Summary
Подготовленный каркас DOX-CL удовлетворил предпосылки идеальной DW-повязки по механической прочности, пористости, водопоглощению, скорости деградации, замедленному высвобождению, антибактериальной, биосовместимости и противовоспалительным свойствам, которые считаются необходимыми для восстановления поврежденных тканей у ДВ.
Abstract
Одним из основных осложнений сахарного диабета являются диабетические раны (DW). Длительная фаза воспаления при диабете препятствует дальнейшим стадиям травмы, что приводит к задержке заживления ран. Мы выбрали доксициклин (DOX) в качестве потенциального препарата выбора из-за его антибактериальных свойств наряду с его противовоспалительными свойствами. Текущее исследование направлено на формулирование doX-нагруженных коллаген-хитозаном несшитых (NCL) и сшитых (CL) каркасов и оценку их заживляющей способности в диабетических состояниях. Результат характеристик каркасов показывает, что каркас DOX-CL обладает идеальной пористостью, низкой скоростью набухания и деградации и устойчивым высвобождением DOX по сравнению с каркасом DOX-NCL. Исследования in vitro показывают, что каркас DOX-CL был биосовместимым и усиливал рост клеток по сравнению с клетками, обработанными КАРКАСОМ CL, и контрольными группами. Антибактериальные исследования показали, что каркас DOX-CL был более эффективным, чем каркас CL против наиболее распространенных бактерий, обнаруженных в DW. Используя стрептозотоцин и модель DW с высоким содержанием жиров, наблюдалась значительно (p≤0,05) более высокая скорость сокращения раны в группе, обработанной каркасом DOX-CL, по сравнению с группами, обработанными каркасами CL, и контрольными группами. Использование каркаса DOX-CL может оказаться перспективным подходом для местного лечения ДМ.
Introduction
Сахарный диабет (СД) - это состояние, при котором неспособность организма доставлять инсулин или реагировать на его результаты при аномальном переваривании простых сахаров приводит к всплеску уровня глюкозы в крови 1. Наиболее последовательным и сокрушимающим запутыванием СД является диабетическая рана (DW). Примерно 25% пациентов с СД имеют возможность создать DW в течение своей жизни 1. Затрудненное заживление DW относится к триопатии СД: иммунопатии, васкулопатии и нейропатии. Всякий раз, когда DW не лечат, это может привести к развитию гангрены, что приводит к удалению соответствующего органа 2.
Множество методов лечения, таких как инструктаж пациентов (ежедневно осматривать рану, очищать рану, избегать действий, которые создают давление на рану, периодический мониторинг глюкозы в крови и т. Д.), Контроль уровня глюкозы в крови, санация ран, разгрузка давления, медицинская процедура, гипербарическая кислородная терапия и передовые методы лечения находятся в практике 3,4. Большинство из этих препаратов не учитывают все предпосылки, жизненно важные для ухода dw в свете многофакторных патофизиологических условий и непредвиденных расходов, связанных с этими лекарствами 5. Несмотря на то, что патогенез DW является многофакторным, стойкое воспаление с ненадлежащим управлением тканями считается фактической причиной задержки заживления в DW 5,6.
Увеличение уровня воспалительных и провоспалительных медиаторов в DW приводит к уменьшению факторов роста, ответственных за задержку заживления ран 2,6. Неправильное образование внеклеточного матрикса (ECM) в ДВ относится к повышенным уровням матричных металлопротеиназ (MMP), ответственным за быструю деградацию сформированных ECM. В MMP MMP-9 сообщается как основной посредник, ответственный за длительное воспаление и быструю деградацию ECM 7. Утверждается, что местное лечение противовоспалительным препаратом, снижающим повышенный уровень ММП-9, восстанавливает кожный гомеостаз, каркасное расположение и побуждает к лучшему заживлению ДМО 8,9.
