Summary
ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。
Abstract
加齢黄斑変性症(AMD)は、患者>60年の失明の最も頻繁な原因であり、世界中で約3000万人に影響を及ぼします。AMDは環境や遺伝的要因の影響を受ける多因子性疾患であり、網膜色素上皮(RPE)細胞の変性に続いて感光体分解による網膜の機能障害を引き起こします。理想的な治療法には、RPE細胞死および感光体変性を防ぐために神経保護因子を分泌する健康なRPE細胞の移植が含まれる。機能的および遺伝的類似性と、より侵襲性の低い生検の可能性のために、虹彩色素上皮(IPE)細胞の移植が退化したRPEの代用として提案された。低い数の網膜移植細胞による神経保護因子の分泌は、睡眠美容(SB100X)、色素上皮由来因子(PEDF)および/または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をコードする遺伝子を用いたトランスポゾン媒介性トランスフェクションによって達成することができる。げっ歯類、豚、牛など様々な種のRPE細胞とIPE細胞の分離、培養、SB100X媒介トランスフェクションを確立しました。地球儀は植え付けされ、角膜とレンズは虹彩と眼炎にアクセスするために除去される。カスタムメイドのヘラを使用して、IPE細胞は単離された虹彩から除去される。RPE細胞を収穫するには、種に応じてトリプシンインキュベーションが必要になることがあります。次いで、RPEカスタマイズされたヘラを使用して、細胞を培地に懸濁させる。播種後、細胞を週2回監視し、合流に達した後、エレクトロポレーションによってトランスフェクトする。遺伝子の一体化、発現、タンパク質分泌、および機能は、qPCR、WB、ELISA、免疫蛍光、および機能アッセイにより確認された。種に応じて、30,000-5百万(RPE)および10,000-150万(IPE)細胞を1眼で単離することができます。遺伝子組み換え細胞は、酸化ストレスを軽減する能力を持つ重要なPEDF/GM-CSF過剰発現を示し、遺伝子治療アプローチを開発するためにヒトに移入可能なex vivo分析および生体内研究のための柔軟なシステムを提供する。
Introduction
我々のグループは、RPEおよびIPEベースの非ウイルス遺伝子治療による神経レチン系変性、すなわちAMDを治療するための再生アプローチの開発に焦点を当てている。このような治療法の前臨床確立は、ヒトに移管可能な 体外モデルで 必要とされる。したがって、ここで示す研究の目的は、一次RPEおよびIPE細胞の分離、培養、および遺伝子工学のためのプロトコルを提供することです。複数の種からPE細胞を単離する根拠は、アプローチの安全性と効率を強固に確認し、その再現性と移動性を高めることです。利用可能なヒトRPE細胞株ARPE-19は、一次細胞とは異なり(例えば、それらは、あまり色素沈着性)であり、したがって、臨床前の分析のための限られた値の1。さらに、非ヒト哺乳類細胞は、より少ないコストで、より大きな量で購入することができます。ヒトドナー組織は様々なアイバンクから得ることができますが、入手可能性は限られており、高価です。最後に、新しい先端治療薬品(ATMP、すなわち、細胞、組織、または遺伝子治療薬品)は、患者で試験される前に少なくとも2つの異なる種で適用する必要があり、これらの インビボ 研究は、同種細胞移植の準備を要求する。
網膜神経変性疾患は、AMDのような一般的な疾患だけでなく、網膜細胞死が最終的に失明につながる網膜色素変性症のような稀な疾患を含む先進国の失明の主な原因である。RPE細胞、光受容体、およびRetinal神経節細胞(RGC)の損傷は、場合によっては遅くなる可能性がありますが、現在のところ治療法はありません。ATMPは、遺伝子欠損を修正したり、治療遺伝子を統合したり、脱退細胞を置き換えたりする可能性を提供し、AMDなどの疾患に対する再生および治癒療法の開発を可能にする。13遺伝子治療は、RPE65変異関連のレチン性変性2、3を治療するための治療法を含むマーケティング承認を既に得ている。高齢者(>60歳)の間で、世界中で約3,000万人が新血管(nvAMD)または血管(aAMD)AMD4の影響を受けます。両方の形態は、酸化的損傷、機能障害およびRPE細胞の喪失を含む年齢関連の誘発によって誘発され、その後に光受容体分解が続き、とりわけ(例えば遺伝的リスク対立遺伝子、喫煙、高血圧)5、6。nvAMDでは、病因は脈絡膜新生血管形成を誘導する血管形成血管内皮成長因子(VEGF)を支持する血管新生および抗血管新生因子の不均衡によって悪化する。現在までに、NVAMDだけが、CNVを抑制するためにVEGFタンパク質の阻害剤の毎月のビトリアル内注射によって治療可能である。aAMD6,7に対する有効な治療法はまだありません。
