS로 채워진 50 mL 튜브에서 눈을 수집하고 라미나르 흐름 후드로 튜브를 전송합니다. 요오드 기반 용액에서 2분 동안 잠근 후 멸균 PBS로 채워진 페트리 접시로 옮기면 눈을 소독합니다.
- 전구 개구 개구
- 멸균 페트리 접시에 눈을 전송 한 후, 콜리브리 또는 뾰족한 집게와 시신경에 단단히 가까이 하나를 개최합니다. 18G 바늘로 홍채의 한계(파 플라나와 오라 세라타 사이)의 한계 근처에 구멍을 뚫습니다. 구멍에 작은 가위를 삽입하고 홍채 주위를 잘라. 전방 세그먼트(각막, 렌즈 및 홍채)를 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. RPE 세포가 분리될 때까지 전구를 유리체로 둡니다.
- IPE 세포의 격리
- 렌즈를 제거하고 미세 한 집게로 IPE 세포를 포함하는 홍채를 섬세하게 꺼냅니다. 홍채를 페트리 접시에 놓고 멸균 PBS로 씻고 더 많은 홍채가 준비될 때까지 PBS에 둡니다.
- 모든 눈이 그날 준비될 수 있도록 2.2.1에서 2.3.1단계를 반복합니다.
- 홍채 당 0.25 %의 50 μL을 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 배양하십시오. 트립신을 제거하고 홍채 당 완전한 매체 150 μL을 추가하고 평평한 화재 광택 파스퇴르 파이펫으로 IPE를 섬세하게 긁어 냅니다. 조직을 고정시키기 위해 미세 한 집게를 사용합니다. 세포 현탁액을 수집하고 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 노이바우어챔버(34)의세포를 계산하기 위해 트라이팬 블루로 1:3희석된 셀 서스펜션의 10μL을사용한다.
- 즉시 감염되지 않을 경우, 24웰 플레이트(100,000세포/cm2)에서200,000개의 세포/웰을 완전한 배지(10% FBS)의 1mL(시드표 1참조)로 시드한다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고 37°C, 5% CO2로배양한다.
참고: 시드를 위한 충분한 세포를 갖기 위해 여러 눈을 함께 모아야 할 수도 있습니다.
- RPE 셀의 격리
- 얇은 집게로 후부 세그먼트에서 유리체 유머와 망막을 제거합니다. 망막 안료 상피 손상을 피하십시오.
- #10 메스로 세그먼트를 반으로 자르고 전 세계를 완전히 열고 멸균 PBS로 씻어냅니다.
- 눈당 0.25%의 50μL을 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 트립신을 제거하고 지구당 완전한 매체의 150 μL을 추가하고 둥근 메스로 RPE 세포를 섬세하게 긁어냅니다. 조직을 고정시키기 위해 미세 한 집게를 사용합니다. 세포 현탁액을 수집하고 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 세포 현탁액의 10 μL을 복용; 노이바우어 챔버의 세포를 계산하기 위해 트라이판 블루로 1:4를 희석시합니다.
- 2.3.4 단계를 참조하십시오.
참고: 시드를 위한 충분한 세포를 갖기 위해 여러 눈을 함께 모아야 할 수도 있습니다.
3. 토끼 PE 세포의 격리
- 2.1~ 2.1.1 단계에 설명된 대로 세척 및 소독을 수행합니다.
- 멸균 거즈 압축에 한 눈을 넣어 시신경에 단단히 가까이 붙입니다. 메스 #11로 눈을 열고 림부 아래 약 2mm가위를 가위로 합니다. 전방 세그먼트(각막, 렌즈 및 홍채)를 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. RPE 세포가 분리될 때까지 전구를 유리체로 둡니다.
- IPE 세포의 격리
- 2.3.1 단계를 수행합니다. 메스 #10로 절단하여 홍채에서 섬모 본체를 제거합니다.