Доксициклин (DOX), ингибитор MMP-9, был выбран для подавления повышенных уровней MMP-9, основного медиатора воспаления, ответственного за стойкое воспаление в DWs 10,11,12. Кроме того, DOX обладают антиоксидантными (продуцируют свободные гидрокси и феноксирадики, способные связываться с активными формами кислорода) 13 и антиапоптотическими (ингибируют экспрессию каспазы и стабилизацию митохондрий) 14 активностями, которые необходимы для лечения DW. Было выбрано расположение фреймворков, содержащих DOX, коллаген (COL) и хитозан (CS). Выбор COL зависит от того, каким образом он помогает в обеспечении необходимых рамок, отвечающих за механическую прочность и регенерацию тканей 15. С другой стороны, CS структурно гомологичны гликозаминогликану, связанным с несколькими фазами заживления ран. Также сообщается, что КС обладает значительным антибактериальным свойством 15. Следовательно, каркас COL / CS DOX разработан для подавления длительного воспаления с последующей поддержкой формирования матрицы для успешного заживления ран в условиях СД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все выполненные процедуры для животных были одобрены институциональным этическим комитетом по защите животных Фармацевтического колледжа JSS, Ути, Индия.
1. Подготовка пористых лесов, загруженных DOX методом сублимационной сушки
- Добавьте 1,2 г COL к 100 мл воды (например, Millipore) и держите в стороне для набухания.
- Перемешайте набухшие дисперсии COL со скоростью 2000 об/мин в течение ночи, чтобы обеспечить полное растворение COL.
- Готовят раствор КС, растворяя примерно 0,8 г КС в 100 мл 1% уксусной кислоты.
- Перемешайте раствор CS в течение ночи со скоростью 2000 об/мин для обеспечения равномерного диспергирования.
- Смешайте DOX (1% мас./об.), а затем раствор CS, с раствором COL, и перемешайте в течение 30 мин.
- Фильтруйте полученную физическую смесь с помощью муслиновой ткани для удаления твердых частиц.
- Глубоко замораживают полученный фильтрат при -85 °C ± 4 °C в течение примерно 24 ч.
- Лиофилизируйте смесь глубокой заморозки при -85 °C ± 4 °C в течение 72 ч.
- Хранят полученные строительные леса в адсорбаторе для дальнейшего анализа 16,17.
2. Сшивание строительных лесов
- Растворить MES (0,488 г) в 50 мл воды.
- Замочите 50 мг нагруженного DOX каркаса в 20 мл буфера MES в течение 30 мин.
- Смешайте 19,5 мл буфера MES с 0,1264 г EDC и 0,014 г NHS в отдельном заквасе.
- Погрузите каркас в буферную смесь на 4 ч для достижения сшивки 16.
- Храните загруженные DOX сшитые (CL) и несшитые каркасы (NCL) для дальнейшей оценки.
3. Характеристика строительных лесов
- Морфологическое исследование с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
- Охарактеризовать каркасы для морфологического анализа с помощью SEM (1 см × 1 см × 0,5 см).
- Окрасить поперечное сечение и внешнюю поверхность каркаса тонким слоем золота (~150 Å).
- Захват фотографического изображения при напряжении возбуждения 5 кВ и 10 кВ.
- Поместите образцы в алюминиевые заглушки и заключите их в золото при длине около 9 В.
- Измерьте каркас с помощью SEM с увеличенным разрешением при 10 кВ.
- Определение пористости
- Измеряют пористость каркасов с помощью метода вытеснения жидкости (этанола) 18.
- Рассчитайте пористость каркасов, используя приведенные ниже формулы.
Ww = Мокрый вес строительных лесов
Wd = Сухой вес каркаса
Wv = Объем каркаса
- Определение водопоглощающей способности
- Измерьте сухой вес строительных лесов.
- Инкубировать взвешенный каркас при 37 °C в течение 24 ч в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) pH 7,4.
- Удалите излишки PBS над каркасом с помощью фильтровальной бумаги.
- Измерьте водопоглощающую способность, используя приведенную ниже формулу 17.
WS = Процент водопоглощения
W1= Мокрый вес строительных лесов
W0= Сухой вес каркаса
- Деградация строительных лесов
- Инкубируют каркас (1 см х 1 см) при 37 °C в течение 7 дней в PBS рН 7,4, содержащей лизоцимы.
- Вымойте каркас, чтобы удалить все прилипшие ионы на поверхности.
- Сублимационная сушка вымытых лесов 17.
- Рассчитайте скорость деградации с помощью формул.