いくつかの研究は、抗VEGF療法に代わる細胞ベースの治療法を評価した:バインダーらによって行われた研究は、採取したばかりの自家RPE細胞がnAMD8、9、10の患者に移植されたが、適度な視力改善を示したが、患者の小さなグループだけが読み取りを可能にするのに十分な高い最終的な視力に達した。最近、第I相臨床試験では、胚性幹細胞由来RPEパッチを使用してAMDを有望な結果で治療しました。すなわち、11を治療した10人の患者のうち2人で最大12ヶ月間のRPEパッチの有効性、安定性、安全性。さらに、いくつかのグループは、自家RPE-ブルッフの膜-脈絡膜パッチが末梢性のレチナから収穫され、黄斑12、13、14に移植された研究を発表している。そして、移植用に誘導多能性幹細胞(iPSC)由来のRPEパッチが生成された。aAMDの場合、補体経路を標的とする抗体は、臨床試験6、16および地理的萎縮(GA)を有する患者における因子CD59(AAVCAGsCD59)の遺伝子をコードするアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターの単一のウイルス内注射を用いた第I相試験で試験された。フェーズIIの研究は最近始まり、高度なaAMDを有する132人の患者を募集し、介入後2年間で結果を評価することを目指しています18.最後に、FocuS研究グループは、ヒト補体因子19をコードする組換え非複製AAVベクターの安全性、用量応答および有効性を評価する第I/II多施設臨床試験を開始した。
主に、再生AMD療法の目的は、損傷または失われた機能的RPE細胞の移植である。しかし、IPE細胞とRPE細胞は多くの機能的および遺伝的類似性(例えば、貪食およびレチノール代謝)を共有し、かつIPE細胞がより実現可能に収穫されるため、RPE代替20として提案されている。IPE細胞移植が動物モデル21,22における感光体変性を遅らせるということは以前に実証されているが、末期nvAMD患者では視覚機能を安定化させるが、これらの患者23では有意な改善は認められなかった。有効性の欠如は、移植細胞の数が少ないこと、および/または神経保護性の疾患の不均衡に起因する可能性があります。別のアプローチは、網膜ホメオスタシスを回復させ、残りのRPE細胞を維持し、変性から光受容体とRGCを保護するために神経保護因子を過剰発現するトランスフェクト色素上皮細胞を移植することです。その結果、PEDF、GM-CSF、インスリン様成長因子(IMF)などの神経保護タンパク質および抗血管新生タンパク質を分泌するために遺伝子工学を受けた機能RPEまたはIPE細胞の移植を含む新しい治療法を提案する。細胞株を使用する代わりに、いくつかの種、1つの種、またはヒト組織でこのアプローチを開発し分析する利点は:1)独立した実験室および異なる種1、24、25で実現された多数の研究によって示されるように結果の再現性および伝達可能性の増加;2)豚やウシの細胞は、追加の動物の犠牲なしで実現可能に使い捨て;3)特に豚やウシの細胞の可用性は、堅牢な結果を生成するために大規模なテストシリーズを可能にします。4)大部分が使用されるモデルから細胞を単離、培養、遺伝的に改変する知識は、複数の種24、25、26で生体内解析を可能にし、最初に治療された患者に対して改善されたリスクベネフィット比を提供する。5)提示されたプロトコルの柔軟性は、様々なモデルや実験的なセットアップで、および遺伝子工学の有無にかかわらずすべての眼球ベースの治療法でその使用を可能にする。対照的に、細胞株またはヒト組織としての代替技術は、限られた転写性および/または限定的な解位性のみのものである。ARPE-19のような細胞株は予備実験に理想的である;しかし、低色素沈着と高増殖は、初等細胞1とは大きく異なる。ヒトドナー組織から分離されたRPEおよびIPE細胞は、転写可能なインビトロ実験のための貴重な供給源を提供する。しかし、米国系アメリカ人の眼バンクからヒト組織を取得すると、組織は少なくとも2日齢(核分裂後)であり、長く高価な輸送が必要ですが、局所ドナー組織は生産的な研究のために十分な量では利用できません。原細胞の使用の利点は、他のグループ27,28からの複数の研究によって確認される。
PEDFおよび/またはGM-CSFをコードする遺伝子を用いて一次RPEおよび/またはGM-CSFをコードする遺伝子を用いたSB100Xトランスポゾンシステムを用いた細胞ベースの非ウイルス遺伝子治療の開発のために、それぞれ29、30、31、32、ARPE-19細胞のトランスフェクションを確立しました。.次に、容易にアクセス可能なウシおよびブタの原発細胞に単離およびトランスフェクションプロトコルが確立された。現在、小さな(マウスとして)から大型哺乳類(牛)まで、5種の異なる種から一次RPE細胞とIPE細胞の単離とトランスフェクションが確立されました。ヒトドナー眼30に由来する一次RPEおよびIPE細胞で確認した。ATMPの良い製造慣行(GMP)準拠の生産は、人間のドナー組織を使用して検証されました33.最後に、アプローチの安全性と効率の両方を、プロトコルが適応された3つの異なる種(マウス、ラット、ウサギ)でin vivoで評価しました。臨床セットアップでは、虹彩生検が患者から採取され、IPE細胞はクリーンルームで単離され、トランスフェクションされ、細胞が同じ患者に下無しに移植される。