Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62145
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 3, 4, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 4Max Delbrück Center for Molecular Medicine
* These authors contributed equally

Summary

هنا، يتم تقديم بروتوكول لعزل وترانسفيكت القزحية الأولية والخلايا الظهارية صبغة الشبكية من الثدييات المختلفة (الفئران والجرذ والأرنب والخنازير والأبقار). هذه الطريقة مناسبة بشكل مثالي لدراسة نهج العلاج الجيني البصري في مختلف ال تشكيلات لتحليلات الجسم الحي السابق وفي دراسات الجسم الحي القابلة للنقل إلى البشر.

Abstract

الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو السبب الأكثر شيوعا للعمى لدى المرضى >60 عاما ، مما يؤثر على ~ 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. AMD هو مرض متعدد العوامل يتأثر بالعوامل البيئية والجينية ، مما يؤدي إلى ضعف وظيفي في شبكية العين بسبب انحطاط الخلايا الظهارية صبغة الشبكية (RPE) يليه تدهور المستقبل الضوئي. ومن شأن العلاج المثالي أن تشمل زرع خلايا RPE صحية تفرز العوامل العصبية لمنع موت الخلية RPE وانحطاط مستقبلات ضوئية. نظرا لأوجه التشابه الوظيفية والوراثية وإمكانية أخذ خزعة أقل توغلا ، تم اقتراح زرع خلايا ظهارية صبغة القزحية (IPE) كبديل ل RPE المنحطة. يمكن تحقيق إفراز العوامل العصبية الوقائية من خلال عدد قليل من الخلايا المزروعة تحت الشبكية عن طريق الجمال النائم (SB100X)transposon بوساطة transfection مع ترميز الجينات لعامل الظهارة المشتق من الصباغ (PEDF) و / أو عامل تحفيز مستعمرة الضامة الحبيبية (GM-CSF). أنشأنا العزلة والثقافة، وSB100X-بوساطة transfection من خلايا RPE و IPE من مختلف الأنواع بما في ذلك القوارض والخنازير والماشية. يتم استئصال الكرة الأرضية وإزالة القرنية والعدسة للوصول إلى القزحية والشبكية. باستخدام ملعقة مصنوعة خصيصا، تتم إزالة خلايا IPE من القزحية المعزولة. لحصاد خلايا RPE، قد تكون هناك حاجة إلى حضانة التريبسين، اعتمادا على الأنواع. ثم، باستخدام ملعقة مخصصة RPE، يتم تعليق الخلايا في المتوسط. بعد البذر ، يتم مراقبة الخلايا مرتين في الأسبوع ، وبعد الوصول إلى التقاء ، يتم تحويلها عن طريق الكهرومporation. تم تأكيد التكامل الجيني والتعبير وإفراز البروتين والوظيفة من قبل qPCR وWB و ELISA و immunofluorescence والمقايسات الوظيفية. اعتمادا على هذا النوع، يمكن عزل 30،000-5 مليون (RPE) و 10،000-1.5 مليون (IPE) الخلايا لكل عين. تظهر الخلايا المعدلة وراثيا فرط التعبير الكبير PEDF/GM-CSF مع القدرة على تقليل الإجهاد التأكسدي وتوفر نظاما مرنا لتحليلات الجسم الحي السابق وفي دراسات الجسم الحي القابلة للنقل إلى البشر لتطوير نهج العلاج الجيني البصري.

Introduction

تركز مجموعتنا على تطوير أساليب تجديدية لعلاج الانحطاط العصبي الشبكي ، أي AMD ، من خلال العلاج الجيني غير الفيروسي القائم على RPE و IPE. إن إنشاء هذه العلاجات قبل السريرية يستلزم نماذج في المختبر قابلة للنقل إلى البشر. وبالتالي، فإن الهدف من الدراسة المعروضة هنا هو تقديم بروتوكولات لعزل الخلايا الأولية RPE و IPE وثقافتها وهندستها الوراثية. والأساس المنطقي لإنشاء عزل خلايا ال PE عن أنواع متعددة هو التأكيد بقوة على سلامة وكفاءة النهج وزيادة قابليته للاستنساخ والنقل. يختلف خط الخلية البشرية المتاحة ARPE-19 عن الخلايا الأولية (على سبيل المثال، فهي أقل صبغة) وبالتالي، فهي ذات قيمة محدودة فقط للتحليلات ما قبل السريرية1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن شراء خلايا الثدييات غير البشرية بتكلفة أقل وبكميات أكبر؛ يمكن الحصول على الأنسجة المانحة الإنسان من مختلف البنوك العين، ولكن توافر محدودة ومكلفة. وأخيرا، يجب تطبيق المنتجات الطبية الجديدة للعلاج المتقدم (ATMP، أي الخلايا أو الأنسجة أو المنتجات الطبية للعلاج الجيني) في نوعين مختلفين على الأقل قبل اختبارها في المرضى، وهذه الدراسات في الجسم الحي تطلب إعداد عمليات زرع الخلايا المسببة للحساسية.

أمراض الشبكية العصبية هي السبب الرئيسي للعمى في البلدان الصناعية، والتي تشمل الأمراض الشائعة مثل AMD، فضلا عن أمراض نادرة مثل التهاب الشبكية الصباغي، الذي يؤدي موت خلايا الشبكية في نهاية المطاف إلى العمى. يمكن إبطاء خلايا RPE ، المستقبل الضوئي ، وخلايا العقدة الشبكية (RGC) في بعض الحالات ، ولكن لا توجد حاليا علاجات علاجية متاحة. توفر أجهزة الصراف الآلي إمكانية تصحيح العيوب الجينية أو دمج الجينات العلاجية أو استبدال الخلايا المنحطة ، وبالتالي تمكين تطوير علاجات تجديدية وعلاجية لأمراض مثل AMD ؛ 13 العلاجات الجينية حصلت بالفعل على موافقة التسويق بما في ذلك العلاج لعلاج RPE65 الطفرات المرتبطة انحطاط الشبكية2,3. بين كبار السن (>60 سنة)، ~ 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم تتأثر إما الأوعية الدموية الجديدة (nvAMD) أو الأوعية الدموية (AAMD) AMD4. يتم تحريض كلا الشكلين من قبل مشغلات المرتبطة بالعمر بما في ذلك الضرر التأكسدي، وضعف وظيفة وفقدان خلايا RPE تليها تدهور مستقبلات ضوئية، من بين أمور أخرى (مثل أليليس الخطر الوراثي، والتدخين، وارتفاع ضغط الدم)5،6. في nvAMD ، يتفاقم الإمراض بسبب عدم توازن العوامل الوعائية والمضاادة للأوعية الدموية لصالح عامل النمو البطاني الوعائي الوعائي (VEGF) الذي يحفز الأوعية الدموية الجديدة المشيمية (CNV). حتى الآن، nvAMD فقط يمكن علاجها عن طريق الحقن الشهري داخلفيتريال من مثبطات البروتين VEGF لقمع CNV. لا يوجد علاج فعال متاح حتى الآن لAMD6،7.