- 2 홍채의 준비 후, 10 분 동안 37 °C에서 0.25 % 트립신의 1 mL로 배양; 이 시간 동안 RPE 셀은 분리될 수 있습니다(단계 3.4 참조). 트립신을 제거하고 홍채에 1 mL 완전 매체를 추가하고 평평한 화재 광택 파스퇴르 파이펫으로 조심스럽게 긁어 세포를 분리합니다. 피펫팅으로 세포를 조심스럽게 중단하고 셀 서스펜션을 1.5 mL 튜브로 이송합니다. 세포 현탁액의 10 μL을 복용하고 노이바우어 챔버의 세포를 계산하기 위해 트라이팬 블루로 1:3을 희석하십시오.
- 2.3.4 단계를 참조하십시오.
- RPE 셀의 격리
- 2.4.1 단계를 수행합니다.
- 멸균 거즈를 12웰 플레이트에 넣고 전구를 거즈 위에 놓습니다.
- PBS로 씻고 2.4.3 단계를 수행하십시오.
참고: 곡면으로 연마된 파저 파이펫을 사용하세요. - 원심 분리는 120 x g에서세포 10 분.
- 2.3.4 단계를 참조하십시오.
4. 돼지 PE 세포의 격리
- 2.1 단계에서 설명한 대로 청소를 수행합니다. PBS로 씻고 요오드 기반 용액으로 2 분 동안 잠기고 PBS로 헹구어 눈을 소독하십시오. 3.2 단계를 계속합니다.
- IPE 세포의 격리
- 3.3.1 단계를 수행합니다. 2 개의 홍채를 준비 한 후, 완전한 매체 1 mL을 추가하고 평평한 화재 광택 파스퇴르 파이펫으로 조심스럽게 긁음으로써 세포를 분리하십시오. 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮기십시오. 세포 현탁액의 10 μL을 복용하고 노이바우어 챔버의 세포를 계산하기 위해 트라이팬 블루로 1:4를 희석하십시오.
- 2.3.4 단계를 참조하십시오.
- RPE 셀의 격리
- 2.4.1 단계를 수행합니다. 전구를 페트리 접시에 놓고 PBS로 씻으신다. 전구를 1mL 완전 매체로 채웁니다.
- 곡면으로 연마된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 RPE 셀을 조심스럽게 제거합니다. 코로이드-브루치의 멤브레인 복합체가 미끄러지지 않도록 바닥에서 위로 긁어내십시오. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 전구 내의 셀 서스펜션을 수집하고 1.5mL 튜브로 이송하여 재발을 위해 합니다. 세포 현탁액의 10 μL을 복용하고 노이바우어 챔버의 세포를 계산하기 위해 트라이팬 블루로 1:8을 희석하십시오.
- 2.3.4 단계를 참조하십시오.
5. 소 PE 세포의 격리
- 2.1 단계에서 설명한 대로 청소를 수행합니다. PBS로 씻고 요오드 기반 용액으로 2 분 동안 잠기고 PBS로 헹구어 눈을 소독하십시오. 3.2 단계를 계속합니다.
- IPE 세포의 격리
- 3.3.1 단계를 수행합니다. 2개의 홍채의 제조 후에, 10 분 동안 37°C에서 0.25%의 트립신의 2mL로 배양하십시오. 이 시간 동안 RPE 셀을 분리할 수 있습니다(단계 5.3 참조).
- 트립신을 제거하고 홍채에 2mL 의 완전한 매체를 추가하고 평평한 화재 광택 파스퇴르 파이펫으로 조심스럽게 긁적으로써 세포를 분리합니다. 셀 서스펜션을 15mL 튜브로 옮킨다. 원심 분리는 120 x g에서세포 10 분. 세포 현탁액의 10 μL을 복용하고 노이바우어 챔버의 세포를 계산하기 위해 트라이팬 블루로 1:4를 희석하십시오.
- 즉시 감염되지 않은 경우, 320,000 개의 세포 / 잘 완전한 매체 (10 % FBS)의 3 mL에서 6 웰 플레이트에 (시드표 1참조). 플레이트를 인큐베이터에 놓고 37°C, 5% CO2로배양한다.
- RPE 셀의 격리
- 2.4.1 단계를 따르십시오. 전구를 페트리 접시에 놓고 PBS로 씻으신다. 2개의 눈의 준비 후에 약 3/4의 전구를 트립신으로 채우고 37°C에서 25분 동안 배양하고 페트리 접시의 뚜껑을 전구 위에 얹습니다.
