Summary
Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.
Abstract
La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la causa más frecuente de ceguera en pacientes >60 años, afectando a ~ 30 millones de personas en todo el mundo. La DMAE es una enfermedad multifactorial influenciada por factores ambientales y genéticos, que conducen a un deterioro funcional de la retina debido a la degeneración de las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) seguida de la degradación de los fotorreceptores. Un tratamiento ideal incluiría el trasplante de células RPE sanas que secretan factores neuroprotectores para prevenir la muerte celular RPE y la degeneración de los fotorreceptores. Debido a las similitudes funcionales y genéticas y la posibilidad de una biopsia menos invasiva, se propuso el trasplante de células epiteliales pigmentarias del iris (IPE) como sustituto del EPR degenerado. La secreción de factores neuroprotectores por un bajo número de células trasplantadas subretinalmente se puede lograr mediante la transfección mediada por transposón de la Bella Durmiente (SB100X)con genes que codifican para el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y / o el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF). Establecimos el aislamiento, el cultivo y la transfección mediada por SB100Xde células RPE e IPE de varias especies, incluidos roedores, cerdos y ganado. Se explantan globos y se extrae la córnea y el cristalino para acceder al iris y la retina. Usando una espátula hecha a medida, las células IPE se eliminan del iris aislado. Para cosechar células RPE, se puede requerir una incubación de tripsina, dependiendo de la especie. Luego, usando espátula personalizada por RPE, las células se suspenden en medio. Después de la siembra, las células son monitoreadas dos veces por semana y, después de llegar a la confluencia, transfectadas por electroporación. La integración génica, la expresión, la secreción de proteínas y la función se confirmaron mediante ensayos qPCR, WB, ELISA, inmunofluorescencia y funcionales. Dependiendo de la especie, se pueden aislar 30.000-5 millones (RPE) y 10.000-1,5 millones de células (IPE) por ojo. Las células modificadas genéticamente muestran una sobreexpresión significativa de PEDF/GM-CSF con la capacidad de reducir el estrés oxidativo y ofrece un sistema flexible para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos para desarrollar enfoques de terapia génica ocular.
Introduction
Nuestro grupo se centra en el desarrollo de enfoques regenerativos para tratar la degeneración neurorretinina, es decir, la DMAE, mediante la terapia génica no viral basada en RPE e IPE. El establecimiento preclínico de tales terapias requiere modelos in vitro transferibles a los seres humanos. Por lo tanto, el objetivo del estudio presentado aquí es entregar protocolos para el aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células primarias de RPE e IPE. La razón para establecer el aislamiento de células de PE de múltiples especies es confirmar sólidamente la seguridad y la eficiencia del enfoque y aumentar su reproducibilidad y transferibilidad. La línea celular de EPR humano disponible ARPE-19 difiere de las células primarias (por ejemplo, están menos pigmentadas) y, por lo tanto, es de valor limitado para los análisis preclínicos1. Además, las células de mamíferos no humanos se pueden comprar a un costo menor y en mayores cantidades; el tejido de donante humano se puede obtener de varios bancos de ojos, pero la disponibilidad es limitada y costosa. Por último, los nuevos medicamentos de terapia avanzada (ATMP, es decir, células, tejidos o medicamentos de terapia génica) deben aplicarse en al menos dos especies diferentes antes de ser probados en pacientes y estos estudios in vivo solicitan la preparación de trasplantes de células alogénicas.
Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de ceguera en los países industrializados, que comprenden enfermedades comunes como la DMAE, así como enfermedades raras como la retinosis pigmentaria, en la que la muerte de las células de la retina finalmente conduce a la ceguera. El daño de las células RPE, los fotorreceptores y las células ganglionares de la retina (RGC) puede en algunos casos disminuirse, pero actualmente no hay terapias curativas disponibles. Los ATMP ofrecen el potencial de corregir defectos genéticos, integrar genes terapéuticos o reemplazar células degeneradas, lo que permite el desarrollo de terapias regenerativas y curativas para enfermedades como la DMAE; 13 terapias génicas ya obtuvieron la aprobación de comercialización, incluida una terapia para tratar la degeneración retiniana asociada a la mutación RPE652,3. Entre los adultos mayores (>60 años), ~ 30 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la DMAE neovascular (nvAMD) o avascular (aAMD)4. Ambas formas son inducidas por desencadenantes asociados a la edad, incluido el daño oxidativo, el deterioro de la función y la pérdida de células RPE, seguidos de la degradación de los fotorreceptores, entre otros (por ejemplo, alelos de riesgo genético, tabaquismo, hipertensión)5,6. En nvAMD, la patogénesis se ve agravada por un desequilibrio de factores angiogénicos y antiangiogénicos a favor del factor de crecimiento endotelial vascular angiogénico (VEGF) que induce la neovascularización coroidea (CNV). Hasta la fecha, solo la nvAMD es tratable mediante inyecciones intravítreas mensuales de inhibidores de la proteína VEGF para suprimir la CNV; todavía no se dispone de un tratamiento eficaz para laAAMD 6,7.
