Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פיגום מרוכבים קולגן-צ'יטוסן טעון דוקסיציקלין לריפוי מואץ של פצעים סוכרתיים

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62184
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1
1Department of Pharmaceutics, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, North Dakota state university, 3Department of Pharmacology, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research

Summary

פיגום DOX-CL המוכן סיפק את התנאים הקדים של רוטב DW אידיאלי בחוזק מכני, נקבוביות, ספיגת מים, שיעור השפלה, שחרור מתמשך, אנטי בקטריאלי, תאימות ביולוגית, תכונות אנטי דלקתיות, אשר נחשבים חיוניים להתאוששות של רקמה פגומה ב- DWs.

Abstract

סיבוך מרכזי אחד של סוכרת הוא פצעים סוכרתיים (DW). השלב הממושך של דלקת בסוכרת חוסם את השלבים הנוספים של פציעה המובילה לריפוי פצעים מאוחר. בחרנו דוקסיציקלין (DOX), כסם פוטנציאלי של בחירה, בשל תכונות אנטי בקטריאלי שלה יחד עם תכונות אנטי דלקתיות דיווח שלה. המחקר הנוכחי נועד לנסח פיגומים שאינם מקושרים קולגן-צ'יטוסן (NCL) וקישורים מקושרים (CL) של DOX ולהעריך את יכולת הריפוי שלהם בתנאי סוכרת. תוצאת האפיון של פיגומים מגלה כי פיגום DOX-CL מחזיק נקבוביות אידיאלית, שיעור נפיחות נמוך השפלה, ושחרור מתמשך של DOX לעומת פיגום DOX-NCL. מחקרי ההפריה החוץ גופית מגלים כי פיגום DOX-CL היה תואם ביולוגית וצמיחת תאים משופרת בהשוואה לפיגומי CL שטופלו וקבוצות בקרה. המחקרים האנטי-בקטריאליים הראו כי פיגום DOX-CL היה יעיל יותר מפיגומי CL נגד החיידקים הנפוצים ביותר שנמצאו ב- DW. באמצעות מודל DW סטרפטוזוטוצין ושומן גבוה דיאטה המושרה, שיעור מהיר יותר באופן משמעותי (p≤0.05) של התכווצות הפצע בקבוצת פיגומים DOX-CL נצפתה בהשוואה לאלה בפיגומים CL שטופלו וקבוצות בקרה. השימוש בפיגומים DOX-CL יכול להתברר כגישה מבטיחה לטיפול מקומי עבור DWs.

Introduction

סוכרת (DM) היא מצב שבו הכישלון של הגוף לספק אינסולין או להגיב לתוצאותיו בעיכול חריג של סוכרים פשוטים מביא לעלייה של גלוקוז בדם 1. ההסתבכות הרצונית והמרסקת ביותר של DM היא הפצע הסוכרתי (DW). בערך 25% מהחולים עם DM יש את ההזדמנות לבנות DW בחיים שלהם 1. הריפוי המופרע של DW מוכר לשלישייה של DM: אימונופתיה, ואסקולופתיה ונוירופתיה. בכל פעם DW נשאר מטופל, זה עלול לגרום להתפתחות נמק, ולכן מבקש את הסרת האיבר המודאג 2.

טיפולים רבים, כגון הנחיית המטופלים (לבדוק את הפצע מדי יום, לנקות את הפצע, להימנע מפעילויות שיוצרות לחץ על הפצע, ניטור גלוקוז תקופתי וכו '), שליטה על רמת הגלוקוז בדם שלהם, פירוק פצעים, העברת לחץ, הליך רפואי, טיפול בחמצן היפרברי וטיפולים מתקדמים הם בפועל 3,4. רוב התרופות הללו אינן מתייחסות לכל התנאים הקדם החיוניים לטיפול DW לאור התנאים הפתופיזיולוגיים הרב-גורמיים והוצאות בלתי צפויות הקשורות לתרופות אלה 5. למרות פתוגנזה DW הוא רב-גורמי, דלקת מתמשכת עם ניהול רקמות בלתי הולם הוא הצהיר להיות הסיבה בפועל לריפוי מאוחר DWs 5,6.