プロセス全体は、約60分間続く単一の外科セッション中に行われます。治療アプローチの開発とその効率の評価は、堅牢で効率的な遺伝子送達方法を実装し、遺伝子送達の効率を分析し、治療タンパク質産生および神経保護効果を分析し、生体内1、24、25、29、30のアプローチをテストするための細胞移植を行うために、優れたin vitroおよびex vivoモデルを要求しました。.この療法は、ジュネーブ州(2019-00250)の研究のための倫理委員会からの臨床段階Ib/IIa試験の倫理的承認を有し、現在、スイスの規制当局によって承認のために要求された最後の前臨床データが提示されたプロトコルを使用して収集されることを言及する価値があります。この点に関して、生体内データの前臨床はCNVの有意な減少および優秀な安全24、25、31を示した。
ここでは、ウシ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスからのRPE/IPE細胞の単離および培養、および効率的な遺伝子送達方法としてエレクトロポレーションと組み合わせた統合型 SB100X トランスポゾンシステムの使用について説明する。特に、原発PE細胞は、過剰発現PEDFおよびGM-CSFにトランスフェクションした。これらのプロトコルのコレクションはATMPの開発のすべての前臨床段階で実施される in vitro および in vivo の研究を可能にする。さらに、セットアップは、関心や疾患の他の遺伝子に適応する可能性を有する。
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Protocol
動物が関与したプロトコルは、認定された人員によって行われ、カントナル・デ・ラ・セクリテ、ド・ランプロイ・エ・ド・ラ・サンテ(DSES)、スイスのジュネーブのドメーヌ・ド・ラルエクスペリメンテーション動物、およびオフタルム・ビジョン研究における動物の使用に関するARVO声明(承認なし)によって承認された。GE/94/17)。成人の健康なブラウンノルウェーラット、C57BL/6マウス、ニュージーランドの白いウサギは、0.9%NaClに希釈したペントバルビタール(150mg/kg)の過剰摂取によって安楽死させ、犠牲の直後に目を欠核化した。ブタとウシの目は、犠牲の6時間以内に地元の食肉処理場から得られ、氷の上の実験室に運ばれました。
1. 準備前
- 完全な培地(DMEM/ハムのF12は10%胎児ウシ血清(FBS)、80 U/mLペニシリン/80 μg/mLストレプトマイシン、2.5 μg/mLアンホテリシンBを補充します。37°Cの水浴で、培地、1x PBS、0.25%のトリプシン(必要に応じて)を熱します。
- 無菌の作業場所を準備するためにフードに無菌ドレープを入れてください。フード内に必要なすべての滅菌器具と材料を導入します。
注:目の核分裂と残りの筋肉組織および皮膚の洗浄のみがフードの外側で行われる処置であり、残りのステップはフードの内部で行われなければならない。
2. ラット/マウス PE 細胞の分離
- 湾曲したはさみと大腸菌の鉗子を使用して、動物を安楽死させた後に目を引き起めます。残りの筋肉組織と皮膚をハサミや鉗子(非無菌)で目からきれいにします。
注:眼の核化と洗浄に使用されるはさみと鉗子の大きさは、種によって異なります(例えば、ラットとマウスの場合、器具は豚や牛に使用されるものよりも小さくなります) ( 図S1を参照)。- 無菌PBSで満たされた50 mLチューブに目を集め、チューブを層流フードに移します。ヨウ素ベースの溶液中に2分間水没して目を消毒し、滅菌PBSを充填したペトリ皿に移します。
- 電球の開口部
- 無菌ペトリ皿に目を移した後、大腸菌または尖った鉗子で視神経の近くにしっかりと1つを保持します。虹彩の限界付近に穴を開け(パープラナとオラセラタの間)に18Gの針を入れます。穴に小さなはさみを挿入し、虹彩の周りにカットします。前セグメント(角膜、レンズ、アイリス)を取り除き、ペトリ皿に入れます。RPE細胞が分離されるまで、球根にガラス膜を残します。
- IPE細胞の分離
- レンズを取り外し、細かい鉗子でIPE細胞を含む虹彩を繊細に引き出します。ペトリ皿に虹彩を入れ、滅菌PBSで洗い、より多くの虹彩が準備されるまでPBSに残します。
- その日に準備するすべての目のためにステップ2.2.1から2.3.1を繰り返します。
- 虹彩あたり0.25%のトリプシンを50μL加え、37°Cで10分間インキュベートします。 トリプシンを取り外し、虹彩あたり150μLの完全な媒体を加え、平らな火で磨かれたパスツールピペットでIPEを繊細に削ります。組織を固定するために細かい鉗子を使用してください。細胞懸濁液を回収し、1.5mLチューブに入れます。細胞懸濁液の10 μLを1:3にトリパンブルーで希釈して、ノイバウアーチャンバー34,35内の細胞を数えます。