قيمت العديد من الدراسات العلاجات القائمة على الخلايا لتحل محل العلاج المضاد ل VEGF: أظهرت الدراسات التي أجراها Binder وآخرون ، والتي تم فيها زرع خلايا RPE ذاتية الحصاد الطازجة في المرضى الذين يعانون من nAMD8و9و10، تحسنا بصريا معتدلا ، ولكن مجموعة صغيرة فقط من المرضى وصلوا إلى حدة بصرية نهائية عالية بما يكفي لتمكين القراءة. في الآونة الأخيرة، استخدمت دراسة سريرية المرحلة الأولى التصحيح RPE المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية لعلاج AMD مع نتائج واعدة. أي فعالية واستقرار وسلامة تصحيح RPE لمدة تصل إلى 12 شهرا في 2 من المرضى العشرة الذين عولجوا11. بالإضافة إلى ذلك، نشرت عدة مجموعات دراسات تم فيها حصاد بقع الغشاء المشيمي الذاتية RPE-Bruch من شبكية العين الطرفية وزرعها في البقعة12و13و14؛ والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المستمدة من بقع RPE تم إنشاؤها لزرع15. بالنسبة ل aAMD ، تم اختبار الأجسام المضادة التي تستهدف المسار التكميلي في التجارب السريرية6و16 ودراسة المرحلة الأولى باستخدام حقنة واحدة داخل الجسم لنواقل فيروسية مرتبطة بالأدينو (AAV) ترميز الجين لعامل CD59 (AAVCAGsCD59) في المرضى الذين يعانون من ضمور جغرافي (GA) تم الانتهاءمن 17؛ بدأت دراسة المرحلة الثانية مؤخرا وتهدف إلى توظيف 132 مريضا يعانون من AAMD المتقدمة وتقييم النتيجة في 2 سنوات بعد التدخل18. وأخيرا، بدأت مجموعة دراسة فوكوس المرحلة الأولى / الثانية تجربة سريرية متعددة المراكز تقييم سلامة واستجابة الجرعة وفعالية ناقلات AAV غير المستنسخة المؤتلف ترميز عامل مكمل الإنسان19.

في المقام الأول ، فإن الهدف من العلاج AMD التجديدي هو زرع خلايا RPE الوظيفية ، والتي تضررت أو فقدت. ومع ذلك، تشترك خلايا IPE و RPE في العديد من أوجه التشابه الوظيفية والوراثية (على سبيل المثال، البلعوس واستقلاب الريتينول)، ولأن خلايا IPE يتم حصادها بشكل أكثر جدوى، فقد تم اقتراحها كبديل RPE20. على الرغم من أنه قد ثبت سابقا أن زرع الخلية IPE يؤخر انحطاط مستقبلات ضوئية في النماذج الحيوانية21،22 ويستقر الوظيفة البصرية في المرضى الذين يعانون من nvAMD المرحلة النهائية ، لم يلاحظ أي تحسن كبير في هؤلاء المرضى23. قد يكون عدم فعالية بسبب انخفاض عدد الخلايا المزروعة، و / أو عدم توازن العوامل العصبية الوقائية الشبكية. وثمة نهج بديل هو زرع الخلايا الظهارية الصباغية المصابة التي تفرط في التعبير عن العوامل العصبية لاستعادة التوازن الشبكي، والحفاظ على خلايا RPE المتبقية، وحماية المستقبلات الضوئية وRGCs من الانحطاط. وبالتالي، نقترح علاجا جديدا يتضمن زرع خلايا RPE أو IPE الوظيفية التي خضعت للهندسة الوراثية لإفراز البروتينات العصبية المضادة للأعائيات، مثل PEDF أو GM-CSF أو عوامل النمو الشبيهة بالإنسولين (IGFs). ميزة تطوير وتحليل هذا النهج في عدة أنواع بدلا من استخدام خط الخلية، نوع واحد فقط، أو الأنسجة البشرية هي: 1) زيادة استنساخ ونقل النتائج كما هو مبين في العديد من الدراسات التي تحققت في مختبرات مستقلة والأنواع المختلفة1،24،25؛ 2) خلايا الخنازير أو الأبقار هي عمليا المتاح دون التضحية من الحيوانات إضافية؛ 3) توافر خلايا الخنازير والأبقار خاصة يسمح سلسلة اختبار كبيرة لتحقيق نتائج قوية؛ 4) المعرفة لعزل وزراعة وتعديل وراثيا الخلايا من النماذج المستخدمة في الغالب تمكن في تحليلات الجسم الحي في أنواع متعددة24،25،26 ، وبالتالي يقدم نسبة محسنة من المخاطر إلى الفائدة للمرضى الذين عولجوا لأول مرة ؛ 5) مرونة البروتوكول المقدم يسمح استخدامه في مختلف النماذج والتجريبية انشاءات وجميع العلاجات القائمة على الخلايا العينية مع وبدون الهندسة الوراثية. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقنيات البديلة كخطوط خلايا أو أنسجة بشرية ليست سوى قدرة محدودة على النقل و/أو قابلية محدودة للتخلص منها. خطوط الخلية مثل ARPE-19 مثالية للتجارب الأولية. ومع ذلك، تصبغ منخفض وانتشار عالية تختلف اختلافا كبيرا عن الخلايا الأولية1. وتوفر خلايا RPE و IPE، المعزولة عن الأنسجة المانحة البشرية، مصدرا ثمينا للتجارب المختبرية القابلة للتحويل؛ ومع ذلك، نحصل على الأنسجة البشرية من بنك العيون الأمريكي الأمريكي مما يعني أن عمر الأنسجة لا يقل عن يومين (بعد التلقيح) ويتطلب نقلا طويلا ومكلفا، ولكن الأنسجة المانحة المحلية غير متوفرة بكميات كافية لإجراء بحث منتج. يتم تأكيد ميزة استخدام الخلايا الأولية من خلال دراسات متعددة من مجموعات أخرى27،28.