- 트립신을 제거하고 1 mL 전체 매체를 추가합니다. 4.3.2 단계를 수행합니다. 원심 분리는 120 x g에서세포 10 분.
- 5.2.3 단계를 참조하십시오.
6. 재배 - 중간 변화
- DMEM/Ham의 F12에서 세포를 배양하여 10% FBS, 80 U/mL 페니실린/80 μg/mL 연쇄 절제술, 2.5 μg/mL 암포테리신 B, 37°C, 가습형 인큐베이터에서 5%CO2로 보충하였다. 3-4 일 파이펫 위아래로 피펫을 위아래로 사용하여 비 부착 된 세포를 수집하고 부피의 절반을 다른 우물에 넣습니다. 완벽한 매체로 최대 1mL를 채웁니다.
참고: 이렇게 하면 모든 셀이 분리된 모든 셀이 출력을 연결하고 최대화할 수 있을 만큼 충분히 큰 표면을 가질 수 있습니다. - 또 다른 후 3-4 일 세포 수집을 반복하지만, 하나의 우물로 두 개의 우물에서 비 부착 세포를 풀링하여이 시간 (예를 들어, C1에서 A1 + B1). 모든 우물에 매체를 추가합니다. 세포를 관찰하고 일주일에 2회 배지를 변경합니다(6및 24웰 플레이트의 경우 각각 3mL/웰을 사용합니다). 세포가 합류에 도달하면 1% FBS로 배지를 완료하거나 실험을 위해 세포를 사용합니다(예: 일시 적 전환).
참고: RPE 및 IPE 세포는 각각 격리 후 3-4 및 4-5주 후에 수렴됩니다. 세포 배양 순도는 존넨과동료(36)에의해 기술된 바와 같이 세포 형태학(pigmented cells) 및 특정 마커를 검사하는 확증되었다.
7. 1 차 적인 PE 세포의 전기화
- 1,37전에 설명된 바와 같이 전기포공을 수행한다.
- 전감염된 세포의 수에 따라 항생제 나 항진제없이 배지에서 세포를 종자하기 위해 6-, 24- 또는 48 웰 플레이트 (표 2참조)를 사용합니다. 다음 2주 동안 페니실린(80 U/mL), 연쇄절제술(80 μg/mL), 암포테리신 B(2.5 μg/mL)를 일주일에 두 번 함유한 배지를 사용하여 방울을 추가합니다. 배지를 완전히 교환2주 후에.
- 세포 성장, 경피 효율 및 단백질 분비를 결정하기 위해, 현미경으로 세포를 매주 모니터링하고 서양 블롯에 의해 세포 배양 상류를 분석한다. 배양종료 전에, ELISA에 의한 단백질 분비를 정량화하고, 세포를 계산하고, 심상 기반 세포측정법(금성-전염된 세포의 경우)에 의한 형광을 측정하고, 제조 지침(재료표 참조)을 위한 세포 펠릿을 수집하고, RT-qPCR 계 유전자 발현 분석을 위한 세포 펠릿을 수집한다.
참고: 이러한 방법은 세포의 분석을 자세히 설명하는 목적이 아니라 오히려 격리된 것이기 때문에 본 논문에 포함되지 않습니다. 세포 파종 밀도는 모든 종(100,000세포/cm2)에 대해 동일하지만, 고립된 세포의 수가 다르기 때문에 상이한 플레이트가 사용되었다. 또한, 마우스, 쥐 및 토끼의 경우 2-3 눈을 풀링하여 파종에 충분한 세포를 가질 필요가 있을 수 있습니다.
| 종 | 트립신 치료 | N° IPE 셀 | N° RPE 셀 | 파종용 플레이트(100,000세포/cm2) |
| 마우스/쥐 | 예 | ~50,000 | ~150,000 | 24웰 플레이트 |
| 토끼 | 예 | ~350,000 | ~2,500,000 | 24웰 플레이트 |
| 돼지 | 아니요 | ~1,000,000 | ~3,000,000 | 24웰 플레이트 |
| 소 | 예 | ~1,700,000 | ~5,000,000 | 6웰 플레이트 |
표 1: 다른 종으로부터 눈에서 분리된 1차 PE 세포의 수입니다.
