Summary
Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Transinfektion primärer Iris- und retinaler Pigmentepithelzellen aus verschiedenen Säugetieren (Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine und Rinder) vorgestellt. Die Methode eignet sich ideal, um okuläre Gentherapieansätze in verschiedenen Setups für Ex-vivo-Analysen und auf den Menschen übertragbare In-vivo-Studien zu untersuchen.
Abstract
Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Patienten >60 Jahren und betrifft weltweit ~ 30 Millionen Menschen. AMD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst wird, die aufgrund einer degeneration retinaler Pigmentepithelzellen (RPE) mit anschließendem Abbau des Photorezeptors zu einer funktionellen Beeinträchtigung der Netzhaut führen. Eine ideale Behandlung wäre die Transplantation gesunder RPE-Zellen, die neuroprotektive Faktoren sezernieren, um den RPE-Zelltod und die Degeneration des Photorezeptors zu verhindern. Aufgrund der funktionellen und genetischen Ähnlichkeiten und der Möglichkeit einer weniger invasiven Biopsie wurde die Transplantation von Irispigmentepithelzellen (IPE) als Ersatz für die degenerierte RPE vorgeschlagen. Die Sekretion neuroprotektiver Faktoren durch eine geringe Anzahl subretinal transplantierter Zellen kann durch transpononvermittelte Transfektion von Dornröschen (SB100X) mit Genen erreicht werden, die für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) und/oder den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kodieren. Wir etablierten die Isolierung, Kultur und SB100X-vermittelteTransfektion von RPE- und IPE-Zellen verschiedener Spezies, darunter Nagetiere, Schweine und Rinder. Globen werden explantiert und die Hornhaut und linse werden entfernt, um Zugang zur Iris und zur Netzhaut zu erhalten. Mit einem speziell angefertigten Spatel werden IPE-Zellen aus der isolierten Iris entfernt. Um RPE-Zellen zu ernten, kann je nach Art eine Trypsin-Inkubation erforderlich sein. Dann werden die Zellen mit RPE-angepasstem Spatel im Medium suspendiert. Nach der Aussaat werden die Zellen zweimal pro Woche überwacht und nach Erreichen des Zusammenflusses durch Elektroporation transfiziert. Genintegration, Expression, Proteinsekretion und -funktion wurden durch qPCR, WB, ELISA, Immunfluoreszenz und funktionelle Assays bestätigt. Je nach Art können pro Auge 30.000-5 Millionen (RPE) und 10.000-1,5 Millionen (IPE) Zellen isoliert werden. Genetisch veränderte Zellen zeigen eine signifikante PEDF/GM-CSF-Überexpression mit der Fähigkeit, oxidativen Stress zu reduzieren, und bieten ein flexibles System für Ex-vivo-Analysen und In-vivo-Studien, die auf den Menschen übertragbar sind, um okuläre Gentherapieansätze zu entwickeln.
Introduction
Unsere Gruppe konzentriert sich auf die Entwicklung regenerativer Ansätze zur Behandlung der neuroretinalen Degeneration, d.h. AMD, durch RPE- und IPE-basierte nicht-virale Gentherapie. Die präklinische Etablierung solcher Therapien erfordert auf den Menschen übertragbare In-vitro-Modelle. Ziel der hier vorgestellten Studie ist es daher, Protokolle für die Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären RPE- und IPE-Zellen bereitzustellen. Die Begründung für die Isolierung von PE-Zellen aus mehreren Spezies besteht darin, die Sicherheit und Effizienz des Ansatzes robust zu bestätigen und seine Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit zu erhöhen. Die verfügbare humane RPE-Zelllinie ARPE-19 unterscheidet sich von Primärzellen (z.B. sind sie weniger pigmentiert) und ist daher für präklinische Analysen nur von begrenztem Wert1. Darüber hinaus können nicht-menschliche Säugetierzellen für weniger Kosten und in größeren Mengen gekauft werden; menschliches Spendergewebe kann aus verschiedenen Augenbanken bezogen werden, aber die Verfügbarkeit ist begrenzt und teuer. Schließlich müssen neue Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP, d. h. Zell-, Gewebe- oder Gentherapeutikum) in mindestens zwei verschiedenen Spezies angewendet werden, bevor sie an Patienten getestet werden, und diese In-vivo-Studien erfordern die Vorbereitung allogener Zelltransplantate.
Retinale neurodegenerative Erkrankungen sind die Hauptursache für Blindheit in Industrieländern und umfassen häufige Erkrankungen wie AMD sowie seltene Krankheiten wie Retinitis pigmentosa, bei denen der retinale Zelltod schließlich zur Erblindung führt. RPE-Zellen, Photorezeptoren und retinale Ganglienzellen (RGC) können in einigen Fällen verlangsamt werden, aber es gibt derzeit keine kurativen Therapien. ATMPs bieten das Potenzial, Gendefekte zu korrigieren, therapeutische Gene zu integrieren oder degenerierte Zellen zu ersetzen, wodurch die Entwicklung regenerativer und kurativer Therapien für Krankheiten wie AMD ermöglicht wird; 13 Gentherapien haben bereits die Marktzulassung erhalten, darunter eine Therapie zur Behandlung der RPE65-Mutation-assoziierten Netzhautdegeneration2,3. Unter den älteren Erwachsenen (>60 Jahre) sind weltweit ~ 30 Millionen Menschen entweder von neovaskulärer (nvAMD) oder avaskulärer (aAMD) AMD4betroffen. Beide Formen werden durch altersbedingte Auslöser induziert, darunter oxidative Schäden, Funktionsstörungen und Verlust von RPE-Zellen, gefolgt von einem Photorezeptorabbau, unter anderem (z. B. genetische Risikoallele, Rauchen, Bluthochdruck)5,6. Bei nvAMD wird die Pathogenese durch ein Ungleichgewicht von angiogenen und anti-angiogenen Faktoren zugunsten des angiogenen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) verschlimmert, der die choroidale Neovaskularisation (CNV) induziert. Bisher ist nur nvAMD durch monatliche intravitreale Injektionen von Inhibitoren des VEGF-Proteins behandelbar, um das CNV zu unterdrücken; für aAMD6,7ist noch keine wirksame Behandlung verfügbar.
