Summary
Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.
Abstract
A degeneração macular relacionada à idade (DAM) é a causa mais frequente de cegueira em pacientes > 60 anos, afetando ~30 milhões de pessoas em todo o mundo. A APA é uma doença multifatorial influenciada por fatores ambientais e genéticos, que levam ao comprometimento funcional da retina devido à degeneração celular epitelial do pigmento da retina (RPE), seguida pela degradação do fotorreceptor. Um tratamento ideal incluiria o transplante de células de RPE saudáveis que secretam fatores neuroprotetores para prevenir a morte celular de RPE e a degeneração do fotorreceptor. Devido às semelhanças funcionais e genéticas e à possibilidade de uma biópsia menos invasiva, o transplante de células epiteliais de pigmento de íris (IPE) foi proposto como um substituto para o RPE degenerado. A secreção de fatores neuroprotetores por um baixo número de células subretinamente transplantadas pode ser alcançada pela transfecção mediada pela Transposon -mígio com genes codificados para o fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e/ou pelo fator estimulante da colônia de macrófago granulocyte (GM-CSF). Estabelecemos o isolamento, a cultura e a transfecção mediada por SB100Xde células RPE e IPE de várias espécies, incluindo roedores, suínos e bovinos. Globos são explantados e a córnea e as lentes são removidas para acessar a íris e a retina. Usando uma espátula personalizada, as células IPE são removidas da íris isolada. Para colher células RPE, pode ser necessária uma incubação de trippsina, dependendo da espécie. Em seguida, usando espátula personalizada rpe, as células são suspensas em média. Após a semeadura, as células são monitoradas duas vezes por semana e, após atingirem a confluência, transfectadas pela eletroporação. Integração genética, expressão, secreção de proteínas e função foram confirmadas por qPCR, WB, ELISA, imunofluorescência e ensaios funcionais. Dependendo da espécie, 30.000-5 milhões (RPE) e 10.000-1,5 milhões (IPE) podem ser isoladas por olho. Células geneticamente modificadas apresentam uma superexpressão significativa de PEDF/GM-CSF com a capacidade de reduzir o estresse oxidativo e oferece um sistema flexível para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos para desenvolver abordagens de terapia genética ocular.
Introduction
Nosso grupo está focando no desenvolvimento de abordagens regenerativas para tratar a degeneração neuroretinal, ou seja, AMD, por terapia genética não viral baseada em RPE e IPE. O estabelecimento pré-clínico de tais terapias requer modelos in vitro transferíveis aos seres humanos. Assim, o objetivo do estudo aqui apresentado é entregar protocolos para o isolamento, cultura e engenharia genética das células RPE e IPE primárias. A lógica para estabelecer o isolamento das células de Pe de múltiplas espécies é confirmar robustamente a segurança e a eficiência da abordagem e aumentar sua reprodutibilidade e transferênciabilidade. A linha celular humana arpe-19 disponível difere das células primárias (por exemplo, elas são menos pigmentadas) e, portanto, é apenas de valor limitado para análises pré-clínicas1. Além disso, as células não-humanas dos mamíferos podem ser adquiridas por menor custo e em maiores quantidades; o tecido doador humano pode ser obtido de vários Bancos de Olhos, mas a disponibilidade é limitada e cara. Finalmente, novos Medicamentos de Terapia Avançada (ATMP, ou seja, células, tecidos ou Medicamentos de Terapia Genética) precisam ser aplicados em pelo menos duas espécies diferentes antes de serem testados em pacientes e esses estudos in vivo solicitam a preparação de transplantes de células alergênicas.
As doenças neurodegenerativas da retina são a principal causa de cegueira em países industrializados, compreendendo doenças comuns como a DAM, bem como doenças raras como a retinite pigmentosa, na qual a morte das células da retina eventualmente leva à cegueira. As células RPE, fotorreceptor e células gânglios da retina (RGC) podem, em alguns casos, ser, mas atualmente não há terapias curativas disponíveis. Os ATMPs oferecem o potencial de corrigir defeitos genéticos, integrar genes terapêuticos ou substituir células degeneradas, possibilitando assim o desenvolvimento de terapias regenerativas e curativas para doenças como a AMD; 13 terapias genéticas já receberam aprovação de marketing, incluindo uma terapia para tratar a degeneração da retina associada à mutação RPE652,3. Entre os idosos (>60 anos), ~30 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas por nevasculares (nvAMD) ou amd4(aAMD) avascular (aAMD). Ambas as formas são induzidas por gatilhos associados à idade, incluindo dano oxidativo, comprometimento da função e perda de células RPE seguidas de degradação fotorreceptora, entre outras (por exemplo, alelos de risco genético, tabagismo, hipertensão)5,6. No nvAMD, a patogênese é agravada por um desequilíbrio de fatores angiogênicos e anti-angiogênicos em favor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular Angiogênico (VEGF) que induz a neovascularização choroidal (CNV). Até o momento, apenas o nvAMD é tratável por injeções intravitreales mensais de inibidores da proteína VEGF para suprimir o CNV; ainda não há tratamento eficaz disponível para aAMD6,7.