רמות מוגברות של מתווכים דלקתיים ופרו דלקתיים ב- DW גורמות לגורמי גדילה מופחתים האחראים לריפוי פצעים מאוחר 2,6. היווצרות מטריצה חוץ-תאית לא נכונה (ECM) ב- DWs מוסמכת לרמות גבוהות יותר של מטריצה metalloproteinases (MMPs) אחראי על השפלה מהירה של ECM שנוצר. ב MMPs, MMP-9 מדווח כמתווך גדול אחראי על דלקת ממושכת השפלה ECM מהירה 7. הואציין כי טיפול מקומי עם תרופה אנטי דלקתית שמפחית את רמות גבוהות של MMP-9 מחדש מקים הומאוסטזיס עורי, סידור מסגרת ומבקש ריפוי טוב יותר של DWs 8,9.

Doxycycline (DOX), מעכב MMP-9, נבחר לדכא את הרמות הגבוהות של MMP-9, מתווך דלקתי גדול אחראי על דלקת מתמשכת ב- DWs 10,11,12. בנוסף, DOX מחזיק נוגד חמצון (לייצר הידרוקסי חינם פנוקסי רדיקלים מסוגל לקשור עם מינים חמצן תגובתי) 13 ואנטי אפופטוטי (לעכב ביטוי קפס וייצוב מיטוכונדריאלי) 14 פעילויות החיוניות לטיפול DW. נבחר הסדר המסגרות המכילות DOX, קולגן (COL) וצ'יטוסן (CS). הבחירה של COL תלויה באופן שבו הוא מסייע במתן המסגרת הדרושה האחראית על כוח מכני והתחדשות רקמות 15. מצד שני, CS הוא הומולוגי מבחינה מבנית כדי glycosaminoglycan, הקשורים עם מספר שלבים ריפוי פצע. כמו כן, הוא דיווח כי CS מחזיק נכס אנטי בקטריאל משמעותי 15. לפיכך, פיגום COL / CS של DOX מנוסח כדי לדכא את הדלקת הממושכת, ואחריו תמיכה היווצרות המטריצה לריפוי פצע מוצלח בתנאי DM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה האתית של בעלי החיים המוסדיים של מכללת JSS לרוקחות, אוטי, הודו.

1. הכנת פיגומים נקבוביים טעונים של DOX בשיטת ייבוש בהקפאה

  1. מוסיפים 1.2 גרם COL ל-100 מ"ל מים (למשל, מלפיגור) ושומרים בצד לנפיחות.
  2. מערבבים את פיזור COL הנפוח ב 2000 סל"ד לילה כדי להבטיח פירוק מלא של COL.
  3. הכן פתרון CS על ידי המסת כ 0.8 גרם של CS ב 100 מ"ל של 1% חומצה אצטית.
  4. מערבבים את פתרון ה-CS למשך הלילה במהירות של 2,000 סל"ד כדי להבטיח פיזור אחיד.
  5. מערבבים את DOX (1% w/v), ואחריו פתרון למדים, לפתרון COL, ומערבבים במשך 30 דקות.
  6. מסננים את התערובת הפיזית המתקבלת באמצעות מטלית מוסלין כדי להסיר את החומר החלקיקים.
  7. להקפיא עמוק את הסינון המתקבל ב -85 °C (55 °F) ± 4 °C (50 °F) במשך כ 24 שעות.
  8. ליופיליזציה תערובת הקפאה עמוקה ב -85 °C (55 °F) ± 4 °C (72 °F) במשך 72 שעות.
  9. לאחסן את הפיגומים המתקבלים בחיטוי לניתוח נוסף 16,17.