- すぐにトランスフェクションしない場合、24ウェルプレート(100,000細胞/cm2)に200,000個の細胞/ウェルを完全培地の1mL(10%FBS)で播種(シード用表1参照)。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO2で培養します。
注: シード処理に十分なセルを持つには、いくつかの目をプールする必要があります。
- RPE細胞の分離
- 薄い鉗子の後部の区分からビトレウスのユーモアおよび無神経を取除く。網膜色素上皮に損傷を与えないようにしてください。
- 地球を完全に開いて、滅菌PBSで洗浄するために#10メスでセグメントを半分にカットします。
- 1眼あたり0.25%のトリプシンを50μL加え、37°Cで10分間インキュベートします。 トリプシンを取り外し、1球当たり150μLの完全な培地を加え、丸いメスでRPE細胞を繊細に削ります。組織を固定するために細かい鉗子を使用してください。細胞懸濁液を回収し、1.5mLチューブに入れます。細胞懸濁液を10μLとします。1:4をトリパンブルーで希釈し、ノイバウアー室の細胞を数えます。
- ステップ 2.3.4 を参照してください。
注: シード処理に十分なセルを持つには、いくつかの目をプールする必要があります。
3. ウサギPE細胞の分離
- 手順 2.1 ~ 2.1.1 の手順で説明されているように、クリーニングと消毒を実行します。
- 滅菌ガーゼの圧縮に片目を置き、視神経の近くにしっかりと保持します。メス#11で目を開け、手足の下に約2mmのはさみがあります。前セグメント(角膜、レンズ、アイリス)を取り除き、ペトリ皿に入れます。RPE細胞が分離されるまで、球根にガラス膜を残します。
- IPE細胞の分離
- ステップ 2.3.1 を実行します。メス#10で切断することにより、虹彩から毛様体を取り除きます。
- 2アイリスの調製後、1mLの0.25%トリプシンを37°Cで10分間インキュベートします。この間、RPE細胞は単離することができます(ステップ3.4を参照)。トリプシンを取り除き、虹彩に1mL完全な媒体を加え、平らな火で磨かれたパスツールピペットで慎重に引っ掻いて細胞を分離します。ピペット処理により細胞を慎重に再懸濁し、細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:3を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。
- ステップ 2.3.4 を参照してください。
- RPE細胞の分離
- ステップ 2.4.1 を実行します。
- 12ウェルプレートに滅菌ガーゼを入れ、ガーゼの上に電球を置きます。
- PBSで洗浄し、ステップ2.4.3を実行します。
注:湾曲した火磨きパスツールピペットを使用してください。 - 細胞を120×gで10分遠心分離する。
- ステップ 2.3.4 を参照してください。
4. 豚PE細胞の単離
- ステップ2.1の説明に従ってクリーニングを行います。PBSで洗浄し、ヨウ素ベースの溶液中に2分間水没して目を消毒し、PBSで洗い流します。ステップ 3.2 に進みます。
- IPE細胞の分離
- ステップ 3.3.1 を実行します。2アイリスの調製後、完全な培地の1 mLを加え、平らな火磨きパスツールピペットで慎重に掻いて細胞を分離します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:4を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。
- ステップ 2.3.4 を参照してください。
- RPE細胞の分離
- ステップ 2.4.1 を実行します。ペトリ皿に電球を入れ、PBSで洗います。1 mL 完全な培地で電球を満たします。
- 湾曲した火で磨かれたパスツールピペットを使用して、RPE細胞を慎重に除去します。チョロイド・ブルッフの膜複合体の滑り落ちを避けるために、下から上に削るようにしてください。1,000 μL ピペットを使用して電球内のセル懸濁液を回収し、1.5 mL チューブに移して再懸濁します。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:8を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。
- ステップ 2.3.4 を参照してください。
5. ウシPE細胞の単離
- ステップ2.1の説明に従ってクリーニングを行います。PBSで洗浄し、ヨウ素ベースの溶液中に2分間水没して目を消毒し、PBSで洗い流します。ステップ 3.2 に進みます。
- IPE細胞の分離
- ステップ 3.3.1 を実行します。2つのアイリスを調製した後、37°Cで0.25%トリプシンの2 mLで10分間インキュベートします。この間、RPEセルは単離することができます(ステップ5.3を参照)。