Mehrere Studien evaluierten zellbasierte Therapien, um die Anti-VEGF-Therapie zu ersetzen: Studien von Binder et al., in denen frisch geerntete autologe RPE-Zellen in Patienten mit nAMD 8,9,10transplantiert wurden, zeigten eine moderate visuelle Verbesserung, aber nur eine kleine Gruppe von Patienten erreichte eine endgültige Sehschärfe, die hoch genug war, um das Lesen zu ermöglichen. Kürzlich verwendete eine klinische Phase-I-Studie ein aus embryonalen Stammzellen gewonnenes RPE-Pflaster zur Behandlung von AMD mit vielversprechenden Ergebnissen; d. h. Wirksamkeit, Stabilität und Sicherheit des RPE-Pflasters für bis zu 12 Monate bei 2 der 10 behandelten Patienten11. Darüber hinaus haben mehrere Gruppen Studien veröffentlicht, in denen autologe RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Flecken aus der peripheren Netzhaut entnommen und in die Makula transplantiert wurden12,13,14; und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete RPE-Pflaster wurden für die Transplantation erzeugt15. Für aAMD wurden Antikörper, die auf den Komplementweg abzielen, in den klinischen Studien6,16 getestet und eine Phase-I-Studie unter Verwendung einer einzigen intravitrealen Injektion eines adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektors, der das Gen für den Faktor CD59 (AAVCAGsCD59) bei Patienten mit geografischer Atrophie (GA) kodiert, wurde abgeschlossen17; Die Kürzlich gestartete Phase-II-Studie zielt darauf ab, 132 Patienten mit fortgeschrittener aAMD zu rekrutieren und das Ergebnis 2 Jahre nach der Intervention zu bewerten18. Schließlich hat die FocuS-Studiengruppe eine multizentrische klinische Phase-I/II-Studie gestartet, in der die Sicherheit, das Dosis-Wirkungs-Verhältnis und die Wirksamkeit eines rekombinanten, nicht replizierenden AAV-Vektors untersucht wurden, der für einen menschlichen Komplementfaktor19kodiert.
Das Ziel einer regenerativen AMD-Therapie ist in erster Linie die Transplantation von funktionellen RPE-Zellen, die beschädigt wurden oder verloren gegangen sind. IPE- und RPE-Zellen teilen jedoch viele funktionelle und genetische Ähnlichkeiten (z. B. Phagozytose und Retinolstoffwechsel), und da IPE-Zellen besser geerntet werden können, wurden sie als RPE-Ersatz vorgeschlagen20. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass die IPE-Zelltransplantation die Photorezeptordegeneration in den Tiermodellen21,22 verzögert und die Sehfunktion bei Patienten mit nvAMD im Endstadium stabilisiert, wurde bei diesen Patienten keine signifikante Verbesserung beobachtet23. Der Mangel an Wirksamkeit kann auf die geringe Anzahl transplantierter Zellen und / oder das Ungleichgewicht neuroprotektiver Netzhautfaktoren zurückzuführen sein. Ein alternativer Ansatz wäre die Transplantation von transfizierten Pigmentepithelzellen, die neuroprotektive Faktoren überexprimieren, um die retinale Homöostase wiederherzustellen, verbleibende RPE-Zellen aufrechtzuerhalten und Photorezeptoren und RGCs vor Degeneration zu schützen. Daher schlagen wir eine neue Therapie vor, die die Transplantation von funktionellen RPE- oder IPE-Zellen umfasst, die gentechnikalisiert wurden, um neuroprotektive und antiangiogene Proteine wie PEDF, GM-CSF oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) abzusondern. Der Vorteil der Entwicklung und Analyse dieses Ansatzes in mehreren Spezies anstelle einer Zelllinie, nur einer Spezies oder menschlichem Gewebe ist: 1) erhöhte Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der Ergebnisse, wie zahlreiche Studien in unabhängigen Labors und verschiedenen Spezies zeigen1,24,25; 2) Schweine- oder Rinderzellen sind ohne die Opfer zusätzlicher Tiere möglicherweise wegwerfbar; 3) Die Verfügbarkeit insbesondere von Schweine- und Rinderzellen ermöglicht große Versuchsreihen, um robuste Ergebnisse zu erzielen; 4) das Wissen, Zellen aus den am häufigsten verwendeten Modellen zu isolieren, zu kultivieren und genetisch zu verändern, ermöglicht In-vivo-Analysen bei mehreren Spezies24,25,26 und bietet somit ein verbessertes Nutzen-Risiko-Verhältnis für die ersten behandelten Patienten; 5) Die Flexibilität des vorgestellten Protokolls ermöglicht den Einsatz in verschiedenen Modellen und Versuchsanordnungen sowie für alle augenzellbasierten Therapien mit und ohne Gentechnik. Im Gegensatz dazu sind alternative Techniken wie Zelllinien oder menschliches Gewebe nur von begrenzter Übertragbarkeit und/oder begrenzter Verfügbarkeit. Zelllinien wie die ARPE-19 sind ideal für Vorversuche; Niedrige Pigmentierung und hohe Proliferation unterscheiden sich jedoch signifikant von Primärzellen1. RPE- und IPE-Zellen, die aus menschlichem Spendergewebe isoliert werden, bieten eine wertvolle Quelle für übertragbare In-vitro-Experimente; Wir beziehen jedoch menschliches Gewebe aus einer US-amerikanischen Augenbank, was bedeutet, dass das Gewebe mindestens zwei Tage alt ist (nach Enukleation) und einen langen und teuren Transport erfordert, aber lokales Spendergewebe nicht in ausreichenden Mengen für eine produktive Forschung zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung von Primärzellen wird durch mehrere Studien aus anderen Gruppen27,28bestätigt.