2. הצלבת פיגומים

  1. להמיס MES (0.488 גרם) ב 50 מ"ל של מים.
  2. השרו 50 מ"ג של פיגום טעון DOX ב 20 מ"ל של מאגר MES במשך 30 דקות.
  3. ערבבו 19.5 מ"ל של מאגר MES עם 0.1264 גרם של EDC ו-0.014 גרם של NHS במכה נפרדת.
  4. לטבול את הפיגומים בתערובת חיץ במשך 4 שעות כדי להשיג crosslinking 16.
  5. אחסן את הפיגומים הטעונים (CL) והפיגומים הלא מקושרים (NCL) של DOX להערכה נוספת.

3. אפיון פיגומים

  1. בדיקה מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
    1. אפיון הפיגומים לניתוח מורפולוגי באמצעות SEM (1 ס"מ × 1 ס"מ × 0.5 ס"מ).
    2. מכתימים את החתך ואת המשטח החיצוני של הפיגומים בשכבה העדינה של הזהב (כ-150 Å).
    3. לכוד את התמונה המצולמת במתח העירור של 5 kV ו- 10 kV.
    4. מניחים את הדגימות בספחי אלומיניום ומכניסים אותן לזהב בערך 9 V.
    5. מדוד את הפיגומים באמצעות SEM ברזולוציה מוגברת של 10 kV.
  2. קביעת נקבוביות
    1. למדוד את נקבוביות הפיגומים באמצעות שיטת תזוזת הנוזל (אתנול) 18.
    2. חשב את נקבוביות הפיגומים באמצעות הנוסחה שלהלן.
      Equation 1
      Ww = משקל רטוב של הפיגומים
      Wd = משקל יבש של הפיגומים
      Wv = נפח הפיגומים
  3. קביעת יכולת ספיגת המים
    1. למדוד את המשקל היבש של הפיגומים.
    2. לדגור את הפיגומים במשקל 37 °C (55 °F) עבור 24 שעות מלוחים פוספט (PBS) pH 7.4.
    3. הסר את ה-PBS העודף מעל הפיגומים באמצעות נייר סינון.
    4. מדוד את קיבולת ספיגת המים באמצעות הנוסחה שלהלן 17.
      Equation 2
      WS = אחוז ספיגת המים
      W1=משקל רטוב של הפיגומים
      W0= משקל יבש של הפיגומים
  4. פגיעה בפיגומים
    1. לדגור את הפיגומים (1 ס"מ x 1 ס"מ) ב 37 °C (7 ימים ב PBS של pH 7.4 המכיל ליזוזים.
    2. לשטוף את הפיגומים כדי להסיר כל יונים דבקים על פני השטח.
    3. להקפיא יבש את הפיגומים השטופים 17.
    4. חשב את קצב ההשפלה באמצעות formulae.
      Equation 3
      Ww = המשקל הראשוני של הפיגומים
      Wd = משקל הפיגומים לאחר ייבוש בהקפאה
  5. מחקרי שחרור במבחנה
    1. קבע את אופן הפעולה של שחרור DOX מהפיגומים בשיטת שק הדיאליזה.
    2. מפזרים את הפיגומים בכמה מיליליטרים של נוזל פצע מדומה (pH 7.4) ומעבירים אותו לשקית דיאליזה.
    3. סגור בחוזקה את קצות שקית הממברנה ולטבול את 500 מ"ל של תמיסת נוזל פצע מדומה.
    4. מערבבים את תמיסת נוזל הפצע המכילה את שקית הדיאליזה ב 200-250 סל"ד.
    5. לאסוף את הפתרון supernatant ולהחליף אותו עם כמות שווה של פתרון חוצץ טרי במרווחי זמן מוגדרים.
    6. קבע את אחוז שחרור DOX מהפיגומים בתמיסה העל-טבעית באמצעות ספקטרומטר הנראה UV ב-240 ננומטר.