Varios estudios evaluaron las terapias basadas en células para reemplazar la terapia anti-VEGF: los estudios realizados por Binder et al., en los que se trasplantaron células autólogas de EPR recién cosechadas en pacientes con nAMD8,9,10,mostraron una mejoría visual moderada, pero solo un pequeño grupo de pacientes alcanzó una agudeza visual final lo suficientemente alta como para permitir la lectura. Recientemente, un estudio clínico de fase I utilizó un parche de ERP derivado de células madre embrionarias para tratar la DMAE con resultados prometedores; es decir, eficacia, estabilidad y seguridad del parche RPE hasta 12 meses en 2 de los 10 pacientes tratados11. Además, varios grupos han publicado estudios en los que se recolectaron parches autólogos de RPE-Bruch-coroides de la retina periférica y se trasplantaron a la mácula12,13,14; y se generaron parches de EPR derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para trasplante15. Para la AAMD, los anticuerpos dirigidos a la vía del complemento se han probado en ensayos clínicos6,16 y se completó un estudio de fase I utilizando una única inyección intravítrea de un vector viral adenoaso asociado (AAV) que codifica el gen para el factor CD59 (AAVCAGsCD59) en pacientes con atrofia geográfica (GA)17; el estudio de fase II comenzó recientemente y tiene como objetivo reclutar a 132 pacientes con AAMD avanzada y evaluar el resultado a los 2 años posteriores a la intervención18. Finalmente, el grupo de estudio FocuS ha iniciado un ensayo clínico multicéntrico de fase I/II evaluando la seguridad, dosis-respuesta y eficacia de un vector AAV no replicante recombinante que codifica un factor19del complemento humano.
Principalmente, el objetivo de una terapia de DMAE regenerativa es el trasplante de células RPE funcionales, que se dañaron o perdieron. Sin embargo, las células IPE y RPE comparten muchas similitudes funcionales y genéticas (por ejemplo, fagocitosis y metabolismo del retinol), y debido a que las células IPE se cosechan de manera más factible, se han propuesto como un sustituto de RPE20. A pesar de que se ha demostrado previamente que el trasplante de células IPE retrasa la degeneración del fotorreceptor en modelos animales21,22 y estabiliza la función visual en pacientes con nvAMD en etapa final, no se observó una mejoría significativa en estos pacientes23. La falta de eficacia puede deberse al bajo número de células trasplantadas y/o al desequilibrio de los factores neuroprotectores de la retina. Un enfoque alternativo sería trasplantar células epiteliales pigmentarias transfectadas que sobreexpresan factores neuroprotectores para restaurar la homeostasis retiniana, mantener las células RPE restantes y proteger los fotorreceptores y RGC de la degeneración. En consecuencia, proponemos una nueva terapia que comprende el trasplante de células funcionales de EPR o IPE que han sido sometidas a ingeniería genética para secretar proteínas neuroprotectoras y antiangiogénicas, como PEDF, GM-CSF o factores de crecimiento similares a la insulina (IGF). La ventaja de desarrollar y analizar este enfoque en varias especies en lugar de utilizar una línea celular, una sola especie, o tejido humano es: 1) mayor reproducibilidad y transferibilidad de los resultados como lo demuestran numerosos estudios realizados en laboratorios independientes y diferentes especies1,24,25; 2) las células de cerdo o bovino son factiblemente desechables sin el sacrificio de animales adicionales; 3) la disponibilidad de células especialmente porcinas y bovinas permite que grandes series de ensayos produzcan resultados sólidos; 4) el conocimiento para aislar, cultivar y modificar genéticamente células a partir de los modelos más utilizados permite realizar análisis in vivo en múltiples especies24,25,26 y,por lo tanto, ofrece una mejor relación riesgo-beneficio para los primeros pacientes tratados; 5) la flexibilidad del protocolo presentado permite su uso en diversos modelos y conjuntos experimentales y para todas las terapias basadas en células oculares con y sin ingeniería genética. Por el contrario, las técnicas alternativas como las líneas celulares o el tejido humano son solo de transferibilidad limitada y / o desechabilidad limitada. Las líneas celulares como el ARPE-19 son ideales para experimentos preliminares; sin embargo, la baja pigmentación y la alta proliferación difieren significativamente de las células primarias1. Las células RPE e IPE, que se aíslan del tejido de donantes humanos, ofrecen una fuente valiosa para experimentos in vitro transferibles; sin embargo, obtenemos tejido humano de un banco de ojos estadounidense, lo que significa que el tejido tiene al menos dos días de edad (después de la enucleación) y requiere un transporte largo y costoso, pero el tejido del donante local no está disponible en cantidades suficientes para una investigación productiva. La ventaja del uso de células primarias es confirmada por múltiples estudios de otros grupos27,28.