| 이름 | 지역 | 볼륨 매형 | 트립신 | 트립신의 동작을 중지하는 볼륨 매체 | 시드 밀도 |
| 6웰 플레이트 | 9.6 cm² | 3.0 mL | 0.5mL | 1.0 mL | 3x105 |
| 24웰 플레이트 | 2.0cm² | 1.0 mL | 0.2 mL | 0.8 mL | 5x104 |
| 48웰 플레이트 | 1.1cm² | 0.5mL | 0.1 mL | 0.4 mL | 0.5-1x104 |
표 2: 세포 배양 물량 및 시드 밀도.
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Representative Results
다른 포유류 종에서 PE 격리
전술한 프로토콜을 사용하여 IPE 및 RPE 세포는 성공적으로 분리되어 5개의 다른 종으로부터 배양되었다. 각 절차에서 얻은 세포의 수는 눈의 종 및 크기에 따라 달라집니다(표 1). 도 1에도시된 바와 같이, 세포는 전형적인 PE 세포 형태학 및 색소 침착을 나타내고 있다(알비노 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼로부터 유래된 토끼 세포를 제외한). 21 일 후 격리에서, 세포는 confluent, 추가 실험에 사용할 준비가 (예를 들어, 형질). 모든 종의 배양은 정상 형태학과 안정적인 유전자 발현(표시되지 않은 데이터)을 확인하는 최대 2년까지 모니터링및 제어된다는 점에 유의해야 합니다.
유전자 발현의 비차분화, 세포 스트레스 및 변화는 RT-qPCR 및 면역 조직화학에 의해 배제되었다. 유전자 의 패널 (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) 전감염된 인간 RPE 세포에서 분석 (ARPE-19 세포) 정상 RPE 발현 패턴1; 이는 RPE65(도2)에대한 면역형광에 의해 1차 소 IPE 세포에서 확인할 수 있다. 또한, 조넨과 동료들은 1차 돼지 IPE 및 RPE세포(36)에서ZO-1 면역염색을 확증하였다.
그림 1: 21일 후 포유동물로부터 의 PE 세포의 현미경. 마우스, 토끼(albino NZW 토끼), 돼지 및 소로부터의 IPE 및 RPE 세포는 21일째에 분리 후 표시됩니다. 모든 종에 대해, 표시된 문화는 혼잡합니다. 토끼 PE 세포는 색소 (원래 배율, 50x)되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RPE65 면역염색의 1차 IPE 세포. RPE65(녹색) 소 IPE 세포의 염색은 비트랜스감염 제어 세포(원래 배율, 200x)에 비해 1 x 104 세포의 초기 세포 수를 사용하여 pFAR4-CMV-PEDF 트랜스포슨 플라스미드로 전염된다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
감염된 1차 RPE의 생존 가능성
셀 생존가능성은 도 3에도시된다. 전기포기 공정에 사용되는 완충제의 잠재적 독성을 배제하기 위해, 사전 배양된 1차 RPE 세포는 시판되는 키트로부터 전기포화 완충제에서 중단되거나, 또는 의정서의 7단계에서 설명된 바와 같이 제약회사(기밀 조성) 및 전기포화(E)에 의해 개발된 영양 완충액(플라스미드의 첨가 없이)에서 중단하였다. 세포 생존능력은 제조업체의 지시에 따라 시판되는 세포독성 분석 키트(재료표참조)를 이용하여 1일 ± 1일 후 트랜스포션을 연구하였다. 이 소는 항상 전력(Co-P) (전기화되지 않음)없이 제어하여 수행하였다. 테스트된 버퍼에 대해 셀 생존가능성에 아무런 영향도 관찰되지않았다(도 3).