4. אין ויטרו מחקרים אנטי בקטריאלית

  1. לקבוע את הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של פיגומי CL ו- DOX-CL נגד S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa באמצעות שיטת דילול המיקרו-מרק.
  2. הכן את תרביות החיידקים באמצעות מרק מולר-הינטון ביחס של 1:1000 כדי להשיג עכוז מקפרלנד 0.5.
  3. הוסף D-גלוקוז (800 מ"ג / ד"ל) לתרבויות החיידקים עבור היפרגליקציה 19,20.
  4. טחון ו solubilize CL ו- DOX-CL ב- DMSO (שליטה שלילית).
  5. לדלל באופן סדרתי את ההשעיה החיידקית hyperglycated (100 μL) ודגימות בדיקה (100 μL של פתרון פיגומים) ב 96 צלחת היטב.
  6. לדגור על הצלחת ב 37 °C (55 °F) במשך 20-24 שעות.
  7. תיעדו את הספיגה בסוף גל של 600 ננומטר 21.

5. מחקרי תאימות ביולוגית במבחנה

  1. להעריך את תאימות ביולוגית של הפיגומים מוכנים באמצעות MTT [(3-(4, 5 דימתיל תיאזול-2 yl) -2, 5-דיפניל טטרזוליום ברומיד)]
  2. מחטאים את הפיגומים של הממד הסטנדרטי ומניחים אותם ב-24 צלחות היטב.
  3. הוסף תאי 3T3-L1 לצלחת 24 הבאר ודגר במשך 72 שעות.

6. במחקרים בבעלי חיים ב-vivo

  1. אינדוקציה של פצע DM ו excision
    1. להאכיל את החיה עם דיאטה עתירת שומן במשך שבועיים ולנהל מנה אחת של סטרפטוזוטוצין (STZ) (50 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) בתמיסת חיץ ציטראט תוך-פריטון לחולדות לבקן Wistar (180-200 גרם) עבור אינדוקציה של סוכרת מסוג 2.
    2. בחר את בעלי החיים עם גלוקוז בדם קבוע של 250 מ"ג / ד"ל למחקר.
    3. אקראי את החיות שנבחרו עבור אינדוקציה של פצעי כריתה.
    4. להנשים את החולדות הסוכרתיות באמצעות אתר diethyl (5 מ"ל נוספה לתא ההרדמה הרווי מראש) ולאשר באמצעות שיטת צביטת בוהן וצבע קרום רירי.
    5. גילחו את אזור הגבעול (בית החזה של דורסל, אזור המותני) באמצעות גוזם אספטי ולהבים (A40).
    6. לחטא את האזור המגולח עם ספוגית אלכוהולית.
    7. Excise את העור (2 x 2 ס"מ2 ועומק של 1 מ"מ) עם להב A40 כירורגי אספטי על האזור המגולח כדי ליצור פצע פתוח.
    8. חלקו את בעלי החיים לשלוש קבוצות (קבוצה 1 - בקרת מחלות (בקרה), פיגום CL קבוצה 2 -CL (פלצבו), פיגום CL קבוצה 3- DOX), כל קבוצה המורכבת מ -6 חולדות.
    9. הדביקו את פיגומי CL ו- DOX CL באמצעות סרט דבק כירורגי וכסו את קבוצת הביקורת בגאזה סטרילית למשך 21 יום.
    10. עקוב אחר אזור הפצע בגיליון OHP סטרילי ומדוד את הפחתת האחוזים של הפצע באמצעות שיטת הרשת בימים 0, 7, 14 ו -21 עבור כל הקבוצות.
    11. חשב את הפחתת פצע האחוזים באמצעות הנוסחה שלהלן.
      Equation 4

7. מחקרים היסטופתולוגיים

  1. לבודד את אזור הפצע נרפא בימים 7, 14, ו 21, לאחסן פתרון פורמלין (10%).
  2. חלק את הרקמות באמצעות microtome כדי להשיג עובי של 6 מיקרומטר.
  3. הר את המקטעים על שקופית זכוכית וכתם באמצעות המטוקסילין ואוסין 17.
  4. לכוד את התמונות תחת הגדלה של פי 40 באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי.