Para el desarrollo de una terapia génica no viral basada en células utilizando el sistema de transposones SB100X para transfectar células primarias de RPE e IPE con los genes que codifican para PEDF y / o GM-CSF para tratar nvAMD y aAMD, respectivamente29,30,31,32, primero establecimos la transfección de células ARPE-191 . A continuación, se establecieron los protocolos de aislamiento y transfección en células primarias bovinas y porcinas de fácil acceso. Ahora, se ha establecido el aislamiento y la transfección de células primarias de RPE e IPE de cinco especies diferentes, desde pequeños (como ratones) hasta grandes mamíferos (como ganado). Se confirmó en células primarias de RPE e IPE derivadas de ojos de donantes humanos30. La producción del ATMP conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) se validó utilizando también tejido de donante humano33. Finalmente, tanto la seguridad como la eficiencia del enfoque se evaluaron in vivo en tres especies diferentes para las que se ha adaptado el protocolo: ratón, rata y conejo. En la configuración clínica, se extraerá una biopsia de iris del paciente y las células IPE se aislarán y transfectarán en la sala limpia, antes de que las células se trasplanten subretinalmente al mismo paciente. Todo el proceso se llevará a cabo durante una sola sesión quirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. El desarrollo del enfoque de tratamiento y la evaluación de su eficiencia solicitaron excelentes modelos in vitro y ex vivo para implementar métodos de administración de genes robustos y eficientes, para analizar la eficiencia de la entrega de genes, la producción terapéutica de proteínas y los efectos neuroprotectores, y para producir trasplantes celulares para probar el enfoque in vivo1,24,25,29,30 . Cabe mencionar que la terapia cuenta con la aprobación ética para un ensayo de fase clínica Ib/IIa de la comisión ética para la investigación del Cantón de Ginebra (nº 2019-00250) y actualmente los últimos datos preclínicos solicitados para su autorización por las autoridades reguladoras suizas se recopilan utilizando el protocolo presentado. En este sentido, los datos preclínicos in vivo demostraron una reducción significativa de la NVC y una excelente seguridad24,25,31.
Aquí, se describe el aislamiento y cultivo de células RPE / IPE de bovinos, cerdos, conejos, ratas y ratones, y el uso del sistema integrador de transposones SB100X combinado con electroporación como un método eficiente de administración de genes. En particular, las células primarias de PE se transfectaron para sobreexpresar PEDF y GM-CSF. La recogida de estos protocolos permite realizar los estudios in vitro e in vivo en todas las fases preclínicas del desarrollo de ATMP. Además, la configuración tiene el potencial de adaptarse a otros genes de interés y enfermedades.
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Protocol
Los protocolos en los que participaron los animales fueron llevados a cabo por personal certificado y previa autorización del Departamento cantonal de la seguridad, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale de Ginebra, Suiza, y de acuerdo con la Declaración arVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión (aprobación no. GE/94/17). Las ratas adultas sanas de Brown Norway, los ratones C57BL / 6 y los conejos blancos de Nueva Zelanda fueron sacrificados por una sobredosis de Pentobarbital (150 mg / kg) diluido en NaCl inyectado intraperitoneal al 0.9% y los ojos se enuclearon inmediatamente después del sacrificio. Los ojos porcinos y bovinos se obtuvieron de un matadero local dentro de las 6 horas posteriores al sacrificio y se transportaron al laboratorio en hielo.
1. Antes de la preparación
- Preparar medio completo (DMEM/Ham's F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B). Calentar el medio, 1x PBS, y 0.25% de tripsina (si es necesario) en un baño de agua a 37 °C.
- Coloque una cortina estéril en la capucha para preparar un lugar de trabajo aséptico. Introduzca todos los instrumentos y materiales estériles necesarios dentro de la campana.
NOTA: Solo la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes son los procedimientos que se llevan a cabo fuera de la capucha, el resto de los pasos deben realizarse dentro de la capucha.
2. Aislamiento de células de PE de rata/ratón
- Use tijeras curvas y pórceps Colibri para enuclear los ojos después de la eutanasia del animal. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos con tijeras y fórceps (no estériles).
NOTA: El tamaño de las tijeras y fórceps utilizados para la enucleación y limpieza de los ojos depende de la especie (por ejemplo, para ratas y ratones los instrumentos van a ser más pequeños que los utilizados para cerdos y bovinos) (ver Figura S1).- Recoja los ojos en un tubo de 50 ml lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinfecte los ojos sumergiéndolos durante 2 minutos en una solución a base de yodo, luego transfiéralos a una placa de Petri llena de PBS estéril.