لتطوير العلاج الجيني غير الفيروسي القائم على الخلية باستخدام نظام SB100X transposon لتجريب الخلايا الأولية RPE و IPE مع ترميز الجينات لPEDF و / أو GM-CSF لعلاج nvAMD وamD ، على التوالي29،30،31،32، أنشأنا لأول مرة العدوى من خلايا ARPE-191 . وبعد ذلك، تم وضع بروتوكولات العزل والإصابة في الخلايا الأولية للأبقار والبورسين التي يمكن الوصول إليها بسهولة. الآن، تم إنشاء عزل وتوريث خلايا RPE و IPE الأولية من خمسة أنواع مختلفة، من الصغيرة (كفأر) إلى الثدييات الكبيرة (كالماشية). تم تأكيد ذلك في خلايا RPE و IPE الأولية المشتقة من عيون المتبرعين البشريين30. تم التحقق من صحة الإنتاج المتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) من ATMP باستخدام الأنسجة المانحة البشرية وكذلك33. وأخيرا، تم تقييم سلامة وكفاءة النهج في الجسم الحي في ثلاثة أنواع مختلفة تم تكييف البروتوكول لها: الفأر والفأر والأرنب. في الإعداد السريري ، سيتم حصاد خزعة القزحية من المريض وسيتم عزل خلايا IPE وترجمتها في الغرفة النظيفة ، قبل أن يتم زرع الخلايا دون المستوى مرة أخرى إلى نفس المريض. وستجري العملية بأكملها خلال جلسة جراحية واحدة تستغرق حوالي 60 دقيقة. تطلب تطوير نهج العلاج وتقييم كفاءته نماذج ممتازة في المختبر وفيفو السابق لتنفيذ طرق توصيل الجينات القوية والفعالة ، لتحليل كفاءة تسليم الجينات وإنتاج البروتين العلاجي والآثار العصبية ، وإنتاج عمليات زرع الخلايا لاختبار النهج في الجسم الحي1،24،25،29،30 . ومن الجدير بالذكر أن العلاج لديه الموافقة الأخلاقية على تجربة المرحلة السريرية Ib/IIa من اللجنة الأخلاقية لأبحاث كانتون جنيف (رقم 2019-00250) ويتم حاليا جمع آخر بيانات ما قبل السريرية المطلوبة للحصول على إذن من السلطات التنظيمية السويسرية باستخدام البروتوكول المقدم. في هذا الصدد، أظهرت بيانات ما قبل السريرية في الجسم الحي انخفاضا كبيرا في CNV وسلامة ممتازة24،25،31.

هنا ، يتم وصف عزل وثقافة خلايا RPE / IPE من الأبقار والخنازير والأرنب والفأر والفأر ، واستخدام نظام الإرسال والاستقبال SB100X التكاملي جنبا إلى جنب مع الكهربوجين كوسيلة فعالة لتسليم الجينات. وعلى وجه الخصوص، تم تحويل خلايا PE الأولية إلى فرط التعبير عن PEDF و GM-CSF. جمع هذه البروتوكولات تمكن من إجراء الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي في جميع مراحل ما قبل السريرية من تطوير ATMP. وعلاوة على ذلك، فإن الإعداد لديه القدرة على التكيف مع الجينات الأخرى ذات الاهتمام والأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد نفذ البروتوكولات التي شاركت فيها الحيوانات أفراد معتمدون وبعد إذن من إدارة المقاطعة الكانتونية في جنيف، سويسرا، ووفقا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في بحوث العيون والرؤية (الموافقة رقم). جنرال إلكتريك/94/17). الكبار صحية الفئران براون النرويج, C57BL/6 الفئران, والأرانب البيضاء نيوزيلندا تم القتل الرحيم بجرعة زائدة من Pentobarbital (150 ملغ/كغ) المخفف في 0.9٪ NaCl حقن داخل الصفاق والعيون كانت متعلمة مباشرة بعد التضحية. تم الحصول على عيون البورسين والأبقار من مسلخ محلي في غضون 6 ساعات من التضحية وتم نقلها إلى المختبر على الجليد.

1. قبل التحضير

  1. إعداد المتوسطة كاملة (DMEM / هام F12 تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 80 U/ مل البنسلين / 80 ميكروغرام / مل العقديبتومايسين، و 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B). سخني المتوسط، 1x PBS، و0.25٪ تريبسين (إذا لزم الأمر) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. وضع الستائر العقيمة في غطاء محرك السيارة لإعداد مكان عمل مطهر. إدخال جميع الأدوات والمواد العقيمة اللازمة داخل غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: فقط تجميل العينين وتنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد هي الإجراءات التي تتم خارج غطاء محرك السيارة، يجب تنفيذ بقية الخطوات داخل غطاء محرك السيارة.

