Summary
Hazırlanan DOX-CL iskelesi, DW'lerde hasarlı dokunun geri kazanılması için gerekli olduğu düşünülen mekanik mukavemet, gözeneklilik, su emme, bozulma oranı, sürekli salınım, anti-bakteriyel, biyouyumluluk ve antienflamatuar özelliklerde ideal bir DW pansumanının önkoşullarını karşıladı.
Abstract
Diabetes mellitus'un en önemli komplikasyonlarından biri diyabetik yaralardır (DW). Diyabette iltihabın uzun süreli evresi, yara iyileşmesinin gecikmesine yol açan bir yaralanmanın ileri aşamalarını engeller. Bildirilen antienflamatuar özellikleri ile birlikte anti-bakteriyel özellikleri nedeniyle, tercih edilen potansiyel bir ilaç olarak doksiksin (DOX) seçtik. Mevcut çalışma, DOX yüklü kollajen-kitosan çapraz bağlı olmayan (NCL) ve çapraz bağlı (CL) iskeleleri formüle etmeyi ve diyabetik koşullarda iyileşme yeteneklerini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. İskelelerin karakterizasyon sonucu, DOX-CL iskelesinin DOX-NCL iskelesine kıyasla ideal gözeneklilik, düşük şişlik ve bozulma oranı ve sürekli bir DOX salınımı barındırdığını ortaya koymaktadır. Tüp bebek çalışmaları, DOX-CL iskelesinin cl iskelesi tedavi ve kontrol gruplarına kıyasla biyouyumlu ve gelişmiş hücre büyümesi olduğunu ortaya koymaktadır. Anti-bakteriyel çalışmalar, DOX-CL iskelesinin DW'de bulunan en yaygın bakterilere karşı CL iskelesinden daha etkili olduğunu göstermiştir. Streptozotosin ve yüksek yağlı diyet kaynaklı DW modeli kullanılarak, CL iskelesi tedavi ve kontrol gruplarındakilere kıyasla DOX-CL iskelesi tedavi grubunda önemli ölçüde (p≤0.05) daha hızlı bir yara kasılma oranı gözlendi. DOX-CL iskelesinin kullanımı, DW'ler için yerel tedavi için umut verici bir yaklaşım olabilir.
Introduction
Diabetes mellitus (DM), vücudun insülin vermemesi veya basit şekerlerin anormal sindiriminde sonuçlarına tepki vermemesinin kan şekerinin yükselişine neden olduğu bir durumdur 1. DM'nin en ardışık ve ezici dolanıklığı diyabetik yaradır (DW). DM'li hastaların kabaca% 25'i yaşamları boyunca bir DW oluşturma fırsatına sahiptir 1. DW'nin engellenen iyileşmesi DM üçlüsüne akredite edilmiştir: immünopati, vaskülopati ve nöropati. DW tedavi edilmediğinde, kangren gelişimine neden olabilir, bu nedenle ilgili organın çıkarılmasına neden olur 2.
Hastalara talimat (yarayı günlük olarak incelemek, yarayı temizlemek, yara üzerinde baskı yaratan aktivitelerden kaçınmak, periyodik glikoz izleme vb.), kan glukozlarını kontrol etmek, yara debridmanı, basınç boşaltma, tıbbi prosedür, hiperbarik oksijen tedavisi ve ileri tedaviler pratikte 3,4. Bu ilaçların çoğunluğu, çok yönlü patofizyolojik koşullar ve bu ilaçlarla ilgili beklenmedik harcamalar ışığında DW bakımı için hayati önem taşıyan tüm ön koşulları ele almamaktadır 5. DW patogenez çok yönlü olsa da, uygunsuz doku yönetimi ile kalıcı inflamasyonun DWs 5,6'dagecikmeli iyileşmenin gerçek nedeni olduğu belirtilir.
DW'deki inflamatuar ve pro-enflamatuar mediatörlerin artırılmış seviyeleri, gecikmiş yara iyileşmesinden sorumlu büyüme faktörlerinin azalmasına neden olarak 2,6. DW'lerde yanlış hücre dışı matris (ECM) oluşumu, oluşan ECM'nin hızlı bozulmasından sorumlu olan matris metalloproteinazlarının (MMP) artan seviyelerine akredite edilmiştir. MMP'lerde, MMP-9 uzun süreli iltihaplanma ve hızlı ECM bozulması 7'densorumlu büyük bir aracı olarak bildiriliyor. MMP-9'un yüksek seviyelerini azaltan anti-enflamatuar bir ilaçla lokal tedavinin, küsinöz homeostaz, çerçeve düzenlemesi ve DWs 8,9'undaha iyi iyileşmesini istemektedir.