8. הערכת הידרוקסיפרולין

  1. לבודד את אזור הפצע נרפא בימים 0, 7, 14, ו 21 להערכה.
  2. הערכת התוכן hydroxyproline באמצעות ההליך המתואר על ידי Reddy G ואח ', 1996 22.

9. מבחן אליסה

  1. הערכת רמות ה- MMP-9 באמצעות ערכת אליסה בהתאם להוראות היצרן.
  2. לבודד את דגימות הרקמה מאזור הפצע נרפא ביום 21 טחון באמצעות homogenizer רקמות.
  3. צנטריפוגה הומוגנית המתקבלת ולאסוף את supernatant.
  4. לדלל את supernatant ב 100 פי 100 באמצעות חוצץ assay.
  5. סרוק את הצלחת באמצעות קורא לוחות מרובים.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. לייצג את התוצאות שהושגו כמו ממוצע ± SD.
  2. בצע את הניתוח הסטטיסטי באמצעות מנסרה משטח גרף v5.01.
  3. השג את המשמעות הסטטיסטית באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ומבחן פוסט הוק של דאנט.
  4. שקול את הערכים עם p≤0.05 כמשמעותיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון פיגום NCL ו- CL טעון של DOX
בבדיקה חזותית, פיגום NCL ו- CL נמצא קרם בצבע. חוץ מזה, שני הפיגומים נראים כמו ספוג, נוקשה ולא אלסטי כאשר נבדקים פיזית. תמונות SEM של פיגומי NCL ו- CL מוצגות באיור 1. מהאיור, היה ברור כי חלה ירידה בגודל הנקבבוביות לאחר הצלבה על ידי יצירת קשרים בין-מולקולריים. כמו כן, נקבוביות הפיגומים NCL ו- CL נמצאו 92.3±4.21 ו 71.35±2.65, בהתאמה. אחוז ספיגת המים של פיגומי NCL ו- CL היה 750±11.4% ו 492±8.66% במרווחי זמן של 24 שעות.

בנוסף, מחקרי ביודגרדציה בוצעו במשך שבעה ימים בנוזל הפצע המדומה של pH 7.4, הכולל ליזוזים. פיגום NCL הציג קצב מהיר יותר של השפלה בתחילה בשלושת הימים הראשונים וירד לאט במשך ארבעה ימים רצופים. בצד השני, פיגום CL הראה שיעור ממושך של השפלה. הצלבה של הפיגומים שיפרה את התכונות המכניות ואת עוצמת הרשת, שבתורה הביאה לירידה בשיעור ההשפלה, מה שמצביע על עמידות משופרת בפני ההשפלה (איור 2).

יתר על כן, שחרור במבחנה של DOX מ- NCL ופיגומי CL בוצע עבור 120 שעות(איור 3). ב-1 השעות הראשונות שוחררו 27.92±3.45% DOX מפיגומי NCL, בעוד שרק 16.54±2.21% DOX שוחרר מפיגומי CL. לאחר 6 שעות, שחרור ה-DOX מהפיגומים עלה ב-63.15±3.78% בפיגומי NCL וב-44.43±3.57% בפיגומי CL. לאחר 24 שעות, היה שחרור של 70% DOX מפיגומי NCL, ואילו פיגום CL לקח יותר מ 72 שעות לשחרר 70% של DOX. בהתבסס על התוצאות שהושגו, פיגום CL טעון DOX נבחר להערכה נוספת ומיוצג כפיגומי DOX-CL. ואילו פיגום CL ללא DOX (פלצבו) מיועד לפיגומי CL.