Vários estudos avaliaram terapias baseadas em células para substituir a terapia anti-VEGF: estudos feitos por Binder et al., em que células de RPE recém-colhidas foram transplantadas em pacientes com nAMD8,9,10, mostraram melhora visual moderada, mas apenas um pequeno grupo de pacientes atingiu uma acuidade visual final alta o suficiente para permitir a leitura. Recentemente, um estudo clínico de fase I utilizou um patch RPE derivado de células-tronco embrionárias para tratar a AMD com resultados promissores; ou seja, eficácia, estabilidade e segurança do patch RPE por até 12 meses em 2 dos 10 pacientes tratados11. Além disso, vários grupos publicaram estudos nos quais as manchas de membrana-coroide autólogas de RPE-Bruch foram colhidas da retina periférica e transplantadas para a mácula12,13,14; e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) foram geradas para transplante15. Para a AAMD, anticorpos voltados para a via complementar foram testados em ensaios clínicos6,16 e um estudo de fase I utilizando uma única injeção intravitareal de um vetor viral associado ao Adeno (AAV) codificando o gene para o fator CD59 (AAVCAGsCD59) em pacientes com atrofia geográfica (GA) foi concluída17; o estudo da fase II começou recentemente e tem como objetivo recrutar 132 pacientes com aAMD avançado e avaliar o resultado aos 2 anos após a intervenção18. Finalmente, o grupo de estudo FocuS iniciou um ensaio clínico multicêntrico de fase I/II avaliando a segurança, a resposta de dose e a eficácia de um vetor AAV não replicante recombinante codificando um fator de complemento humano19.
Principalmente, o objetivo de uma terapia regenerativa de AMD é o transplante de células RPE funcionais, que foram danificadas ou perdidas. No entanto, as células IPE e RPE compartilham muitas semelhanças funcionais e genéticas (por exemplo, fagocitose e metabolismo retinol), e como as células IPE são mais viáveis colhidas, elas foram propostas como substitutas de RPE20. Embora tenha sido demonstrado anteriormente que o transplante de células IPE atrasa a degeneração fotorreceptora nos modelosanimais 21,22 e estabiliza a função visual em pacientes com nvAMD em estágio terminal, não foi observada melhora significativa nesses pacientes23. A falta de eficácia pode ser devido ao baixo número de células transplantadas e/ou ao desequilíbrio de fatores neuroprotetores da retina. Uma abordagem alternativa seria transplantar células epiteliais de pigmento transfectados que superexpressem fatores neuroprotetores para restaurar a homeostase da retina, manter células RPE remanescentes e proteger fotorreceptores e RGCs da degeneração. Consequentemente, propomos uma nova terapia que inclua o transplante de células funcionais de RPE ou IPE que passaram por engenharia genética para segregar proteínas neuroprotetoras e anti-angiogênicas, como PEDF, GM-CSF ou fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs). A vantagem de desenvolver e analisar essa abordagem em várias espécies em vez de usar uma linha celular, apenas uma espécie ou tecido humano é: 1) maior reprodutibilidade e transferência dos resultados, como mostram inúmeros estudos realizados em laboratórios independentes e diferentes espécies1,24,25; 2) as células suínas ou bovinas são factíveis descartáveis sem o sacrifício de animais adicionais; 3) a disponibilidade de células especialmente suínas e bovinas permite que grandes séries de testes produzam resultados robustos; 4) o conhecimento para isolar, cultura e modificar geneticamente células dos modelos mais utilizados permite análises in vivo em múltiplas espécies24,25,26 e, portanto, oferece uma melhor relação risco-benefício para os primeiros pacientes tratados; 5) a flexibilidade do protocolo apresentado permite seu uso em diversos modelos e configurações experimentais e para todas as terapias baseadas em células oculares com e sem engenharia genética. Em contraste, técnicas alternativas como linhas celulares ou tecido humano são apenas de transferência limitada e/ou capacidade de descarte limitada. Linhas celulares como o ARPE-19 são ideais para experimentos preliminares; no entanto, a baixa pigmentação e a alta proliferação diferem significativamente das células primárias1. As células RPE e IPE, isoladas do tecido doador humano, oferecem uma fonte preciosa para experimentos in vitro transferíveis; no entanto, obtemos tecido humano de um Banco de Olhos AMERICANO-Americano, o que significa que o tecido tem pelo menos dois dias de idade (após a enucleação) e requer um transporte longo e caro, mas o tecido doador local não está disponível em quantidades suficientes para uma pesquisa produtiva. A vantagem do uso de células primárias é confirmada por múltiplos estudos de outros grupos27,28.