Bir MMP-9 inhibitörü olan doksiksin (DOX), DWs 10 , 11,12'dekalıcı iltihaplanmadan sorumlu büyük bir enflamatuar arabulucuolanMMP-9'un yüksek seviyelerini bastırmak için seçildi. Ek olarak, DOX antioksidana sahiptir (reaktif oksijen türleriyle bağlanabilen serbest hidroksi ve fenoksi radikalleri üretin) 13 ve anti-apoptotik (kaspaz ekspresyonunu ve mitokondriyal stabilizasyonu inhibe edin) DW tedavisi için gerekli olan 14 aktivite. DOX, kollajen (COL) ve chitosan (CS) içeren çerçevelerin düzenlenmesi seçildi. COL seçimi, mekanik mukavemet ve doku yenilenmesinden sorumlu gerekli çerçevenin sağlanmasına yardımcı olma yoluna bağlıdır 15. Öte yandan, CS yapısal olarak glikozaminojlikan için homologdur ve çeşitli yara iyileşme aşamaları ile ilişkilidir. Ayrıca CS'nin önemli anti-bakteriyel özelliğe sahip olduğu bildirilmektedir 15. Bu nedenle, DOX'un COL / CS iskelesi uzun süreli iltihabı bastırmak için formüle edilmiştir, ardından DM koşullarında başarılı yara iyileşmesi için matris oluşumunu destekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, Ooty, Hindistan'daki JSS Eczacılık Koleji'nin kurumsal hayvan etik komitesi tarafından onaylandı.
1. DOX yüklü gözenekli iskelelerin dondurularak kurutma yöntemiyle hazırlanması
- 100 mL suya (örneğin, Millipore) 1,2 g COL ekleyin ve şişme için bir kenara bırakın.
- COL'un tamamen dağılmasını sağlamak için şişmiş COL dağılımını bir gecede 2000 rpm'de karıştırın.
- %1 asetik asidin 100 mL'sinde yaklaşık 0,8 g CS çözerek CS çözeltisi hazırlayın.
- Düzgün dağılım sağlamak için CS çözümünü 2000 rpm'de gece karıştırın.
- DOX'u (%1 w/v) ve ardından CS çözümünü COL çözümüne karıştırın ve 30 dakika karıştırın.
- Elde edilen fiziksel karışımı partikül maddeyi çıkarmak için bir muslin bezi kullanarak filtreleyin.
- Elde edilen filtratı -85 °C ± 4 °C'de yaklaşık 24 saat derin dondurucu.
- Derin dondurucu karışımını -85 °C'de ± 4 °C'de 72 saat boyunca ilikleyin.
- Elde edilen iskeleleri daha fazla analiz için bir kurutucuda saklayın 16,17.
2. İskelenin çapraz bağlantısı
- MES'i (0,488 g) 50 mL suda çözün.
- DOX yüklü iskelenin 50 mg'ını 30 dakika boyunca MES tamponunun 20 mL'sinde bekletin.
- 19,5 mL MES tamponu 0,1264 g EDC ve 0,014 g NHS ile ayrı bir beherde karıştırın.
- Çapraz bağlama elde etmek için iskeleyi tampon karışımına 4 saat daldırin 16.
- Daha fazla değerlendirme için DOX yüklü çapraz bağlı (CL) ve çapraz bağlı olmayan iskeleleri (NCL) saklayın.
3. İskelelerin karakterizasyonu
- Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılarak morfolojik inceleme
- SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm) kullanarak morfolojik analiz için iskeleleri karakterize edin.
- İskelenin kesitini ve dış yüzeyini hassas altın tabakasıyla (~150 Å) lekeleyin.
- 5 kV ve 10 kV'lik heyecan geriliminde fotoğrafik görüntüyü yakalayın.
- Numuneleri alüminyum saplamalara yerleştirin ve yaklaşık 9 V'ta altınla çevreleyin.
- SEM kullanarak iskeleyi 10 kV'da artırılmış çözünürlükle ölçün.
- Gözeneklilik tayini
- Sıvı deplasman yöntemini (etanol) kullanarak iskelelerin gözenekliliğini ölçün 18.
- Aşağıdaki formülleri kullanarak iskelelerin gözenekliliğini hesaplayın.
Ww = İskelenin ıslak ağırlığı
Wd = İskelenin kuru ağırlığı
Wv = İskelenin hacmi
- Su emme kapasitesinin belirlenmesi
- İskelenin kuru ağırlığını ölçün.
- Tartılmış iskeleyi fosfat tampon salin (PBS) pH 7.4'te 24 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Filtre kağıdı kullanarak fazla PBS'yi iskelenin üzerinden çıkarın.
- Aşağıdaki formül 17'yikullanarak su emme kapasitesini ölçün.
WS = Su emme yüzdesi
W1=İskelenin ıslak ağırlığı
W0= İskelenin kuru ağırlığı
- İskele bozulması
- Lysozymes içeren pH 7.4 PBS'de 7 gün boyunca 37 °C'de iskeleyi (1cm x 1cm) kuluçkaya yatırın.
- Yüzeydeki yapışan iyonları çıkarmak için iskeleyi yıkayın.
- Donmuş kuru yıkanmış iskele 17.
- Formül kullanarak bozulma oranını hesaplayın.