Ww = Начальный вес каркаса
Wd = Вес строительных лесов после сублимационной сушки
-
Исследования высвобождения in vitro
- Определите поведение высвобождения DOX из каркаса с помощью метода диализного мешка.
- Рассейте каркас в нескольких миллилитрах моделируемой раневой жидкости (рН 7,4) и перенесите его в диализный мешок.
- Плотно закройте концы мембранного мешка и погрузите в 500 мл смоделированного раствора раневой жидкости.
- Размешайте раствор раневой жидкости, содержащий диализный мешок, со скоростью 200-250 об/мин.
- Соберите раствор супернатанта и замените его равным количеством свежего буферного раствора через определенные промежутки времени.
- Определите процент высвобождения DOX из каркасов в растворе супернатанта с помощью УФ-видимого спектрометра при 240 нм.
4. Антибактериальные исследования in vitro
- Определить минимальную ингибируемую концентрацию (МИК) каркасов CL и DOX-CL в отношении S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa с помощью метода микро-разведения отвара.
- Готовят бактериальные культуры с помощью бульона Мюллера-Хинтона в соотношении 1:1000 для получения 0,5 мутности Макфарланда.
- Добавляют D-глюкозу (800 мг/дл) в бактериальные культуры для гипергликации 19,20.
- Измечить и солюбилизировать CL и DOX-CL в ДМСО (отрицательный контроль).
- Последовательно разбавляют гипергликированную бактериальную суспензию (100 мкл) и испытуемые образцы (100 мкл раствора каркасов) в 96-й пластине скважины.
- Инкубировать пластину при 37 °C в течение 20-24 ч.
- Запись поглощения на длине волны 600 нм 21.
5. Исследования биосовместимости in vitro
- Оценить биосовместимость подготовленных каркасов с помощью анализа MTT [(3-(4, 5 диметилтиазол-2 ил)-2, 5-дифенилтетразолия бромида)].
- Стерилизуйте каркасы стандартного размера и поместите их в 24 плиты скважины.
- Добавляют клетки 3T3-L1 в пластину 24 лунки и инкубировали в течение 72 ч.
6. Исследования in vivo на животных
- Индукция ДМ и иссечение раны
- Кормят животное с высокожировой диетой в течение двух недель и вводят однократную дозу стрептозотоцина (СТЗ) (50 мг/кг массы тела) в цитратном буферном растворе внутрибрюшинно крысам-альбиносам Wistar (180-200 г) для индукции диабета 2 типа.
- Выберите животных с постоянным содержанием глюкозы в крови 250 мг/дл для исследования.
- Рандомизировать отобранных животных для индукции иссеченных ран.
- Обезболивают крыс с диабетом с помощью диэтилового эфира (5 мл добавляли в ранее насыщенную анестезируемую камеру) и подтверждали с помощью метода защемления носком и цвета слизистой оболочки.
- Сбрить дорсальную область (дорсальная грудная, поясничная область) с помощью асептического триммера и лопастей (А40).
- Стерилизуйте выбритый участок спиртовой тампон.
- Иссекайте кожу (2 х 2см2 и глубиной 1 мм) асептическим хирургическим лезвием А40 на бритой области для создания открытой раны.
- Разделите животных на три группы (Группа 1 - Контроль заболевания , Группа 2 - Каркас CL (Плацебо), Группа 3 - Каркас DOX CL), каждая группа состоит из 6 крыс.
- Прикрепите каркасы CL и DOX CL хирургическим скотчем и накройте контрольную группу стерильной марлей в течение 21 дня.
- Проследите область раны на стерильном листе OHP и измерьте процентное уменьшение раны с помощью сетчатого метода в дни 0, 7, 14 и 21 для всех групп.
- Рассчитайте процент уменьшения раны, используя следующие формулы.
7. Гистопатологические исследования
- Изолируют заживчивую рану на 7, 14 и 21 день, хранят в растворе формалина (10%).
- Срез тканей с помощью микротома получают толщину 6 мкм.
- Установите секции на стеклянную горку и пятно с помощью гематоксилина и эозина 17.
- Захват изображений под 40-кратным увеличением с помощью цифрового микроскопа.