- Apertura de la bombilla
- Después de transferir los ojos a una placa de Petri estéril, sostenga uno firmemente cerca del nervio óptico con Colibri o forrórceps puntiagudos. Perfora un agujero cerca del límite del iris (entre pars plana y ora serrata) con una aguja de 18 G. Inserte tijeras pequeñas en el orificio y corte alrededor del iris. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colórelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE.
- Aislamiento de células IPE
- Retire la lente y con fórceps finos saque delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri, lávelo con PBS estéril y déjelo en PBS hasta que se prepare más iris.
- Repita los pasos 2.2.1 a 2.3.1 para que todos los ojos estén preparados ese día.
- Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por iris e incubar durante 10 min a 37 °C. Retire la tripsina, agregue 150 μL de medio completo por iris y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego; use forrórceps finos para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Utilice 10 μL de la suspensión celular diluida 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer34,35.
- Si no se transfecta inmediatamente, sembrar 200.000 células/pozo en una placa de 24 pozos (100.000 células/cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultnémosla a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Puede ser necesario agrupar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.
- Aislamiento de células RPE
- Elimine el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pórceps delgados. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina.
- Corta el segmento por la mitad con un bisturí #10 para tener el globo completamente abierto y lávate con PBS estéril.
- Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por ojo e incubar durante 10 min a 37 °C. Retire la tripsina y agregue 150 μL de medio completo por globo y raspe las células RPE delicadamente con un bisturí redondo; use forrórceps finos para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Tomar 10 μL de la suspensión celular; diluir 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
- Consulte el paso 2.3.4.
NOTA: Puede ser necesario agrupar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.
3. Aislamiento de células de PE de conejo
- Realice la limpieza y desinfección como se describe en los pasos 2.1 a 2.1.1.
- Ponga un ojo en una compresa de gasa estéril y manténgala firmemente cerca del nervio óptico. Abre el ojo con el bisturí #11 y tijeras unos 2 mm debajo del limbo. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colórelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE.
- Aislamiento de células IPE
- Realice el paso 2.3.1. Retire el cuerpo ciliar del iris cortando con un bisturí # 10.
- Después de la preparación de 2 iris, incubar con 1 ml de tripsina al 0,25 % a 37 °C durante 10 min; durante este tiempo, las células RPE se pueden aislar (ver paso 3.4). Retire la tripsina y agregue 1 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Resuspenda las células cuidadosamente mediante pipeteo y transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
- Consulte el paso 2.3.4.
- Aislamiento de células RPE
- Realice el paso 2.4.1.
- Coloque una gasa estéril en una placa de 12 pozos y coloque la bombilla sobre la gasa.
- Lavar con PBS y realizar el paso 2.4.3.
NOTA: Utilice una pipeta Pasteur curva pulida al fuego. - Centrifugar las células 10 min a 120 x g.
- Consulte el paso 2.3.4.
4. Aislamiento de células de EP de cerdo
- Realice la limpieza como se describe en el paso 2.1. Lavar con PBS y desinfectar los ojos sumergiéndonos durante 2 min en solución a base de yodo, enjuague con PBS. Continúe con el paso 3.2.
- Aislamiento de células IPE
- Realice el paso 3.3.1. Después de la preparación de 2 iris, agregue 1 ml de medio completo y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
- Consulte el paso 2.3.4.
- Aislamiento de células RPE
- Realice el paso 2.4.1. Coloque la bombilla en una placa de Petri y lávese con PBS. Llene la bombilla con 1 ml de medio completo.
- Usando una pipeta Pasteur curva pulida al fuego, retire cuidadosamente las celdas de RPE. Asegúrese de raspar de abajo hacia arriba para evitar deslizarse hacia abajo del complejo de membrana coroideo-Bruch. Recoja la suspensión celular dentro del bulbo con una pipeta de 1.000 μL y transfiérala a un tubo de 1,5 ml para la resuspensión. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:8 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
- Consulte el paso 2.3.4.
5. Aislamiento de células de PE bovinas
- Realice la limpieza como se describe en el paso 2.1. Lavar con PBS y desinfectar los ojos sumergiéndonos durante 2 min en solución a base de yodo, enjuague con PBS. Continúe con el paso 3.2.
- Aislamiento de células IPE
- Realice el paso 3.3.1. Después de la preparación de dos iris, incubar con 2 ml de tripsina al 0,25% a 37 °C durante 10 min. Durante este tiempo, las células RPE se pueden aislar (ver paso 5.3).