- トリプシンを取り除き、虹彩に2mL完全な媒体を加え、平らな火で磨かれたパスツールピペットで慎重に引っ掻いて細胞を分離します。細胞懸濁液を15mLチューブに移します。細胞を120×gで10分遠心分離する。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:4を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。
- すぐにトランスフェクションしない場合、完全培地(10%FBS)の3mLで6ウェルプレートに320,000個の細胞/ウェルをシードする(シードについては表1参照)。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO2で培養します。
- RPE細胞の分離
- ステップ 2.4.1 に従ってください。ペトリ皿に電球を入れ、PBSで洗います。2目を準備した後、トリプシンで約3/4の電球を充填し、球根の上にペトリ皿の蓋を37°Cで25分間インキュベートします。
- トリプシンを取り外し、1 mL完全な培地を追加します。ステップ 4.3.2 を実行します。細胞を120×gで10分遠心分離する。
- ステップ 5.2.3 を参照してください。
6. 栽培 - 中程度の変化
- DMEM/HamのF12で細胞を培養し、10%FBS、80 U/mLペニシリン/80μg/mLストレプトマイシン、2.5 μg/mLアンホテリシンBを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2で培養します。3-4日後にピペットを上下にして非接着細胞を収集し、ボリュームの半分を別の井戸に入れます。完全な媒体で1 mLまで満たします。
注: これにより、すべてのセルが接続して出力を最大化するのに十分な大きさのサーフェスを使用できます。 - さらに3〜4日後に細胞の採取を繰り返しますが、今回は2つのウェルから1つのウェル(例えば、C1のA1+B1)に非接着細胞をプールすることによって。すべての井戸にミディアムを追加します。細胞を観察し、週に2回培地を変更します(6ウェルプレートと24ウェルプレートで3mL/wellを使用)。細胞が合流に達したら、1%FBSで培地を完成するか、実験(例えば、トランスフェクション)のために細胞を使用する。
注:RPE細胞とIPE細胞は、それぞれ3-4後、および4〜5週間後にコンフルエントです。細胞培養純度を、Johnenたちの研究グループ36が述べたように細胞形態(色素細胞)および特異的マーカーを確認して裏付けた。
7. 一次PE細胞のエレクトロポレーション
- 1,37の前に説明したようにエレクトロポレーションを行う。
- トランスフェクトされた細胞の数に応じて、抗生物質や抗ミコティックを使用せずに培地に細胞を播種するために6-、24-または48ウェルプレート( 表2を参照)を使用します。次の2週間はペニシリン(80 U/mL)、ストレプトマイシン(80 μg/mL)、アンホテリシンB(2.5 μg/mL)を含む培地を週2回添加します。トランスフェクション後2週間で培地を完全に交換する。
- 細胞増殖、トランスフェクション効率、タンパク質分泌を判定するには、顕微鏡で細胞を週1回監視し、ウェスタンブロットで細胞培養上清を分析します。培養終了前に、ELISAによるタンパク質分泌を定量化し、細胞を数え、画像ベースのサイトメトリー (Venus-トランスフェクト細胞の場合)による蛍光を測定し、製造者の指示に従って細胞ペレットを回収し、RT-qPCRベースの遺伝子発現解析用 の細胞ペレットを採取します。
注: これらの方法は、細胞の分析を詳細に説明する目的ではなく、むしろその分離を説明する目的であるため、本論文には含まれていません。細胞の播種密度は全ての種(10万個の細胞/cm2)で同じであるが、単離された細胞の数が異なるため、異なるプレートを用いた。また、マウス、ラット、ウサギの場合、播種に十分な細胞を持つために2〜3個の目をプールする必要があるかもしれません。
| 種 | トリプシン治療 | N° IPE セル | N° RPE細胞 | 播種用プレート(100,000細胞/cm2) |
| マウス/ラット | はい | ~50,000 | ~150,000 | 24ウェルプレート |
| 兎 | はい | ~350,000 | ~2,500,000 | 24ウェルプレート |
| 豚 | いいえ | ~1,000,000 | ~3,000,000 | 24ウェルプレート |
| 牛 | はい | ~1,700,000 | ~5,000,000 | 6ウェルプレート |
表1:異種の眼から単離された一次PE細胞の数。
| 名前 | 面積 | ボリュームメディア | トリプシン | トリプシンの動作を停止するボリューム媒体 | シード密度 |
| 6ウェルプレート | 9.6 cm² | 3.0 mL | 0.5 mL | 1.0 mL | 3x105 |
| 24ウェルプレート | 2.0 cm² | 1.0 mL | 0.2 mL | 0.8 mL | 5x104 |
| 48ウェルプレート | 1.1 cm² | 0.5 mL | 0.1 mL | 0.4 mL | 0.5-1x104 |