8. Оценка гидроксипролина
- Изолируйте заживливую рану на 0, 7, 14 и 21 день для оценки.
- Оцените содержание гидроксипролина с помощью процедуры, описанной Reddy G et al., 1996 22.
9. Ифа-тест
- Оцените уровни MMP-9 с помощью комплекта Elisa в соответствии с инструкциями производителя.
- Изолируйте образцы тканей из зажившей раны на 21-й день и измерзайте с помощью гомогенизатора ткани.
- Центрифугируют полученный гомогенат и собирают супернатант.
- Разбавить супернатант в 100 раз с помощью пробирного буфера.
- Сканируйте пластину с помощью устройства считывания нескольких пластин.
10. Статистический анализ
- Представить полученные результаты как среднее ± УР.
- Выполните статистический анализ с помощью призмы Графовой панели v5.01.
- Достигайте статистической значимости с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) и пост-специального теста Даннета.
- Рассмотрим значения с p≤0,05 как значимые.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристика скафолдов NCL и CL, загруженных DOX
При визуальном осмотре было обнаружено, что каркасы NCL и CL кремового цвета. Кроме того, оба каркаса кажутся похожими на губку, жесткими и неэластичными при физическом осмотре. SEM-изображения каркасов NCL и CL показаны на рисунке 1. Из рисунка было ясно, что после сшивания наблюдалось уменьшение размера пор путем образования межмолекулярных связей. Кроме того, было обнаружено, что пористость каркасов NCL и CL составила 92,3±4,21 и 71,35±2,65 соответственно. Процент водопоглощения каркасов NCL и CL составил 750±11,4% и 492±8,66% через 24-часовые промежутки времени.
Кроме того, исследования биодеградации проводились в течение семи дней в моделируемой раневой жидкости рН 7,4, содержащей лизоцимы. Каркас NCL демонстрировал более высокую скорость деградации первоначально в первые три дня и медленно уменьшался в течение четырех дней подряд. С другой стороны, каркас CL показал длительную скорость деградации. Сшивание каркаса улучшило механические свойства и прочность сети, что, в свою очередь, привело к снижению скорости деградации, что свидетельствует об улучшении устойчивости к деградации(рисунок 2).
Далее экстракорпорный выпуск DOX из каркасов NCL и CL осуществлялся в течение 120 ч(рисунок 3). В первые 1 час из каркаса NCL было выпущено 27,92±3,45% DOX, тогда как только 16,54±2,21% DOX было выпущено из каркаса CL. Через 6 ч высвобождение DOX из строительных лесов увеличилось на 63,15±3,78% в каркасах NCL и на 44,43±3,57% в каркасах CL. Через 24 ч произошло высвобождение 70% DOX из каркаса NCL, тогда как каркасу CL потребовалось более 72 ч, чтобы освободить 70% DOX. На основании полученных результатов для дальнейшей оценки был выбран загруженный DOX каркас CL, представленный как каркас DOX-CL. В то время как CL scaffold без DOX (плацебо) обозначается как CL Scaffold.
Антибактериальные исследования in vitro
Пациенты с DW обычно испытывают инфекции, которые приводят к длительному заживлению ран. Таким образом, подготовленные каркасы исследовали на их антибактериальную активность с использованием ОПК против выбранной панели бактерий(таблица 1). Из результатов ясно, что DOX проявлял ингибируемую активность с МИК <4 мкг/мл против S. aureus и S. epidermis. В отношении E. coli и P. aeruginosaнаблюдался МИК <8 мкг/мл и <16 мкг/мл. Один только хитозан и экстракт каркаса CL проявляли минимальную активность в отношении отдельных организмов, таких как S. aureus (<64 мкг / мл), S. epidermis (<64 мкг / мл), E. coli (<128 мкг / мл) и P. aeruginosa (<128 мкг / мл). Каркас DOX-CL показал аналогичную ингибируемую активность с МИК <2 мкг/мл как против S. aureus, так и против S. epidermis. Кроме того, каркас DOX-CL демонстрировал умеренную активность с MIC <8 мкг/мл против E. coli и P. aeruginosa.