- Retire la tripsina y agregue 2 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células 10 min a 120 x g. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
- Si no se transfecta inmediatamente, sembrar 320.000 células/pozo en una placa de 6 pozos en 3 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultnémosla a 37 °C, 5% CO2.
- Aislamiento de células RPE
- Siga el paso 2.4.1. Coloque la bombilla en una placa de Petri y lávese con PBS. Después de la preparación de 2 ojos, llene el bulbo aproximadamente 3/4 con tripsina e incube durante 25 min a 37 ° C con la tapa de la placa de Petri en la parte superior del bulbi.
- Retire la tripsina y agregue 1 ml de medio completo. Realice el paso 4.3.2. Centrifugar las células 10 min a 120 x g.
- Consulte el paso 5.2.3.
6. Cultivo - cambio medio
- Cultite las células en DMEM/Ham's F12, suplementado con 10% de FBS, 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B, a 37°C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada. Después de 3-4 días, pipetee hacia arriba y hacia abajo para recolectar células no adherentes y coloque la mitad del volumen en otro pozo. Llene hasta 1 ml con medio completo.
NOTA: Esto permite tener una superficie lo suficientemente grande como para que todas las celdas aisladas se adhieran y maximicen la salida. - Después de otros 3-4 días, repita la recolección de células, pero esta vez agrupando las células no adherentes de dos pozos en un pozo (por ejemplo, A1 + B1 en C1). Agregue medio a todos los pozos. Observe las células y cambie el medio 2 veces por semana (para placas de 6 y 24 pozos use 3 y 1 ml / pozo, respectivamente). Cuando las células alcancen la confluencia, cambie a un medio completo con 1% de FBS o use las células para experimentos (por ejemplo, transfección).
NOTA: Las células RPE e IPE son confluentes después de 3-4 y 4-5 semanas después del aislamiento, respectivamente. La pureza del cultivo celular fue corroborada comprobando la morfología celular (células pigmentadas) y marcadores específicos según lo descrito por Johnen y colegas36.
7. Electroporación de células primarias de PE
- Realizar electroporación como se describe antes1,37.
- Dependiendo del número de células transfectadas, utilice placas de 6, 24 o 48 pozos (ver Tabla 2)para sembrar las células en medio sin antibióticos ni antimicóticos. Durante las siguientes 2 semanas, agregue gotas con medio que contenga penicilina (80 U / ml), estreptomicina (80 μg / ml) y anfotericina B (2.5 μg / ml) dos veces por semana. Cambie el medio completamente 2 semanas después de la transfección.
- Para determinar el crecimiento celular, la eficiencia de la transfección y la secreción de proteínas, monitoree las células semanalmente por microscopía y analice el sobrenadante de cultivo celular por western blot. Antes de finalizar el cultivo, tome un sobrenadante de cultivo celular de 24 h para cuantificar la secreción de proteínas por ELISA, contar las células, medir la fluorescencia mediante citometría basada en imágenes (en el caso de células transfectadas por Venus)siguiendo las instrucciones de los fabricantes (ver Tabla de materiales)y recolectar el pellet celular para el análisis de expresión génica basado en RT-qPCR.
NOTA: Estos métodos no están incluidos en el presente trabajo ya que no es el propósito explicar en detalle el análisis de las células sino más bien su aislamiento. La densidad de siembra celular es la misma para todas las especies (100.000 células/cm2),pero debido a que el número de células aisladas varía, se utilizaron diferentes placas. Además, para ratones, ratas y conejos podría ser necesario agrupar 2-3 ojos para tener suficientes células para la siembra.
| Especie | Tratamiento con tripsina | N° células IPE | N° células RPE | Placa para siembra (100.000 células/cm2) |
| Ratón/rata | Sí | ~50,000 | ~150,000 | Placas de 24 pozos |
| Conejo | Sí | ~350,000 | ~2,500,000 | Placas de 24 pozos |
| Cerdo | No | ~1,000,000 | ~3,000,000 | Placas de 24 pozos |
| Bovino | Sí | ~1,700,000 | ~5,000,000 | Placas de 6 pozos |
Tabla 1: Número de células primarias de PE aisladas de ojos de diferentes especies.
| Nombre | Área | Volumen medio | Tripsina | Medio de volumen para detener la acción de la tripsina | Densidad de siembra |
| Placa de 6 pozos | 9,6 cm² | 3,0 ml | 0,5 ml | 1,0 ml | 3x105 |
| Placa de 24 pozos | 2,0 cm² | 1,0 ml | 0,2 ml | 0,8 ml | 5x104 |
| Placa de 48 pozos | 1,1 cm² | 0,5 ml | 0,1 ml | 0,4 ml | 0,5-1x104 |
Tabla 2: Volúmenes de cultivo celular y densidades de siembra.