表2:細胞培養量と播種密度
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Representative Results
異種哺乳類からのPE分離
前述のプロトコルを用いて、IPE細胞とRPE細胞を5種分から正常に単離し、培養した。各手順から得られる細胞の数は、眼の種や大きさに依存する(表1)。図1に示すように、細胞は典型的なPE細胞の形態および色素沈着を示す(示されたウサギ細胞を除く、アルビノニュージーランドホワイト(NZW)ウサギ由来である)。21日後の分離では、細胞はコンフルエントであり、さらなる実験(例えば、トランスフェクション)に使用する準備ができている。なお、全ての種の培養物は、正常形態および安定したトランスジーン発現を確認して、さらに2年まで監視および制御される(データは示さない)。
脱分化、細胞ストレス、および遺伝子発現の変化は、RT-qPCRおよび免疫体系化学によって除外された。遺伝子のパネル(VEGF、CRALBP、CATD、ZO-1、KRT8)は、トランスフェクトされたヒトRPE細胞(ARPE-19細胞)で分析し、正常RPE発現パターン1を確認した。RPE65の免疫蛍光によって一次ウシIPE細胞で確認できた(図2)。また、Johnenたちの研究グループは、一次ブタIPEおよびRPE細胞36におけるZO-1免疫染色を裏付けた。
図1:分離後21日の各種哺乳類のPE細胞の顕微鏡写真 マウス、ウサギ(アルビノNZWウサギ)、ブタ、ウシからのIPEおよびRPE細胞は、21日目の分離後に示される。すべての種について、示された培養物はコンフルエントである。なお、ウサギPE細胞は、色素(元の倍率、50倍)に着色されていない。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:一次IPE細胞のRPE65免疫染色 pFAR4-CMV-PEDFトランスポゾンプラスミドにトランスフェクトされたウシIPE細胞のRPE65(緑色)染色は、非トランスフェクト対照細胞と比較して1 x104細胞 の初期細胞数を使用した(元の倍率、200倍)。核はDAPI(青色)で染色した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
トランスフェクトされたプライマリRPEの生存率
セルの生存率を図 3に示します。エレクトロポレーションプロセスに使用されるバッファーの潜在的毒性を除外するために、前培養された一次RPE細胞を、市販のキットからエレクトロポレーションバッファーに懸濁させたか、または製薬会社(機密組成物)および電気泳動(E)(プラスミドを添加しない)によって開発された栄養緩衝液に、プロトコルのステップ7に記載されている。細胞生存率は、製造業者の指示に従って市販の細胞毒性アッセイキット(材料表を参照)を用いてトランスフェクション後3±1日後に検討した。アッセイは、常に電力なし(Co-P)(電気ポポレートされていない)で行った。テストしたいずれのバッファに対しても細胞生存率への影響は認められなかった(図3)。
図3:異なる緩衝液に懸濁した一次RPE細胞の生存率.1 x104 細胞は、市販のキットからエレクトロポレーションバッファーに、または栄養バッファーに懸濁した。細胞生存率は、市販の細胞毒性アッセイキットを用いてトランスフェクション後1日±3±測定した。異なるバッファー間で生存率の違いは認められなかった。データは平均±SD(n=2ドナー、3反復/ドナー)として表されます。E:エレクトロポレートされた細胞、Co-P:電力なしで制御。AU: 任意の単位。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
金星レポーター遺伝子を有する前培養したPE細胞のトランスフェクション
異種由来の50,000-100,000個の前培養されたPE細胞を、多活性SB100Xトランスポゾン遺伝子導入システムを用いて黄色蛍光金タンパク質(pT2-CAGGS-Venus)にトランスフェクトした。図4に示す顕微鏡写真は、細胞が正常にトランスフェクション(トランスフェクション後21日で蛍光細胞)に成功したことを裏付ける。図5は、前培養された豚RPE細胞(n=6ドナー、50,000細胞/トランスフェクション)をVenus(pT2-CAGGS-Venus)にトランスフェクトしたトランスフェクション効率の定量を示す。蛍光細胞およびMFIの割合は、細胞培養終了時の製造業者の指示に従って画像ベースのサイトメトリーを用いて測定した(トランスフェクション後5日間で30±)。蛍光細胞の平均割合は50±30%であったが、95±6%(ドナー2)から28±1%(ドナー4)までの変動(ドナー4)であった(図5)。全ての実験において、トランスフェクトされたARPE-19細胞を陽性対照として使用した。さらに、トランスフェクション効率は常に負のコントロールと比較されました:Co-P(電力なし制御[電気ポポレートなし])およびCo+P(電力[エレクトロポレートされたがプラスミドを添加しない])で制御)。実験はIPE細胞を用いても行われている(データは示されていない)。