Исследование биосовместимости in vitro
МТТ-анализ проводили для определения клеточной жизнеспособности клеток 3T3-L1 в присутствии каркасов CL и DOX-CL. Результаты свидетельствуют о том, что каркасы CL и DOX-CL не стимулировали цитотоксичность. Кроме того, клеточная жизнеспособность была сравнительно выше в группах, обработанных каркасами, чем в контрольных, что представляет собой усиленный рост фибробластов в присутствии каркасов(рисунок 4).
Исследования заживления ран in vivo
Среднюю площадь раны, уменьшенную во всех группах, определяли графическим методом на 0, 7, 14 и 21 день(рисунок 5). При визуальном осмотре раны в группах, обработанных каркасами CL и DOX-CL, не сочились на седьмой день. В то же время раны в контрольной группе сочились. На 14-й день во всех группах наблюдалась сухая парса; однако более высокая скорость сокращения раны наблюдалась в каркасе DOX-CL (89,663%). На 21-й день 99,9% раны зажило, и в каркасе DOX-CL образовался шрам, тогда как частичное заживление наблюдалось в контрольных группах и группах, обработанных каркасами CL.
Изучение гистопатологии
Гистопатологическое наблюдение за заживления ран на седьмой день после травмы выявляло нарушение всех слоев кожи по краям раны во всех группах. Отсутствовала видимость эпидермиса; однако в контрольной группе наблюдались преобладающие нейтрофилы с прерывистыми моноцитами и лимфоцитами. В группе, получавших каркас CL, наблюдалась умеренная видимость эпидермиса наряду с небольшим количеством нейтрофилов и макрофагов. Принимая во внимание, что в группе, обработанной каркасом DOX-CL, рана была покрыта тонким слоем эпидермиса, представляющим фазу реэпителизации. Мягкие нейтрофилы и макрофаги, наряду с грануляционной тканью, также чаще наблюдались в группе, получавших каркас DOX-CL.
На 14-й день после травмы было обнаружено, что раны во всех группах покрыты эпидермисом. В контрольной группе образовавленный слой эпидермиса был очень тонким слоем вместе с преобладающими нейтрофилами. В группе, обработанной каркасом CL, сформированный слой эпидермиса был толще, чем в контрольной группе, наряду с мягкими многоядерными массивными клетками. В группе, обработанной каркасом DOX-CL, эпидермис развивался толще по сравнению с другими группами, наряду с обильным количеством гистиоцитов и гигантских многоядерных клеток. Плотная зона фибробластов наблюдалась также в группе, обработанной каркасом DOX-CL.
На 21-й день после травмы в контрольной группе было уменьшено доминирующее количество нейтрофилов вместе с рецидивом макрофагов и гистиоцитов, представляющих уменьшение воспаления. Принимая во внимание, что в группе, обработанной каркасом CL, наблюдалось умеренное количество гистоцитов и лимфоцитов. Было обнаружено, что сформированный эпидермис был значительно толще в группе, обработанной каркасом DOX-CL, чем в контрольной группе, наряду с богатым количеством гистиоцитов, лимфоцитов и массивных многоядерных клеток. В группе, получавших каркас DOX-CL, количество нейтрофилов было снижено на 7-й день. Также на 14 и 21 день было замечено скопление макрофагов и их морфологических вариантов, таких как многоядерные массивные клетки и гистиоциты(рисунок 6).
Оценка гидроксипролина
Оценка гидроксипролина является косвенной мерой количества коллагена, присутствующего в заживающих ранах. Более высокая концентрация гидроксипролина обозначает быстрый процент заживления ран. Биохимическое исследование выявило более высокое количество гидроксипролина в группе, обработанной каркасом DOX-CL, за которой следует группа, обработанная каркасом CL, чем в контрольной группе(рисунок 7).
Оценка MMP-9 с использованием комплекта Elisa
Содержание MMP-9 в группе, обработанной каркасом DOX-CL, было значительно снижено по сравнению с группами, на которые обращались в контрольной группе, и в группе, обработанной каркасом CL. Принимая во внимание, что содержание MMP-9 в группе, обработанной каркасом CL, было незначительно меньше по сравнению с содержанием обработанной группы каркасов DOX-CL, как показано на рисунке 8.