그림 3: 상이한 완충제에서 정지된 1차 RPE 세포의 생존가능성. 1 x 104 세포는 시판되는 키트 또는 영양 완충제로부터 전기기화 완충제에서 중단되었다. 세포 생존능력은 시판되는 세포독성 분석 키트를 사용하여 3± 1일 후 형질 전환 후 측정되었다. 다른 버퍼 간에 는 생존력의 차이가 관찰되지 않았습니다. 데이터는 평균 ± SD(n=2 기증자, 3복제/기증자)로 표시됩니다. E: 전기화 된 세포, Co-P : 전원없이 제어. AU: 임의 단위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
금성 기자 유전자를 가진 사전 배양 된 PE 세포의 트랜스페션
상이한 종으로부터 50,000-100,000의 사전 배양 된 PE 세포는 활동적인 SB100X 트랜스포슨 유전자 전달 시스템을 사용하여 노란색 형광 금성 단백질 (pT2-CAGGS-Venus)으로 전염되었다. 도 4에 나타난 현미경 사진은 세포가 성공적으로 전과 감염되었다는 것을 확증합니다 (21 일 후에 형광 세포). 도 5는 금성(pT2-CAGGS-Venus)으로 전감염된 사전 배양돼지 RPE 세포(n=6 기증자, 50,000개의 세포/트랜스퍼션)에서 의 형질화 효율의 정량화를 나타낸다. 형광 세포와 MFI의 백분율은 세포 배양 종료 일에 제조업체의 지시에 따라 이미지 기반 세포 측정을 사용하여 측정되었다 (30 ± 5 일 후 형광). 형광세포의 평균 백분율은 50± 30%였지만 95± 6%(기증자 2)에서 28± 1%(기증자 4)(도5)에이르는 변수였다. 모든 실험에서, 전감염된 ARPE-19 세포는 양성 대조군으로 사용되었다. 또한, 형질 효율은 항상 부정적인 컨트롤에 비해: Co-P (전력없이 제어 [전기화되지 않음]) 및 Co+P (전력 [전기 화하지만 플라스미드를 추가하지 않고]). 실험은 IPE 셀(도시되지 않은 데이터)으로도 수행되었습니다.
그림 4: pT2-CAGGS-금성으로 감염된 사전 배양 된 PE 세포의 현미경 그래프. 금성-전과토끼(A),소(B),및돼지(C)PE 세포는 21일 후에 배분 후 로 표시됩니다. 양성 대조군으로서, 50,000ARPE-19 세포는 금성(D)으로 전감염되었다. 왼쪽 현미경 사진 : 밝은 필드, 오른쪽 현미경 : GFP (480 nm) 필터 (원래 배율, 50x). 트랜스프로프는 삼중판으로 수행되었고 부정적인 제어가 포함되었다: Co-P (전력이 없는 제어 [전기화되지 않음]) 및 Co+P(전력[전기포화하지만 플라스미드를 첨가하지 않음])(도시되지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 금성 리포터 유전자에 감염된 돼지 RPE 세포의 이식 효율. (A)50,000원발성 포신 RPE 세포는 pT2-CAGGS-Venus로 전염되었고, 전체 평균 경질 효율은 50± 30%였으며 평균 MFI는 세포 배양 종료 일(30±5일 후 트랜스페션)의 종결일에 2712± 197이었다. 그래프는 6개의 다른 동물의 평균 ± SD(n=3 복제)를 보여줍니다. (B)양성 대조군으로 사용되는 금성+ ARPE-19 세포의 비율은 98±6%였으며, 138일 동안 안정적이었다. 평균 형광 강도 (MFI)는 5,785 ± 1,255이었다. 그래프는 매일 평균 ± SD(n=3 복제)를 보여 주습니다. Co-P(전력없이 제어[전기폴트되지 않음]) 및 Co+P(전력[전극하지만 플라스미드를 첨가하지 않음]로 제어됨)은 모든 경피 실험(도시되지 않음)에 포함되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비너스 리포터 유전자를 가진 갓 PE 세포의 이식
토끼로부터 갓 분리된 10,000-50,000개의 PE 세포는 황색 형광 단백질 비너스(pFAR4-CMV-Venus)로 전염되었고, 세포 배양은 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다. 도 6형광세포에서는 21일째에 형광세포를 관찰할 수 있다. 영상 기반 세포측정에 의해 측정된 형광세포의 비율은 IPE 세포에 대해 53± 29%, RPE 세포에 대해 28± 23%였다(데이터는 도시되지 않음).