Para o desenvolvimento de uma terapia genética não viral baseada em células usando o sistema transposon SB100X para transfecção de células primárias de RPE e IPE com os genes codificados para PEDF e/ou GM-CSF para tratar nvAMD e aAMD,respectivamente 29,30,31,32, estabelecemos pela primeira vez a transfesionamento de células ARPE-191 . Em seguida, os protocolos de isolamento e transfecção foram estabelecidos em células primárias bovinas e suínas facilmente acessíveis. Agora, foi estabelecido o isolamento e transfecção de células primárias de RPE e IPE de cinco espécies diferentes, desde pequenos (como camundongos) até grandes mamíferos (como gado). Foi confirmado em células primárias de RPE e IPE derivadas de olhos de doadores humanos30. A produção compatível com boas práticas de fabricação (GMP) do ATMP foi validada utilizando tecido doador humano, bem como33. Finalmente, tanto a segurança quanto a eficiência da abordagem foram avaliadas in vivo em três espécies diferentes para as quais o protocolo foi adaptado: rato, rato e coelho. Na configuração clínica, uma biópsia de íris será colhida do paciente e as células do IPE serão isoladas e transfectadas na sala limpa, antes que as células sejam transplantadas subretinarmente de volta para o mesmo paciente. Todo o processo ocorrerá durante uma única sessão cirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. O desenvolvimento da abordagem terapêutica e a avaliação de sua eficiência solicitaram excelentes modelos in vitro e ex vivo para implementar métodos robustos e eficientes de entrega de genes, analisar a eficiência da entrega de genes, produção de proteínas terapêuticas e efeitos neuroprotetores, e produzir transplantes celulares para testar a abordagem in vivo1,24,25,29,30 . Vale ressaltar que a terapia tem a aprovação ética para um ensaio de fase clínica Ib/IIa da comissão ética para pesquisa do Cantão de Genebra (nº 2019-00250) e atualmente os últimos dados pré-clínicos solicitados para autorização pelas autoridades reguladoras suíças são coletados usando o protocolo apresentado. Nesse sentido, os dados pré-clínicos do In Vivo demonstraram uma redução significativa na CNV e excelente segurança24,25,31.
Aqui, descreve-se o isolamento e a cultura das células RPE/IPE de bovinos, suínos, coelhos, ratos e camundongos, e o uso do sistema transposon integrativo SB100X combinado com a eletroporação como um método eficiente de entrega de genes. Particularmente, as células pe primárias foram transfectadas para superexpressar PEDF e GM-CSF. A coleta desses protocolos permite que os estudos in vitro e in vivo sejam realizados em todas as fases pré-clínicas do desenvolvimento do ATMP. Além disso, a configuração tem potencial para ser adaptada a outros genes de interesse e doenças.
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Protocol
Os protocolos em que os animais estavam envolvidos foram realizados por pessoal certificado e após autorização do Cantonal Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale de Genebra, Suíça, e de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmica e Visão (aprovação sem aprovação). GE/94/17). Ratos adultos e saudáveis da Noruega, camundongos C57BL/6 e coelhos brancos neozelandeses foram eutanizados por uma overdose de pentobarbital (150 mg/kg) diluídos em 0,9% NaCl injetado intraperitoneal e os olhos foram enucleados imediatamente após o sacrifício. Olhos suínos e bovinos foram obtidos de um matadouro local dentro de 6 horas após o sacrifício e foram transportados para o laboratório no gelo.
1. Antes da preparação
- Prepare o meio completo (DMEM/Ham's F12 complementado com soro bovino fetal de 10% (FBS), penicilina U/mL / 80 μg/mL estreptomicina e 2,5 μg/mL de anfotericina B). Aqueça o médio, 1x PBS e 0,25% de trippsina (se necessário) em um banho de água de 37 °C.
- Coloque uma cortina estéril no capô para preparar um local de trabalho asséptico. Introduza todos os instrumentos e materiais estéreis necessários dentro do capô.
NOTA: Apenas a enucleação dos olhos e a limpeza do tecido muscular e da pele restantes são os procedimentos realizados fora do capô, o restante das etapas deve ser realizada dentro do capô.
2. Isolamento de células pe de rato/rato
- Use tesouras curvas e fórceps colibri para enuclear os olhos após eutanásia do animal. Limpe o tecido muscular e a pele restantes dos olhos usando tesouras e fórceps (não estéreis).
NOTA: O tamanho da tesoura e fórceps utilizados para a enucleação e limpeza dos olhos depende da espécie (por exemplo, para ratos e camundongos os instrumentos serão menores do que os utilizados para suínos e bovinos) (ver Figura S1).- Colete os olhos em um tubo de 50 mL cheio de PBS não estérei e transfira o tubo para o capô de fluxo laminar. Desinfete os olhos submergindo por 2 min em solução à base de iodo, em seguida, transfira-os para uma placa de Petri cheia de PBS estéril.