Ww = İskelenin ilk ağırlığı
Wd = Dondurarak kuruttuktan sonra iskelenin ağırlığı
-
Tüp bebek salınım çalışmaları
- Diyaliz çuvalı yöntemini kullanarak DOX'un iskeleden salınma davranışını belirleyin.
- İskeleyi birkaç mililitre simüle yara sıvısına (pH 7.4) dağıtın ve bir diyaliz torbasına aktarın.
- Membran torbasının uçlarını sıkıca kapatın ve 500 mL simüle edilmiş yara sıvısı çözeltisinin içine daldırın.
- Diyaliz torbasını içeren yara sıvısı solüsyonını 200-250 rpm'de karıştırın.
- Süpernatant çözeltiyi toplayın ve belirli zaman aralıklarında eşit miktarda taze tampon çözeltisi ile değiştirin.
- 240 nm'de UV görünür bir spektrometre kullanarak süpernatant çözeltisteki iskelelerden DOX salınımının yüzdesini belirleyin.
4. In vitro anti-bakteriyel çalışmalar
- Mikro et suyu seyreltme yöntemini kullanarak CL ve DOX-CL iskelelerinin S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa'ya karşı minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirleyin.
- 0,5 McFarland bulanıklığı elde etmek için 1:1000 oranında Mueller-Hinton suyu kullanarak bakteri kültürlerini hazırlayın.
- Hiperglasyon için bakteri kültürlerine D-glikoz (800 mg/dL) ekleyin 19,20.
- DMSO'da CL ve DOX-CL'yi (negatif kontrol) kıyma ve çözün.
- Hipergliğe maruz bakteri süspansiyonu (100 μL) ve test numunelerini (100 μL iskele çözeltisi) 96 kuyu plakasında seri olarak seyreltin.
- Plakayı 37 °C'de 20-24 saat kuluçkaya yatırın.
- Emiciliği 600 nm 21dalga boyunda kaydedin.
5. Tüp bebek biyouyumbilite çalışmaları
- MTT [(3-(4, 5 dimetil tiazol-2 yl) -2, 5-difenil tetrazolium bromür)] tahlil kullanarak hazırlanan iskelelerin biyouyumluluğunu değerlendirin.
- Standart boyuttaki iskeleleri sterilize edin ve 24 kuyu plakasına yerleştirin.
- 24 kuyu plakasına 3T3-L1 hücreleri ekleyin ve 72 saat boyunca inkübe edin.
6. In vivo hayvan çalışmaları
- DM indüksiyonu ve eksizyon yarası
- Hayvanı iki hafta boyunca yüksek yağlı bir diyetle besleyin ve tip-2 diyabetin indüksiyonu için Wistar albino sıçanlarına (180-200 g) intraperitoneally sitrat tampon çözeltisinde tek doz streptozotosin (STZ) (50 mg / kg vücut ağırlığı) uygulayın.
- Çalışma için 250 mg / dL sabit kan şekeri olan hayvanları seçin.
- Eksizyon yaralarının indüksiyonu için seçilen hayvanları rastgele halen.
- Diyabetik sıçanları dietil eter (önceden doymuş anestezi odasına 5 mL eklendi) kullanarak uyuşturun ve parmak sıkışması yöntemini ve mukoza zarı rengini kullanarak onaylayın.
- Dorsal bölgeyi (Dorsal torasik, bel bölgesi) aseptik bir düzeltici ve bıçaklar (A40) kullanarak tıraş edin.
- Tıraş edilen bölgeyi alkollü bir bezle sterilize edin.
- Açık bir yara oluşturmak için tıraş edilen bölgeye aseptik cerrahi A40 bıçağı ile cildi (2 x 2 cm2 ve 1 mm derinlikte) açın.
- Hayvanları üç gruba ayırın (Grup 1- Hastalık kontrolü (Kontrol), Grup 2- CL iskele (Plasebo), Grup 3- DOX CL iskele), her grup 6 sıçandan oluşan.
- Cl ve DOX CL iskelelerini cerrahi bant kullanarak yapıştırın ve kontrol grubunu 21 gün boyunca steril gazlı bezle örtün.
- Yara bölgesini steril bir OHP tabakası üzerinde takip edin ve tüm gruplar için 0, 7, 14 ve 21.
- Aşağıdaki formülleri kullanarak yara azaltma yüzdesini hesaplayın.
7. Histopatolojik çalışmalar
- İyileşmiş yara bölgesini 7, 14 ve 21.
- 6 μm kalınlığı elde etmek için dokuları bir mikrotom kullanarak bölümlere alın.
- Bölümleri cam bir kaydırağa monte edin ve Hematoksilin ve eosin 17kullanarak lekeleyin.
- Dijital mikroskop kullanarak görüntüleri 40x büyütme altında yakalayın.
8. Hidroksiprolin tahmini
- İyileşmiş yara bölgesini değerlendirme için 0, 7, 14 ve 21.
- Reddy G ve ark., 1996 22.
9. Elisa testi
- Üreticinin talimatlarına göre Elisa kitini kullanarak MMP-9 seviyelerini tahmin edin.
- İyileşmiş yara bölgesinden alınan doku örneklerini 21. günde izole edin ve doku homojenizatör kullanarak kıymayı haline getirin.