Für die Entwicklung einer zellbasierten nicht-viralen Gentherapie unter Verwendung des SB100X-Transposon-Systems zur Transfizierung primärer RPE- und IPE-Zellen mit den Genen, die für PEDF und/oder GM-CSF kodieren, zur Behandlung von nvAMD bzw. aAMD29,30,31,32, haben wir zunächst die Transfektion von ARPE-19-Zellen etabliert1 . Als nächstes wurden die Isolations- und Transfektionsprotokolle in leicht zugänglichen Primärzellen von Rindern und Schweinen etabliert. Jetzt wurde die Isolierung und Transfektion von primären RPE- und IPE-Zellen aus fünf verschiedenen Arten etabliert, von kleinen (als Maus) bis zu großen Säugetieren (als Rinder). Es wurde in primären RPE- und IPE-Zellen aus menschlichen Spenderaugen bestätigt30. Die GMP-konforme Produktion (Good Manufacturing Practices) des ATMP wurde ebenfalls unter Verwendung von menschlichem Spendergewebe validiert33. Schließlich wurden sowohl die Sicherheit als auch die Effizienz des Ansatzes in vivo bei drei verschiedenen Spezies bewertet, für die das Protokoll angepasst wurde: Maus, Ratte und Kaninchen. Im klinischen Aufbau wird eine Irisbiopsie vom Patienten geerntet und IPE-Zellen werden isoliert und im Reinraum transfiziert, bevor die Zellen subretinal in denselben Patienten zurück transplantiert werden. Der gesamte Prozess findet während einer einzigen chirurgischen Sitzung statt, die etwa 60 Minuten dauert. Die Entwicklung des Behandlungsansatzes und die Bewertung seiner Effizienz erforderten ausgezeichnete In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, um robuste und effiziente Genliefermethoden zu implementieren, die Effizienz der Genabgabe, die therapeutische Proteinproduktion und die neuroprotektiven Wirkungen zu analysieren und Zelltransplantate zu produzieren, um den Ansatz in vivozu testen1,24,25,29,30 . Erwähnenswert ist, dass die Therapie von der Ethikkommission für Forschung des Kantons Genf (Nr. 2019-00250) über die ethische Genehmigung für eine klinische Phase-Ib/IIa-Studie verfügt und derzeit die letzten präklinischen Daten, die von den Schweizer Zulassungsbehörden zur Genehmigung angefordert wurden, mit dem vorgestellten Protokoll gesammelt werden. In dieser Hinsicht zeigten präklinische In-vivo-Daten eine signifikante Reduktion des CNV und eine ausgezeichnete Sicherheit24,25,31.
Hier wird die Isolierung und Kultur von RPE/IPE-Zellen aus Rind, Schwein, Kaninchen, Ratte und Maus sowie der Einsatz des integrativen TRANSPONON-Systems SB100X in Kombination mit der Elektroporation als effiziente Gen-Delivery-Methode beschrieben. Insbesondere primäre PE-Zellen wurden transfiziert, um PEDF und GM-CSF zu überexprimieren. Die Sammlung dieser Protokolle ermöglicht die Durchführung der In-vitro- und In-vivo-Studien in allen präklinischen Phasen der ATMP-Entwicklung. Darüber hinaus hat der Aufbau das Potenzial, an andere interessante Gene und Krankheiten angepasst zu werden.
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Protocol
Die Protokolle, an denen Tiere beteiligt waren, wurden von zertifiziertem Personal und nach Genehmigung durch das kantonale Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale von Genf, Schweiz, und gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung (Genehmigungs-Nr. GE/94/17). Erwachsene gesunde Braune Wanderratten, C57BL/6-Mäuse und neuseeländische weiße Kaninchen wurden durch eine Überdosis Pentobarbital (150 mg/kg), verdünnt in 0,9% NaCl intraperitoneal injiziert, eingeschläfert und die Augen wurden unmittelbar nach dem Opfer enukleiert. Schweine- und Rinderaugen wurden innerhalb von 6 Stunden nach der Opferung aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen und auf Eis ins Labor transportiert.
1. Vor der Zubereitung
- Bereiten Sie ein komplettes Medium vor (DMEM/Ham's F12 ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 80 U/ml Penicillin / 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B). Erhitzen Sie das Medium, 1x PBS und 0,25% Trypsin (falls erforderlich) in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Legen Sie einen sterilen Vorhang in die Haube, um einen aseptischen Arbeitsplatz vorzubereiten. Führen Sie alle benötigten sterilen Instrumente und Materialien in die Haube ein.
HINWEIS: Nur die Enukleation der Augen und die Reinigung des verbleibenden Muskelgewebes und der Haut sind die Verfahren, die außerhalb der Haube durchgeführt werden, der Rest der Schritte muss innerhalb der Haube durchgeführt werden.
2. Isolierung von Ratten-/Maus-PE-Zellen
- Verwenden Sie eine gebogene Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen nach dem Einschläfern des Tieres zu enukleieren. Reinigen Sie das restliche Muskelgewebe und die Haut mit einer Schere und einer Pinzette (nicht steril) von den Augen.
HINWEIS: Die Größe der Schere und Pinzette, die für die Enukleation und Reinigung der Augen verwendet wird, hängt von der Art ab (z. B. für Ratte und Maus sind die Instrumente kleiner als die für Schweine und Rinder) (siehe Abbildung S1).- Sammeln Sie die Augen in einem 50 ml Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen auf die Laminar-Flow-Haube. Desinfizieren Sie die Augen, indem Sie 2 minuten in jodhaltige Lösung eintauchen, und geben Sie sie dann in eine Petrischale, die mit sterilem PBS gefüllt ist.