אין ויטרו מחקרים אנטי בקטריאלית
חולים עם DW בדרך כלל חווים זיהומים שגורמים לריפוי פצעים ממושך. לפיכך, נבדקו פיגומים מוכנים לפעילות האנטי-בקטריאלית שלהם באמצעות המיקרופון כנגד פאנל נבחר של חיידקים (טבלה 1). מהתוצאות, ברור כי DOX הציג פעילות מעכבת עם מיקרופון של <4 מיקרוגרם / mL נגד S. aureus ו- S. epidermis. מיקרופון של <8 מיקרוגרם / מ"ל ו - <16 מיקרוגרם / מ"ל נצפה נגד E. coli ו P. aeruginosa. תמצית צ'יטוסן ו- CL לבד הציגה פעילות מינימלית נגד אורגניזמים נבחרים כגון S. aureus (<64 מיקרוגרם / מ"ל), S. epidermis (<64 מיקרוגרם / מ"ל), E. coli (<128 מיקרוגרם / מ"ל) ו P. aeruginosa (<128 מיקרוגרם / מ"ל). פיגום DOX-CL הראה פעילות מעכבת דומה עם מיקרופון של <2 מיקרוגרם / mL נגד S. aureus ו- S. epidermis. יתר על כן, פיגום DOX-CL הציג פעילויות מתונות עם מיקרופון של <8 מיקרוגרם / מ"ל נגד E. coli ו P. aeruginosa.

מחקר תאימות ביולוגית במבחנה
MTT assay בוצע כדי לקבוע את הכדאיות התאית של תאי 3T3-L1 בנוכחות פיגומים CL ו- DOX-CL. התוצאות הדגים כי פיגומי CL ו- DOX-CL לא עורר שום ציטוטוקסיות. יתר על כן, הכדאיות התאית הייתה גבוהה יחסית בקבוצות שטופלו בפיגומים מאשר בשליטה, המייצגת את הצמיחה המשופרת של פיברובלסטים בנוכחות פיגומים (איור 4).

במחקרי ריפוי פצעים של Vivo
שטח הפצע הממוצע ירד בכל הקבוצות נקבע בשיטה הגרפית בימים 0, 7, 14 ו -21 (איור 5). בבדיקה חזותית, הפצעים בקבוצות שטופלו בפיגומים CL ו- DOX-CL היו חופשיים מנזלת ביום השביעי. באותו הזמן, הפצעים בקבוצת הביקורת היו נוטפים. ביום ה -14, גלד יבש נצפה בכל הקבוצות; עם זאת, שיעור מהיר יותר של התכווצות הפצע נצפתה בפיגומים DOX-CL (89.663%). ביום 21, 99.9% מהפצע החלימו, וצלקת נוצרה בפיגומים DOX-CL, בעוד ריפוי חלקי נצפה בשליטה וקבוצות שטופלו בפיגומי CL.

מחקר היסטופתולוגיה
התבוננות היסטופתולוגית של ריפוי פצעים ביום השביעי שלאחר ההשמה הציגה הפרעה לכל שכבות העור בשולי הפצע בכל הקבוצות. לא הייתה ראות של האפידרמיס; עם זאת, נויטרופילים שולטים עם מונוציטים לסירוגין ולימפוציטים נצפו בקבוצת הביקורת. בקבוצה שטופלו בפיגומים CL, ראות מתונה של אפידרמיס נצפתה יחד עם מעט נויטרופילים ומקרופטים. בעוד, בקבוצת פיגומי DOX-CL שטופלו, הפצע היה מכוסה בשכבה דקה של האפידרמיס, המייצגת את שלב הרפיטליזציה מחדש. נויטרופילים קלים ומקרופטים, יחד עם רקמת גרגר, נראו לעתים קרובות יותר בקבוצת הפיגומים DOX-CL.

ביום ה-14 לאחר ההשחתה, נמצאו פצעים בכל הקבוצות מכוסים באפידרמיס. בקבוצת הביקורת, שכבת האפידרמיס שנוצרה נצפתה כשכבה דקה מאוד יחד עם נויטרופילים השוררים. בקבוצת פיגומי CL שטופלו, שכבת האפידרמיס שנוצרה הייתה עבה יותר מזו בקבוצת הביקורת, יחד עם תאים מסיביים רב-גרעיניים קלים. בקבוצת פיגומי DOX-CL שטופלו, האפידרמיס שפותח היה עבה יותר בהשוואה לקבוצות אחרות, יחד עם מספר רב של היסטיוציטים ותאים רב-גרעיניים ענקיים. האזור הצפוף של פיברובלסטים נצפה גם בקבוצת פיגומי DOX-CL שטופלו.