- Elde edilen homojenatı santrifüj edin ve süpernatantı toplayın.
- Test tamponu kullanarak süpernatant'ı 100 kat seyreltin.
- Birden fazla plaka okuyucu kullanarak plakayı tarayın.
10. İstatistiksel analiz
- Elde edilen sonuçları Ortalama ± SD olarak temsil eder.
- Graph pad prizması v5.01 kullanarak istatistiksel analizi gerçekleştirin.
- Varyansın Tek Yönlü Analizi (ANOVA) ve Dunnet'in geçici testini kullanarak istatistiksel öneme sahip olun.
- p≤0.05 değerlerini önemli olarak düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DOX yüklü NCL ve CL iskelesinin karakterizasyonu
Yapılan görsel incelemede NCL ve CL iskelesinin krem renginde olduğu tespit edildi. Ayrıca, her iki iskele de fiziksel olarak incelendiğinde sert ve inelastik bir sünger gibi görünmektedir. NCL ve CL iskelelerinin SEM görüntüleri Şekil 1'degösterilmiştir. Rakamdan, intermoleküler bağlar oluşturarak çapraz bağlama yapıldıktan sonra gözenek boyutunda azalma olduğu açıktı. Ayrıca, NCL ve CL iskele gözenekliliği sırasıyla 92.3±3±4.21 ve 71.35±2.65 olarak bulunmuştur. NCL ve CL iskelelerinin su emilim yüzdesi 24 saat aralıklarla %750±11±4 ve %492±8,66 olarak gerçekleşti.
Ayrıca lysozymes'den oluşan pH 7.4'ün simüle edilmiş yara sıvısında yedi gün boyunca biyobozunurluk çalışmaları yapıldı. NCL iskelesi başlangıçta ilk üç günde daha hızlı bir bozulma oranı sergiledi ve art arda dört gün boyunca yavaşça azaldı. Diğer tarafta, CL iskelesi uzun süreli bir bozulma oranı gösterdi. İskelenin çapraz bağlantısı, bozulmaya karşı direncin arttığını gösteren bozulma oranının azalmasına neden olan mekanik özellikleri ve ağ mukavemetini artırmıştır (Şekil 2).
Ayrıca, DOX'un NCL ve CL iskelesinden in vitro salınımı 120 saat boyunca gerçekleştirildi (Şekil 3). İlk 1 h'de, NCL iskelesinden %27±92±3,45 DOX, CL iskelesinden ise sadece %16,54±2,21 DOX serbest bırakıldı. 6 saat sonra, inşaat iskelelerinden dox salınımı NCL iskelesinde% 63.15±3.78 ve CL iskelelerinde% 44.43±3.57 arttı. 24 saat sonra, NCL iskelesinden% 70 DOX salınımı yapılırken, CL iskelesinin DOX'un% 70'ini serbest bırakması 72 saatten fazla sürdü. Elde edilen sonuçlara göre, DOX yüklü CL iskelesi daha fazla değerlendirme için seçildi ve DOX-CL iskelesi olarak temsil edildi. DOX (plasebo) içermeyen CL iskelesi CL İskelesi olarak belirlenmiştir.
İn vitro anti-bakteriyel çalışmalar
DW'li hastalar genellikle uzun süreli yara iyileşmesi ile sonuçlanan enfeksiyonlar yaşarlar. Böylece, hazırlanan iskeleler seçilen bir bakteri paneline karşı MIC kullanılarak anti-bakteriyel aktiviteleri için incelenmiştir(Tablo 1). Sonuçlardan, DOX'un hem S. aureus hem de S. epidermis'e karşı <4 μg / mL'lik bir MIC ile inhibitör aktivite sergilediği açıktır. E. coli ve P. aeruginosa'yakarşı <8 μg/mL ve <16 μg/mL'lik bir MIC gözlendi. Tek başına chitosan ve CL iskele özü, S. aureus (<64 μg/mL), S. epidermis (<64 μg/mL), E. coli (<128 μg/mL) ve P. aeruginosa (<128 μg/mL) gibi seçilmiş organizmalara karşı minimum aktivite gösterdi. DOX-CL iskelesi, hem S. aureus hem de S. epidermis'ekarşı <2 μg / mL'lik bir MIC ile benzer inhibitör aktivite göstermiştir. Ayrıca, DOX-CL iskelesi E. coli ve P. aeruginosa'yakarşı <8 μg / mL'lik bir MIC ile ılımlı faaliyetler sergiledi.
In vitro biyouyumbilite çalışması
CL ve DOX-CL iskelelerinin varlığında 3T3-L1 hücrelerinin hücresel canlılığını belirlemek için MTT tahlili yapıldı. Sonuçlar CL ve DOX-CL iskelelerinin herhangi bir sitotoksikliği uyarmadığını örneklendirdi. Ayrıca, hücresel canlılık, tedavi edilen iskele gruplarında kontrolden nispeten daha yüksekti ve iskelelerin varlığında fibroblastların gelişmiş büyümesini temsil ediyordu (Şekil 4).