- Öffnen der Glühbirne
- Nachdem Sie die Augen in eine sterile Petrischale gebracht haben, halten Sie eine mit Colibri oder einer spitzen Pinzette fest in der Nähe des Sehnervs. Stanzen Sie ein Loch in der Nähe der Grenze der Iris (zwischen Pars Plana und Ora Serrata) mit einer 18 G Nadel. Stecken Sie eine kleine Schere in das Loch und schneiden Sie um die Iris herum. Entfernen Sie das vordere Segment (Hornhaut, Linse und Iris) und legen Sie es in eine Petrischale. Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind.
- Isolierung von IPE-Zellen
- Entfernen Sie die Linse und ziehen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Iris heraus, die die IPE-Zellen enthält. Legen Sie die Iris in eine Petrischale, waschen Sie sie mit sterilem PBS und lassen Sie sie in PBS, bis mehr Iris vorbereitet ist.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.3.1, damit alle Augen an diesem Tag vorbereitet sind.
- 50 μL 0,25% Trypsin pro Iris zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren. Trypsin entfernen, 150 μL komplettes Medium pro Iris hinzufügen und die IPE vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette abkratzen; Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5 ml Röhrchen. Verwenden Sie 10 μL der Zellsuspension 1:3 mit Trypanblau verdünnt, um die Zellen in der Neubauer-Kammer34,35zu zählen.
- Wenn nicht sofort transfiziert, säen Sie 200.000 Zellen / Well in eine 24-Well-Platte (100.000 Zellen / cm2) in 1 ml vollständigem Medium (10% FBS) (für die Aussaat siehe Tabelle 1). Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 ° C, 5% CO2.
HINWEIS: Es kann notwendig sein, mehrere Augen zu bündeln, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.
- Isolierung von RPE-Zellen
- Entfernen Sie Glaskörper und Netzhaut mit einer dünnen Pinzette aus dem hinteren Segment. Vermeiden Sie es, das retinale Pigmentepithel zu beschädigen.
- Schneiden Sie das Segment mit einem # 10-Skalpell in zwei Hälften, um den Globus vollständig zu öffnen und mit sterilem PBS zu waschen.
- 50 μL 0,25% Trypsin pro Auge zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren. Trypsin entfernen und 150 μL komplettes Medium pro Globus hinzufügen und die RPE-Zellen vorsichtig mit einem runden Skalpell abkratzen; Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension; 1:4 mit Trypanblau verdünnen, um die Zellen in der Neubauerkammer zu zählen.
- Siehe Schritt 2.3.4.
HINWEIS: Es kann notwendig sein, mehrere Augen zu bündeln, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.
3. Isolierung von Kaninchen-PE-Zellen
- Führen Sie die Reinigung und Desinfektion wie in den Schritten 2.1 bis 2.1.1 beschrieben durch.
- Legen Sie ein Auge auf eine sterile Mullkompresse und halten Sie sie fest in der Nähe des Sehnervs. Öffne das Auge mit dem Skalpell #11 und der Schere ca. 2 mm unter dem Limbus. Entfernen Sie das vordere Segment (Hornhaut, Linse und Iris) und legen Sie es in eine Petrischale. Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind.
- Isolierung von IPE-Zellen
- Führen Sie Schritt 2.3.1 aus. Entfernen Sie den Ziliarkörper von der Iris, indem Sie mit einem Skalpell #10 schneiden.
- Nach der Herstellung von 2 Iris mit 1 ml 0,25 % Trypsin bei 37 °C für 10 min inkubieren; während dieser Zeit können die RPE-Zellen isoliert werden (siehe Schritt 3.4). Entfernen Sie das Trypsin und geben Sie 1 ml komplettes Medium in die Iris und isolieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:3 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
- Siehe Schritt 2.3.4.
- Isolierung von RPE-Zellen
- Führen Sie Schritt 2.4.1 aus.
- Legen Sie eine sterile Gaze in eine 12-Well-Platte und legen Sie die Glühbirne über die Gaze.
- Waschen Sie mit PBS und führen Sie Schritt 2.4.3 aus.
HINWEIS: Verwenden Sie eine gebogene, feuerpolierte Pasteurpipette. - Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min bei 120 x g.
- Siehe Schritt 2.3.4.
4. Isolierung von SCHWEINE-PE-Zellen
- Führen Sie die Reinigung wie in Schritt 2.1 beschrieben durch. Waschen Sie mit PBS und desinfizieren Sie die Augen, indem Sie 2 Minuten in jodhaltige Lösung eintauchen, mit PBS abspülen. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort.
- Isolierung von IPE-Zellen
- Führen Sie Schritt 3.3.1 aus. Nach der Herstellung von 2 Iris fügen Sie 1 ml komplettes Medium hinzu und isolieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:4 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
- Siehe Schritt 2.3.4.
- Isolierung von RPE-Zellen
- Führen Sie Schritt 2.4.1 aus. Legen Sie die Zwiebel in eine Petrischale und waschen Sie sie mit PBS. Füllen Sie die Glühbirne mit 1 ml komplettem Medium.
- Entfernen Sie die RPE-Zellen vorsichtig mit einer gebogenen, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Achten Sie darauf, von unten nach oben zu kratzen, um ein Abrutschen des Aderhaut-Bruch-Membrankomplexes zu vermeiden. Sammeln Sie die Zellsuspension in der Lampe mit einer 1.000 μL Pipette und geben Sie sie zur Wiederverwendung in ein 1,5 ml Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie 1:8 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
- Siehe Schritt 2.3.4.
5. Isolierung von bovinen PE-Zellen
- Führen Sie die Reinigung wie in Schritt 2.1 beschrieben durch. Waschen Sie mit PBS und desinfizieren Sie die Augen, indem Sie 2 Minuten in jodhaltige Lösung eintauchen, mit PBS abspülen. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort.