図4pT2-CAGGS-Venusを導入した前培養PE細胞の顕微鏡写真金星トランスフェクションウサギ(A)、ウシ(B)、ブタ(C)PE細胞はトランスフェクション後21日で示されている。陽性対照として、50,000 ARPE-19細胞がVenus(D)にトランスフェクションされた。 左顕微鏡写真:明視野、右顕微鏡写真:GFP(480 nm)フィルタ(元の倍率、50倍)。トランスフェクションは三重で行われ、負のコントロールが含まれていました:Co-P(電力なしの制御[電気ポポレートなし])とCo+P(電力[エレクトロポレートされたがプラスミドを添加しない])を使用した制御(図示せず)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:金星レポーター遺伝子にトランスフェクトしたブタRPE細胞におけるトランスフェクション効率(A)50,000個の一次ブタのRPE細胞をpT2-CAGGS-Venusでトランスフェクトし、全体平均トランスフェクション効率は50±30%、平均MFIは細胞培養終了日(トランスフェクション後30±5日後)で2712±197であった。グラフは、6つの異なる動物の平均±SD(n=3反復)を示しています。(B)陽性対照として使用された金星+ ARPE-19細胞の割合は98±6%であり、その後の138日間安定であった。平均蛍光強度(MFI)は5,785±1,255であった。グラフは、各日の平均 ±SD(n=3反復)を示しています。Co-P(電力なし制御[電気ポポレートしない])およびCo+P(電力[電気ポレートされたがプラスミドを添加しない])を用いたすべてのトランスフェクション実験(図示せず)に含まれていた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
金星レポーター遺伝子を有する新生PE細胞のトランスフェクション
ウサギから分離したばかりの10,000~50,000個のPE細胞を黄色蛍光タンパク質Venus(pFAR4-CMV-Venus)にトランスフェクトし、顕微鏡で細胞培養をモニタリングした。 図6 では、トランスフェクション後21日目に蛍光細胞が観察できる。画像ベースのサイトメトリーで測定した蛍光細胞の割合は、IPE細胞では53±29%、RPE細胞では28±23%であった(データは示されていない)。
図6:ウサギから分離した新たにトランスフェクトされたPE細胞の顕微鏡写真. ウサギから50,000個のIPE細胞およびRPE細胞をpFAR4-CMV-Venusでトランスフェクトした。蛍光はトランスフェクション後21日目に示される。左顕微鏡写真:明るいフィールド、右顕微鏡写真:GFP(480 nm)フィルタ。すべての場合において、トランスフェクションは三重(元の倍率、50倍)で行われました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
治療遺伝子PEDFおよびGM-CSFを有するPE細胞のトランスフェクション
50,000個のPE細胞を PEDF にトランスフェクトし、タンパク質分泌をWBでモニタリングした(図7)。トランスフェクトされた細胞のWBシグナルは、研究されたすべての種および日の非トランスフェクト細胞と比較して高かった。この時間内にタンパク質分泌の減少は認められなかった。
図7: トランスフェクトされたPE細胞のPEDF分泌のWB分析ブタ(前培養)(A)および牛(新たに)(B)PEDFトランスフェクションPE細胞からの上清のWB分析は、コントロール(非トランスフェクト細胞)と比較して高いPEDF分泌を示し、時間の経過とともに安定している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図S1: 種に応じてPE分離に使用される器具 (A) 眼の核形成や残りの筋肉組織や皮膚の洗浄に用いられる非滅菌器具。セット1はラット、マウス、ウサギに使用され、セット2は豚や牛の目に使用されます。(B) PEの分離に使用される無菌器具。目の大きさに応じて使用されるハサミや鉗子のサイズが異なります。丸く、平らな火磨きパスツールピペットは、それぞれRPEとIPEの擦り傷のために使用されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PE細胞を単離し培養するための標準化された方法を持つことは、レチン性変性疾患に対する新しい治療法の開発の基本です。ここで提示されるプロトコルでは、PE細胞は異なる種から正常に分離され、長期間培養することができます(これまで、最長の培養は2年間1、38年維持されていました)。典型的なPE細胞形態、色素沈着および機能が観察された(図1、図2)。特に純粋なRPE培養では、神経の細胞との汚染を避けるために完全にレティナを抽出することが重要であることに注意してください。IPE細胞の場合、毛様体は、プロトコルで説明されているように虹彩から除去されるべきである。