In vivo yara iyileştirme çalışmaları
Tüm gruplarda ortalama yara alanı 0, 7, 14 ve 21. günlerde grafik yöntem kullanılarak belirlenmiştir (Şekil 5). Görsel incelemede, CL ve DOX-CL iskelesi tedavi edilen gruplardaki yaralar yedinci günde sızmaktan kurtuldu. Aynı zamanda kontrol grubundaki yaralar da akıyor. 14. günde, tüm gruplarda kuru bir kabuk gözlendi; bununla birlikte, DOX-CL iskelesinde (%89.663) daha hızlı bir yara kasılma oranı gözlenmiştir. 21. günde yaranın %99,9'u iyileşti ve DOX-CL iskelesinde bir yara izi oluşurken, kontrol ve CL iskelesi tedavi gruplarında kısmi iyileşme gözlendi.
Histopatoloji çalışması
Yedinci gün yaralanma sonrası yara iyileşmesinin histopatolojik gözlemi, tüm gruplarda yaranın kenarlarındaki tüm cilt katmanlarının bozulmasını gösterdi. Epidermisin görünürlüğü yoktu; ancak kontrol grubunda aralıklı monosit ve lenfositli baskın nötrofiller gözlendi. CL iskelesi tedavi edilen grupta, az sayıda nötrofil ve makrofaj ile birlikte epidermisin orta derecede görünürlüğü fark edildi. Dox-CL iskelesi tedavi grubunda yara, reepithelization evresini temsil eden ince bir epidermis tabakası ile kaplandı. Hafif nötrofiller ve makrofajlar, granülasyon dokusu ile birlikte DOX-CL iskele tedavi grubunda daha sık görüldü.
14. doğum gününde, tüm gruplardaki yaraların epidermis ile kaplı olduğu tespit edildi. Kontrol grubunda, oluşan epidermis tabakasının hakim nötrofillerle birlikte çok ince bir tabaka olduğu gözlenmiştir. CL iskelesi tedavi edilen grupta, oluşan epidermis tabakası, hafif çoküllü masif hücrelerle birlikte kontrol grubundakinden daha kalındı. DOX-CL iskele tedavi grubunda, geliştirilen epidermis, çok sayıda histiosit ve dev çok noktayaükleli hücrelerle birlikte diğer gruplara göre daha kalındı. Fibroblastların yoğun bölgesi de DOX-CL iskele tedavi grubunda gözlendi.
21. günde, kontrol grubunda, inflamasyonun azalmasını temsil eden makrofajların ve histiositlerin tekrarlaması ile birlikte baskın sayıda nötrofil azaldı. Cl iskelesi tedavi grubunda ise orta sayıda histosit ve lenfosit gözlendi. Oluşan epidermisin DOX-CL iskele tedavi grubunda, çok sayıda histiosit, lenfosit ve büyük çoküllü hücre ile birlikte kontrol grubundakilerden önemli ölçüde daha kalın olduğu gözlenmiştir. DOX-CL iskele tedavi grubunda nötrofil sayısı 7. günde azaldı. Ayrıca, makrofajların ve çok noktaya çoküllü masif hücreler ve histiositler gibi morfolojik varyantlarının toplanması 14 ve 21.
Hidroksiprolin tahmini
Hidroksiprolin tahmini, yaraların iyileşmesinde bulunan kollajen miktarının dolaylı bir ölçüsüdür. Daha yüksek hidroksiprolin konsantrasyonu, yara iyileşmesinin hızlı bir yüzdesini belirler. Biyokimyasal incelemede DOX-CL iskelesi tedavi grubunda daha yüksek miktarda hidroksiprolin ve ardından CL iskelesi tedavi grubu kontrol grubundakilere göre daha yüksek miktarda hidroksiprolin saptanmıştır (Şekil 7).
Elisa kiti kullanılarak MMP-9 tahmini
DOX-CL iskele tedavi grubundaki MMP-9 içeriği, kontroldekilere ve CL iskelesi tedavi edilen gruba göre önemli ölçüde azaldı. Cl iskelesi işlenmiş grubundaki MMP-9 içeriği, Şekil 8'degösterildiği gibi DOX-CL iskele işlenmiş grubun içeriğiyle karşılaştırıldığında marjinal olarak daha azdı.
Şekil 1: DOX yüklü COL-CS iskelesinin morfolojisi a) CL'den önce ve b) SEM tarafından 50 μm ölçek aralığında CL belirlenmesinden sonra.