ביום 21 לאחר ההסמכה, בקבוצת הביקורת, מספר דומיננטי של נויטרופילים ירדו יחד עם הישנות של מקרופאגים והיסטיוציטים המייצגים את הירידה בדלקת. בעוד, בקבוצת פיגומי CL שטופלו, מספר מתון של היסטוציטים ולימפוציטים נצפו. האפידרמיס שנוצר נצפה להיות עבה באופן משמעותי בקבוצת פיגומי DOX-CL שטופלו מאשר אלה בקבוצת הביקורת, יחד עם מספר עשיר של היסטיוציטים, לימפוציטים, ותאים רב-גרעיניים מסיביים. בקבוצת הפיגומים DOX-CL, ספירת הנויטרופילים ירדה ביום 7. כמו כן, איסוף מקרופאגים והגרסאות המורפולוגיות שלהם, כגון תאים מסיביים רב-גרעיניים והיסטיוציטים, נצפו ביום ה-14 וה-21 (איור 6).

הערכת הידרוקסיפרולין
הערכת הידרוקסיפרולין היא מדד עקיף של כמות הקולגן הקיימת בפצעי ריפוי. ריכוז הידרוקסיפרולין גבוה יותר מייעד אחוז מהיר של ריפוי פצעים. הבדיקה הביוכימית חשפה כמות גבוהה יותר של הידרוקסיפרולין בקבוצת פיגומי DOX-CL שטופלו ואחריה קבוצת פיגומי CL שטופלו מאשר אלה בקבוצת הביקורת(איור 7).

הערכת MMP-9 באמצעות ערכת אליסה
תכולת MMP-9 בקבוצת הפיגומים DOX-CL ירדה באופן משמעותי בהשוואה לאלו שבשליטתם, וקבוצת פיגומי CL. בעוד שתוכן ה-MMP-9 בקבוצת פיגומי CL היה נמוך במרווחים בהשוואה לזה של קבוצת פיגומי DOX-CL, כפי שמוצג באיור 8.