그림 6: 토끼로부터 분리된 갓 전염된 PE 세포의 현미경 그래프. 50,000IPE 및 토끼로부터의 RPE 세포가 pFAR4-CMV-금성으로 전염되었다. 형광은 21 일째에 형광 후 표시됩니다. 왼쪽 현미경 사진 : 밝은 필드, 오른쪽 현미경 : GFP (480 nm) 필터. 모든 경우에, 형질은 삼중 (원래 배율, 50x)에서 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
치료 유전자 PEDF 및 GM-CSF를 가진 PE 세포의 전환
50,000개의 PE 세포가 PEDF로 전감염되었고 단백질 분비는WB(도 7)에의해 모니터링되었다. 전감염된 세포에 대한 WB 신호는 연구된 모든 종 및 일 동안 비트랜스감염된 세포와 비교하여 더 높았습니다. 이 시간 내에 단백질 분비의 감소가 관찰되지 않았다.
그림 7: WB 는 전감염된 PE 세포의 PEDF 분비의 분석. 돼지(pre-배양)(A)및가축(B)PEDF-전관된 PE 세포로부터의 수퍼나츠를 WB 분석하여 대조군(비트랜스감염된 세포)에 비해 더 높은 PEDF 분비를 나타내고 시간이 지남에 따라 안정되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도서 S1: 종에 따라 PE 격리에 사용되는 계측기. (A)눈의 이핵화 및 남은 근육 조직 및 피부의 세척에 사용되는 비멸식 기구. 세트 1은 쥐, 마우스, 토끼에 사용되며, 세트 2는 돼지와 가축 의 눈에 사용된다. (B)PE 격리에 사용되는 멸균 기기. 눈 크기에 따라 사용되는 가위와 집게의 크기가 다릅니다. 둥글고 평평한 화재 광택 파저 파이펫은 각각 RPE와 IPE의 긁어에 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PE 세포를 분리하고 배양하는 표준화된 방법을 갖는 것은 망막 퇴행성 질병을 위한 새로운 치료 접근을 개발하는 데 근본적입니다. 여기에 제시 된 프로토콜으로, PE 세포는 성공적으로 다른 종에서 분리하고 오랜 기간 동안 배양 될 수있다 (지금까지, 가장 긴 배양은 2 년동안유지되었다1,38); 전형적인 PE 세포 형태, 색소 침착 및 기능이 관찰되었다(도1, 도 2). 특히 순수 RPE 배양에 대해 신경 망막 세포로 오염을 피하기 위해 망막을 완전히 추출하는 것이 중요합니다. IPE 세포의 경우, 주모 체는 프로토콜에 설명된 대로 홍채에서 제거되어야 합니다. 세포의 합류는 상대적으로 짧은 시간(~21일)에 달성되며, 그 후 세포는 치료 유전자로 전염되거나 다른 실험에서 사용할 준비가 되어 있습니다(예: 독성 제자, 단백질 등에 대한 노출). 더욱이, 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 시험뿐만 아니라 인간 응용, 즉, 전감염된 PE 세포 이식의 검증에도 중요합니다. 특히 IPE 세포가 홍채 생검으로부터 분리되고 즉시 전염되고 한 번의 수술 세션 내에서 동일한 환자에게 피복으로 이식되는 우리 그룹에 의해 개발된 것과 같은 AMD의 치료를 위해. 자가 IPE 세포의 격리 및 피하 이식은토끼(39)와 환자(23)에확립되었다. 자가 IPE 세포의 이식은 성공적이었지만 시력을 회복하기에 충분하지 않았기 때문에, PEDF 및 GM-CSF와 같은 신경 보호 인자를 과발현하기 위해 세포의 이식이 접근법에 추가되어 3 종 (마우스, 쥐 및 가축)으로 확립되었습니다. PE 세포의 격리, 배양 및 유전자 변형을 위해 여기에 설명된 방법으로, 각 세포 이식은 이제 생체 내에서 접근법의 독성 및 효율을 테스트하기 위해 다양한 종으로부터제조될 수 있다.