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Representative Results
Aislamiento de EP de diferentes especies de mamíferos
Utilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El número de células obtenidas de cada procedimiento depende de la especie y el tamaño del ojo (Tabla 1). Como se muestra en la Figura 1,las células muestran la morfología y pigmentación típica de las células de PE (a excepción de las células de conejo mostradas, derivadas de conejos albinos new zealand white (NZW)). A los 21 días después del aislamiento, las células son confluentes, listas para ser utilizadas para experimentos adicionales (por ejemplo, transfecciones). Cabe señalar que los cultivos de todas las especies se monitorean y controlan hasta 2 años confirmando la morfología normal y la expresión estable de transgenes (datos no mostrados).
La desdiferenciación, el estrés celular y los cambios en la expresión génica fueron excluidos por RT-qPCR e inmunohistoquímica. Un panel de genes (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) analizados en células RPE humanas transfectadas (células ARPE-19) confirmó el patrón normal de expresión de RPE1; que podría confirmarse en células IPE bovinas primarias por inmunofluorescencia para RPE65 (Figura 2). Además, Johnen y sus colegas corroboraron la inmunotinción ZO-1 en células primarias de IPE y RPE porcino36.
Figura 1: Micrografías de células de PE de varios mamíferos a los 21 días después del aislamiento. Las células IPE y RPE de ratón, conejo (conejo albino NZW), cerdo y bovino se muestran en el día 21 después del aislamiento. Para todas las especies, los cultivos mostrados son confluentes. Tenga en cuenta que las células de PE de conejo no están pigmentadas (aumento original, 50x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Inmunotinción RPE65 de células IPE primarias. Tinción RPE65 (verde) de células IPE bovinas transfectadas con el plásmido transposón pFAR4-CMV-PEDF utilizando un número celular inicial de 1 x 104 células en comparación con las células de control no transfectadas (aumento original, 200x). Los núcleos se tiñó con DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Viabilidad del RPE primario transfectado
La viabilidad celular se muestra en la Figura 3. Para excluir una toxicidad potencial del tampón utilizado para el proceso de electroporación, las células RPE primarias precultivadas se suspendieron en tampón de electroporación de un kit disponible comercialmente, o en un tampón de nutrientes desarrollado por una compañía farmacéutica (composición confidencial) y electroporado (E) (sin adición de plásmido) como se describe en el paso 7 del protocolo. La viabilidad celular se estudió 3 ± 1 días después de la transfección utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad disponible comercialmente (ver Tabla de materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ensayos se realizaron siempre con un control sin potencia (Co-P) (no electroporado). No se observó ningún impacto en la viabilidad celular para ninguno de los tampones probados (Figura 3).
Figura 3: Viabilidad de las células primarias de RPE suspendidas en diferentes tampones. 1 x 104 celdas se suspendieron en tampón de electroporación de un kit disponible comercialmente o en un tampón de nutrientes. La viabilidad celular se midió 3 ± 1 días después de la transfección utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad disponible comercialmente. No se observaron diferencias en la viabilidad entre los diferentes tampones; los datos se representan como media ± de SD (n=2 donantes, 3 réplicas/donante). E: celdas electroporadas, Co-P: control sin alimentación. AU: unidades arbitrarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Transfecciones de células pe precultoras con el gen Venus reporter
50,000-100,000 células de PE precultivadas de diferentes especies fueron transfectadas con la proteína venus fluorescente amarilla (pT2-CAGGS-Venus) utilizando el sistema hiperactivo de entrega de genes transposones SB100X. Las micrografías que se muestran en la Figura 4 corroboran que las células fueron transfectadas con éxito (células fluorescentes a los 21 días después de la transfección). La Figura 5 muestra la cuantificación de la eficiencia de transfección en células RPE de cerdo precultos (n=6 donantes, 50.000 células/transfección) transfectadas con Venus (pT2-CAGGS-Venus). El porcentaje de células fluorescentes y MFI se midió mediante citometría basada en imágenes siguiendo las instrucciones del fabricante el día de la terminación del cultivo celular (30 ± 5 días después de la transfección). El porcentaje medio de células fluorescentes fue del 50 ± 30% pero variable oscilando entre el 95 ± el 6% (donante 2) y el 28 ± el 1% (donante 4)(Figura 5). En todos los experimentos, se utilizaron células ARPE-19 transfectadas como control positivo. Además, la eficiencia de transfección siempre se comparó con los controles negativos: Co-P (control sin potencia [no electroporado]) y Co+P (control con potencia [electroporado pero sin adición de plásmidos]). El experimento también se ha realizado con células IPE (datos no mostrados).