Рисунок 1:Морфология нагруженного DOX каркаса COL-CS a) перед CL и b) после определения CL SEM в диапазоне масштаба 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Матричная деградация DOX, загруженная в каркасы NCL и CL с 1 по 7 день в PBS pH 7,4 при 37 °C, показывая, что NCL постепенно деградировал в течение 7 дней. Вопреки этому, значительно сниженная скорость деградации каркаса CL указывает на повышенную устойчивость к ферментативной деградации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Профиль высвобождения лекарственного средства IN vitro DOX из каркасов NCL и CL в PBS pH 7,4 при 37°C, показывающий медленное высвобождение лекарственного средства во всех составах с последующим пролонгированным высвобождением. Данные, выраженные в виде среднего ± УР (n=3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Клетки 3T3-L1, культивируемые в присутствии каркасов CL и DOX-CL, показывают процентный рост клеток больше в группе, обработанной каркасом DOX-CL, за которым следует каркас CL, обработанный и контрольный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:(a)Изображения, представляющие уменьшение средней площади раны в контрольных группах, каркасах CL и DOX-CL на 0, 7, 14 и 21 день после ранения. (b)Графическое представление уменьшения средней площади раны в контрольных группах, каркасах CL и DOX-CL на 0, 7, 14 и 21 день после ранения. Данные выражаются в виде среднего ± SD (n=6 ран/группа). Статистическая значимость была получена с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым последовал пост-специальный тест Даннета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Гистологические изменения в процессе заживления ран в СТЗ и диабете, индуцированном диетой с высоким содержанием жиров, в коже крыс-альбиносов Wistar на 7, 14 и 21 день без (контроль) и с лечением (каркасы CL и DOX-CL) в модели иссеченной раны полной толщины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Результат, представляющий содержание гидроксипролина в ранах на 0, 7, 14 и 21 день в качестве показателя косвенной оценки уровня коллагена. Результаты экспрессируются в мкг гидроксипролина/мг сухой раневой ткани. Данные представляют собой среднее ±SD (n= 6 ран/группа). Статистическая значимость была получена с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым последовал пост-специальный тест Даннета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:График, представляющий уровни MMP-9 в гомогенатах, полученных из заживающих ран в STZ и модели крыс с диабетом, вызванной диетой с высоким содержанием жиров, на 21-й день. Уровни MMP-9 определяли в 100-кратных аликвотах раневых жидкостей с помощью ИФА-анализа. Данные представляют среднее ±SD (n=3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| MIC (мкг/мл) | ||||
| Тестовый образец | S. aureus | S. эпидермис | Кишечно-кишечное кишечно | . аэругиноза |
| Докс | <4 | <4 | <8 | <16 |
| КС | <64 | <64 | <128 | <128 |
| Извлечение каркаса CL | <64 | <64 | <128 | <128 |
| Извлечение каркаса DOX-CL | <2 | <2 | <4 | <4 |
Таблица 1:Минимальная ингибирующая концентрация каркасов CS, DOX, CL и DOX-CL против выбранной группы бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основной целью этого исследования было определение влияния нагруженного DOX каркаса COL-CS на заживление DW у крыс. CL и NCL были подготовлены и оценены с точки зрения морфологии, индекса набухания, кинетики высвобождения in vitro и биосовместимости.
Характеристика скафолдов NCL и CL, загруженных DOX
Подготовленные каркасы оказались пористыми с взаимосвязанными порами. Эти взаимосвязанные поры обеспечивают пористую, губчатую природу, которая помогает в правильной диффузии кислорода и питательных веществ в клетки для пролиферации и миграции, что приводит к ускоренному заживлению. Здесь размер пор в основном зависел от сшивки. Сшивание каркаса привело к уменьшению размера пор за счет формирования сильных внутримолекулярных взаимодействий EDC /NHS с CS и COL, увеличивая механическую прочность каркаса.