細胞の合流は比較的短時間(〜21日)で達成され、その後、細胞は治療遺伝子でトランスフェクションしたり、他の実験で使用したり(例えば、毒性物質、タンパク質への暴露)する準備が整う。さらに、プロトコルは、前臨床インビトロおよびインビボ検査に重要であるだけでなく、ヒトの応用、すなわち、トランスフェクトされたPE細胞移植の検証にとっても重要である。特に、IPE細胞が虹彩生検から単離され、すぐにトランスフェクションされ、1回の外科セッション内で同じ患者に対して皮下移植される、我々のグループによる開発におけるAMDの治療のために。自己のIPE細胞の単離および副腎移植は、ウサギ39および患者23に確立された。自家IPE細胞の移植は成功したが視力回復には十分ではなかったため、PEDFやGM-CSFなどの神経保護因子を過剰発現させる細胞のトランスフェクションがアプローチに追加され、さらに3種(マウス、ラット、および牛)に確立された。ここで説明する方法を用いて、PE細胞の単離、培養および遺伝子改変、各細胞移植は、インビボでのアプローチの毒性および効率をテストするために様々な種から調製することができる。
これは、多動性SB100Xトランスポゾンシステムを用いて、様々な起源からのPE細胞が効率的に過剰発現PEDFに変えることができることを示した(図7)。ラットIPEおよびRPE24およびヒトRPE細胞29を用いた同様の結果が公表されている。PEDFによるトランスフェクションは、VEGF媒介性新血管化の阻害と、グルタメートおよび酸化ストレスならびに虚血40,41からのRPE細胞およびレチナルニューロンの保護によってnvAMDを治療するために提案されている。安定的な長期タンパク質分泌の腐食(図7)は、信頼性の高い生物学的「薬物送達システム」としてPE細胞を確認した。この点に関して、レポーター遺伝子Venus(図4、図5、図6)で研究したトランスフェクション効率は、ジョニーンらで報告された〜20〜100%(種依存およびドナー依存性)の高いトランスフェクション効率を確認した。1.
なお、使用するプラスミドの大きさは可変であったが、pFARミニプラスミド(〜3,000bp)からpT2-骨格(〜5,000bp)30のプラスミドまで、トランスフェクション効率は同等に高かった。トランスフェクション効率の違いは、おそらく、細胞の分離から細胞の分離、組織の保存までの時間の変動によるものの、細胞が合流する時間(分離後21日)、あるいは細胞がトランスフェクション後に続いた時間のどちらにも変化しなかった。一般に、正常なトランスフェクションを達成するための重要な考慮事項は、PE細胞の供給源ができるだけ新鮮であるべきだということです。これは、新鮮な単離されたPE細胞を用いてトランスフェクションを行う場合に特に重要です。
細胞シート移植と比較して、我々のグループが開発している治療法(細胞懸濁液として網膜下移植されたトランスフェクト細胞)は、最初に増殖性硝子乳前網膜症および網膜下線維症42の関連リスクを伴う大きな網膜切除術を必要とするため、侵襲性が低い。また、湿式AMD用のシート移植片では、CNVの面積が隣接する脈絡膜とともに除去され、したがって、移植片生存率が損なわれる可能性が43である。最後に、細胞パッチを使用するという考えは、単一の外科セッション中に細胞の単離、改変および移植が行われる提案された手順と互換性がない。一方、細胞懸濁液として移植されたPE細胞の固有の問題は、送達中の細胞死の可能性、接着性の欠如、細胞分布の分散である。しかし、これらの欠点は、組織工学のアプローチ42によって克服することができる。また、細胞生存率は、44、45、46、47のプロサバイバル剤を使用することによって改善することができる。PEDFやGM-CSFなどの神経保護因子を細胞懸濁液として過剰発現する一次PE細胞の移植は、AMDを治療するための有望なアプローチであると考えており、この治療法を開発するためには、一次PE細胞の分離、培養、および分析の標準化を可能にするため、ここで提示されるプロトコルが重要である。
要約すると、このプロトコルは、異なるソースからの細胞質の個々の差異を補償するのに十分な堅牢性を備えた5つの異なる種における眼高度な薬用療法の開発および前臨床イン ビトロ および インビボ 試験のための高度なモデルシステムを提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
グレッグ・シーリーとアリン・コンティの優れた技術支援に感謝します。この研究は、第7枠組みプログラム、スイス国立科学財団、シュミーダー・ボーリッシュ財団の文脈で欧州委員会によって支援されました。Z.I.は、フルブライト・リサーチ・グラントとスイス政府優秀奨学金から、欧州研究評議会、ERCアドバンス[ERC-2011-ADG 294742]、B.M.W.から資金を受け取りました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
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