- Abertura da lâmpada
- Depois de transferir os olhos para uma placa de Petri estéril, segure um firmemente perto do nervo óptico com colibri ou fórceps pontiagudos. Faça um buraco perto do limite da íris (entre pars plana e ora serrata) com uma agulha de 18 G. Insira uma tesoura pequena no orifício e corte ao redor da íris. Retire o segmento anterior (córnea, lente e íris) e coloque-o em uma placa de Petri. Deixe a lâmpada com o vítreo até que as células RPE estejam isoladas.
- Isolamento das células IPE
- Remova a lente e com fórceps finos puxe delicadamente a íris contendo as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri, lave com PBS estéril e deixe-a na PBS até que mais íris estejam preparadas.
- Repita os passos 2.2.1 a 2.3.1 para que todos os olhos estejam preparados naquele dia.
- Adicione 50 μL de 0,25% de trippsina por íris e incubar por 10 min a 37 °C. Remova a trippsina, adicione 150 μL de meio completo por íris e raspe o IPE delicadamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano; usar fórceps finos para imobilizar o tecido. Pegue a suspensão do celular e coloque em um tubo de 1,5 mL. Use 10 μL da suspensão celular diluída 1:3 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer34,35.
- Se não for transfeinado imediatamente, semente 200.000 células/poço em uma placa de 24 poços (100.000 células/cm2) em 1 mL de meio completo (10% FBS) (para semeadura ver Tabela 1). Coloque a placa em uma incubadora e culta a 37 °C, 5% DE CO2.
NOTA: Pode ser necessário reunir vários olhos para ter células suficientes para semeadura.
- Isolamento de células RPE
- Remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com fórceps finos. Evite danificar o pigmento da retina epitélio.
- Corte o segmento ao meio com um bisturi #10 para ter o globo completamente aberto e lavar com PBS estéril.
- Adicione 50 μL de 0,25% de trippsina por olho e incubar por 10 min a 37 °C. Remova a trippsina e adicione 150 μL de meio completo por globo e raspe delicadamente as células RPE com um bisturi redondo; usar fórceps finos para imobilizar o tecido. Pegue a suspensão da célula e coloque-a em um tubo de 1,5 mL. Tome 10 μL da suspensão da célula; diluir 1:4 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.
- Veja o passo 2.3.4.
NOTA: Pode ser necessário reunir vários olhos para ter células suficientes para semeadura.
3. Isolamento de células pe coelho
- Realizar limpeza e desinfecção conforme descrito nas etapas 2.1 a 2.1.1.
- Coloque um olho em uma compressa de gaze estéril e segure-a firmemente perto do nervo óptico. Abra o olho com o bisturi #11 e a tesoura cerca de 2 mm sob o limbus. Retire o segmento anterior (córnea, lente e íris) e coloque-o em uma placa de Petri. Deixe a lâmpada com o vítreo até que as células RPE estejam isoladas.
- Isolamento das células IPE
- Realizar a etapa 2.3.1. Remova o corpo ciliar da íris cortando com um bisturi #10.
- Após a preparação de 2 íris, incubar com 1 mL de 0,25 % trypsin a 37 °C por 10 min; durante este tempo, as células RPE podem ser isoladas (ver passo 3.4). Remova a trippsina e adicione 1 mL de meio completo à íris e isole as células coçando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano. Resuspente as células cuidadosamente por pipetação e transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:3 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.
- Veja o passo 2.3.4.
- Isolamento de células RPE
- Faça a etapa 2.4.1.
- Coloque uma gaze estéril em uma placa de 12 poços e coloque a lâmpada sobre a gaze.
- Lave com PBS e realize a etapa 2.4.3.
NOTA: Use uma pipeta Pasteur polida com fogo curva. - Centrifugar as células 10 min a 120 x g.
- Veja o passo 2.3.4.
4. Isolamento de células de PE suínas
- Realizar a limpeza conforme descrito na etapa 2.1. Lave com PBS e desinfete os olhos submergindo por 2 min em solução à base de iodo, enxágue com PBS. Continue com o passo 3.2.
- Isolamento das células IPE
- Realizar a etapa 3.3.1. Após a preparação de 2 íris, adicione 1 mL de meio completo e isole as células coçando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:4 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.
- Veja o passo 2.3.4.
- Isolamento de células RPE
- Faça a etapa 2.4.1. Coloque a lâmpada em uma placa de Petri e lave com PBS. Encha a lâmpada com meio completo de 1 mL.
- Usando uma pipeta Pasteur polida com fogo curva, remova cuidadosamente as células RPE. Certifique-se de raspar de baixo para cima para evitar escorregar para baixo do complexo de membrana do choroid-Bruch. Colete a suspensão da célula dentro da lâmpada usando uma pipeta de 1.000 μL e transfira para um tubo de 1,5 mL para ressuspensão. Tome 10 μL da suspensão celular e diluir 1:8 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.
- Veja o passo 2.3.4.