2. عزل خلايا الفئران / الماوس PE

  1. استخدام مقص منحني والملقط Colibri لتعميم العينين بعد القتل الرحيم الحيوان. تنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين باستخدام مقص والملقط (غير معقمة).
    ملاحظة: حجم المقص والملقط المستخدمة لمساعدة وتنظيف العينين يعتمد على الأنواع (على سبيل المثال، للفئران والفأر الصكوك ستكون أصغر من تلك المستخدمة للخنازير والماشية) (انظر الشكل S1).
    1. جمع العينين في أنبوب 50 مل مليئة برنامج تلفزيوني غير معقم ونقل أنبوب إلى غطاء محرك السيارة تدفق صفح. تطهير العينين عن طريق الغمر لمدة 2 دقيقة في محلول اليود القائم، ثم نقلها إلى طبق بيتري مليئة برنامج تلفزيوني عقيمة.
  2. فتح المصباح
    1. بعد نقل العينين إلى طبق بيتري معقم ، أمسك واحدة قريبة بشدة من العصب البصري مع Colibri أو ملقط مدبب. لكمة حفرة بالقرب من الحد الأقصى للقزحية (بين بارس بلانكا وأورا سيراتا) مع إبرة 18 G. أدخل مقص صغير في الحفرة وقطع حول القزحية. إزالة الجزء الأمامي (القرنية والعدسة والقزحية) ووضعها في طبق بيتري. اترك المصباح مع الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE.
  3. عزل خلايا IPE
    1. إزالة العدسة ومع ملقط غرامة سحب بدقة القزحية التي تحتوي على خلايا IPE. ضع القزحية في طبق بيتري، اغسلها مع برنامج تلفزيوني معقم واتركها في PBS حتى يتم إعداد المزيد من القزحية.
    2. كرر الخطوات 2.2.1 إلى 2.3.1 لجميع العيون لتكون مستعدة في ذلك اليوم.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل قزحية واحتضن لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. إزالة التريبسين، إضافة 150 ميكرولتر من المتوسطة كاملة لكل قزحية وكشط IPE بدقة مع ماصة باستور مسطحة مصقول النار؛ استخدام ملقط ناعم لشل الأنسجة. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 مل. استخدام 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المخفف 1:3 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور34،35.
    4. إذا لم يتم تحويلها على الفور، البذور 200،000 خلية / جيدا في لوحة 24 جيدا (100،000 خلية / سم2) في 1 مل من المتوسطة كاملة (10٪ FBS) (للبذر انظر الجدول 1). ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري تجميع عدة عيون معا للحصول على خلايا كافية للبذر.
  4. عزل خلايا RPE
    1. إزالة الفكاهة الزجاجية وشبكية العين من الجزء الخلفي مع ملقط رقيقة. تجنب إتلاف ظهارة صبغة الشبكية.
    2. قطع الجزء إلى النصف مع مشرط # 10 أن يكون العالم مفتوحة تماما وغسل مع برنامج تلفزيوني عقيمة.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل عين واحتضان لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. إزالة التربسين وإضافة 150 ميكرولتر من المتوسطة كاملة في العالم وكشط خلايا RPE بدقة مع مشرط جولة; استخدام ملقط ناعم لشل الأنسجة. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 مل. تأخذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية; تمييع 1:4 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    4. انظر الخطوة 2.3.4.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري تجميع عدة عيون معا للحصول على خلايا كافية للبذر.

3. عزل خلايا PE أرنب

  1. إجراء التنظيف والتطهير كما هو موضح في الخطوات 2.1 إلى 2.1.1.
  2. ضع عين واحدة على ضغط شاش معقم واحمله بقوة بالقرب من العصب البصري. فتح العين مع مشرط # 11 ومقص حوالي 2 ملم تحت الحويئض. إزالة الجزء الأمامي (القرنية والعدسة والقزحية) ووضعها في طبق بيتري. اترك المصباح مع الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE.
  3. عزل خلايا IPE
    1. تنفيذ الخطوة 2.3.1. إزالة الجسم السيلاري من القزحية عن طريق قطع مع مشرط # 10.
    2. بعد إعداد 2 قزحية، واحتضان مع 1 مل من 0.25 ٪ تريبسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. خلال هذا الوقت، يمكن عزل خلايا RPE (راجع الخطوة 3.4). إزالة التريبسين وإضافة 1 مل متوسطة كاملة إلى القزحية وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية مع ماصة باستور مسطحة مصقول النار. إعادة تشغيل الخلايا بعناية عن طريق الأنابيب ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:3 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    3. انظر الخطوة 2.3.4.
  4. عزل خلايا RPE
    1. تنفيذ الخطوة 2.4.1.
    2. وضع شاش معقم في لوحة بئر 12 ووضع لمبة على الشاش.
    3. غسل مع برنامج تلفزيوني وتنفيذ الخطوة 2.4.3.
      ملاحظة: استخدام ماصة باستور مصقول النار المنحني.
    4. الطرد المركزي الخلايا 10 دقيقة في 120 × ز.
    5. انظر الخطوة 2.3.4.

4. عزل خلايا PE الخنزير

  1. قم بالتنظيف كما هو موضح في الخطوة 2.1. غسل مع برنامج تلفزيوني وتطهير العينين عن طريق الغمر لمدة 2 دقيقة في محلول اليود القائم، شطف مع برنامج تلفزيوني. تابع الخطوة 3.2.
  2. عزل خلايا IPE
    1. تنفيذ الخطوة 3.3.1. بعد إعداد 2 قزحية، إضافة 1 مل من المتوسطة كاملة وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية مع شقة النار مصقول باستور ماصة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:4 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    2. انظر الخطوة 2.3.4.
  3. عزل خلايا RPE
    1. تنفيذ الخطوة 2.4.1. ضع المصباح في طبق بيتري واغسله مع PBS. ملء المصباح مع 1 مل متوسطة كاملة.
    2. باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار، قم بإزالة خلايا RPE بعناية. تأكد من كشط من أسفل إلى أعلى لتجنب الانزلاق إلى أسفل من مجمع غشاء المشيمي-Bruch. جمع تعليق الخلية داخل لمبة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل لإعادة الإنفاق. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:8 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    3. انظر الخطوة 2.3.4.

5. عزل خلايا PE البقري

  1. قم بالتنظيف كما هو موضح في الخطوة 2.1. غسل مع برنامج تلفزيوني وتطهير العينين عن طريق الغمر لمدة 2 دقيقة في محلول اليود القائم، شطف مع برنامج تلفزيوني. تابع الخطوة 3.2.
  2. عزل خلايا IPE
    1. تنفيذ الخطوة 3.3.1. بعد إعداد اثنين من القزحية، واحتضان مع 2 مل من 0.25٪ تريبسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. خلال هذا الوقت، يمكن عزل خلايا RPE (راجع الخطوة 5.3).
    2. إزالة التريبسين وإضافة 2 مل متوسطة كاملة إلى القزحية وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية مع ماصة باستور مسطحة مصقول النار. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل. الطرد المركزي الخلايا 10 دقيقة في 120 × ز. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:4 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    3. إذا لم يتم تحويلها على الفور، البذور 320،000 الخلايا / جيدا في لوحة 6-جيدا في 3 مل من المتوسطة كاملة (10٪ FBS) (للبذر انظر الجدول 1). ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  3. عزل خلايا RPE
    1. اتبع الخطوة 2.4.1. ضع المصباح في طبق بيتري واغسله مع PBS. بعد إعداد 2 عيون ملء لمبة حوالي 3/4 مع تريبسين واحتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية مع غطاء طبق بيتري على رأس لمبي.
    2. إزالة التريبسين وإضافة 1 مل متوسطة كاملة. تنفيذ الخطوة 4.3.2. الطرد المركزي الخلايا 10 دقيقة في 120 × ز.
    3. انظر الخطوة 5.2.3.