Индекс пористости зависит от относительной плотности, которая является функцией массы губчатых стоек и объема. Как правило, уменьшение объема каркаса происходит, если сшивающий агент изменяет положение стоек, перетаскивая их ближе друг к другу, что приводит к уплотнению каркаса. Однако в случае химии карбодиимидов увеличение массы каркаса не ожидается из-за его уникального механизма, т.е. введения амидной связи (O=C-NH) с использованием карбоксильной (>COOH) и аминовой (-NH) группы соседней пептидной цепи без вхождения в каркас. Одновременно при сшивании может произойти незначительная потеря массы из-за растворения и миграции неприкрепленных полимерных цепей. Тем не менее, в случае обработки каркасов EDC/NHS не оказали заметного влияния на морфологию каркаса.
Способность каркаса поглощать биологическую жидкость имеет решающее значение для оценки его пригодности в качестве носителя лекарственного средства. Свойство поглощения воды не только влияет на форму каркаса, но и влияет на рост клеток. Было отмечено, что строительные леса CL показали более низкую скорость поглощения воды, чем строительные леса NCL, что может быть связано со сшиванием леса. Кроме того, гидрофильность материала каркаса была значительно снижена после сшивки за счет (i) потери гидрофильных групп (>COOH & -NH) в процессе формирования амидных связей; ii) ингибирование отека путем образования новых связей (O=C-NH). Эти результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными отчетами 23,24.
Исследование ферментативной биодеградации проводили путем мониторинга процента остаточной массы после семи дней инкубации в моделируемой раневой жидкости рН 7,4, содержащей лизоцимы. Каркас NCL показал более высокую скорость деградации первоначально в первые три дня и медленно уменьшался в течение четырех дней подряд. С другой стороны, каркас CL демонстрировал длительную скорость деградации. Сшивание каркаса улучшило механические свойства и прочность сети, что, в свою очередь, привело к снижению скорости деградации, демонстрируя улучшенную устойчивость к деградации.
Исследования высвобождения лекарств проводились для каркасов CL и NCL в течение 120 ч. В целом, коэффициент высвобождения лекарственного средства каркаса уменьшается по мере увеличения плотности сшивания из-за улучшенных взаимосвязей между порами и уменьшения пространства между полипептидными цепями. На коэффициент высвобождения препарата также влияют индекс пористости, содержание воды, индекс набухания и степень сшивки. В нашем исследовании 27,92±3,45% и 63,15±3,78% DOX из каркаса NCL, тогда как 16,54±2,21% и 44,43±3,57% DOX из каркаса CL были выпущены через 1 ч и 6 ч соответственно. Через 24 ч произошло высвобождение 70% DOX из каркаса NCL, тогда как; Каркасу CL потребовалось более 72 ч, чтобы выпустить 70% DOX. Результаты показали, что сшивание каркаса обратно повлияло на высвобождение DOX, уменьшив коэффициент набухания и содержание воды.
Антибактериальные исследования in vitro
Экстракт каркаса DOX-CL проявлял более высокую ингибируемую активность (MIC) в отношении грамположительных организмов. Более высокая активность экстракта каркаса DOX-CL может быть связана с повышенной гидрофобностью образца. Тем не менее, экстракт каркаса DOX-CL проявлял минимальную активность против грамотрицательных организмов, вероятно, из-за недостаточности проникновения в клеточную стенку. Кроме того, MIC DOX-CL был сравнительно выше, чем cs, CL scaffold и DOX образцов, что может быть связано с синергетической активностью DOX и CS в экстракте DOX-CL.
Исследование биосовместимости in vitro
Исследование биосовместимости in vitro проводили на клетках фибробластов (3T3-L1). Фибробласты отвечают за выработку ECM и белков. Кроме того, они играют решающую роль в поддержании структурной целостности, улучшая формирование каркаса, необходимого для заживления ран. Результаты показывают, что каркас DOX-CL и каркас CL не производили никакой цитотоксичности клеток. Тем не менее, обе группы каркасов наблюдались с ростом клеток и дифференцировкой фибробластов в порах каркаса, что указывает на то, что подготовленные каркасы были биосовместимыми. Увеличение роста и дифференцировки клеток в обеих группах было в основном связано с присутствием CS и COL в качестве внеклеточного матрикса в структуре каркаса.
Более того, сравнительно более высокий рост клеток наблюдался с группой каркасов DOX-CL, чем у каркаса CL, из-за активации сигнала PI3K-AKT DOX, ответственным за рост и выживание клеток 25.
Исследования заживления ран in vivo
Различные осложнения СД отвечают за длительное заживление СД. Чтобы имитировать диабетическое состояние у крыс, была введена диета с высоким содержанием жиров, за которой последовала внутрибрюшинная инъекция STZ. Через 2-3 дня подтверждения диабета были созданы открытые раны путем иссечения кожи в дорсальном грудном отделе. Лечение проводилось в течение 21 дня с соответствующими каркасами. Уменьшение области раны определялось для всех групп на 0, 7, 14 и 21 день. Крысы с диабетом, получавших каркас DOX-CL, демонстрировали значительную степень сокращения раны по сравнению с группами каркасов CL и группами без лечения.
Воспалительная фаза заживления ран отвечает за формирование функционального барьера. На следующем этапе пролиферативная фаза заживления ран привлекает внимание в уходе за ранами, в которой 43% уменьшения площади раны наблюдалось с группой каркасов DOX-CL. Для сравнения, только 23% и 7% наблюдались с каркасами CL и необработанными группами на 7-й день соответственно. Из изображений(рисунок 5)сокращение раны было начато после завершения воспалительной и пролиферативной фазы. В группе каркасов DOX-CL проявилось значительное сокращение раны из-за наличия DOX, который отвечает за противовоспалительное и противоинфекционное действие. Кроме того, COL и CS в каркасе помогли пролиферации, дифференцировки и миграции клеток, что привело к заживлению 99% DW за 21 день.
Необработанные эксцизные раны показали нейтрофилы, лимфоциты и моноциты на 7-й день после травмы. Как указывалось ранее, нейтрофилы помогают в санации ран на ранней стадии заживления ран. Кроме того, переизбыток нейтрофилов может негативно повлиять на процесс заживления, повреждая нормальную ткань. Как сообщают Dovi et al., минимальное количество нейтрофилов ускоряет процесс реэпителизации 26.
Кроме того, увеличение макрофагов, гистиоцитов и массивных многоядерных клеток в группе, обработанной каркасом DOX-CL, благоприятствовало среде для ускоренного заживления ран путем восстановления поврежденных клеток и содействия синтезу COL. Более того, сочетание COL с тканью определяли с использованием уровней гидроксипролина во всех группах. Тем не менее, сравнительно более высокие уровни гидроксипролина наблюдались в группе, обработанной каркасом DOX-CL, чем в группе, обработанной необработанным и обработанным каркасом CL. Как говорится в литературе, длительная воспалительная фаза в диабетическом состоянии препятствует другим фазам заживления. Более быстрая скорость сокращения раны в каркасе DOX-CL может быть связана с противовоспалительным свойством DOX, что приводит к дальнейшим стадиям раны, происходящим в надлежащей временной фазе, что приводит к ускоренному заживлению раны.
Биохимическая оценка уровней MMP-9 с использованием теста ИФА показывает, что в группе, обработанной каркасом DOX-CL, наблюдалось снижение уровней MMP-9 по сравнению с теми, которые были в группах, обработанных каркасом CL, и необработанных. Согласно литературе, повышенные уровни MMP-9 ответственны за деградацию матрицы, что, в свою очередь, продлевает процесс заживления ран. DOX, противовоспалительное средство, ингибировал уровни MMP-9, что считается причиной предотвращения распада COL, что приводит к ускоренному заживлению DW. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями Lindeman et al., 2009 и Zhang et al., 2014 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Ашиша Д. Вадхвани. (Доцент и заведующий кафедрой фармацевтической биотехнологии, Фармацевтический колледж JSS, Ути, Индия) за помощь в исследованиях жизнеспособности клеток in vitro.
Авторы хотели бы поблагодарить Департамент науки и технологий - Фонд совершенствования научно-технической инфраструктуры в университетах и высших учебных заведениях (DST-FIST), Нью-Дели, за поддержку нашего отдела.
Авторы также хотели бы поблагодарить г-на Санджу. С. и г-н Шрирам. Нарукулла М. Фарм студентам за поддержку в видеосъеме.
Это исследование было поддержано JSS Academy of Higher Education & Research (JSSAHER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