5. Isolamento de células pe bovinas
- Realizar a limpeza conforme descrito na etapa 2.1. Lave com PBS e desinfete os olhos submergindo por 2 min em solução à base de iodo, enxágue com PBS. Continue com o passo 3.2.
- Isolamento das células IPE
- Realizar a etapa 3.3.1. Após a preparação de duas íris, incubar com 2 mL de 0,25% de trippsina a 37 °C por 10 min. Durante esse tempo, as células RPE podem ser isoladas (ver passo 5.3).
- Remova a trippsina e adicione 2 mL de meio completo à íris e isole as células coçando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL. Centrifugar as células 10 min a 120 x g. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:4 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.
- Se não for transfeinado imediatamente, semente 320.000 células/bem em uma placa de 6 poços em 3 mL de meio completo (10% FBS) (para semeadura ver Tabela 1). Coloque a placa em uma incubadora e culta a 37 °C, 5% DE CO2.
- Isolamento de células RPE
- Siga o passo 2.4.1. Coloque a lâmpada em uma placa de Petri e lave com PBS. Após a preparação de 2 olhos encha a lâmpada cerca de 3/4 com trippsina e incubar por 25 min a 37 °C com a tampa da placa de Petri em cima do bulbi.
- Retire o trypsin e adicione 1 mL de meio completo. Realizar a etapa 4.3.2. Centrifugar as células 10 min a 120 x g.
- Veja o passo 5.2.3.
6. Cultivo - mudança média
- Cultura as células no F12 do DMEM/Ham, complementadas com 10% FBS, penicilina U/mL / 80 μg/mL estreptomicina, e 2,5 μg/mL de anfotericina B, a 37°C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada. Depois de 3-4 dias pipeta para cima e para baixo para coletar células não aderentes e colocar metade do volume em outro poço. Encha até 1 mL com meio completo.
NOTA: Isso permite ter uma superfície grande o suficiente para todas as células isoladas para anexar e maximizar a saída. - Após mais 3-4 dias, repita a coleção celular, mas desta vez unindo as células não aderentes de dois poços em um poço (por exemplo, A1+B1 em C1). Adicione meio a todos os poços. Observe as células e troque o meio 2 vezes por semana (para placas de 6 e 24 poços, use 3 e 1 mL/poço, respectivamente). Quando as células atingirem a confluência, mude para meio completo com 1% de FBS ou use as células para experimentos (por exemplo, transfecção).
NOTA: As células RPE e IPE são confluentes após 3-4 e 4-5 semanas após o isolamento, respectivamente. A pureza da cultura celular foi corroborada verificando a morfologia celular (células pigmentadas) e marcadores específicos como descrito por Johnen e colegas36.
7. Eletroporação de células pe primárias
- Realize eletroporação conforme descrito antesde 1,37.
- Dependendo do número de células transfeinadas usar placas de 6, 24 ou 48 poços (ver Tabela 2) para semear as células em médio sem antibióticos ou antimicópticos. Para as 2 semanas seguintes adicione gotas com penicilina média (80 U/mL), estreptomicina (80 μg/mL) e anfotericina B (2,5 μg/mL) duas vezes por semana. Troque o meio completamente 2 semanas após a transfecção.
- Para determinar o crescimento celular, a eficiência da transfecção e a secreção de proteínas, monitore as células semanalmente por microscopia e analise a cultura celular supernacida pela mancha ocidental. Antes do término da cultura, pegue um supernacante de cultura celular de 24 horas para quantificar a secreção de proteínas pela ELISA, conte as células, meça fluorescência por citometria baseada em imagem (no caso de células transfectadas de Vênus)seguindo as instruções dos fabricantes (ver Tabela de Materiais),e colete a pelota celular para análise de expressão genética baseada em RT-qPCR.
NOTA: Esses métodos não estão incluídos no presente artigo, pois não se trata de explicar detalhadamente a análise das células, mas sim seu isolamento. A densidade de semeadura celular é a mesma para todas as espécies (100.000 células/cm2), mas como o número de células isoladas varia, foram utilizadas diferentes placas. Além disso, para ratos, ratos e coelho pode ser necessário juntar 2-3 olhos para ter células suficientes para semeadura.
| Espécie | Tratamento de tripca | Células N° IPE | Células N° RPE | Placa para semeadura (100.000 células/cm2) |
| Rato/rato | Sim | ~50.000 | ~150.000 | Placas de 24 poços |
| Coelho | Sim | ~350.000 | ~2.500.000 | Placas de 24 poços |
| Porco | Não | ~1.000.000 | ~3.000.000 | Placas de 24 poços |
| Bovina | Sim | ~1.700.000 | ~5.000.000 | Placas de 6 poços |
Tabela 1: Número de células pe primárias isoladas de olhos de diferentes espécies.
| Nome | Área | Meio de volume | Tripsina | Meio de volume para parar a ação de trypsin | Densidade de semeadura |
| Placa de 6 poços | 9,6 cm² | 3,0 mL | 0,5 mL | 1,0 mL | 3x105 |
| Placa de 24 poços | 2,0 cm² | 1,0 mL | 0,2 mL | 0,8 mL | 5x104 |
| Placa de 48 poços | 1,1 cm² | 0,5 mL | 0,1 mL | 0,4 mL | 0.5-1x104 |
Tabela 2: Volumes de cultura celular e densidades de semeadura.