- Isolierung von IPE-Zellen
- Führen Sie Schritt 3.3.1 aus. Nach der Herstellung von zwei Iris, inkubieren Sie mit 2 ml 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 10 min. Während dieser Zeit können die RPE-Zellen isoliert werden (siehe Schritt 5.3).
- Entfernen Sie das Trypsin und geben Sie 2 ml komplettes Medium in die Iris und isolieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min bei 120 x g. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:4 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
- Wenn nicht sofort transfiziert, säen Sie 320.000 Zellen / Well in eine 6-Well-Platte in 3 ml vollständigem Medium (10% FBS) (für die Aussaat siehe Tabelle 1). Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 ° C, 5% CO2.
- Isolierung von RPE-Zellen
- Folgen Sie Schritt 2.4.1. Legen Sie die Zwiebel in eine Petrischale und waschen Sie sie mit PBS. Nach der Zubereitung von 2 Augen die Zwiebel ca. 3/4 mit Trypsin füllen und für 25 min bei 37 °C mit dem Deckel der Petrischale auf der Oberseite der Bulbi inkubieren.
- Entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie 1 ml komplettes Medium hinzu. Führen Sie Schritt 4.3.2 aus. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min bei 120 x g.
- Siehe Schritt 5.2.3.
6. Anbau - Mittlerer Wandel
- Kultur der Zellen in DMEM/Ham's F12, ergänzt mit 10% FBS, 80 U/ml Penicillin / 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B, bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Nach 3-4 Tagen pipettieren Sie auf und ab, um nicht adhärente Zellen zu sammeln und die Hälfte des Volumens in eine andere Vertiefung zu geben. Füllen Sie bis zu 1 ml mit komplettem Medium.
HINWEIS: Dies ermöglicht eine Fläche, die groß genug ist, damit alle Zellen isoliert werden können, um die Ausgabe anzuhängen und zu maximieren. - Nach weiteren 3-4 Tagen wiederholen Sie die Zellentnahme, aber diesmal durch Bündelung der nicht adhärenten Zellen aus zwei Vertiefungen in einer Vertiefung (z. B. A1 + B1 in C1). Fügen Sie allen Vertiefungen Medium hinzu. Beobachten Sie die Zellen und wechseln Sie das Medium 2 Mal pro Woche (für 6- und 24-Well-Platten verwenden Sie 3 bzw. 1 ml / Well). Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, wechseln Sie zu einem vollständigen Medium mit 1% FBS oder verwenden Sie die Zellen für Experimente (z. B. Transfektion).
HINWEIS: RPE- und IPE-Zellen sind nach 3-4 bzw. 4-5 Wochen nach der Isolierung konfluent. Die Reinheit der Zellkultur wurde bestätigt, indem die Zellmorphologie (pigmentierte Zellen) und spezifische Marker überprüft wurden, wie von Johnen und Kollegenbeschrieben 36.
7. Elektroporation von primären PE-Zellen
- Elektroporation wie vor1,37beschrieben durchführen.
- Abhängig von der Anzahl der transfizierten Zellen verwenden Sie 6-, 24- oder 48-Well-Platten (siehe Tabelle 2), um die Zellen ohne Antibiotika oder Antimykotika in Medium zu säen. Für die folgenden 2 Wochen zweimal wöchentlich Tropfen mit Medium hinzufügen, das Penicillin (80 U / ml), Streptomycin (80 μg / ml) und Amphotericin B (2,5 μg / ml) enthält. Tauschen Sie das Medium 2 Wochen nach der Transfektion vollständig aus.
- Um das Zellwachstum, die Transfektionseffizienz und die Proteinsekretion zu bestimmen, überwachen Sie die Zellen wöchentlich durch Mikroskopie und analysieren Sie den Zellkulturüberstand durch Western Blot. Vor Beendigung der Kultur nehmen Sie einen 24-stündigen Zellkulturüberstand, um die Proteinsekretion per ELISA zu quantifizieren, zählen Sie die Zellen, messen Sie die Fluoreszenz durch bildbasierte Zytometrie (im Falle von Venus-transfizierten Zellen) gemäß den Anweisungen der Hersteller (siehe Materialtabelle)und sammeln Sie das Zellpellet für die RT-qPCR-basierte Genexpressionsanalyse.
HINWEIS: Diese Methoden sind in der vorliegenden Arbeit nicht enthalten, da es nicht der Zweck ist, die Analyse der Zellen im Detail zu erklären, sondern ihre Isolierung. Die Zellsaatdichte ist für alle Arten gleich (100.000 Zellen/cm2),aber da die Anzahl der isolierten Zellen variiert, wurden unterschiedliche Platten verwendet. Darüber hinaus kann es für Mäuse, Ratten und Kaninchen notwendig sein, 2-3 Augen zu sammeln, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.
| Spezies | Trypsin Behandlung | N° IPE Zellen | N° RPE Zellen | Platte für die Aussaat (100.000 Zellen/cm2) |
| Maus/Ratte | Ja | ~50.000 | ~150.000 | 24-Well-Platten |
| Kaninchen | Ja | ~350.000 | ~2.500.000 | 24-Well-Platten |
| Schwein | Nein | ~1.000.000 | ~3.000.000 | 24-Well-Platten |
| Rind | Ja | ~1.700.000 | ~5.000.000 | 6-Well-Platten |
Tabelle 1: Anzahl der primären PE-Zellen, die aus Augen verschiedener Spezies isoliert wurden.
| Name | Fläche | Volumen mittel | Trypsin | Lautstärke mittel, um die Wirkung von Trypsin zu stoppen | Aussaatdichte |
| 6-Well-Platte | 9,6 cm² | 3,0 ml | 0,5 ml | 1,0 ml | 3x105 |
| 24-Well-Platte | 2,0 cm² | 1,0 ml | 0,2 ml | 0,8 ml | 5x104 |
| 48-Well-Platte | 1,1 cm² | 0,5 ml | 0,1 ml | 0,4 ml | 0,5-1x104 |
Tabelle 2: Zellkulturvolumina und Seeding-Dichten.