6. زراعة - تغيير متوسط

  1. ثقافة الخلايا في DMEM / هام F12، تكملها مع 10٪ FBS، 80 U/mL البنسلين / 80 ميكروغرام / مل ستريبتوميسين، و 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B، في 37 درجة مئوية و 5٪ثاني أكسيد الكربون في حاضنة رطبة. بعد 3-4 أيام ماصة صعودا وهبوطا لجمع الخلايا غير الملتصقة ووضع نصف حجم في بئر آخر. املأ ما يصل إلى 1 مل مع وسيط كامل.
    ملاحظة: يسمح هذا وجود سطح كبير بما يكفي لكافة الخلايا المعزولة إرفاق وتكبير الإخراج.
  2. بعد آخر 3-4 أيام تكرار جمع الخلية ولكن هذه المرة عن طريق تجميع الخلايا غير الملتصقة من بئرين في بئر واحد (على سبيل المثال، A1 + B1 في C1). إضافة متوسطة إلى جميع الآبار. مراقبة الخلايا وتغيير المتوسطة 2 مرات في الأسبوع (ل6 و 24-جيدا لوحات استخدام 3 و 1 مل / بئر، على التوالي). عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بالتبديل إلى وسيط كامل مع 1٪ FBS أو استخدم الخلايا للتجارب (على سبيل المثال، العدوى).
    ملاحظة: خلايا RPE و IPE هي التقاء بعد 3-4، و 4-5 أسابيع بعد العزل، على التوالي. تم تأكيد نقاء ثقافة الخلية التحقق من مورفولوجيا الخلية (الخلايا المصطبغة) وعلامات محددة كما وصفها جونين وزملاؤه36.

7. الكهرومبوريشن من الخلايا PE الأولية

  1. تنفيذ الكهرومporation كما هو موضح قبل1،37.
  2. اعتمادا على عدد الخلايا المتحولة استخدام 6-, 24- أو 48-جيدا لوحات (انظر الجدول 2) لزرع الخلايا في المتوسط دون المضادات الحيوية أو مضادات المخدرات. للأسابيع التالية 2 إضافة قطرات مع المتوسطة التي تحتوي على البنسلين (80 U /mL), الستربتومايسين (80 ميكروغرام / مل), والأمفوتريسين B (2.5 ميكروغرام / مل) مرتين في الأسبوع. تبادل المتوسط تماما 2 أسابيع بعد transfection.
  3. لتحديد نمو الخلايا، وكفاءة العدوى، وإفراز البروتين، ومراقبة الخلايا أسبوعيا عن طريق المجهر وتحليل ثقافة الخلية supernatant بواسطة لطخة الغربية. قبل إنهاء الثقافة، واتخاذ 24 ح خلية الثقافة supernatant لقياس إفراز البروتين من قبل ELISA، عد الخلايا، وقياس الفلورسينس عن طريق قياس الخلايا القائمة على الصورة (في حالة الخلاياالزهرة -المصابة) بعد تعليمات المصنوعات (انظر جدول المواد)،وجمع بيليه الخلية لتحليل التعبير الجيني القائم على RT-qPCR.
    ملاحظة: لا يتم تضمين هذه الطرق في هذه الورقة لأنه ليس الغرض من شرح بالتفصيل تحليل الخلايا ولكن بدلا عزلها. كثافة بذر الخلايا هي نفسها بالنسبة لجميع الأنواع (100،000 خلية / سم2)ولكن لأن عدد الخلايا المعزولة يختلف ، تم استخدام لوحات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للفئران والجرذ والأرنب قد يكون من الضروري تجميع عيون 2-3 للحصول على خلايا كافية للبذر.
جنس علاج التريبسين N° خلايا IPE N° خلايا RPE لوحة للبذر (100،000 خلية / سم2)
الماوس / الفئران نعم ~50,000 ~150,000 24 لوحة بئر
أرنب نعم ~350,000 ~2,500,000 24 لوحة بئر
خنزير لا ~1,000,000 ~3,000,000 24 لوحة بئر
البقري نعم ~1,700,000 ~5,000,000 6 لوحات الآبار

الجدول 1: عدد خلايا ال PE الأولية المعزولة عن العيون من أنواع مختلفة.

اسم منطقة متوسط الحجم تريبسين حجم المتوسطة لوقف عمل تريبسين كثافة البذر
6-لوحة جيدا 9.6 سم² 3.0 مل 0.5 مل 1.0 مل 3x105
24-لوحة جيدا 2.0 سم² 1.0 مل 0.2 مل 0.8 مل 5x104
48-لوحة جيدا 1.1 سم² 0.5 مل 0.1 مل 0.4 مل 0.5-1x104

الجدول 2: أحجام زراعة الخلايا وكثافات البذر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عزل PE من أنواع الثدييات المختلفة
وباستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، تم بنجاح عزل خلايا IPE وRPE واستزراعها من خمسة أنواع مختلفة. يعتمد عدد الخلايا التي يتم الحصول عليها من كل إجراء على نوع العين وحجمها (الجدول 1). كما هو مبين في الشكل 1، تظهر الخلايا مورفولوجيا خلايا PE النموذجية والتصبغ (باستثناء خلايا الأرانب المعروضة ، المشتقة من أرانب البياض النيوزيلندي (NZW). في 21 يوما بعد العزل، والخلايا هي التقاء، وعلى استعداد لاستخدامها لمزيد من التجارب (على سبيل المثال، transfections). وتجدر الإشارة إلى أن الاستزراعات من جميع الأنواع تخضع للرصد والتحكم لمدة تصل إلى سنتين مما يؤكد وجود مورفولوجيا طبيعية وتعبير متحول مستقر (البيانات غير مبينة).