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Representative Results
Isolamento de PE de diferentes espécies de mamíferos
Utilizando os protocolos acima mencionados, as células IPE e RPE foram isoladas com sucesso e cultivadas a partir de cinco espécies diferentes. O número de células obtidas a partir de cada procedimento depende da espécie e tamanho do olho (Tabela 1). Como mostrado na Figura 1,as células mostram morfologia e pigmentação típica das células pe (exceto para as células de coelho mostradas, derivadas de coelhos albinos da Nova Zelândia White (NZW). Aos 21 dias após o isolamento, as células são confluentes, prontas para serem usadas para outros experimentos (por exemplo, transfecções). Deve-se notar que culturas de todas as espécies são monitoradas e controladas mais até 2 anos confirmando morfologia normal e expressão transgênica estável (dados não mostrados).
A desdiferente, o estresse celular e as alterações na expressão genética foram excluídas pelo RT-qPCR e pela imunohistoquímica. Um painel de genes (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) analisados em células RPE humanas transfeinadas (células ARPE-19) confirmou o padrão normal de expressão RPE1; que poderia ser confirmado em células IPE bovina primárias por imunofluorescência para RPE65 (Figura 2). Além disso, Johnen e colegas corroboraram a imunostaining ZO-1 nas células IPE e RPE primárias36.
Figura 1: Micrografias de células de Pe de vários mamíferos aos 21 dias após o isolamento. Células IPE e RPE de rato, coelho (coelho albino NZW), porco e bovino são mostradas no dia 21 pós-isolamento. Para todas as espécies, as culturas mostradas são confluentes. Note que as células pe do coelho não são pigmentadas (ampliação original, 50x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imunostaining RPE65 de células IPE primárias. RPE65 (verde) de células de IPE bovinas transfeinadas com o plasmídeo transposon pFAR4-CMV-PEDF usando um número celular inicial de 1 x 104 células em comparação com células de controle não transfectadas (ampliação original, 200x). Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Viabilidade de RPE primário transfectado
A viabilidade celular é mostrada na Figura 3. Para excluir uma toxicidade potencial do tampão usado para o processo de eletroporação, as células RPE primárias pré-cultivadas foram suspensas em tampão de eletroporação de um kit comercialmente disponível, ou em um tampão de nutrientes desenvolvido por uma empresa farmacêutica (composição confidencial) e eletroporada (E) (sem adição de plasmídeo) conforme descrito na etapa 7 do protocolo. A viabilidade celular foi estudada 3 ± 1 dia após a transfecção utilizando um kit de ensaio de citotoxicidade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante. Os ensaios sempre foram realizados com um controle sem potência (Co-P) (não eletroporado). Não foi observado impacto na viabilidade celular para nenhum dos buffers testados(Figura 3).
Figura 3: Viabilidade das células RPE primárias suspensas em diferentes buffers. 1 x 104 células foram suspensas em tampão de eletroporação de um kit comercialmente disponível ou em um tampão de nutrientes. A viabilidade celular foi medida 3 ± 1 dia após a transfecção usando um kit de ensaio de citotoxicidade disponível comercialmente. Não foram observadas diferenças na viabilidade entre os diferentes buffers; os dados são representados como média ± SD (n=2 doadores, 3 réplicas/doador). E: células eletroporadas, Co-P: controle sem energia. AU: unidades arbitrárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Transfecções de células pe pré-cultivadas com o gene repórter de Vênus
50.000-100.000 células pe pré-cultivadas de diferentes espécies foram transfectadas com a proteína de Vênus fluorescente amarela (pT2-CAGGS-Venus) usando o sistema hiperativo de entrega de genes transposon SB100X. Micrografos mostrados na Figura 4 corroboram que as células foram transfeccionadas com sucesso (células fluorescentes aos 21 dias após a transfecção). A Figura 5 mostra a quantificação da eficiência de transfecção em células de RPE suínos pré-cultivados (n=6 doadores, 50.000 células/transfecção) transfeccionadas com Vênus (pT2-CAGGS-Venus). A porcentagem de células fluorescentes e MFI foi medida por meio de citometria baseada em imagem seguindo as instruções do fabricante no dia do término da cultura celular (30 ± 5 dias após a transfecção). O percentual médio de células fluorescentes foi de 50 ± 30%, mas variável variando de 95 ± 6% (doador 2) a 28 ± 1% (doador 4) (Figura 5). Em todos os experimentos, as células ARPE-19 transfectadas foram utilizadas como controle positivo. Além disso, a eficiência da transfecção sempre foi comparada aos controles negativos: Co-P (controle sem potência [não eletroporado]) e Co+P (controle com potência [eletroporado, mas sem adição de plasmídeos]). O experimento também foi realizado com células IPE (dados não mostrados).