Figura 4: Micrografías de células de PE precultos transfectadas con pT2-CAGGS-Venus. Lascélulas de PE de conejo transfectado por Venus (A), bovina (B) y porcina (C) se muestran a los 21 días después de la transfección. Como control positivo, 50.000 células ARPE-19 fueron transfectadas con Venus (D). Micrografía izquierda: campo brillante, micrografía derecha: filtro GFP (480 nm) (aumento original, 50x). Las transfecciones se realizaron por triplicado y se incluyeron controles negativos: Co-P (control sin potencia [no electroporado]) y Co+P (control con potencia [electroporado pero sin adición de plásmidos]) (no mostrado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Eficiencia de transfección en células RPE porcinas transfectadas con el gen reportero de Venus. (A) 50.000 células primarias de RPE porcino fueron transfectadas con pT2-CAGGS-Venus, la eficiencia media general de transfección fue de 50 ± 30% y la IMF media fue de 2712 ± 197 en el día de la terminación de los cultivos celulares (30±5 días después de la transfección). El gráfico muestra la media ± SD (n=3 réplicas) de 6 animales diferentes. (B) El porcentaje de células Venus+ ARPE-19 utilizadas como control positivo, fue del 98±6% y se mantuvo estable durante los 138 días que se siguieron las células. La intensidad media de fluorescencia (IMF) fue de 5.785 ± 1.255. El gráfico muestra la media ± SD (n = 3 réplicas) para cada día. Co-P (control sin potencia [no electroporado]) y Co+P (control con potencia [electroporar pero sin adición de plásmidos]) se incluyeron en todos los experimentos de transfección (no mostrados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Transfecciones de células recién PE con el gen Venus reporter
10.000-50.000 células de PE recién aisladas de conejos fueron transfectadas con la proteína fluorescente amarilla Venus (pFAR4-CMV-Venus), y los cultivos celulares fueron monitoreados por microscopía. En la Figura 6 se pueden observar células fluorescentes en el día 21 después de la transfección. El porcentaje de células fluorescentes medidas por citometría basada en imágenes fue del 53 ± 29% para las células IPE y del 28 ± 23% para las células RPE (datos no mostrados).
Figura 6: Micrografías de células de PE recién transfectadas aisladas de conejo. 50.000 células IPE y RPE de conejo fueron transfectadas con pFAR4-CMV-Venus. La fluorescencia se muestra en el día 21 después de la transfección. Micrografía izquierda: campo brillante, micrografía derecha: filtro GFP (480 nm). En todos los casos, las transfecciones se realizaron por triplicado (aumento original, 50x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Transfecciones de células PE con los genes terapéuticos PEDF y GM-CSF
50.000 células de PE fueron transfectadas con PEDF y la secreción de proteínas fue monitoreada por WB (Figura 7). La señal WB para las células transfectadas fue mayor en comparación con las células no transfectadas para todas las especies y días estudiados; no se observó una disminución en la secreción de proteínas dentro de este tiempo.
Figura 7: Análisis WB de la secreción peDF de células PE transfectadas. El análisis WB de sobrenadantes de cerdos (precultos)(A)y bovinos (frescos)(B)de células de PEDFtransfectadas muestra una mayor secreción de PEDF en comparación con el control (células no transfectadas) y estable en el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: Instrumentos utilizados para el aislamiento de EP dependiendo de la especie. (A) Instrumentos no estériles utilizados para la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes. El conjunto 1 se usa para ratas, ratones y conejos, y el conjunto 2 se usa para ojos de cerdos y vacas. (B) Instrumentos estériles utilizados para el aislamiento de EP. Tenga en cuenta el diferente tamaño de las tijeras y las pórceps utilizadas según el tamaño del ojo. Las pipetas Pasteur redondas y planas pulidas al fuego se utilizan para el raspado de RPE e IPE, respectivamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Contar con métodos estandarizados para aislar y cultivar células de EP es fundamental en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para las enfermedades degenerativas de la retina. Con los protocolos presentados aquí, las células de PE pueden aislarse con éxito de diferentes especies y cultivarse durante largos períodos (hasta ahora, el cultivo más largo se mantuvo durante 2 años1,38); se observó morfología, pigmentación y función típicas de las células de PE(Figura 1, Figura 2). Tenga en cuenta que particularmente para los cultivos de RPE puro, es importante extraer completamente la retina para evitar la contaminación con células retinianas neurales; para las células IPE, el cuerpo ciliar debe extraerse del iris como se explica en el protocolo. La confluencia de las células se logra en un tiempo relativamente corto (~ 21 días), después de lo cual las células están listas para la transfección con genes terapéuticos o para su uso en otros experimentos (por ejemplo, exposición a agentes tóxicos, proteínas, etc.). Además, los protocolos no solo son cruciales para las pruebas preclínicas in vitro e in vivo, sino también para la aplicación humana, es decir, la validación de trasplantes de células de EP transfectadas; particularmente para el tratamiento de la DMAE como en desarrollo por nuestro grupo, donde las células IPE se aislarán de una biopsia de iris, se transfectarán inmediatamente y se trasplantarán subretinalmente al mismo paciente dentro de una sesión quirúrgica. El aislamiento y trasplante subretinario de células IPE autólogas se estableció en conejos39 y pacientes23. Dado que el trasplante de células IPE autólogas fue exitoso pero no suficiente para restaurar la visión, la transfección de las células para sobreexpresar factores neuroprotectores, como PEDF y GM-CSF, se había agregado al enfoque y se estableció en tres especies más (ratón, rata y ganado). Con los métodos descritos aquí para el aislamiento, cultivo y modificación genética de células PE, ahora se pueden preparar trasplantes celulares respectivos de varias especies para probar la toxicidad y la eficiencia del enfoque in vivo.