تم استبعاد التمايز والإجهاد الخلوي والتغيرات في التعبير الجيني عن طريق RT-qPCR والكيمياء المناعية. أكدت لوحة من الجينات (VEGF، CRALBP، CATD، ZO-1، KRT8) تحليلها في خلايا RPE البشرية المصابة (ARPE-19 الخلايا) نمط التعبير RPE العادي1؛ والتي يمكن تأكيدها في خلايا IPE البقرية الأولية عن طريق immunofluorescence لRPE65 (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، أكد جونين وزملاؤه وجود مناعة ZO-1 في خلايا البورسين الأولية IPE و RPE36.

Figure 1
الشكل 1: ميكروجرافات خلايا PE من الثدييات المختلفة في 21 يوما بعد العزل. تظهر خلايا IPE و RPE من الماوس والأرنب (أرنب NZW المهق) والخنزير والأبقار في اليوم 21 بعد العزل. بالنسبة لجميع الأنواع، الثقافات المعروضة هي التقاء. لاحظ أن خلايا PE الأرنب ليست مصطبغة (التكبير الأصلي، 50x). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:RPE65 مناعة خلايا IPE الأولية. RPE65 (أخضر) تلطيخ خلايا IPE البقرية المصابة مع pFAR4-CMV-PEDF بلازميد الإرسال والاستقبال باستخدام عدد الخلايا الأولية من 1 × 104 خلايا مقارنة بخلايا التحكم غير المصابة (التكبير الأصلي، 200x). كانت النوى ملطخة بال DAPI (الأزرق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صلاحية RPE الأولية المصابة
تظهر صلاحية الخلية في الشكل 3. لاستبعاد السمية المحتملة للحاجز المستخدم في عملية الكهرومporation، تم تعليق خلايا RPE الأولية المستزرعة مسبقا في حاجز كهربية من مجموعة متاحة تجاريا، أو في مخزن مؤقت للمغذيات طورته شركة أدوية (تكوين سري) ومكتربو (E) (دون إضافة البلازميد) كما هو موضح في الخطوة 7 من البروتوكول. تمت دراسة صلاحية الخلية 3 ± 1 أيام بعد العدوى باستخدام عدة فحص السمية الخلوية المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. كانت المقايسات تؤدى دائما مع التحكم بدون طاقة (Co-P) (وليس كهربائي). لم يلاحظ أي تأثير على صلاحية الخلية لأي من المخازن المؤقتة التي تم اختبارها(الشكل 3).

Figure 3
الشكل 3:تم تعليقصلاحية خلايا RPE الأولية المعلقة في مخازن مؤقتة مختلفة. تم قياس صلاحية الخلية 3 ± 1 أيام بعد العدوى باستخدام عدة فحص السمية الخلوية المتاحة تجاريا. ولم تلاحظ أي اختلافات في الجدوى بين المخازن المؤقتة المختلفة؛ يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SD (n = 2 الجهات المانحة، 3 تكرارات / المانحة). E: الخلايا الكهربائية، Co-P: السيطرة من دون طاقة. الاتحاد الافريقي: وحدات تعسفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عمليات العدوى من خلايا PE المستزرعة مسبقا مع جين مراسل الزهرة
50,000-100,000 خلايا PE المستزرعة مسبقا من أنواع مختلفة تم تحويلها مع بروتين الزهرة الفلوري الأصفر (pT2-CAGGS-Venus) باستخدام نظام تسليم الجينات الإرسال والاستقبال SB100X مفرط النشاط. وتؤكد الصور الدقيقة المبينة في الشكل 4 أن الخلايا قد تم تحويلها بنجاح (الخلايا الفلورية بعد 21 يوما من العدوى). ويبين الشكل 5 تقدير كفاءة العدوى في خلايا الخنازير المستزرعة مسبقا (n=6متبرعين، 000 50 خلية/إصابة) مصابة بالزهرة (pT2-CAGGS-Venus). تم قياس النسبة المئوية للخلايا الفلورية و MFI باستخدام قياس الخلايا القائم على الصور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في يوم إنهاء ثقافة الخلية (30 ± 5 أيام بعد العدوى). وكان متوسط النسبة المئوية للخلايا الفلورية 50 ± 30 في المائة ولكنه متغير يتراوح بين 95 ± 6 في المائة (المانح 2) و 28 ± 1 في المائة (المانح 4)(الشكل 5). في جميع التجارب، استخدمت خلايا ARPE-19 المصابة كتحكم إيجابي. بالإضافة إلى ذلك، كانت كفاءة العدوى دائما مقارنة بالضوابط السلبية: Co-P (التحكم بدون طاقة [غير كهربائي]) و Co+P (التحكم بالطاقة [كهربائيا ولكن دون إضافة البلازميدات]). كما أجريت التجربة مع خلايا IPE (البيانات غير المعروضة).