Şekil 2: NCL ve CL iskelelerine yüklenen DOX'un matris bozulması, 37 °C'de PBS pH 7.4'te 1 günden 7'ye kadar NCL'nin 7 gün boyunca kademeli olarak bozulduğunu gösterir. Bunun aksine, cl iskele bozulma oranı önemli ölçüde azaltılmış enzymatic bozulmaya karşı gelişmiş direnç gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PBS pH 7.4'te 37° C'de NCL ve CL iskelelerinden DOX'un in vitro ilaç salınım profili, tüm formülasyonlarda ilacın yavaş bir salınımını ve ardından sürekli bir salınımı gösterir. Ortalama olarak ifade edilen veriler SD ± (n=3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 3T3-L1 hücreleri CL ve DOX-CL iskelelerinin varlığında kültürlenmiştir ve DOX-CL iskelesi tedavi edilen grupta yüzde hücre büyümesini daha fazla gösterir ve ardından CL iskelesi tedavi edilir ve kontrol edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: (a) Kontrolde ortalama yara bölgesindeki azalmayı temsil eden görüntüler, CL iskelesi ve DOX-CL iskelesi tedavi grupları 0, 7, 14 ve 21. (b) 0, 7, 14 ve 21. gün yaralama sonrası kontrol, CL iskele ve DOX-CL iskele tedavi gruplarında ortalama yara bölgesinde azalmanın grafiksel gösterimi. Veriler ortalama ± SD (n=6 yara/ grup) olarak ifade edilir. İstatistiksel anlamlılık, Varyansın Tek Yönlü Analizi (ANOVA) ve ardından Dunnet'in geçici testi ile elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: STZ'de yara iyileşme sürecinde histolojik değişiklikler ve Wistar albino sıçan derisinde 7, 14 ve 21. günlerde (kontrolsüz) ve tam kalınlıkta eksizyon yarası modelinde tedavi (CL ve DOX-CL iskeleler) ile yüksek yağlı diyet kaynaklı diyabet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Dolaylı kollajen düzeyi tahmininin bir göstergesi olarak 0, 7, 14 ve 21. günlerde yaralardaki hidroksiprolin içeriğini temsil eden sonuç. Sonuçlar μg hidroksiprolin / kuru yara dokusunun mg'ı ile ifade edilir. Veriler Ortalama±SD'± (n=6 yara/grup) temsil eder. İstatistiksel anlamlılık, Varyansın Tek Yönlü Analizi (ANOVA) ve ardından Dunnet'in geçici testi ile elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: STZ'de iyileşmiş yaralardan elde edilen homojenatlarda MMP-9 seviyelerini temsil eden grafik ve 21. günde yüksek yağlı diyet kaynaklı diyabetik sıçan modeli. ELISA analizi kullanılarak 100 kat yara sıvısı aliquots MMP-9 düzeyleri belirlendi. Veriler Ortalama±SD'± temsil eder (n=3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| MIC (μg/mL) | ||||
| Test örneği | S. aureus | S. epidermis | E. coli | P. aeruginosa |
| DOX | <4 | <4 | <8 | <16 |
| BİLGİSAYAR BİLİMİ | <64 | <64 | <128 | <128 |
| CL iskele özü | <64 | <64 | <128 | <128 |
| DOX-CL iskele özü | <2 | <2 | <4 | <4 |
Tablo 1: Seçilen bir bakteri paneline karşı CS, DOX, CL ve DOX-CL İskelelerinin minimum inhibitör konsantrasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın temel amacı, DOX yüklü COL-CS iskelesinin sıçanlarda DW iyileşmesi üzerindeki etkisini belirlemekti. CL ve NCL morfoloji, şişlik indeksi, in vitro sönme kinetiği ve biyouyumluluk açısından hazırlandı ve değerlendirildi.
DOX yüklü NCL ve CL iskelesinin karakterizasyonu
Hazırlanan iskelelerin birbirine bağlı gözeneklerle gözenekli olduğu tespit edildi. Bu birbirine bağlı gözenekler, çoğalma ve göç için hücrelere oksijen ve besin maddelerinin uygun şekilde yayılmasına yardımcı olan gözenekli, süngerimsi doğayı garanti eder ve iyileşmenin hızlanmasına yol sağlar. Burada gözenek büyüklüğü esas olarak çapraz bağlamaya bağlıydı. İskelenin çapraz bağlantısı, EDC/NHS'nin CS ve COL ile güçlü intramoleküler etkileşimler oluşturarak, iskele mekanik mukavemetini artırarak gözenek boyutunun azalmasına neden oldu.
Gözeneklilik indeksi, sünger payandaları ve hacminin kütlesinin bir işlevi olan göreceli yoğunluğa dayanır. Genellikle, bir çapraz bağlama aracısı payanda pozisyonunu birbirine yaklaştırarak değiştirirse ve iskele insifikasyonuna yol açtığında iskele hacminin büzülmesi meydana gelir. Bununla birlikte, karbodiimid kimyası durumunda, benzersiz mekanizması nedeniyle, yani iskeleye girmeden karboksilik (>COOH) ve amin (-NH) grubu kullanılarak amide bağlantısının (O=C-NH) tanıtılması nedeniyle iskele kütlesinde bir artış beklenmemektedir. Aynı zamanda, çapraz bağlama sırasında, bağlanmamış polimer zincirlerinin çözünmesi ve göçü nedeniyle küçük kütle kaybı meydana gelebilir. Bununla birlikte, EDC / NHS ile iskele tedavisi durumunda, iskele morfolojisi üzerinde gözle görülür bir etki yaratmamıştır.