Se demostró que, utilizando el sistema de transposones SB100X hiperactivo, las células PE de diversos orígenes pueden modificarse eficientemente para sobreexpresar PEDF (Figura 7); se han publicado resultados similares utilizando IPE y RPE24 de rata y células de RPE humano29,30. La transfección con PEDF se ha propuesto para tratar la nvAMD mediante la inhibición de la neovascularización mediada por VEGF y la protección de las células RPE y las neuronas de la retina contra el glutamato y el estrés oxidativo, así como la isquemia40,41. La corroboración de la secreción estable de proteínas a largo plazo(Figura 7)confirmó que las células de PE son un "sistema de administración de fármacos" biológico confiable. En este sentido, la eficiencia de transfección estudiada con el gen reportero Venus (Figura 4, Figura 5, Figura 6)confirmó altas eficiencias de transfección de ~ 20-100% (dependiente de especies y donantes) como se informó en Johnen et al. 1.
Cabe señalar que aunque el tamaño de los plásmidos utilizados fue variable, desde miniplásmidos pFAR (~ 3,000 pb) hasta plásmidos con una columna vertebral pT2 (~ 5,000 pb)30,las eficiencias de transfección fueron comparativamente altas. Las diferencias observadas en la eficiencia de la transfección probablemente se deban a la variabilidad en el tiempo desde la enucleación hasta el aislamiento celular y en la preservación del tejido, pero no alteraron la morfología celular ni el tiempo en que las células alcanzan la confluencia (~ 21 días después del aislamiento), o el tiempo que las células fueron seguidas después de la transfección. En general, una consideración importante para lograr una transfección exitosa es que la fuente de células pe debe ser lo más fresca posible; esto es particularmente importante para las transfecciones con células de PE recién aisladas.
En comparación con los trasplantes de láminas celulares, la terapia que nuestro grupo está desarrollando (células transfectadas trasplantadas subretinalmente como suspensión celular) es menos invasiva ya que la primera requiere grandes retinotomías con los riesgos asociados de vitreorretinopatía proliferativa y fibrosis subretinista42. Además, en los injertos de lámina para DMAE húmeda se extirpa la zona de la CNV junto con la coroides adyacente y por tanto, la supervivencia del injerto podría verse comprometida43. Finalmente, la idea de utilizar un parche celular no es compatible con el procedimiento propuesto, donde el aislamiento, modificación y trasplante de las células se realiza durante una sola sesión quirúrgica. Por otro lado, los problemas inherentes de las células PE trasplantadas como suspensiones celulares son la muerte celular potencial durante el parto, la falta de adhesión y la varianza en la distribución celular; pero estos inconvenientes podrían superarse mediante enfoques de ingeniería de tejidos42; además, la supervivencia celular podría mejorarse mediante el uso de agentes pro-supervivencia44,45,46,47. Creemos que el trasplante de células PE primarias que sobreexpresan factores neuroprotectores como PEDF y GM-CSF como suspensión celular es un enfoque prometedor para tratar la DMAE, y para desarrollar esta terapia los protocolos presentados aquí son cruciales ya que permiten la estandarización del aislamiento, cultivo y análisis de las células PE primarias.
En resumen, el protocolo ofrece un sistema modelo avanzado para el desarrollo y las pruebas preclínicas in vitro e in vivo de terapias medicinales avanzadas oculares en cinco especies diferentes, lo suficientemente robusto como para compensar las variaciones individuales en la calidad celular de las diferentes fuentes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Un agradecimiento merece a Gregg Sealy y Alain Conti por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Comisión Europea en el contexto del Séptimo Programa Marco, la Fundación Nacional Suiza de Ciencias y la Fundación Schmieder-Bohrisch. Z.I. recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] y B.M.W. de una beca de investigación Fulbright y una beca de excelencia del gobierno suizo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
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