Figure 4
الشكل 4:ميكروجرافات خلايا PE المستزرعة مسبقا مع pT2-CAGGS-Venus. الزهرة-transfected أرنب (أ), البقري (ب), وposcine (C) وتظهر خلايا PE في 21 أيام بعد transfection. وكعنصر تحكم إيجابي، تم تحويل 50,000 خلية من خلايا ARPE-19 مع الزهرة (D). ميكروجراف أيسر: حقل ساطع، ميكروجراف أيمن: فلتر GFP (480 نانومتر) (التكبير الأصلي، 50x). تم إجراء عمليات العدوى في ثلاثة أشكال من الضوابط السلبية وشملت: Co-P (التحكم بدون طاقة [غير كهربائي]) و Co+P (التحكم بالطاقة [كهربائيا ولكن دون إضافة البلازميدات]) (غير مبين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:كفاءة العدوى في خلايا بورسيني RPE المصابة بجين مراسل الزهرة. (أ)تم تحويل 50000 خلية من خلايا البورسين الأولية RPE مع pT2-CAGGS-Venus ، وكان متوسط كفاءة العدوى الإجمالية 50 ± 30٪ وكان متوسط MFI 2712 ± 197 في يوم إنهاء ثقافات الخلية (30±5 يوما بعد العدوى). يوضح الرسم البياني متوسط ± SD (n = 3 تكرارات) ل 6 مختلفة. (ب)كانت النسبة المئوية لخلايا الزهرة+ ARPE-19 المستخدمة كعنصر تحكم إيجابي، 98±6٪ وكانت مستقرة لمدة 138 يوما تم اتباع الخلايا. بلغ متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) 5,785 ± 1,255. يوضح الرسم البياني متوسط ± SD (n = 3 نسخ متماثلة) لكل يوم. تم تضمين Co-P (التحكم بدون طاقة [غير كهربائي]) و Co+P (التحكم بالطاقة [كهربائيا ولكن دون إضافة البلازميدات]) في جميع تجارب العدوى (غير الموضحة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الترافيكتوريات من خلايا PE الطازجة مع جين مراسل الزهرة
تم تحويل 10000-50000 خلية PE معزولة حديثا من الأرانب مع البروتين الفلوري الأصفر فينوس (pFAR4-CMV-Venus) ، وتم رصد ثقافات الخلايا عن طريق المجهر. في الشكل 6 يمكن ملاحظة الخلايا الفلورية في اليوم 21 بعد العدوى. وكانت النسبة المئوية للخلايا الفلورية التي تقاس بقياس الخلايا القائمة على الصور 53 ± و29 في المائة لخلايا ال IPE و28 ± 23 في المائة لخلايا RPE (البيانات غير مبينة).

Figure 6
الشكل 6:تم تحويلالصور الدقيقة لخلايا PE المصابة حديثا المعزولة عن الأرنب. يظهر الفلورسينس في اليوم 21 بعد العدوى. ميكروجراف الأيسر: حقل مشرق، ميكروجراف اليمين: GFP (480 نانومتر) مرشح. وفي جميع الحالات، أجريت عمليات تحويل العدوى في ثلاث نسخ (التكبير الأصلي، 50x). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حالات العدوى من خلايا PE مع الجينات العلاجية PEDF وجنرال موتورز-CSF
تم تحويل 50000 خلايا PE مع PEDF وتم رصد إفراز البروتين من قبل البنك الدولي(الشكل 7). وكانت إشارة البنك الدولي للخلايا المتحولة أعلى مقارنة بالخلايا غير المصابة لجميع الأنواع والأيام التي تمت دراستها؛ لوحظ أي انخفاض في إفراز البروتين في غضون هذا الوقت.

Figure 7
الشكل 7: تحليل البنك الدولي لإفراز PEDF لخلايا PE المصابة. تحليل البنك الدولي للنواحل من الخنازير (قبل المستزرعة) (أ)، والماشية (الطازجة) (ب) PEDF- الخلايا PE المصابة تظهر إفراز PEDF أعلى مقارنة مع السيطرة (الخلايا غير المصابة) ومستقرة مع مرور الوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل S1: الأدوات المستخدمة لعزل PE اعتمادا على الأنواع. (أ) الأدوات غير العقيمة المستخدمة كتحقين العينين وتنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد. يستخدم مجموعة 1 للفئران والفأر والأرانب، ويستخدم مجموعة 2 لعيون الخنازير والماشية. (ب) أدوات معقمة تستخدم لعزل PE. لاحظ الحجم المختلف للمقص والمملقط المستخدم اعتمادا على حجم العين. وتستخدم جولة ومسطحة النار مصقول ماصة Pasteur لكشط من RPE و IPE، على التوالي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وجود طرق موحدة لعزل وزراعة خلايا PE أمر أساسي في تطوير نهج العلاج الجديدة للأمراض التنكسية الشبكية. مع البروتوكولات المعروضة هنا، يمكن عزل خلايا PE بنجاح من الأنواع المختلفة ومثقفة لفترات طويلة (حتى الآن، تم الحفاظ على أطول ثقافة لمدة 2 سنة1،38)؛ لوحظت نموذجية PE مورفولوجيا الخلية، تصبغ ووظيفة (الشكل 1، الشكل 2). لاحظ أنه لا سيما بالنسبة للثقافات RPE نقية, من المهم لاستخراج شبكية العين تماما لتجنب التلوث مع خلايا الشبكية العصبية; لخلايا IPE، يجب إزالة الجسم السيلاري من القزحية كما هو موضح في البروتوكول. ويتحقق التقاء الخلايا في وقت قصير نسبيا (~ 21 يوما)، وبعد ذلك تكون الخلايا جاهزة للإصابة بالجينات العلاجية أو للاستخدام في تجارب أخرى (مثل التعرض للعوامل السامة والبروتينات وما إلى ذلك). وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكولات ليست حاسمة فقط في المختبر قبل السريرية وفي اختبار الجسم الحي، ولكنها مهمة أيضا للتطبيق البشري، أي التحقق من صحة عمليات زرع خلايا PE المصابة؛ خاصة لعلاج AMD كما هو الحال في التنمية من قبل مجموعتنا، حيث سيتم عزل خلايا IPE من خزعة القزحية، على الفور المصابة، وزرعها دون الحمراء لنفس المريض في جلسة جراحية واحدة. تم تأسيس العزل وزرع تحت الشبكية من خلايا IPE الذاتية في الأرانب39 والمرضى23. وبما أن زرع خلايا IPE الذاتية كان ناجحا ولكنه لم يكن كافيا لاستعادة الرؤية، فقد أضيفت إلى النهج عملية نقل الخلايا لفرط التعبير عن العوامل العصبية الوقائية، مثل PEDF و GM-CSF، وأنشأت في ثلاثة أنواع أخرى (الماوس والجرذ والماشية). مع الأساليب الموصوفة هنا لعزل وزراعة وتعديل وراثي لخلايا PE ، يمكن الآن إعداد عمليات زرع الخلايا من مختلف الأنواع لاختبار سمية وكفاءة النهج في الجسم الحي.