Figura 4: Micrografias de células Pe pré-cultivadas transfectadas com pT2-CAGGS-Venus. As células pe de Vênus-transfection(A),bovina (B)e suína(C)são mostradas aos 21 dias após a transfecção. Como controle positivo, 50.000 células ARPE-19 foram transfeinadas com Vênus (D). Micrografia esquerda: campo brilhante, micrografo direito: filtro GFP (480 nm) (ampliação original, 50x). Foram incluídas transfecções em controles triplicados e negativos: Co-P (controle sem energia [não eletroporado]) e Co+P (controle com potência [eletroporado, mas sem adição de plasmídeos]) (não mostrado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Eficiência de transfecção em células RPE suínas transfeccionadas com o gene repórter venus. (A) 50.000 células RPE suína primária foram transfecidas com pT2-CAGGS-Venus, a eficiência média global de transfecção foi de 50 ± 30% e a média de 2712 ± 197 no dia do término das culturas celulares (30±5 dias após a transfecção). O gráfico mostra a média ± SD (n=3 replica) de 6 animais diferentes. (B) O percentual de células Venus+ ARPE-19 utilizadas como controle positivo, foi de 98±6% e ficou estável durante os 138 dias em que as células foram seguidas. A intensidade média de fluorescência (IFA) foi de 5.785 ± 1.255. O gráfico mostra a média ± SD (n=3 replica) para cada dia. Co-P (controle sem energia [não eletroporado]) e Co+P (controle com potência [eletroporado, mas sem adição de plasmídeos]) foram incluídos em todos os experimentos de transfecção (não mostrados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Transfecções de células recém-pe com gene repórter Venus
10.000-50.000 células pe recém-isoladas de coelhos foram transfectadas com a proteína fluorescente amarela Vênus (pFAR4-CMV-Vênus), e as culturas celulares foram monitoradas por microscopia. Na Figura 6 as células fluorescentes podem ser observadas no dia 21 pós-transfecção. O percentual de células fluorescentes medida por citometria baseada em imagem foi de 53 ± 29% para células IPE e 28± 23% para células RPE (dados não mostrados).
Figura 6: Micrografos de células pe recém-transfectadas isoladas de coelho. 50.000 células IPE e RPE de coelho foram transfectadas com pFAR4-CMV-Venus. A fluorescência é mostrada no dia 21 pós-transfecção. Micrografia esquerda: campo brilhante, micrografo direito: filtro GFP (480 nm). Em todos os casos, as transfesões foram feitas em triplicado (ampliação original, 50x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Transfecções de células pe com os genes terapêuticos PEDF e GM-CSF
50.000 células pe foram transfeinadas com PEDF e a secreção proteica foi monitorada pela WB (Figura 7). O sinal de WB para células transfeinadas foi maior em comparação com as células não transfeinadas para todas as espécies e dias estudados; não foi observada diminuição da secreção proteica neste período.
Figura 7: Análise de WB da secreção pedf de células pe transfectadas. A análise de FC de supernacantes de suínos (pré-cultivados) (A)e bovinos (recém)(B) PEDF -células pedf transfectadas de PEDFmostram uma maior secreção de PEDF em comparação com o controle (células não transfectadas) e estáveis ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1: Instrumentos utilizados para isolamento de PE dependendo da espécie. (A) Instrumentos não estéreis utilizados para a enucleação dos olhos e limpeza do tecido muscular e pele restantes. O conjunto 1 é usado para ratos, ratos e coelhos, e o conjunto 2 é usado para olhos de porco e gado. (B) Instrumentos estéreis utilizados para isolamento de PE. Observe o tamanho diferente de tesouras e fórceps usados dependendo do tamanho dos olhos. Pipetas pasteur com polimento redondo e plano são usadas para a raspagem de RPE e IPE, respectivamente. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Ter métodos padronizados para isolar e cultivar células de PE é fundamental no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças degenerativas da retina. Com os protocolos aqui apresentados, as células pe podem ser isoladas com sucesso de diferentes espécies e cultivadas por longos períodos (até agora, a cultura mais longa foi mantida por 2 anos1,38); tipicamente células pe morfologia, pigmentação e função foi observada(Figura 1, Figura 2). Observe que particularmente para culturas puras de RPE, é importante extrair completamente a retina para evitar contaminação com células neurais da retina; para células IPE, o corpo ciliar deve ser removido da íris como explicado no protocolo. A confluência das células é alcançada em um tempo relativamente curto (~21 dias), após o qual as células estão prontas para transfecção com genes terapêuticos ou para uso em outros experimentos (por exemplo, exposição a agentes tóxicos, proteínas, etc.). Além disso, os protocolos não são apenas cruciais para testes pré-clínicos in vitro e in vivo, mas também importantes para a aplicação humana, ou seja, a validação de transplantes de células de PE transfeinados; particularmente para o tratamento da AMD como em desenvolvimento pelo nosso grupo, onde as células IPE serão isoladas de uma biópsia de íris, imediatamente transfeminadas e transplantadas subretinarmente para o mesmo paciente dentro de uma sessão cirúrgica. O isolamento e transplante subretinal de células autólogas do IPE foi estabelecido em coelhos39 e pacientes23. Uma vez que o transplante de células autólogas do IPE foi bem sucedido, mas não suficiente para restaurar a visão, a transfecção das células para superexpressar fatores neuroprotetores, como PEDF e GM-CSF, foi adicionada à abordagem e estabelecida em mais três espécies (camundongo, rato e gado). Com os métodos aqui descritos para o isolamento, cultura e modificação genética das células de PE, os respectivos transplantes celulares podem agora ser preparados de várias espécies para testar a toxicidade e eficiência da abordagem in vivo.