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Representative Results
PE-Isolierung aus verschiedenen Säugetierarten
Mit den oben genannten Protokollen wurden IPE- und RPE-Zellen erfolgreich isoliert und aus fünf verschiedenen Spezies kultiviert. Die Anzahl der Zellen, die aus jedem Verfahren gewonnen werden, hängt von der Art und Größe des Auges ab (Tabelle 1). Wie in Abbildung 1gezeigt, zeigen die Zellen eine typische PE-Zellmorphologie und Pigmentierung (mit Ausnahme der gezeigten Kaninchenzellen, die von Albino New Zealand White (NZW) Kaninchen abgeleitet sind). 21 Tage nach der Isolierung sind die Zellen konfluent und können für weitere Experimente (z. B. Transfektionen) verwendet werden. Es muss beachtet werden, dass Kulturen aller Arten bis zu 2 Jahre weiter überwacht und kontrolliert werden, was die normale Morphologie und die stabile Transgenexpression bestätigt (Daten nicht gezeigt).
Dedifferenzierung, zellulärer Stress und Veränderungen der Genexpression wurden durch RT-qPCR und Immunhistochemie ausgeschlossen. Ein Panel von Genen (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8), die in transfizierten menschlichen RPE-Zellen (ARPE-19-Zellen) analysiert wurden, bestätigte das normale RPE-Expressionsmuster1; die in primären bovinen IPE-Zellen durch Immunfluoreszenz für RPE65 bestätigt werden konnte (Abbildung 2). Darüber hinaus bestätigten Johnen und Kollegen die ZO-1-Immunfärbung in primären porcinen IPE- und RPE-Zellen36.
Abbildung 1: Mikroaufnahmen von PE-Zellen von verschiedenen Säugetieren 21 Tage nach der Isolierung. IPE- und RPE-Zellen von Maus, Kaninchen (Albino-NZW-Kaninchen), Schwein und Rind werden am Tag 21 nach der Isolierung gezeigt. Für alle Arten sind die gezeigten Kulturen konfluent. Beachten Sie, dass die Pe-Zellen des Kaninchens nicht pigmentiert sind (originale Vergrößerung, 50x). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: RPE65-Immunfärbung primärer IPE-Zellen. RPE65 (grün) Färbung von bovinen IPE-Zellen, die mit dem pFAR4-CMV-PEDF-Transposon-Plasmid transfiziert wurden, unter Verwendung einer anfänglichen Zellzahl von 1 x10 4 Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Kontrollzellen (ursprüngliche Vergrößerung, 200x). Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Lebensfähigkeit der transfizierten primären RPE
Die Lebensfähigkeit der Zellen ist in Abbildung 3 dargestellt. Um eine mögliche Toxizität des für den Elektroporationsprozess verwendeten Puffers auszuschließen, wurden vorkultivierte primäre RPE-Zellen in Elektroporationspuffer aus einem kommerziell erhältlichen Kit oder in einem von einem Pharmaunternehmen entwickelten Nährstoffpuffer suspendiert (vertrauliche Zusammensetzung) und elektroporat (E) (ohne Zusatz von Plasmid), wie in Schritt 7 des Protokolls beschrieben. Die Zelllebensfähigkeit wurde 3 ± 1 Tag nach der Transfektion mit einem kommerziell erhältlichen Zytotoxizitäts-Assay-Kit (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers untersucht. Die Assays wurden immer mit einer Kontrolle ohne Strom (Co-P) (nicht elektroporiert) durchgeführt. Für keinen der getesteten Puffer wurde ein Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit beobachtet (Abbildung 3).
Abbildung 3: Lebensfähigkeit von primären RPE-Zellen, die in verschiedenen Puffern suspendiert sind. 1 x 104 Zellen wurden in Elektroporationspuffer aus einem kommerziell erhältlichen Kit oder in einem Nährstoffpuffer suspendiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde 3 ± 1 Tag nach der Transfektion mit einem kommerziell erhältlichen Zytotoxizitätstest-Kit gemessen. Es wurden keine Unterschiede in der Lebensfähigkeit zwischen den verschiedenen Puffern beobachtet; Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt (n=2 Spender, 3 Replikate/Spender). E: elektroporierte Zellen, Co-P: Steuerung ohne Strom. AU: beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Transfektionen von vorkultivierten PE-Zellen mit dem Venus-Reporter-Gen
50.000-100.000 vorkultivierte PE-Zellen verschiedener Spezies wurden mit dem gelb fluoreszierenden Venusprotein (pT2-CAGGS-Venus) unter Verwendung des hyperaktiven TRANSPONON-Genabgabesystems SB100X transfiziert. Die in Abbildung 4 gezeigten Mikroaufnahmen bestätigen, dass die Zellen erfolgreich transfiziert wurden (fluoreszierende Zellen 21 Tage nach der Transfektion). Abbildung 5 zeigt die Quantifizierung der Transfektionseffizienz in vorkultivierten Schweine-RPE-Zellen (n=6 Spender, 50.000 Zellen/Transfektion), die mit Venus (pT2-CAGGS-Venus) transfiziert wurden. Der Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen und MFI wurde mittels bildbasierter Zytometrie nach den Anweisungen des Herstellers am Tag der Beendigung der Zellkultur (30 ± 5 Tage nach der Transfektion) gemessen. Der mittlere Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen betrug 50 ± 30%, aber variabel zwischen 95 ± 6% (Spender 2) bis 28 ± 1% (Spender 4) (Abbildung 5). In allen Experimenten wurden transfizierte ARPE-19-Zellen als Positivkontrolle verwendet. Darüber hinaus wurde die Transfektionseffizienz immer mit den Negativkontrollen verglichen: Co-P (Kontrolle ohne Strom [nicht elektroporiert]) und Co + P (Kontrolle mit Leistung [elektroporiert, aber ohne Zusatz von Plasmiden]). Das Experiment wurde auch mit IPE-Zellen durchgeführt (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 4: Mikroaufnahmen von vorkultivierten PE-Zellen, die mit pT2-CAGGS-Venus transfiziert wurden. Venus-transfizierte Kaninchen (A), Rinder (B) und Schweine (C) PE-Zellen werden 21 Tage nach der Transfektion gezeigt. Als Positivkontrolle wurden 50.000 ARPE-19-Zellen mit der Venus transfiziert (D). Linke Mikroaufnahme: Helles Feld, rechte Mikroaufnahme: GFP (480 nm) Filter (Originalvergrößerung, 50x). Transfektionen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und Negativkontrollen eingeschlossen: Co-P (Kontrolle ohne Strom [nicht elektroporiert]) und Co+P (Kontrolle mit Leistung [elektroporiert, aber ohne Zusatz von Plasmiden]) (nicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Transfektionseffizienz in porcinen RPE-Zellen, die mit dem Venus-Reporter-Gen transfiziert wurden. (A) 50.000 primäre porcine RPE-Zellen wurden mit pT2-CAGGS-Venus transfiziert, die mittlere Gesamttransfektionseffizienz betrug 50 ± 30% und der mittlere MFI betrug 2712 ± 197 am Tag der Beendigung der Zellkulturen (30±5 Tage nach der Transfektion). Die Grafik zeigt den mittleren ± SD (n=3 Replikate) von 6 verschiedenen Tieren. (B) Der Prozentsatz der Venus+ ARPE-19-Zellen, die als Positivkontrolle verwendet wurden, betrug 98±6% und war für die 138 Tage, an denen die Zellen beobachtet wurden, stabil. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) betrug 5.785 ± 1.255. Die Grafik zeigt die mittlere ± SD (n=3 Replikate) für jeden Tag. Co-P (Kontrolle ohne Leistung [nicht elektroporiert]) und Co+P (Kontrolle mit Leistung [elektroporiert, aber ohne Zusatz von Plasmiden]) wurden in alle Transfektionsexperimente eingeschlossen (nicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Transfektionen von frisch PE-Zellen mit Venus-Reporter-Gen
10.000-50.000 frisch aus Kaninchen isolierte PE-Zellen wurden mit dem gelb fluoreszierenden Protein Venus (pFAR4-CMV-Venus) transfiziert und Zellkulturen mikroskopisch überwacht. In Abbildung 6 können fluoreszierende Zellen am Tag 21 nach der Transfektion beobachtet werden. Der Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen, die mittels bildbasierter Zytometrie gemessen wurden, betrug 53 ± 29% für IPE-Zellen und 28 ± 23% für RPE-Zellen (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 6: Mikroaufnahmen von frisch transfizierten PE-Zellen, die aus Kaninchen isoliert wurden. 50.000 IPE- und RPE-Zellen von Kaninchen wurden mit pFAR4-CMV-Venus transfiziert. Die Fluoreszenz wird am Tag 21 nach der Transfektion gezeigt. Linke Mikroaufnahme: Hellfeld, rechte Mikroaufnahme: GFP (480 nm) Filter. In allen Fällen wurden die Transfektionen in dreifacher Ausfertigung (originale Vergrößerung, 50x) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Transfektionen von PE-Zellen mit den therapeutischen Genen PEDF und GM-CSF
50.000 PE-Zellen wurden mit PEDF transfiziert und die Proteinsekretion wurde durch WB überwacht (Abbildung 7). Das WB-Signal für transfizierte Zellen war höher im Vergleich zu den nicht-transfizierten Zellen für alle untersuchten Spezies und Tage; Innerhalb dieser Zeit wurde keine Abnahme der Proteinsekretion beobachtet.
Abbildung 7: WB-Analyse der PEDF-Sekretion von transfizierten PE-Zellen. Die WB-Analyse von Überständen aus Schweinen (vorkultivierten) (A) und Rindern (frisch) (B) PEDF-transfizierten PE-Zellen zeigt eine höhere PEDF-Sekretion im Vergleich zur Kontrolle (nicht transfizierte Zellen) und stabil über die Zeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung S1: Instrumente zur PE-Isolierung je nach Spezies. (A) Nicht sterile Instrumente zur Enukleation der Augen und zur Reinigung des verbleibenden Muskelgewebes und der Haut. Set 1 wird für Ratte, Maus und Kaninchen verwendet, und Set 2 wird für Schweine- und Rinderaugen verwendet. B)Sterile Instrumente zur PE-Isolierung. Beachten Sie die unterschiedliche Größe von Schere und Pinzette, die je nach Augengröße verwendet wird. Runde und flache feuerpolierte Pasteurpipetten werden für das Schaben von RPE bzw. IPE verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Standardisierte Methoden zur Isolierung und Kultivierung von PE-Zellen sind von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapieansätze für netzhautdegenerative Erkrankungen. Mit den hier vorgestellten Protokollen können PE-Zellen erfolgreich aus verschiedenen Spezies isoliert und über lange Zeiträume kultiviert werden (bisher wurde die längste Kultur 2 Jahre lang gepflegt1,38); typische PE-Zellmorphologie, Pigmentierung und Funktion wurde beobachtet (Abbildung 1, Abbildung 2). Beachten Sie, dass es insbesondere bei reinen RPE-Kulturen wichtig ist, die Netzhaut vollständig zu extrahieren, um eine Kontamination mit neuralen Netzhautzellen zu vermeiden. Bei IPE-Zellen sollte der Ziliarkörper aus der Iris entfernt werden, wie im Protokoll erläutert. Der Zusammenfluss der Zellen wird in relativ kurzer Zeit (~ 21 Tage) erreicht, wonach die Zellen für die Transfektion mit therapeutischen Genen oder für den Einsatz in anderen Experimenten (z. B. Exposition gegenüber toxischen Wirkstoffen, Proteinen usw.) bereit sind. Darüber hinaus sind die Protokolle nicht nur für präklinische In-vitro- und In-vivo-Tests von entscheidender Bedeutung, sondern auch für die Anwendung am Menschen, d.h. die Validierung von transfizierten PE-Zelltransplantaten; insbesondere für die Behandlung von AMD wie in der Entwicklung durch unsere Gruppe, wo IPE-Zellen aus einer Irisbiopsie isoliert, sofort transfiziert und subretinal an denselben Patienten innerhalb einer chirurgischen Sitzung transplantiert werden. Die Isolierung und subretinale Transplantation von autologen IPE-Zellen wurde bei Kaninchen39 und Patienten23 nachgewiesen. Da die Transplantation autologer IPE-Zellen erfolgreich war, aber nicht ausreichte, um das Sehvermögen wiederherzustellen, wurde die Transfektion der Zellen zur Überexpression neuroprotektiver Faktoren wie PEDF und GM-CSF in den Ansatz aufgenommen und bei drei weiteren Spezies (Maus, Ratte und Rinder) etabliert. Mit den hier beschriebenen Methoden zur Isolierung, Kultur und genetischen Veränderung von PE-Zellen können nun entsprechende Zelltransplantate aus verschiedenen Spezies hergestellt werden, um die Toxizität und Effizienz des Ansatzes in vivozu testen.