다각형 SB100X 트랜스포슨 시스템을 이용하여, 다양한 기원으로부터의 PE 세포가 PEDF(도7)로효율적으로 변형될 수 있는 것으로 나타났다. 쥐 IPE 및RPE(24) 및 인간 RPE세포(29)및30을 이용한 유사한 결과가 발표되었다. PEDF를 가진 경피는 VEGF 매개 신생 혈관화의 억제및 고미질 및 산화 스트레스뿐만 아니라 허혈40,41에서RPE 세포 및 망막 뉴런의 보호에 의해 nvAMD를 치료하는 것이 제안되었다. 안정적인 장기 단백질 분비(도7)의부식은 PE 세포를 신뢰할 수 있는 생물학적 "약물 전달 시스템"으로 확인하였다. 이와 관련하여, 조넨 등에서 보고된 바와 같이, 리포터 유전자 비너스(도 4, 도 5, 도 6)와함께 연구된 경질 효율은 ~20-100%(종-100%)의 높은 형질 효율을 확인하였다. 1.
사용되는 플라스미드의 크기는 가변이었지만 pFAR 미니플라스미드(~3,000bp)에서 pT2-백본(~5,000bp)30,트랜스페션 효율이 비교적 높았다는 점에 유의해야 한다. 형질 전환 효율에서 볼 수있는 차이는 아마도 세포 격리 및 조직 보존에 대한 enucleation에서 시간의 가변성 때문이지만 세포가 합류에 도달하는 시간 (~21 일 격리 후) 또는 세포가 트랜스페이션 후에 수행된 시간도 세포 형태학을 변경하지 않았습니다. 일반적으로 성공적인 전환을 달성하기 위한 중요한 고려 사항은 PE 세포의 공급원이 가능한 한 신선해야 한다는 것입니다. 이것은 새로 고립된 PE 세포를 가진 transfections를 위해 특히 중요합니다.
세포 시트 이식과 비교하여, 우리 그룹이 개발중인 치료법(세포 현탁액으로 감산된 세포)은 증식 성 유리섬유증 및 피상섬유증(42)의관련 위험과 함께 큰 망막이 필요하기 때문에 덜 침습적입니다. 또한, 젖은 AMD를 위한 시트 이식편에서 CNV의 면적은 인접한 코로이드와 함께 제거되므로 이식 생존이43로손상될 수 있다. 마지막으로, 세포 패치를 사용하는 아이디어는 단일 수술 세션 동안 세포의 격리, 변형 및 이식이 수행되는 제안 된 절차와 호환되지 않습니다. 한편, 세포 현탁액으로 이식된 PE 세포의 내재된 문제는 전달 중 잠재적인 세포 사멸, 유착 부족 및 세포 분포의 차이; 그러나 이러한 단점은 조직 공학 접근법42에의해 극복 될 수있다; 또한, 세포 생존은프로 생존제(44,45,46,47)의사용에 의해 개선될 수 있다. 우리는 세포 현탁액으로 PEDF와 GM-CSF와 같은 신경 보호 인자를 과발현하는 1 차적인 PE 세포의 이식이 AMD를 취급하고, 이 치료를 개발하는 것이 1 차 적인 PE 세포의 격리, 배양 및 분석의 표준화를 허용하기 때문에 여기에서 제시된 프로토콜이 결정적이라고 믿습니다.
요약하자면, 이 프로토콜은 5가지 다른 종에서 안구 고급 약용 요법의 개발 및 전임상 및 생체 내 검사를 위한 고급 모델 시스템을 제공하며, 이는 다른 소스로부터 세포 품질의 개별적인 차이를 보상할 수 있을 만큼 견고합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
그렉 실리와 알린 콘티의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 제7프레임 워크 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 및 슈미더 보리쉬 재단의 맥락에서 유럽 위원회에 의해 지원되었다. Z.I.는 풀브라이트 연구 보조금과 스위스 정부 우수 장학금으로부터 유럽 연구 위원회, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] 및 B.M.W. 로부터 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
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