Summary
准备好的 DOX-CL 脚手架满足了机械强度、孔隙度、吸水率、降解率、持续释放、抗菌、生物相容性和抗炎特性的理想 DW 敷料的先决条件，这些都被认为是 DW 中受损组织恢复的关键。
Abstract
糖尿病的一个主要并发症是糖尿病伤口（DW）。糖尿病炎症的延长阶段阻碍了导致伤口愈合延迟的进一步阶段。我们选择多西环素（DOX），作为一种潜在的药物的选择，因为它的抗菌性能，以及它报告的抗炎特性。目前的研究旨在制定DOX加载胶原蛋白-奇托桑非交联（NCL）和交联（CL）脚手架，并评估其在糖尿病条件下的愈合能力。脚手架的定性结果表明，与 DOX-NCL 脚手架相比，DOX-CL 脚手架具有理想的孔隙性、低肿胀和降解率以及 DOX 的持续释放。 体外 研究表明，与处理和控制组的 CL 脚手架相比，DOX-CL 脚手架具有生物相容性和增强的细胞生长。抗菌研究表明，DOX-CL脚手架比CL脚手架对DW中最常见的细菌更有效。使用链球菌素和高脂肪饮食诱导的DW模型，观察到DIX-CL脚手架治疗组的伤口收缩速度明显（p≤0.05）。使用 DOX-CL 脚手架可以证明是治疗 DW 的有希望的方法。
Introduction
糖尿病（DM）是一种身体未能提供胰岛素或对直接糖的异常消化结果作出反应的情况，导致血糖 1的激增。DM 最连续和最破碎的纠缠是糖尿病伤口 （DW）。大约25%的DM患者有机会在有生之年建立 DW。DW 的阻碍愈合被认可为 DM 的三种病变：免疫病变、血管病和神经病变。每当DW得不到治疗，它可能导致坏死的发展，因此促使有关器官 2的删除。
大量的治疗方法，如指导病人（每天检查伤口，清洁伤口，避免对伤口造成压力的活动，定期葡萄糖监测等），控制他们的血糖，伤口脱脂，压力卸载，医疗程序，高压氧疗法，和先进的治疗是在实践3，4。鉴于多因素病理生理条件和与这些药物相关的意外费用，这些药物大多未能解决DW护理至关重要的所有先决条件。即使DW发病机制是多因素的，但组织管理不当的持续炎症是DW 5、6中延迟愈合的实际原因。
DW中炎症和亲炎症调解人的增加水平导致导致伤口愈合延迟的生长因子减少2，6。DW 中细胞外矩阵 （ECM） 的形成被认可为矩阵金属蛋白酶 （MMP） 水平增加，导致已形成的 ECM 的快速降解。在MMP中，MMP-9被报告为主要中间人，负责长期炎症和快速ECM降解7。据说，局部治疗与抗炎药物，降低MMP-9的升高水平，重新建立皮肤平衡，框架安排，并提示更好的愈合DWs8，9。
多西环素（DOX），一种MMP-9抑制剂，被选择来抑制MMP-9的升高水平，MMP-9是负责10、11、12号DWs持续炎症的主要炎症调解人。此外，DOX 拥有抗氧化剂（产生能够与活性氧物种结合的自由羟基和苯氧基）13和抗凋零（抑制卡斯帕塞表达和线粒体稳定）14项对治疗 DW 至关重要的活动。选择了包含 DOX、胶原蛋白 （COL） 和奇托桑 （CS） 的框架安排。COL的选择取决于它如何帮助提供必要的框架负责机械强度和组织再生15。另一方面，CS在结构上与糖糖糖素同源，与几个伤口愈合阶段相关。另据报道，CS持有显著的抗菌特性15。因此，DOX 的 COL/CS 脚手架被配制以抑制长期炎症，然后支持矩阵形成，以便在 DM 条件下成功愈合伤口。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物程序都得到了印度奥蒂JSS药学院动物伦理委员会的批准。
1. 通过冷冻干燥方法制备 DOX 装载多孔脚手架
- 将 1.2 克 COL 添加到 100 毫升水（例如米利波尔），并留出以防肿胀。
- 在 2000 rpm 时搅拌肿胀的 COL 分散，以确保 COL 完全解散。
- 通过溶解约 0.8 克 CS 在 100 mL 的 1% 醋酸中准备 CS 解决方案。
- 在 2000 rpm 时将 CS 解决方案搅拌过夜，以确保均匀分散。
- 将 DOX（1% w/v）混合，然后将 CS 解决方案混合到 COL 溶液中，搅拌 30 分钟。
- 使用粘膜布过滤获得的物理混合物，以去除颗粒物。
- 将获得的过滤剂在 -85 °C ± 4 °C 下深度冻结约 24 小时。
- 将深冷冻混合物在 -85 °C ± 4 °C 72 h 下进行嗜好。
- 将所得的脚手架存放在干燥器中，以便进一步分析。
2. 脚手架的交叉链接
- 在 50 mL 水中溶解 MES （0.488 g）。
- 将 50 毫克的 DOX 装载脚手架浸泡在 MES 缓冲器的 20 mL 中，浸泡 30 分钟。
- 将 19.5 mL 的 MES 缓冲器与 0.1264 克 EDC 和 0.014 克 NHS 混合在单独的烧嘴中。
- 将脚手架浸入缓冲混合物中4小时，实现 16的交联。
- 存储 DOX 加载的交联 （CL） 和非交联脚手架 （NCL） 以进行进一步评估。
3. 脚手架的特征
- 使用扫描电子显微镜（SEM）进行形态学检查
- 使用 SEM（1 厘米× 1 厘米× 0.5 厘米）对脚手架进行形态分析。
- 用细腻的黄金层（+150+）弄脏脚手架的横截面和外表面。
- 在 5 kV 和 10 kV 的激发电压下拍摄照片。
- 将样品放入铝存根中，并以大约 9 V 的黄金包裹。
- 使用 SEM 测量脚手架，分辨率提高 10 kV。
- 孔隙度确定
- 使用液体位移法（乙醇 ）18测量脚手架的孔隙度。
- 使用以下公式计算脚手架的孔隙度。
Ww = 脚手架的湿重量
Wd = 脚手架的干重量
Wv = 脚手架的体积
- 确定吸水能力
- 测量脚手架的干重。
- 在磷酸盐缓冲盐 （PBS） pH 7.4 中，在 37 °C 下孵育称重脚手架，换 24 小时。
- 使用滤纸去除脚手架上多余的 PBS。
- 使用以下公式 17测量吸水能力。
WS = 吸水百分比
W1=脚手架的湿重量
W0= 脚手架的干重量
- 脚手架降解
- 在 37 °C 下将脚手架（1 厘米 x 1 厘米）孵育 7 天，在含有酶的 pH 7.4 的 PBS 中。
- 清洗脚手架，去除表面上任何粘附的离子。
- 冷冻干燥洗过的脚手架17。
- 使用公式计算降解率。
Ww = 脚手架的初始重量
Wd = 冻干后脚手架的重量
-
体外 释放研究
- 使用透析袋法确定 DOX 从脚手架上的释放行为。
- 将脚手架分散在几毫升模拟伤口液（pH 7.4）中，并将其转移到透析袋中。
- 紧紧关闭膜袋的末端，沉浸在 500 mL 的模拟伤口液溶液中。
- 在 200-250 rpm 时搅拌含有透析袋的伤口液溶液。
- 收集超高溶液，并在一定时间间隔内用同等数量的新鲜缓冲液替换。
- 使用 240 nm 的紫外可见光谱仪确定超高频解决方案中脚手架中的 DOX 释放百分比。
4. 体外 抗菌研究
- 使用微汤稀释法确定CL和DOX-CL脚手架对S.Aureus、S.表皮、大肠杆菌、P.Aeruginosa的最小抑制浓度（MIC）。
- 使用穆勒-欣顿肉汤以1：1000的比例准备细菌培养物，以获得0.5麦克法兰浊度。
- 添加D-葡萄糖（800毫克/分升）到细菌培养物高糖19，20。
- 在 DMSO 中对 CL 和 DOX-CL 进行薄荷和溶化（负控制）。
- 连续稀释 96 井板中的高血脂细菌悬浮 （100 μL） 和测试样品（100 μL 脚手架溶液）。
- 在 37 °C 下孵育板，20-24 小时。
- 以600纳米 21的波长记录吸收。
5. 体外 生物相容性研究
- 使用 MTT [（3-（4，5 二甲基硫化物-2 yl） -2，5-二苯基三聚氰胺溴化物）评估制备脚手架的生物相容性。
- 对标准尺寸的脚手架进行消毒，并将其放置在 24 个井板中。
- 将 3T3-L1 细胞添加到 24 井板中，孵育 72 小时。
6. 体内 动物研究
- 诱导 DM 和切除伤口
- 用高脂肪饮食喂养动物两周，并在柠檬酸盐缓冲液中给白化病大鼠（180-200克）服用一剂链球菌素（STZ）（50毫克/千克体重），用于诱导2型糖尿病。
- 选择血糖持续为250毫克/分升的动物进行研究。
- 随机选择的动物，以感应切除伤口。
- 使用二乙醚（5 mL 被添加到先前饱和麻醉室）麻醉糖尿病大鼠，并确认使用脚趾捏法和粘膜颜色。
- 使用无菌修剪器和刀片（A40）剃须肩部区域（多萨尔胸腔、腰部区域）。
- 用酒精棉签消毒剃须区。
- 在剃须区域使用无菌手术 A40 刀片切除皮肤（2 x 2 厘米2 和 1 mm 的深度），以创建一个开放的伤口。
- 将动物分成三组（第1组-疾病控制（控制），第2组-CL脚手架（安慰剂），第3组-DOX CL脚手架），每组由6只大鼠组成。
- 使用手术胶带贴上 CL 和 DOX CL 脚手架，用无菌纱布覆盖对照组 21 天。
- 在无菌 OHP 表上跟踪伤口区域，并使用网格方法测量所有组在 0、7、14 和 21 天伤口的减少百分比。
- 使用以下公式计算伤口减少百分比。
7. 组织病理学研究
- 在第 7 天、第 14 天和第 21 天隔离愈合的伤口区域，储存在正式溶液中（10%）。
- 使用微原子对组织进行分割，以获得 6 μm 的厚度。
- 使用血氧林和欧辛 17将部分安装在玻璃滑梯上并弄脏。
- 使用数字显微镜捕捉 40 倍放大倍以下的图像。
8. 羟基丙线估计
- 在第 0 天、第 7 天、第 14 天和第 21 天隔离愈合的伤口区域进行评估。
- 使用 Reddy G 等人描述的程序估计羟基丙林含量，1996 年 22 日。
9. 伊丽莎测试
- 根据制造商的说明，使用 Elisa 套件估计 MMP-9 级别。
- 在第21天从愈合的伤口区域分离组织样本，然后使用组织同质化剂切碎。
- 离心获得的同质化和收集超高纳特。
- 使用检测缓冲器将超高纳特稀释 100 倍。
- 使用多个板读取器扫描板。
10. 统计分析
- 将获得的结果表示为平均± SD。
- 使用图形垫棱镜 v5.01 执行统计分析。
- 使用方差单向分析 （ANOVA） 和 Dunnet 的事后测试来获得统计学意义。
- 将 p≤0.05 值视为重要值。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DOX 加载 NCL 和 CL 脚手架的特征
在目视检查中，NCL 和 CL 脚手架被发现为彩色奶油色。此外，两个脚手架似乎都像海绵，僵硬和无弹性时，身体检查。NCL 和 CL 脚手架的 SEM 图像显示在 图 1中。从数字上看，通过形成分子间联系，在交叉链接后，孔径尺寸明显减少。此外，NCL和CL脚手架孔隙度分别为92.3±4.21和71.35±2.65。NCL和CL脚手架的吸水百分比为750±11.4%和492±8.66%，间隔24小时。
此外，在由酶组成的pH 7.4的模拟伤口液中进行了7天的生物降解研究。NCL脚手架在前三天最初表现出更快的降解速度，并连续四天缓慢下降。另一方面，CL脚手架显示长期退化。脚手架的交叉链接增强了机械性能和网络强度，进而降低了降解率，表明对降解的抵抗力有所提高（图2）。
此外，从NCL和CL脚手架的DOX 体外 释放进行了120小时（图3）。在最初的1小时，27.92±3.45%的DOX从NCL脚手架释放，而只有16.54±2.21%DOX从CL脚手架释放。6小时后，DOX从脚手架释放增加了63.15±3.78%的NCL脚手架和44.43±3.57%的CL脚手架。24 小时后，NCL 脚手架释放了 70% 的 DOX，而 CL 脚手架需要超过 72 小时才能释放 70% 的 DOX。根据获得的结果，DOX 加载的 CL 脚手架被选为进一步评估，并作为 DOX-CL 脚手架进行表示。而没有 DOX （安慰剂） 的 CL 脚手架被指定为 CL 脚手架。
体外 抗菌研究
DW 患者通常会经历感染，导致伤口愈合时间过长。因此，准备的脚手架被检查其抗菌活性使用MIC对选定的细菌面板（表1）。从结果中可以明显看出，DOX表现出抑制活性，对 S.尿素 和 S.表皮 的MIC为<4微克/mL。观察到对 大肠杆菌 和 P.阿鲁吉诺萨的MIC为<8微克/mL和<16微克/mL。单独的奇托桑和CL脚手架提取物对选定的生物体表现出最小的活性，如 S.奥雷乌斯 （<64 μg/mL）、S. 表皮 （<64 μg/mL）、 大肠杆菌 （<128微克/mL）和 P.阿鲁吉诺萨 （<128微克/mL）。DOX-CL脚手架已显示出类似的抑制活性与MIC<2微克/mL对 S.尿素 和 S.表皮。此外，DOX-CL脚手架展示了适度的活动，MIC为<8微克/mL，对 大肠杆菌 和 P.阿鲁吉诺萨。
体外 生物相容性研究
进行了 MTT 检测，以确定 3T3-L1 细胞在 CL 和 DOX-CL 脚手架面前的细胞生存能力。结果表明，CL和DOX-CL脚手架没有刺激任何细胞毒性。此外，在脚手架治疗组的细胞生存能力比控制组相对较高，表示在脚手架存在的情况下成纤维细胞的生长增强（图4）。
体内 伤口愈合研究
所有组的平均伤口面积均减少，使用图形方法在第 0 天、第 7 天、第 14 天和第 21 天确定（图 5）。在目视检查中，CL和DOX-CL脚手架治疗组的伤口在第七天没有渗出。与此同时，对照组的伤口渗出。第14天，在所有组中观察到干疤痕：然而，在 DOX-CL 脚手架（89.663%）中观察到伤口收缩的速度更快。第21天，99.9%的伤口愈合，在DOX-CL脚手架上形成疤痕，而部分愈合观察控制和CL脚手架治疗组。
组织病理学研究
组织病理学观察伤口愈合的第七天后，显示所有皮肤层在伤口的边缘在所有组中断。表皮没有能见度：然而，在对照组中观察到主要的中性粒细胞，有间歇性单核细胞和淋巴细胞。在CL脚手架治疗组中，表皮的中度能见度与少数嗜中性粒细胞和巨噬细胞一起被注意到。然而，在DOX-CL脚手架治疗组中，伤口覆盖着一层薄薄的表皮，代表再皮化阶段。轻度嗜中性粒细胞和巨噬细胞，以及造粒组织，在DOX-CL脚手架治疗组也更常见。
在受伤后的第14天，发现所有群体的伤口都覆盖着表皮。在对照组中，表皮层与占上风的嗜中性粒细胞一起被观察为非常薄的层。在CL脚手架处理组中，形成的表皮层比对照组的表皮层厚，以及温和的多核大细胞。在DOX-CL脚手架处理组中，与其他组相比，表皮发育较厚，同时具有丰富的组细胞和巨大的多核细胞。在 DOX-CL 脚手架处理组中也观察到了成纤维细胞的密集区域。
在21日手术后，在对照组中，随着巨噬细胞和组织细胞的复发，中性粒细胞的占主导地位的数量减少，代表炎症的减少。然而，在CL脚手架治疗组中，观察到适量的组织细胞和淋巴细胞。观察到，DOX-CL脚手架处理组的表皮比对照组的表皮厚得多，同时还有大量组细胞、淋巴细胞和大量多核细胞。在DOX-CL脚手架治疗组中，嗜中性粒细胞数量在第7天减少。此外，在第14天和第21天（图6），人们注意到巨噬细胞及其形态变异的聚集，如多核大细胞和组织细胞。
羟基丙线估计
羟基丙基估计是间接测量愈合伤口中胶原蛋白的含量。较高的羟基丙酸浓度表示伤口愈合的快速百分比。生化检查显示，DOX-CL脚手架处理组的羟基丙胺含量高于对照组（图7）。
使用 Elisa 套件进行 MMP-9 估计
与对照组相比，DOX-CL脚手架处理组的MMP-9含量显著下降，CL脚手架处理组的MMP-9含量显著下降。与 DOX-CL 脚手架处理组相比，CL 脚手架处理组中的 MMP-9 含量略低，如图 8 所示。
图1：DOX加载COL-CS脚手架 的形态学 a） 在 CL 和 b） CL 确定后，由 SEM 在 50 μm 的尺度范围内。 请点击这里查看此图的较大版本。
图2：从PBS pH 7.4的第1天到第7天，在NCL和CL脚手架中装载的DOX矩阵降解在37°C显示NCL逐渐降解7天。与此相反，CL脚手架降解率显著降低，表明对酶降解的抵抗力增强。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在37°C的PBS pH 7.4中，NCL和CL脚手架的DOX体外药物释放配置文件显示所有制剂中药物释放缓慢，随后持续释放。以平均± SD （n+3） 表示的数据。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：3T3-L1细胞在CL和DIX-CL脚手架的存在下培养，显示DIX-CL脚手架处理组的细胞生长百分比更多，其次是CL脚手架处理和控制。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：（a） 表示控制、CL脚手架和DOX-CL脚手架治疗组在受伤后第0天、第7天、第14天和21日平均伤口面积减少的图像。（b） 控制、CL脚手架和 DOX-CL 脚手架治疗组在受伤后的第 0 天、7 日、第 14 天和 21 日平均伤口面积减少的图形表示。数据表示为平均± SD（n=6 伤口/组）。统计学意义是通过方差单向分析（ANOVA）获得的，然后是邓纳特的特设测试。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：在STZ伤口愈合过程中的组织学变化和高脂肪饮食诱发的糖尿病在威斯塔白化病鼠皮肤在第7天，14天和21天没有（控制）和治疗（CL和DEX-CL脚手架）在全厚切除伤口模型。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：代表第0天、第7天、第14天和第21天伤口中羟基丙基蛋白含量的结果，作为间接胶原蛋白水平估计的指标。结果以 μg 羟基丙林/毫克干伤口组织表示。数据表示平均±SD（n=6伤口/组）。统计学意义是通过方差单向分析（ANOVA）获得的，然后是邓纳特的特设测试。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：图为21日从STZ愈合的伤口和高脂肪饮食诱发的糖尿病大鼠模型中获得的同质性中MMP-9水平。MMP-9 水平是使用 ELISA 分析在 100 倍的伤口液中确定的。数据表示平均±SD （n=3）。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 麦克风 （μg/mL） | ||||
| 测试示例 | 美国奥雷乌斯 | 表皮 | 大肠杆菌 | P. 阿鲁吉诺萨 |
| 多克斯 | <4 | <4 | <8 | <16 |
| CS | <64 | <64 | <128 | <128 |
| CL 脚手架提取物 | <64 | <64 | <128 | <128 |
| DOX-CL 脚手架提取物 | <2 | <2 | <4 | <4 |
表1：CS、DOX、CL和DOX-CL脚手架对选定细菌面板的最小抑制浓度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究的主要目的是确定 DOX 装载的 COL-CS 脚手架对大鼠 DW 愈合的影响。CL 和 NCL 在形态、肿胀指数、体外释放动力学和生物相容性方面进行了准备和评估。
DOX 加载 NCL 和 CL 脚手架的特征
已准备好的脚手架被发现多孔，毛孔相互连接。这些相互关联的毛孔确保多孔、海绵状的性质，有助于将氧气和营养物质适当扩散到细胞中，从而促进增殖和迁移，从而加速愈合。在这里，孔径大小主要取决于交叉链接。通过EDC/NHS与CS和COL形成强大的分子内相互作用，将脚手架交叉连接，从而减少了毛孔大小，从而增加了脚手架的机械强度。
孔隙度指数依赖于相对密度，这是海绵支柱和体积质量的函数。通常，如果交叉链接剂通过将脚手架拖得更近而改变支柱位置，导致脚手架密度增大，则会发生脚手架体积收缩。然而，就碳二胺化学而言，由于其独特的机制，即使用碳化物（>COOH）和邻近肽链胺（-NH）组的胺（-NH）组引入中间体链（O+C-NH），而不进入脚手架，预计脚手架的质量不会增加。同时，在交联过程中，由于未连接聚合物链的溶解和迁移，可能会发生轻微的质量损失。然而，在EDC/NHS的脚手架处理的情况下，并没有对脚手架形态产生任何明显的影响。
脚手架吸收生物液体的能力对于评估其作为药物载体的适宜性至关重要。吸水特性不仅影响脚手架的形状，而且影响细胞生长。据观察，CL脚手架的吸水率低于NCL脚手架，这可归因于脚手架的交叉链接。此外，由于（一） 亲水团体（>COOH + NH）在水联形成过程中丧失，脚手架材料的亲水性显著降低;（二） 通过形成新债券抑制肿胀（O+C-NH）。这些结果与先前发表的23、24份报告是一致的。
通过监测由酶组成的pH 7.4模拟伤口液中潜伏7天后剩余质量的百分比，进行了酶生物降解研究。NCL脚手架在前三天最初表现出更快的降解速度，并连续四天缓慢下降。另一方面，CL脚手架显示长期降解率。脚手架的交叉连接增强了机械性能和网络强度，进而降低了降解率，显示出对降解的抵抗力的提高。
药物释放研究为CL和NCL脚手架进行了120小时。一般来说，脚手架的药物释放系数会随着交叉链接密度的增加而降低，因为毛孔之间的互连增强和多肽链之间的空间减少。药物释放系数也受到孔隙度指数、含水量、肿胀指数和交联程度的影响。在我们的研究中，NCL脚手架中 DOX 的 27.92±3.45% 和 63.15± 3.78%，而 CL 脚手架的 16.54±2.21% 和 44.43± 3.57% 的 DOX 分别在 1 小时和 6 小时发布。24 小时后，NCL 脚手架释放了 70% 的 DOX，而CL 脚手架花了超过 72 小时才释放 70% 的 DOX。结果表明，脚手架交联通过降低肿胀比和含水量对DOX释放产生反比影响。
体外 抗菌研究
DOX-CL脚手架提取物对克阳性生物体表现出较高的抑制活性（MIC）。DOX-CL 脚手架提取物的活性较高可能是因为样品的疏水性增加。然而，DOX-CL脚手架提取物对克阴性生物的活性极小，可能是由于细胞壁穿透失败。此外，DOX-CL 的 MIC 高于 CS、CL 脚手架和 DOX 样本，这可归因于 DOX 和 CS 在 DOX-CL 提取物中的协同活动。
体外 生物相容性研究
体外生物相容性研究是在成纤维细胞（3T3-L1）上进行的。成纤维细胞负责ECM和蛋白质的生产。此外，它们通过加强伤口愈合所需的框架的形成，在保持结构完整性方面发挥着关键作用。结果表明，DOX-CL脚手架和CL脚手架没有产生任何细胞毒性。然而，在脚手架毛孔中观察到两个脚手架组的细胞生长和成纤维细胞的分化，表明准备好的脚手架是生物相容的。两组细胞生长和分化增加的主要原因是脚手架结构中存在CS和COL作为细胞外基质。
此外，由于负责细胞生长和生存 的DOX激活PI3K-AKT信号，DOX-CL脚手架组的细胞生长相对较高。
体内 伤口愈合研究
DM 的各种并发症是 DW 长期愈合的原因。为了模仿大鼠的糖尿病状况，我们采用高脂肪饮食，然后在腹内注射STZ。经过2-3天的糖尿病确认，在胸腔区域皮肤切除后，产生了开放性伤口。治疗用各自的脚手架进行了21天。在0、7、14和21天确定所有组的伤口面积减少。与 CL 脚手架组和未治疗组相比，使用 DOX-CL 脚手架治疗的糖尿病大鼠表现出相当程度的伤口收缩。
伤口愈合的炎症阶段负责功能屏障的形成。在下一阶段，伤口愈合的增殖阶段在伤口护理中引起注意，其中 43% 的伤口面积减少与 DOX-CL 脚手架组一起观察到。相比之下，在第7天，只有23%和7%的受人观察到CL脚手架和未经治疗的组。从图像（图5）中，伤口的收缩是在炎症和增殖阶段完成后开始的。DOX-CL脚手架组表现出严重的伤口收缩，由于DOX的存在，这是负责抗炎和抗感染作用。此外，脚手架中的 COL 和 CS 帮助细胞增殖、分化和迁移，导致 99% 的 DW 在 21 天内愈合。
未经治疗的切除伤口显示，在受伤后的第7天，嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。如前所述，嗜中性粒细胞在伤口愈合的早期阶段有助于伤口脱颤。此外，嗜中性粒细胞的过多可能通过损害正常组织对愈合过程产生负面影响。据多维等人报告，极少数嗜中性粒细胞加速了 26日的再体细胞化过程。
此外，DOX-CL脚手架治疗组中增加的巨噬细胞、组织细胞和大量多核细胞有利于通过修复受损细胞和促进 COL 合成来加速伤口愈合的环境。此外，COL 与组织的结合是使用所有组中的羟基丙线水平确定的。然而，与未处理和CL脚手架处理组相比，DOX-CL脚手架处理组的羟基丙胺水平相对较高。如文献所述，糖尿病状况的长期炎症阶段阻碍了其他愈合阶段。DOX-CL 脚手架的伤口收缩速度较快可归因于 DOX 的抗炎特性，导致伤口的进一步阶段发生在适当的时间阶段，导致伤口愈合加速。
使用 ELISA 测试对 MMP-9 水平进行生化估计后发现，与 CL 脚手架处理和未处理组相比，DOX-CL 脚手架处理组的 MMP-9 水平有所降低。根据文献，MMP-9水平增加导致基质降解，这反过来又延长了伤口愈合过程。DOX，一种抗炎剂，抑制了MMP-9水平，这被认为是防止COL崩溃的原因，导致加速DW愈合。这些结果与林德曼等人早前发表的研究一致，2009年和张等人，2014年27，28。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢阿希什·瓦德瓦尼博士。（印度奥蒂JSS药学院药物生物技术系助理教授兼系主任）协助 体外 细胞生存能力研究。
作者要感谢新德里大学和高等教育机构科技基础设施改善基金（DST-FIST）支持我们系。
作者也想感谢三菊先生。S 和斯里拉姆先生纳鲁库拉M.制药学生的支持，在视频拍摄。
这项研究得到了JSS高等教育与研究学院（JSSAHER）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