İskelenin biyolojik sıvıyı absorbe etme yeteneği, bir ilaç taşıyıcısı olarak uygunluğunu değerlendirmede çok önemlidir. Su emme özelliği sadece iskelenin şeklini etkilemekle kalmaz, aynı zamanda hücre büyümesini de etkiler. CL iskelesinin NCL iskelesinden daha düşük bir su emme oranı gösterdiği gözlendi, bu da iskelenin çapraz bağlantısına bağlanabilir. Ayrıca, (i) orta bağlantı oluşumu sürecinde hidrofilik grupların (>COOH & -NH) kaybı nedeniyle çapraz bağlamadan sonra iskele malzemesinin hidrofilizliği önemli ölçüde azaltılmıştır; (ii) yeni bağların oluşumu ile şişmenin inhibisyonu (O=C-NH). Bu sonuçlar daha önce yayınlanan raporlar 23 , 24ile iyi bir şekildeuyulur.
Lysozymes'den oluşan pH 7.4'ün simüle edilmiş yara sıvısında yedi günlük inkübasyondan sonra artık kütlenin yüzdesi izlenerek enzimmatik bir biyobozunurluk çalışması yapıldı. NCL iskelesi başlangıçta ilk üç günde daha hızlı bir bozulma oranı gösterdi ve art arda dört gün boyunca yavaşça azaldı. Diğer tarafta, CL iskelesi uzun süreli bir bozulma oranı gösterdi. İskelenin çapraz bağlantısı, mekanik özellikleri ve ağ gücünü artırdı ve bu da bozulma oranının düşmesine neden oldu ve bozulmaya karşı daha iyi direnç gösterdi.
CL ve NCL iskeleleri için 120 saat boyunca ilaç salınım çalışmaları yapıldı. Genel olarak, gözenekler arasındaki gelişmiş bağlantılar ve polipeptid zincirleri arasındaki boşluğun azalması nedeniyle çapraz bağlama yoğunluğu arttıkça iskelenin ilaç salınım katsayısı azalır. İlaç salınım katsayısı ayrıca gözeneklilik indeksi, su içeriği, şişlik indeksi ve çapraz bağlantı derecesi ile de etkilenir. Çalışmamızda, NCL iskelesinden DOX'un %27,92±92±3,45'i ve %63,15,3,78'i, CL iskelesinden ise %16,54±2,21'i ve %44,43±3,57'si sırasıyla 1 saat 6 saat olarak piyasaya sürüldü. 24 saat sonra, DOX'un% 70'inin NCL iskelesinden serbest bırakılması sözdür; CL iskelesinin DOX'un %70'ini serbest bırakması 72 saatten fazla sürdü. Sonuçlar, iskele çapraz bağlantısının şişme oranını ve su içeriğini azaltarak DOX salınımını ters yönde etkilediğini göstermiştir.
İn vitro anti-bakteriyel çalışmalar
DOX-CL iskele özü gram pozitif organizmalara karşı daha yüksek inhibitör aktivite (MIC) gösterdi. DOX-CL iskele ekstresinin daha yüksek aktivitesi, numunenin hidrofobikliğinin artmasından kaynaklanıyor olabilir. Bununla birlikte, DOX-CL iskele özü, muhtemelen hücre duvarı penetrasyon yetmezliği nedeniyle gram negatif organizmalara karşı minimum aktivite gösterdi. Ayrıca, DOX-CL'nin MIC'si, DOX-CL özünde dox ve CS'nin sinerjik aktivitesine atfedilebilecek CS, CL iskelesi ve DOX örneklerinden nispeten daha yüksekti.
In vitro biyouyumbilite çalışması
In vitro biyouyumluluk çalışması fibroblast hücreleri (3T3-L1) üzerinde yapıldı. Fibroblastlar ECM ve proteinlerin üretiminden sorumludur. Ayrıca, yara iyileşmesi için gerekli çerçevenin oluşumunu artırarak yapısal bütünlüğün korunmasında çok önemli bir rol oynarlar. Sonuçlar, DOX-CL iskelesi ve CL iskelesinin herhangi bir hücre sitotoksikliği üretmediğini göstermektedir. Bununla birlikte, her iki iskele grubu da, hazırlanan iskelelerin biyouyumlu olduğunu gösteren, iskele gözeneklerindeki fibroblastların hücre büyümesi ve farklılaşması ile gözlenmiştir. Her iki grupta da artan hücre büyümesi ve farklılaşma esas olarak iskele yapısında hücre dışı matris olarak CS ve COL'nin varlığından kaynaklandı.
Ayrıca, HÜCRE büyüme ve sağkalımdan sorumlu DOX tarafından PI3K-AKT sinyalinin aktivasyonu nedeniyle DOX-CL iskele grubunda CL iskelesinden nispeten daha yüksek hücre büyümesi gözlenmiştir 25.