Es wurde gezeigt, dass mit dem hyperaktiven SB100X-Transposon-System PE-Zellen verschiedener Herkunft effizient modifiziert werden können, um PEDF zu überexprimieren (Abbildung 7); Ähnliche Ergebnisse mit Ratten-IPE und RPE24 und menschlichen RPE-Zellen29,30 wurden veröffentlicht. Die Transfektion mit PEDF wurde vorgeschlagen, um nvAMD durch Hemmung der VEGF-vermittelten Neovaskularisation und Schutz von RPE-Zellen und retinalen Neuronen vor Glutamat und oxidativem Stress sowie Ischämie zu behandeln40,41. Die Bestätigung einer stabilen Langzeitproteinsekretion (Abbildung 7) bestätigte PE-Zellen als zuverlässiges biologisches "Drug Delivery System". In dieser Hinsicht bestätigte die mit dem Reportergen Venus untersuchte Transfektionseffizienz (Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6) hohe Transfektionseffizienzen von ~ 20-100% (spezies- und spenderabhängig), wie in Johnen et al. berichtet. ( 1 ) DIE MITGLIEDSTAATEN DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN
Es sollte beachtet werden, dass, obwohl die Größe der verwendeten Plasmide variabel war, von pFAR-Miniplasmiden (~ 3.000 bp) bis zu Plasmiden mit einem pT2-Rückgrat (~ 5.000 bp)30, die Transfektionseffizienzen vergleichbar hoch waren. Unterschiede in der Transfektionseffizienz sind wahrscheinlich auf die Variabilität in der Zeit von der Enukleation bis zur Zellisolation und in der Gewebekonservierung zurückzuführen, haben aber weder die Zellmorphologie noch die Zeit, in der die Zellen die Konfluenz erreichen (~ 21 Tage nach der Isolierung), noch die Zeit, in der die Zellen nach der Transfektion verfolgt wurden, verändert. Im Allgemeinen ist eine wichtige Überlegung, um eine erfolgreiche Transfektion zu erreichen, dass die Quelle der PE-Zellen so frisch wie möglich sein sollte; dies ist besonders wichtig für Transfektionen mit frisch isolierten PE-Zellen.
Im Vergleich zu Zellblatttransplantationen ist die Therapie, die unsere Gruppe entwickelt (transfizierte Zellen, die subretinal als Zellsuspension transplantiert werden), weniger invasiv, da die erste große Retinotomien mit den damit verbundenen Risiken einer proliferativen Vitreoretinopathie und subretinalen Fibrose erfordert42. Darüber hinaus wird bei Blatttransplantaten für nasse AMD der Bereich der CNV zusammen mit der benachbarten Aderhaut entfernt und daher könnte das Überleben des Transplantats beeinträchtigt werden43. Schließlich ist die Idee, ein Zellpflaster zu verwenden, nicht mit dem vorgeschlagenen Verfahren vereinbar, bei dem die Isolierung, Modifikation und Transplantation der Zellen während einer einzigen chirurgischen Sitzung erfolgt. Auf der anderen Seite sind inhärente Probleme von PE-Zellen, die als Zellsuspensionen transplantiert werden, der potenzielle Zelltod während der Geburt, mangelnde Adhäsion und Varianz in der Zellverteilung; diese Nachteile könnten jedoch durch Tissue-Engineering-Ansätze überwunden werden42; darüber hinaus könnte das Zellüberleben durch den Einsatz von Pro-Survival-Wirkstoffen44,45,46,47verbessert werden. Wir glauben, dass die Transplantation von primären PE-Zellen, die neuroprotektive Faktoren wie PEDF und GM-CSF als Zellsuspension überexprimieren, ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von AMD ist, und für die Entwicklung dieser Therapie sind die hier vorgestellten Protokolle von entscheidender Bedeutung, da sie die Isolierung, Kultur und Analyse der primären PE-Zellen ermöglichen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll ein fortschrittliches Modellsystem für die Entwicklung und präklinische In-vitro- und In-vivo-Tests von neuartigen medizinischen Augentherapien in fünf verschiedenen Spezies liefert, das robust genug ist, um individuelle Abweichungen in der Zellqualität aus den verschiedenen Quellen auszugleichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Ein Dank gebührt Gregg Sealy und Alain Conti für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Kommission im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms, dem Schweizerischen Nationalfonds für Wissenschaften und der Schmieder-Bohrisch-Stiftung unterstützt. Das Z.I. wurde vom Europäischen Forschungsrat, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] und B.M.W. aus einem Fulbright Research Grant und einem Bundes-Exzellenz-Stipendium gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
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