وقد تبين أنه باستخدام نظام الإرسال والاستقبال SB100X مفرط النشاط، يمكن تعديل خلايا PE من أصل مختلف بكفاءة لفرط التعبير PEDF(الشكل 7)؛ نتائج مماثلة باستخدام الفئران IPE و RPE24 والخلايا البشرية RPE29،30 وقد نشرت. وقد اقترح transfection مع PEDF لعلاج nvAMD عن طريق تثبيط الأوعية الدموية الجديدة بوساطة VEGF وحماية خلايا RPE والخلايا العصبية الشبكية من الغلوتامات والإجهاد التأكسدي وكذلك نقص التروية40،41. وأكد تأكيد مستقر إفراز البروتين على المدى الطويل (الشكل 7) خلايا PE باعتبارها موثوق البيولوجية "نظام تسليم المخدرات". وفي هذا الصدد، أكدت كفاءة العدوى التي تمت دراستها مع الجين المراسل فينوس (الشكل 4، الشكل 5، الشكل 6)كفاءة عالية في العدوى بنسبة 20-100٪ تقريبا (الأنواع والجهات المانحة المعتمدة) كما ورد في Johnen وآخرون. 1.

وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن حجم البلازميدات المستخدمة كان متغيرا ، من pFAR miniplasmids (~ 3000 bp) إلى البلازميدات ذات العمود الفقري pT2 (~ 5000 bp)30، كانت كفاءة العدوى عالية نسبيا. الاختلافات التي شوهدت في كفاءة العدوى ربما يرجع إلى التباين في الوقت من التلقيح إلى عزل الخلايا وفي الحفاظ على الأنسجة ولكن لم يغير مورفولوجيا الخلايا لا الوقت الذي تصل فيه الخلايا إلى التقاء (~ 21 يوما بعد العزلة)، أو الوقت الذي اتبعت الخلايا بعد العدوى. بشكل عام، من الاعتبارات الهامة لتحقيق العدوى الناجحة هو أن مصدر خلايا PE يجب أن يكون طازجا قدر الإمكان؛ هذا مهم بشكل خاص لالعاب مع خلايا PE معزولة حديثا.

بالمقارنة مع زرع ورقة الخلية، والعلاج مجموعتنا هو تطوير (الخلايا المصابة زرعها تحت الشبكية كتعليق الخلية) هو أقل الغازية منذ الأول يتطلب retinotomies كبيرة مع المخاطر المرتبطة بها من اعتلال الزجاجية التكاثرية والتليف تحتالشبكية 42. وبالإضافة إلى ذلك، في الطعوم ورقة ل AMD الرطب تتم إزالة منطقة CNV جنبا إلى جنب مع المشيمي المجاورة، وبالتالي، يمكن أن يتعرض للخطر بقاء الكسب غير المشروع43. وأخيرا، فإن فكرة استخدام رقعة الخلية لا تتوافق مع الإجراء المقترح، حيث يتم عزل الخلايا وتعديلها وزرعها خلال جلسة جراحية واحدة. من ناحية أخرى، فإن القضايا المتأصلة في خلايا PE المزروعة كذلك تعليق الخلايا هي موت الخلايا المحتمل أثناء الولادة، وعدم التصاق، والتباين في التوزيع الخلوي؛ ولكن يمكن التغلب على هذه العيوب من خلال نهج هندسة الأنسجة42؛ وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين بقاء الخلية باستخدام عوامل المؤيدة للبقاء على قيد الحياة44،45،46،47. ونحن نعتقد أن زرع الخلايا PE الأولية الإفراط في التعبير عن العوامل العصبية مثل PEDF وGM-CSF كتعليقة الخلية هو نهج واعد لعلاج AMD، وتطوير هذا العلاج البروتوكولات المعروضة هنا حاسمة لأنها تسمح توحيد العزلة والثقافة وتحليل خلايا PE الأولية.

وباختصار، يوفر البروتوكول نظاما نموذجيا متقدما لتطوير واختبار ما قبل السريرية في المختبر وفي الجسم الحي للعلاجات الطبية المتقدمة العينية في خمسة أنواع مختلفة، قوية بما يكفي للتعويض عن التباينات الفردية في جودة الخلية من المصادر المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يستحق الشكر جريج سيلي وألان كونتي لمساعدتهما التقنية الممتازة. وقد دعمت المفوضية الأوروبية هذا العمل في سياق البرنامج الإطاري السابع، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم، ومؤسسة شميدر - بوريش. تلقى Z.I. التمويل من مجلس البحوث الأوروبي، ERC المتقدمة [ERC-2011-ADG 294742] وB.M.W. من منحة فولبرايت للبحوث ومنحة التميز الحكومية السويسرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 353043
24-well plates Corning 353047
48-well plates ThermoFisher Scientific 150687
6-well plate Greiner 7657160
Betadine Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay Promega G9291
DMEM/Ham`s F12 Sigma-Aldrich D8062
Drape (sterile) Mölnlycke Health Care 800530
Electroporation buffer 3P.14 3P Pharmaceutical
FBS Brunschwig P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress PROMEDICAL AG 25403
NaCl (0.9%) Laboratorium Dr. Bichsel AG 1000090
Needle (18G)  Terumo TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL ThermoFisher Scientific MPK1096
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000S
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Pasteur pipette (fire-polish) Witeg 4100150
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa) Ospedalia AG 31408025
Petri dish ThermoFisher Scientific 150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Pastor et al., 2018
scarpel no. 10 Swann-Morton 501
scarpel no. 11 Swann-Morton 503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer ThermoFisher Scientific T10796
Trypsin 0.25%  ThermoFisher Scientific 25050014
Trypsin 5%/EDTA 2% Sigma-Aldrich T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  2. Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
  3. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  4. Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  5. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  6. Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
  7. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  8. Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
  9. Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  10. Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
  11. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
  12. Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
  13. Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
  14. Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
  17. Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
  18. , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
  19. Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
  20. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
  21. Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
  22. Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
  23. Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
  24. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  25. Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
  26. Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
  27. Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
  28. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  29. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  30. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
  31. Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
  32. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  33. Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
  34. Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  37. Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
  38. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
  39. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
  40. Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
  41. Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
  42. Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
  43. Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
  44. Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
  45. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  46. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  47. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).

Tags

علم الأحياء، العدد 168، العلاج الجيني العيني، انحطاط الشبكية، خلايا RPE، خلايا IPE، عزل الخلايا، جهاز الإرسال والاستقبال الجمال النائم، العلاج الجيني غير الفيروسي، PEDF، GM-CSF
العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Wong, B. M., Johnen, S., Izsvák, Z., Thumann, G. Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy. J. Vis. Exp. (168), e62145, doi:10.3791/62145 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter