Summary
El andamio DOX-CL preparado satisfizo los requisitos previos de un apósito DW ideal en resistencia mecánica, porosidad, absorción de agua, tasa de degradación, liberación sostenida, propiedades antibacterianas, biocompatibilidad y antiinflamatorias, que se consideran esenciales para la recuperación del tejido dañado en los trabajadores de la muerte.
Abstract
Una complicación importante de la diabetes mellitus son las heridas diabéticas (DW). La fase prolongada de inflamación en diabetes obstruye las etapas posteriores de lesión que lleva a la herida retrasada que cura. Se seleccionó la doxiciclina (DOX), como un fármaco potencial de elección, debido a sus propiedades antibacterianas junto con sus propiedades antiinflamatorias reportadas. El estudio actual tiene como objetivo formular andamios no reticulados (NCL) y reticulados (CL) cargados con DOX y evaluar su capacidad curativa en condiciones diabéticas. El resultado de la caracterización de los andamios revela que el andamio DOX-CL tiene una porosidad ideal, una baja tasa de hinchazón y degradación, y una liberación sostenida de DOX en comparación con el andamio DOX-NCL. Los estudios in vitro revelan que el andamio DOX-CL fue biocompatible y mejoró el crecimiento celular en comparación con los grupos de control y tratados con andamios CL. Los estudios antibacterianos han demostrado que el andamio DOX-CL era más efectivo que el andamio CL contra las bacterias más comunes que se encuentran en DW. Usando el streptozotocin y el modelo dieta-inducido alto en grasas de DW, un índice perceptiblemente (p≤0,05) más rápido de contracción de la herida en el grupo tratado andamio de DOX-CL fue observado comparado a ésos en el andamio del CL tratados y los grupos de control. El uso del andamio DOX-CL puede resultar ser un enfoque prometedor para el tratamiento local para los trabajadores de la mujer.
Introduction
La diabetes mellitus (DM) es una condición en la que el fracaso del cuerpo para administrar insulina o reaccionar a sus resultados en la digestión anormal de azúcares directos provoca un aumento de la glucosa en sangre 1. El enredo más consecutivo y aplastante de la DM es la herida diabética (DW). Aproximadamente el 25% de los pacientes con DM tienen la oportunidad de acumular una DW en su vida 1. La cura obstaculizada de DW se acredita a un triopathy del DM: immunopathy, vasculopathy, y neuropatía. Siempre que la DW no se trate, puede dar lugar al desarrollo de gangrena, lo que provoca la extracción del órgano en cuestión 2.
Muchos tratamientos, como instruir a los pacientes (inspeccionar la herida diariamente, limpiar la herida, evitar actividades que crean presión sobre la herida, monitoreo periódico de glucosa, etc.), controlar su glucosa en sangre, desbridamiento de la herida, descarga de presión, procedimiento médico, oxigenoterapia hiperbárica y terapias avanzadas son en la práctica 3,4. La mayoría de estos medicamentos no abordan todos los requisitos previos vitales para la atención de la DW a la luz de las condiciones fisiopatológicas multifactoriales y los gastos inesperados relacionados con estos medicamentos 5. Aunque la patogenesia de DW es multifactorial, la inflamación persistente con la gerencia inadecuada del tejido se indica para ser la razón real de la cura retrasada en DWs 5,6.
Los niveles aumentados de mediadores inflamatorios y favorable-inflamatorios en DW dan lugar a factores de crecimiento disminuidos responsables de la herida retrasada que cura 2,6. La formación inadecuada de la matriz extracelular (ECM) en DWs se acredita a los niveles crecientes de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) responsables de la degradación rápida de ECM formado. En los MMPs, MMP-9 es reportado como un intermediario importante responsable de la inflamación prolongada y la rápida degradación de la ECM 7. Se afirma que el tratamiento local con un fármaco antiinflamatorio que disminuye los niveles elevados de MMP-9 restablece la homeostasis cutánea, la disposición marco y provoca una mejor curación de los DWs 8,9.
La doxiciclina (DOX), un inhibidor de MMP-9, fue elegida para suprimir los niveles elevados de MMP-9, un mediador inflamatorio importante responsable de la inflamación persistente en DWs 10,11,12. Además, dox poseen antioxidante (producir radicales hidroxi y fenoxi libres capaces de unirse con especies reactivas de oxígeno) 13 y anti-apoptótico (inhibir la expresión de caspasa y estabilización mitocondrial) 14 actividades que son esenciales para el tratamiento de dw. Se eligió la disposición de los marcos que contenían DOX, colágeno (COL) y quitosano (CS). La elección del COL depende de la forma en que ayuda a proporcionar el marco necesario responsable de la resistencia mecánica y la regeneración tisular 15. Por otra parte, el CS es estructural homólogo al glycosaminoglycan, asociado a varias fases curativas de la herida. También se informa que el CS posee una propiedad antibacteriana significativa 15. Por lo tanto, el andamio COL/CS de DOX está formulado para suprimir la inflamación prolongada, seguido de apoyar la formación de la matriz para la cura exitosa de heridas en condiciones de DM.
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Protocol
Todos los procedimientos animales realizados fueron aprobados por el comité ético animal institucional de JSS College of Pharmacy, Ooty, India.
1. Preparación de andamios porosos cargados DOX por método de liofilamiento
- Agregue 1.2 g de COL a 100 mL de agua (por ejemplo, Millipore) y manténgalo a un lado para la hinchazón.
- Revuelva la dispersión de COL hinchada a 2000 rpm durante la noche para asegurar la disolución completa de COL.
- Preparar la solución de CS disolviendo aproximadamente 0,8 g de CS en 100 mL de ácido acético al 1%.
- Revuelva la solución CS durante la noche a 2000 rpm para asegurar una dispersión uniforme.
- Mezcle DOX (1% p/v), seguido de la solución CS, a la solución COL, y revuelva durante 30 min.
- Filtre la mezcla física obtenida utilizando un paño de muselina para eliminar el material particulado.
- Ultracongelar el filtrado obtenido a -85 °C ± 4 °C durante unas 24 h.
- Liofilizar la mezcla ultracongelada a -85 °C ± 4 °C durante 72 h.
- Almacenar los andamios obtenidos en un desecador para su posterior análisis 16,17.
2. Reticulado de andamios
- Disolver la ETM (0,488 g) en 50 mL de agua.
- Remoje 50 mg del andamio cargado dox en 20 mL del tampón MES durante 30 min.
- Mezcle 19,5 mL de tampón MES con 0,1264 g de EDC y 0,014 g de NHS en un casto separado.
- Sumergir el andamio en la mezcla tampón durante 4 h para lograr la reticulación 16.
- Almacene los andamios reticulados (CL) y no reticulados (NCL) cargados dox para su posterior evaluación.
3. Caracterización de andamios
- Examen morfológico mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)
- Caracterizar los andamios para análisis morfológicos utilizando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
- Manche la sección transversal y la superficie exterior del andamio con la delicada capa de oro (~ 150 Å).
- Captura la imagen fotográfica a un voltaje de excitación de 5 kV y 10 kV.
- Coloque las muestras en trozos de aluminio y encierre con el oro a aproximadamente 9 V.
- Mida el andamio utilizando SEM con el aumento de la resolución a 10 kV.
- Determinación de la porosidad
- Medir la porosidad de los andamios utilizando el método de desplazamiento de líquido (etanol) 18.
- Calcule la porosidad de los andamios utilizando las fórmulas siguientes.
Ww = Peso húmedo del andamio
Wd = Peso seco del andamio
Wv = Volumen del andamio
- Determinación de la capacidad de absorción de agua
- Mida el peso seco del andamio.
- Incubar el andamio pesado a 37 °C durante 24 h en tampón de fosfato salino (PBS) pH 7,4.
- Retire el exceso de PBS sobre el andamio utilizando papel de filtro.
- Mida la capacidad de absorción de agua utilizando las fórmulas siguientes 17.
WS = Porcentaje de absorción de agua
W1=Peso húmedo del andamio
W0= Peso seco del andamio
- Degradación de andamios
- Incubar el andamio (1cm x 1cm) a 37 °C durante 7 días en un PBS de pH 7,4 que contenga lisizimas.
- Lave el andamio para eliminar los iones adheridos en la superficie.
- Liofil liofil el andamio lavado 17.
- Calcule la tasa de degradación utilizando fórmulas.
Ww = Peso inicial del andamio
Wd = Peso del andamio después de la liofilamiento
-
Estudios de liberación in vitro
- Determine el comportamiento de liberación del DOX desde el andamio utilizando el método de saco de diálisis.
- Dispersar el andamio en unos mililitros de líquido de herida simulado (pH 7.4) y transferirlo a una bolsa de diálisis.
- Cierre firmemente los extremos de la bolsa de membrana y sumérjase en los 500 mL de solución de líquido de herida simulada.
- Revuelva la solución de líquido de la herida que contiene la bolsa de diálisis a 200-250 rpm.
- Recoja la solución sobrenadante y reemplácela con una cantidad igual de solución tampón fresca a intervalos de tiempo definidos.
- Determine el porcentaje de liberación de DOX de los andamios en la solución sobrenadante utilizando un espectrómetro uv-visible a 240 nm.
4. Estudios antibacterianos in vitro
- Determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de los andamios CL y DOX-CL contra S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa utilizando el método de dilución de micro-caldo.
- Prepare los cultivos bacterianos utilizando caldo Mueller-Hinton en una proporción de 1:1000 para obtener 0.5 de turbidez de McFarland.
- Añadir D-glucosa (800 mg/dL) a los cultivos bacterianos para hiperglucation 19,20.
- Picar y solubilizar el CL y DOX-CL en DMSO (control negativo).
- Diluir en serie la suspensión bacteriana hiperglicada (100 μL) y las muestras de ensayo (100 μL de solución de andamios) en una placa de 96 pozos.
- Incubar la placa a 37 °C durante 20-24 h.
- Registre la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm 21.
5. Estudios de biocompatibilidad in vitro
- Evaluar la biocompatibilidad de los andamios preparados utilizando MTT [(3-(4, 5 dimetil tiazol-2 il)-2, 5-difenil tetrazolio bromuro)] ensayo.
- Esterilizar los andamios de dimensión estándar y colocarlos en placas de 24 pozos.
- Añadir las células 3T3-L1 a la placa de 24 pozos e incubar durante 72 h.
6. Estudios in vivo en animales
- Inducción de dm y herida por escisión
- Alimente al animal con una dieta alta en grasas durante dos semanas y administre una dosis única de estreptozotocina (STZ) (50 mg/kg de peso corporal) en solución tampón de citrato por vía intraperitoneal a ratas albinas Wistar (180-200 g) para la inducción de la diabetes tipo 2.
- Elija los animales con una glucosa en sangre constante de 250 mg/dL para el estudio.
- Aleatorizar los animales seleccionados para la inducción de heridas por escisión.
- Anestesiar a las ratas diabéticas usando el éter dietílico (5 mL fueron agregados a la cámara de anestesia previamente saturada) y confirmar usando el método del pellizco del dedo del pie y el color de la membrana mucosa.
- Afeitarse la zona dorsal (dorsal torácica, región lumbar) utilizando un recortador aséptico y cuchillas (A40).
- Esterilice el área afeitada con un hisopo alcohólico.
- Extirpar la piel (2 x 2 cm2 y una profundidad de 1 mm) con una cuchilla quirúrgica aséptica A40 en el área afeitada para crear una herida abierta.
- Divida los animales en tres grupos (Grupo 1- Control de enfermedades (Control), Grupo 2- Andamio CL (Placebo), Grupo 3- ANDAMIO DOX CL), cada grupo formado por 6 ratas.
- Coloque los andamios CL y DOX CL con cinta quirúrgica y cubra el grupo control con gasa estéril durante 21 días.
- Trace el área de la herida en una hoja estéril de OHP y mida la reducción porcentual de la herida usando el método de la rejilla en los días 0, 7, 14 y 21 para todos los grupos.
- Calcule el porcentaje de reducción de la herida utilizando las siguientes fórmulas.
7. Estudios histopatológicos
- Aísle el área curada de la herida en los días 7, 14, y 21, almacene en la solución del formalin (el 10%).
- Seccione los tejidos utilizando un microtomo para obtener un espesor de 6 μm.
- Monte las secciones en un portaobjetos de vidrio y manche con Hematoxilina y eosina 17.
- Capture las imágenes con un aumento de 40x utilizando un microscopio digital.
8. Estimación de hidroxiprolina
- Aísle el área curada de la herida en los días 0, 7, 14, y 21 para la evaluación.
- Estimar el contenido de hidroxiprolina utilizando el procedimiento descrito por Reddy G et al., 1996 22.
9. Prueba de Elisa
- Estime los niveles de MMP-9 utilizando el kit Elisa según las instrucciones del fabricante.
- Aísle las muestras de tejido del área curada de la herida el día 21 y mince usando un homogeneizador del tejido.
- Centrífuga el homogeneizado obtenido y recoge el sobrenadante.
- Diluya el sobrenadante a 100 veces usando el tampón de ensayo.
- Escanee la placa con un lector de placas múltiples.
10. Análisis estadístico
- Representar los resultados obtenidos como Media ± DE.
- Realice el análisis estadístico utilizando Graph pad prism v5.01.
- Lograr la significación estadística utilizando el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba post hoc de Dunnet.
- Considere los valores con p≤0.05 como significativos.
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Representative Results
Caracterización del andamio NCL y CL cargado dox
En la examinación visual, el ncl y el andamio del CL fueron encontrados para ser crema en color. Además, ambos andamios parecen ser como una esponja, rígidos e inelásticos cuando se examinan físicamente. Las imágenes SEM de los andamios NCL y CL se muestran en la Figura 1. De la figura, estaba claro que había una disminución en el tamaño de los poros después de la reticulación mediante la formación de enlaces intermoleculares. También, la porosidad de los andamios NCL y del CL fue encontrada para ser 92.3±4.21 y 71.35±2.65, respectivamente. El porcentaje de absorción de agua de los andamios NCL y CL fue de 750±11,4% y 492±8,66% a intervalos de tiempo de 24 h.
Además, se realizaron estudios de biodegradación durante siete días en el líquido de herida simulado de pH 7,4, que comprende las lisozimas. El andamio NCL exhibió una tasa más rápida de degradación inicialmente en los primeros tres días y disminuyó lentamente durante cuatro días consecutivos. Por otro lado, el andamio CL mostró una tasa prolongada de degradación. La reticulación del andamio mejoró las propiedades mecánicas y la resistencia de la red que, a su vez, resultó en una disminución de la tasa de degradación, lo que indica una mayor resistencia a la degradación (Figura 2).
Además, se realizó la liberación in vitro de DOX a partir de andamios NCL y CL durante 120 h (Figura 3). En la 1 h inicial, 27.92±3.45% DOX fue liberado del andamio NCL, mientras que solamente 16.54±2.21% DOX fue liberado del andamio cl. Después de 6 h, la liberación dox de los andamios aumentó en 63.15±3.78% en el andamio NCL y 44.43±3.57% en andamios CL. Después de 24 h, había un lanzamiento del 70% DOX del andamio de NCL, mientras que el andamio del CL tomó más de 72 h para liberar el 70% del DOX. En base a los resultados obtenidos, el andamio CL cargado dox fue seleccionado para su posterior evaluación y representado como andamio DOX-CL. Mientras que el andamio CL sin DOX (placebo) se designa como Andamio CL.
Estudios antibacterianos in vitro
Los pacientes con DW generalmente experimentan infecciones que resultan en la cicatrización prolongada de heridas. Así, se examinaron los andamios preparados para determinar su actividad antibacteriana utilizando el MIC contra un panel seleccionado de bacterias(Tabla 1). De los resultados, está claro que DOX exhibió actividad inhibitoria con un MIC de <4 μg/mL contra S. aureus y S. epidermis. Se observó un MIC de <8 μg/mL y <16 μg/mL contra E. coli y P. aeruginosa. El extracto solo de quitosano y andamio cl exhibió una actividad mínima contra organismos seleccionados como S. aureus (<64 μg/mL), S. epidermis (<64 μg/mL), E. coli (<128 μg/mL) y P. aeruginosa (<128 μg/mL). El andamio DOX-CL ha mostrado una actividad inhibitoria similar con un MIC de <2 μg/mL contra S. aureus y S. epidermis. Además, el andamio DOX-CL exhibió actividades moderadas con un MIC de <8 μg/mL contra E. coli y P. aeruginosa.
Estudio de biocompatibilidad in vitro
El análisis de MTT fue realizado para determinar la viabilidad celular de las células 3T3-L1 en presencia de andamios del CL y de DOX-CL. Los resultados ejemplificaron que los andamios CL y DOX-CL no estimularon ninguna citotoxicidad. Además, la viabilidad celular fue comparativamente mayor en los grupos tratados con andamios que en los de control, lo que representa el mayor crecimiento de fibroblastos en presencia de andamios(Figura 4).
Estudios de cicatrización de heridas in vivo
El área media de la herida disminuida en todos los grupos se determinó mediante el método gráfico en los días 0, 7, 14 y 21(Figura 5). En la examinación visual, las heridas en los grupos tratados andamio del CL y de DOX-CL estaban libres de supurar el día séptimo. Al mismo tiempo, las heridas en el grupo de control rezumaban. El el día 14, una costra seca fue observada en todos los grupos; sin embargo, se observó una tasa más rápida de contracción de la herida en el andamio DOX-CL (89,663%). El día 21, 99,9% de la herida consiguieron curados, y una cicatriz fue formada en el andamio de DOX-CL, mientras que la cura parcial fue observada en grupos tratados del andamio del control y del CL.
Estudio histopatológico
La observación histopatológica de la herida que curaba el postinjury del séptimo día exhibió la interrupción de todas las capas de la piel en los bordes de la herida en todos los grupos. No había visibilidad de la epidermis; sin embargo, los neutrófilos predominantes con monocitos y linfocitos intermitentes fueron observados en el grupo de control. En el grupo tratado andamio del CL, la visibilidad moderada de la epidermis fue notada junto con pocos neutrófilos y macrófagos. Mientras que, en el grupo tratado andamio DOX-CL, la herida fue cubierta con una capa delgada de la epidermis, representando la fase de reepithelization. Los neutrófilos y los macrófagos suaves, junto con el tejido de granulación, también fueron considerados más a menudo en el grupo tratado andamio de DOX-CL.
El postinjury del día 14, las heridas en todos los grupos fueron encontradas para ser cubiertas con epidermis. En el grupo de control, la capa de la epidermis formada fue observada para ser una capa muy delgada junto con los neutrófilos prevalecidos. En el grupo tratado andamio cl, la capa de epidermis formada era más gruesa que la del grupo de control, junto con las células masivas multinucleadas leves. En el grupo tratado con andamios DOX-CL, la epidermis desarrollada fue más gruesa en comparación con otros grupos, junto con un abundante número de histiocitos y células gigantes multinucleadas. La zona densa de fibroblastos también se observó en el grupo tratado andamio DOX-CL.
El postinjury del día 21, en el grupo de control, un número dominante de neutrófilos fue disminuido junto con la repetición de macrófagos e histiocytes que representaban la inflamación disminuida. Considerando que, en el grupo tratado andamio del CL, un número moderado de histocytes y de linfocitos fue observado. La epidermis formada fue observada para ser substancialmente más gruesa en el grupo tratado andamio de DOX-CL que ésos en el grupo de control, junto con un número rico de histiocytes, de linfocitos, y de células multinucleated masivas. En el grupo tratado andamio DOX-CL, la cuenta de los neutrófilos fue disminuida el el día 7. Asimismo, la recolección de macrófagos y sus variantes morfológicas como las células masivas multinucleadas y los histiocitos se notaron los días 14 y 21(Figura 6).
Estimación de hidroxiprolina
La estimación de la hidroxiprolina es una medida indirecta de la cantidad de colágeno presente en la cicatrización de heridas. Mayor concentración de hidroxiprolina designa un porcentaje rápido de cicatrización de heridas. El examen bioquímico reveló una mayor cantidad de hidroxiprolina en el grupo tratado con andamio DOX-CL seguido por el grupo tratado con andamio CL que en el grupo control(Figura 7).
Estimación de MMP-9 utilizando el kit elisa
El contenido MMP-9 en el grupo tratado andamio DOX-CL disminuyó significativamente en comparación con los que están en control, y el andamio CL trató el grupo. Considerando que el contenido de MMP-9 en el grupo tratado con andamio CL fue marginalmente menor en comparación con el del grupo tratado andamio DOX-CL, como se muestra en la Figura 8.
Figura 1:Morfología del andamio COL-CS cargado con DOX a ) antes de CL y b) después de la determinación de CL por SEM en un rango de escala de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:Degradación matricial de DOX cargado en andamios NCL y CL del día 1 al 7 en PBS pH 7.4 a 37 °C mostrando que NCL se degrada gradualmente durante 7 días. Contrariamente a esto, la tasa de degradación del andamio CL reducida considerablemente indica una mayor resistencia a la degradación enzimática. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Perfil de liberación de fármacos in vitro de DOX de andamios de NCL y CL en PBS pH 7.4 a 37° C mostrando una liberación lenta de fármaco en toda la formulación seguida de una liberación sostenida. Datos expresados como media ± DE (n=3). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:Células 3T3-L1 cultivadas en presencia de andamios CL y DOX-CL que muestran porcentaje de crecimiento celular más en el grupo tratado con andamios DOX-CL seguidos de andamios CL tratados y control. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5:(a)Imágenes que representan la reducción del área media de la herida en los grupos de control, andamio CL y andamio DOX-CL tratados en los días 0, 7, 14 y 21 después de la herida. (b)Representación gráfica de la reducción en el área media de la herida en los grupos de control, andamio CL y andamio DOX-CL tratados en los días 0, 7, 14 y 21 después de la herida. Los datos se expresan como media ± DE (n=6 heridas/grupo). La significación estadística se obtuvo mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Dunnet. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 6:Cambios histológicos durante el proceso de cicatrización de heridas en STZ y diabetes inducida por dieta alta en grasas en piel de rata albina Wistar en los días 7, 14 y 21 sin (control) y con tratamiento (andamios CL y DOX-CL) en un modelo de herida por escisión de espesor completo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 7: Resultado que representa el contenido de hidroxiprolina en heridas en los días 0, 7, 14 y 21 como indicador de estimación indirecta del nivel de colágeno. Los resultados se expresan en μg hidroxiprolina/mg de tejido de herida seca. Los datos representan la Media±SD (n=6 heridas/grupo). La significación estadística se obtuvo mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Dunnet. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 8:Gráfico que representa los niveles de MMP-9 en homogenados obtenidos de heridas curadas en STZ y modelo de rata diabética inducida por dieta alta en grasas el día 21. Los niveles de MMP-9 fueron determinados en alícuotas de 100 dobleces de los líquidos de la herida usando análisis de ELISA. Los datos representan Media±SD (n=3). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| MIC (μg/mL) | ||||
| Muestra de prueba | S. áureo | S. epidermis | E. coli | P. aeruginosa |
| DOX | <4 | <4 | <8 | <16 |
| CS | <64 | <64 | <128 | <128 |
| Extracto de andamio cl | <64 | <64 | <128 | <128 |
| Extracto de scaffolding DOX-CL | <2 | <2 | <4 | <4 |
Tabla 1:Concentración inhibitoria mínima de andamios CS, DOX, CL y DOX-CL contra un panel seleccionado de bacterias.
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Discussion
El objetivo principal de este estudio fue determinar el efecto del andamio COL-CS cargado dox en la curación de DW en ratas. El CL y el NCL fueron preparados y evaluados en términos de morfología, índice de la hinchazón, cinética in vitro del lanzamiento, y biocompatibilidad.
Caracterización del andamio NCL y CL cargado dox
Se encontró que los andamios preparados eran porosos con poros interconectados. Estos poros interconectados aseguran la naturaleza porosa y esponjosa que ayuda en la difusión adecuada del oxígeno y los nutrientes a las células para la proliferación y migración, lo que conduce a una curación acelerada. Aquí, el tamaño del poro dependía principalmente de la reticulación. La reticulación del andamio dio lugar a la disminución del tamaño de los poros mediante la formación de fuertes interacciones intramoleculares por EDC / NHS con CS y COL, aumentando la resistencia mecánica del andamio.
El índice de porosidad se basa en la densidad relativa, que es una función de la masa de puntales de esponja y el volumen. Generalmente, la contracción del volumen del andamio se produce si un agente de reticulación altera la posición de los puntales arrastrándolos más cerca unos de otros, lo que lleva a la densificación del andamio. Sin embargo, en el caso de la química carbodiimida, no se prevé un aumento en la masa del andamio debido a su mecanismo único, es decir, la introducción del enlace de la amida (O = C-NH) utilizando el grupo carboxílico (>COOH) y amina (-NH) de la cadena peptídica adyacente sin entrar en el andamio. Simultáneamente, durante la reticulación, puede ocurrir una pérdida de masa menor debido a la disolución y migración de cadenas poliméricas no unidas. Sin embargo, en el caso del tratamiento de andamios con EDC/NHS no produjo ningún efecto notable en la morfología de los andamios.
La capacidad del andamio para absorber el fluido biológico es crucial en la evaluación de su idoneidad como portador de fármacos. La propiedad de absorción de agua no solo afecta la forma del andamio, sino que también afecta el crecimiento celular. Se observó que el andamio CL había mostrado una tasa de absorción de agua inferior a la del andamio NCL, lo que puede atribuirse a la reticulación del andamio. Por otra parte, la hidrofilicidad del material del andamio se redujo significativamente después de la reticulación debido a (i) la pérdida de grupos hidrófilos (>COOH > (ii) inhibición de la hinchazón por la formación de nuevos enlaces (O=C-NH). Estos resultados están en buen acuerdo con los informes publicados anteriormente 23,24.
Se realizó un estudio de biodegradación enzimática mediante el seguimiento del porcentaje de masa residual después de siete días de incubación en el líquido de herida simulado de pH 7,4, que comprende lisozimas. El andamio NCL mostró una tasa más rápida de degradación inicialmente en los primeros tres días y disminuyó lentamente durante cuatro días consecutivos. En el otro lado, el andamio CL mostró una tasa prolongada de degradación. La reticulación del andamio mejoró las propiedades mecánicas y la resistencia de la red que, a su vez, resultó en una disminución de la tasa de degradación, demostrando una mejor resistencia a la degradación.
Los estudios del lanzamiento de la droga fueron realizados para los andamios del CL y del NCL para 120 h. En general, el coeficiente de liberación de fármacos del andamio disminuye a medida que aumenta la densidad de reticulado debido a las interconexiones mejoradas entre los poros y la disminución del espacio entre las cadenas polipeptídicas. El coeficiente de liberación de fármacos también está influenciado por el índice de porosidad, el contenido de agua, el índice de hinchazón y el grado de reticulado. En nuestro estudio, 27,92±3,45% y 63,15±3,78% de DOX del andamio NCL, mientras que 16,54±2,21% y 44,43±3,57% de DOX del andamio CL se liberó a 1 h y 6 h, respectivamente. Después de 24 h, había un lanzamiento del 70% de DOX del andamio de NCL, mientras que; El andamio CL tardó más de 72 h en liberar el 70% del DOX. Los resultados mostraron que la reticulación del andamio influyó inversamente en la liberación de DOX al disminuir la relación de hinchazón y el contenido de agua.
Estudios antibacterianos in vitro
El extracto del andamio de DOX-CL exhibió una actividad inhibitoria más alta (MIC) contra organismos grampositivos. La mayor actividad del extracto de andamio DOX-CL podría deberse al aumento de la hidrofobicidad de la muestra. Sin embargo, el extracto del andamio de DOX-CL exhibió actividad mínima contra organismos gramnegativos, probablemente debido a la falta de la penetración de la pared celular. Además, el MIC de DOX-CL fue comparativamente más alto que las muestras de CS, andamio cl y DOX, lo que puede atribuirse a la actividad sinérgica de DOX y CS en el extracto de DOX-CL.
Estudio de biocompatibilidad in vitro
El estudio de biocompatibilidad in vitro se realizó en células fibroblásticas (3T3-L1). Los fibroblastos son responsables de la producción de ECM y proteínas. Además, desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la integridad estructural al mejorar la formación del marco necesario para la cicatrización de heridas. Los resultados muestran que el andamio DOX-CL y el andamio CL no produjeron ninguna citotoxicidad celular. Sin embargo, ambos grupos de andamios se observaron con el crecimiento celular y la diferenciación de fibroblastos en los poros del andamio, lo que indica que los andamios preparados eran biocompatibles. El crecimiento y la diferenciación celular crecientes en ambos grupos eran principalmente debido a la presencia de CS y de COL como matriz extracelular en la estructura del andamio.
Además, se observó un crecimiento celular comparativamente mayor con el grupo andamio DOX-CL que el del andamio CL debido a la activación de la señal PI3K-AKT por DOX, responsable del crecimiento celular y la supervivencia 25.
Estudios de cicatrización de heridas in vivo
Las diversas complicaciones del DM son responsables de la cura prolongada de DW. Para mímico la condición diabética en ratas, una dieta de alto contenido en grasas fue dada, seguida por una inyección intraperitoneal de STZ. Después de 2-3 días de confirmación diabética, las heridas abiertas fueron creadas por la supresión de la piel en la región torácica dorsal. El tratamiento se realizó durante 21 días con los respectivos andamios. La reducción en el área de la herida fue determinada para todos los grupos el los días 0, 7, 14, y 21. Las ratas diabéticas tratadas con el andamio DOX-CL exhibieron un grado significativo de contracción de la herida comparada a los grupos del andamio del CL y a los grupos no tratados.
La fase inflamatoria de la cicatrización de heridas es responsable de la formación de barreras funcionales. En la siguiente etapa, la fase proliferativa de la cicatrización de heridas llama la atención en el cuidado de heridas, en la que se observó un 43% de la reducción del área de la herida con el grupo de andamios DOX-CL. En comparación, sólo el 23% y el 7% fueron observados con el andamio del CL y los grupos no tratados el día 7, respectivamente. A partir de las imágenes (Figura 5), la contracción de la herida se inició después de que se completa la fase inflamatoria y proliferativa. El grupo de andamios DOX-CL exhibió una contracción significativa de la herida debido a la presencia de DOX, que es responsable de los efectos antiinflamatorios y antiinfecciosos. Por otra parte, col y CS en el andamio ayudó a la proliferación celular, diferenciación, y la migración resultando en el 99% de dw curación en 21 días.
Las heridas untreated del excisional demostraron neutrófilos, linfocitos, y monocitos el postinjury del día 7. Como se indicó anteriormente, los neutrófilos ayudan en el desbridamiento de la herida en la etapa temprana de la cicatrización de la herida. Además, la sobreabundancia de neutrófilos puede influir negativamente en el proceso de curación dañando el tejido normal. Según lo informado por Dovi et al., un número mínimo de neutrófilos acelera el proceso de reepitelización 26.
Además, el aumento de macrófagos, histiocitos y células multinucleadas masivas en el grupo tratado andamio DOX-CL favoreció el entorno para la cicatrización acelerada de heridas mediante la reparación de las células dañadas y la promoción de la síntesis de COL. Por otra parte, la amalgamación del COL con el tejido fue determinada usando los niveles de la hidroxiprolina en todos los grupos. Sin embargo, los niveles comparativamente más altos de la hidroxiprolina fueron observados con el grupo tratado andamio de DOX-CL que el grupo tratado andamio no tratado y del CL. Según lo indicado en la literatura, la fase inflamatoria prolongada en la condición diabética dificulta las otras fases de curación. El índice más rápido de contracción de la herida en el andamio de DOX-CL se puede atribuir a DOX' propiedad antiinflamatoria de s, dando por resultado las etapas posteriores de la herida que ocurre en la fase apropiada del tiempo que lleva a la herida acelerada que cura.
La estimación bioquímica de los niveles de MMP-9 utilizando la prueba ELISA revela que el grupo tratado con andamios DOX-CL exhibió niveles disminuidos de MMP-9 en comparación con los de los grupos tratados y no tratados con andamios CL. Según la literatura, los niveles crecientes de MMP-9 responsables de la degradación de la matriz, que, a su vez, prolonga el proceso curativo de la herida. DOX, un agente antiinflamatorio, inhibió los niveles MMP-9, que se considera la razón de prevenir la avería del COL, dando por resultado la cura acelerada de DW. Estos resultados están de acuerdo con estudios publicados anteriormente por Lindeman et al., 2009 y Zhang et al., 2014 27,28.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Ashish D Wadhwani. (Profesor Asistente y Jefe del Departamento de Biotecnología Farmacéutica, JSS College of Pharmacy, Ooty, India) por ayudar en los estudios de viabilidad de células in vitro.
Los autores desean agradecer al Departamento de Ciencia y Tecnología - Fondo para la Mejora de la Infraestructura de Ciencia y Tecnología en Universidades e Instituciones de Educación Superior (DST-FIST), Nueva Delhi, por apoyar a nuestro departamento.
Los autores también quieren dar las gracias al Sr. Sanju. S y el Sr. Sriram. Estudiantes de Narukulla M. Pharm por su apoyo en la sesión de video.
Esta investigación fue apoyada por la Jss Academy of Higher Education &Research (JSSAHER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