In vivo yara iyileştirme çalışmaları
DM'nin çeşitli komplikasyonları DW'nin uzun süreli iyileşmesinden sorumludur. Sıçanlardaki diyabetik durumu taklit etmek için, yüksek yağlı bir diyet verildi, ardından stz intraperitoneal enjeksiyonu yapıldı. 2-3 günlük diyabetik doğrulamadan sonra sırt torasik bölgesindeki cildin eksizyonu ile açık yaralar oluşturuldu. Tedavi 21 gün boyunca ilgili iskelelerle gerçekleştirildi. Yara bölgesinde azalma 0, 7, 14 ve 21. DOX-CL iskelesi ile tedavi edilen diyabetik sıçanlar, CL iskele gruplarına ve tedavi edilmemiş gruplara kıyasla önemli derecede yara kasılması gösterdi.
Yara iyileşmesinin enflamatuar fazı fonksiyonel bariyer oluşumundan sorumludur. Bir sonraki aşamada, yara iyileşmesinin proliferatif aşaması, DOX-CL iskele grubu ile yara bölgesi azalmasının% 43'ünün gözlendiği yara bakımında dikkat çeker. Buna karşılık, 7. günde sırasıyla CL iskelesi ve tedavi edilmemiş gruplarla sadece %23 ve %7 oranında gözlenmiştir. Görüntülerden (Şekil 5), yaranın kasılması enflamatuar ve proliferatif faz tamamlandıktan sonra başlatılmıştır. DOX-CL iskele grubu, antienflamatuar ve anti-enfektif etkilerden sorumlu olan DOX varlığı nedeniyle önemli yara kasılması gösterdi. Ayrıca, iskeledeki COL ve CS hücre çoğalmasına, farklılaşmasına ve göçe yardımcı oldu ve 21 günde DW iyileşmesinin% 99'unu elde etti.
Tedavi edilmeyen eksizyonal yaralar 7. Daha önce de belirtildiği gibi, nötrofiller yara iyileşmesinin erken aşamasında yara debridmanında yardımcıdır. Ayrıca nötrofillerin fazlalığı normal dokuya zarar vererek iyileşme sürecini olumsuz etkileyebilir. Dovi ve arkadaşları tarafından bildirildiği gibi, minimum sayıda nötrofil yeniden epitelizasyon sürecini hızlandırır 26.
Ayrıca, DOX-CL iskelesi tedavi grubundaki makrofajlar, histiositler ve büyük çok noktayaükle hücreler, hasarlı hücreleri onararak ve COL sentezini teşvik ederek hızlandırılmış yara iyileşmesi için çevreyi tercih etti. Ayrıca tüm gruplarda hidroksiprolin düzeyleri kullanılarak doku ile KOL birleşmesi saptanmıştır. Bununla birlikte, DOX-CL iskelesi işlenmiş grupta, işlenmemiş ve CL iskelesi tedavi edilen gruba göre nispeten daha yüksek hidroksiprolin düzeyleri gözlenmiştir. Literatürde belirtildiği gibi, diyabetik durumdaki uzun süreli enflamatuar faz iyileşmenin diğer aşamalarını engeller. DOX-CL iskelesinde yara kasılma oranının daha hızlı olması, DOX'un antienflamatuar özelliğine bağlanabilir ve bu da yaranın daha sonraki aşamalarında yara iyileşmesinin hızlandırılmasına yol açan uygun zaman evresinde meydana geldi.
ELISA testi kullanılarak MMP-9 seviyelerinin biyokimyasal tahmini, DOX-CL iskelesi tedavi edilen grubun CL iskelesi tedavi edilen ve tedavi edilmeyen gruplardakilere kıyasla MMP-9 seviyelerinin azaldığını ortaya koymaktadır. Literatüre göre, matris bozulmasından sorumlu MMP-9 seviyelerinin artması, buna karşılık yara iyileşme sürecini uzatır. Bir anti-enflamatuar ajan olan DOX, COL bozulmasını önlemenin nedeni olarak kabul edilen MMP-9 seviyelerini inhibe etti ve DW iyileşmesinin hızlanmasına neden oldu. Bu sonuçlar Lindeman ve ark., 2009 ve Zhang ve ark., 2014 27, 28tarafından daha önce yayınlanan çalışmalarla aynı fikirdedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar Dr. Ashish D Wadhwani'ye teşekkür eder. (Yardımcı Doçent ve Farmasötik Biyoteknoloji Bölümü Başkanı, JSS Eczacılık Koleji, Ooty, Hindistan) In vitro hücre canlılığı çalışmalarına yardımcı olduğu için.
Yazarlar, Bölümümüzü desteklemektedirler için Yeni Delhi'deki Üniversiteler ve Yükseköğretim Kurumlarında Bilim ve Teknoloji Altyapısının geliştirilmesi için Bilim ve Teknoloji Bölümü 'ne (DST-FIST) teşekkür ederler.
Yazarlar da Bay Sanju'ya teşekkür etmek istiyor. S ve Bay Sriram. Narukulla M. Pharm öğrencileri video çekimine verdikleri destek için.
Bu araştırma JSS Yükseköğretim ve Araştırma Akademisi (JSSAHER) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