Mostrou-se que, utilizando o sistema hiperativo SB100X transposon, as células PE de várias origens podem ser modificadas eficientemente para sobreexpressar PEDF (Figura 7); resultados similares utilizando IPE e RPE24 e células RPE humanas29,30 foram publicados. A transfecção com PEDF foi proposta para tratar nvAMD pela inibição da neovascularização mediada pelo VEGF e proteção de células RPE e neurônios da retina a partir de glutamato e estresse oxidativo, bem como isquemia40,41. A corroboração da secreção de proteínas de longo prazo estável(Figura 7) confirmou as células de PE como um "sistema de entrega de medicamentos" biológico confiável. Nesse sentido, a eficiência de transfecção estudada com o gene repórter Venus (Figura 4, Figura 5, Figura 6) confirmou altas eficiências de transfecção de ~20-100% (espécies e doadores dependentes) conforme relatado em Johnen et al. 1.
Deve-se notar que, embora o tamanho dos plasmídeos utilizados tenha sido variável, desde miniplasmídeos pFAR (~3.000 bp) até plasmídeos com espinha dorsal pT2 (~5.000 bp)30,as eficiências de transfecção foram comparativamente altas. As diferenças observadas na eficiência da transfecção provavelmente se devem à variabilidade no tempo da enucleação ao isolamento celular e na preservação dos tecidos, mas não alteraram a morfologia celular nem o momento em que as células atingem a confluência (~21 dias após o isolamento), ou o tempo que as células foram seguidas após a transfecção. Em geral, uma consideração importante para alcançar uma transfecção bem sucedida é que a fonte das células de Pe deve ser o mais fresca possível; isso é particularmente importante para transfecções com células pe recém-isoladas.
Comparando-se com transplantes de folhas de células, a terapia que nosso grupo está desenvolvendo (células transfeinadas transplantadas subretinarmente como suspensão celular) é menos invasiva, uma vez que a primeira requer grandes retinotomias com os riscos associados de vitreoretinopatia proliferativa e fibrose subretinal42. Além disso, nos enxertos de folha para AMD molhado a área da CNV é removida juntamente com o coroide adjacente e, portanto, a sobrevivência do enxerto pode ser comprometida43. Por fim, a ideia de usar um patch celular não é compatível com o procedimento proposto, onde o isolamento, modificação e transplante das células é feito durante uma única sessão cirúrgica. Por outro lado, questões inerentes às células de Pe transplantadas como suspensões celulares são morte celular potencial durante o parto, falta de adesão e variância na distribuição celular; mas essas desvantagens poderiam ser superadas pelas abordagens de engenharia de tecidos42; além disso, a sobrevivência celular poderia ser melhorada pelo uso de agentes pró-sobrevivência44,45,46,47. Acreditamos que o transplante de células de Pe primárias superexpressando fatores neuroprotetores como PEDF e GM-CSF como suspensão celular é uma abordagem promissora para tratar a DM, e para desenvolver essa terapia os protocolos aqui apresentados são cruciais, pois permitem a padronização do isolamento, cultura e análise das células de Pe primárias.
Em resumo, o protocolo oferece um sistema de modelo avançado para o desenvolvimento e testes pré-clínicos in vitro e in vivo de terapias medicinais avançadas oculares em cinco espécies diferentes, robusto o suficiente para compensar as variâncias individuais na qualidade celular das diferentes fontes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Um agradecimento merece a Gregg Sealy e Alain Conti por sua excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Comissão Europeia no contexto do Sétimo Programa-Quadro, da Fundação Nacional de Ciências Suíça e da Fundação Schmieder-Bohrisch. Z.I. recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] e B.M.W. de uma Bolsa de Pesquisa Fulbright e bolsa de excelência do governo suíço.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
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