Figure 1
איור 1: מורפולוגיה של פיגום COL-CS טעון של DOX a) לפני CL ו- b) לאחר קביעת CL על ידי SEM בטווח קנה מידה של 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השפלת מטריצה של DOX טעון NCL ופיגומי CL מהיום 1 עד 7 ב PBS pH 7.4 ב 37 °C מראה NCL מושפל בהדרגה במשך 7 ימים. בניגוד לכך, שיעור ההשפלה של פיגומי CL מופחת במידה ניכרת מצביע על עמידות מוגברת להשפלה אנזימטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרופיל שחרור תרופות במבחנה של DOX מפיגומי NCL ו- CL ב- PBS pH 7.4 ב 37° C המציג שחרור איטי של תרופה בכל ניסוח ואחריו שחרור מתמשך. נתונים המבוטאים כממוצע ± SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תאי 3T3-L1 בתרבית בנוכחות פיגומי CL ו- DOX-CL המציגים צמיחת תאים באחוזים יותר בקבוצה שטופלו בפיגומים DOX-CL ואחריו פיגומי CL שטופלו ושליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: (א)תמונות המייצגות את הירידה באזור הפצע הממוצע בבקרה, פיגום CL ופיגומי DOX-CL טופלו בקבוצות ביום 0, 7, 14 ו -21 לאחר הפציעה. (ב)ייצוג גרפי של צמצום באזור הפצע הממוצע בבקרה, פיגום CL ופיגומים DOX-CL טופלו בקבוצות ביום 0, 7, 14 ו -21 לאחר הפציעה. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SD (n = 6 פצעים / קבוצה). המשמעות הסטטיסטית הושגה על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט הוק של דאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : שינויים היסטולוגיים במהלך תהליך ריפויהפצעים ב-STZ וסוכרת המושרה בתזונה עתירת שומן בעור חולדת לבקן של Wistar בימים 7, 14 ו-21 ללא (שליטה) ועם טיפול (פיגומי CL ו-DOX-CL) במודל פצע כריתה בעובי מלא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תוצאה המייצגת את תכולת ההידרוקסיפרולין בפצעים בימים 0, 7, 14 ו-21 כאינדיקטור להערכת רמת הקולגן העקיפה. התוצאות באות לידי ביטוי מיקרוגרם הידרוקסיפרופילין / מ"ג של רקמת פצע יבש. הנתונים מייצגים את ה±SD הממוצע " (n = 6 פצעים / קבוצה). המשמעות הסטטיסטית הושגה על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט הוק של דאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: גרף המייצג את רמות ה-MMP-9 בהומוגנטים המתקבלים מפצעים שנרפאו ב-STZ ומודל עכברושים סוכרתיים עתירי שומן המושרה בתזונה ביום ה-21. רמות של MMP-9 נקבעו 100-פי 100 aliquots של נוזלי פצע באמצעות ניתוח ELISA. הנתונים מייצגים ממוצע±SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מיקרופון (מיקרוגרם/מ"ל)
דוגמה לבדיקה ס. אוריוס ש. אפידרמיס אי קולי פ. ארוגינוזה
דוק <4 <4 <8 <16
CS <64 <64 <128 <128
תמצית פיגום CL <64 <64 <128 <128
תמצית פיגומים DOX-CL <2 <2 <4 <4

טבלה 1: ריכוז מעכב מינימלי של CS, DOX, CL ופיגומים DOX-CL נגד פאנל נבחר של חיידקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לקבוע את ההשפעה של פיגום COL-CS טעון DOX על ריפוי DW בחולדות. CL ו- NCL הוכנו והוערכה במונחים של מורפולוגיה, מדד נפיחות, קינטיקה שחרור במבחנה, תאימות ביולוגית.

אפיון פיגום NCL ו- CL טעון של DOX
הפיגומים המוכנים נמצאו נקבוביים עם נקבוביות מחוברות. נקבוביות מחוברות אלה מבטיחות את הטבע הנקבובי והספוגי המסייע בהפצה נכונה של חמצן וחומרים מזינים לתאים להתפשטות ולהגירה, מה שמוביל לריפוי מואץ. כאן, גודל הנקבבובית היה תלוי בעיקר בקישור הצולב. הצלבת הפיגומים הביאה לירידה בגודל הנקבבוביות על ידי יצירת אינטראקציות תוך-עיניות חזקות על ידי EDC / NHS עם CS ו- COL, והגדילה את כוח הפיגומים המכני.

מדד הנקבוביות מסתמך על צפיפות יחסית, שהיא פונקציה של המסה של התמוכות הספוג והנפח. בדרך כלל, התכווצות נפח הפיגומים מתרחשת אם סוכן קישור צולב משנה את מיקום התמוכות על ידי גרירתם קרוב יותר זה לזה, מה שמוביל ל densification פיגומים. עם זאת, במקרה של כימיה קרבודימיד, עלייה במסת הפיגומים אינה צפויה בשל המנגנון הייחודי שלה, כלומר, כניסת הצמדת אמיד (O = C-NH) באמצעות קרבוקסילי (>COOH) וקבוצת אמין (-NH) של שרשרת פפטיד סמוכה מבלי להיכנס לפיגומים. בו זמנית, במהלך crosslinking, אובדן מסה קל עלול להתרחש עקב פירוק ונדידה של שרשראות פולימר לא מחוברות. עם זאת, במקרה של טיפול בפיגומים עם EDC / NHS לא לייצר השפעה ניכרת על מורפולוגיה פיגומים.

היכולת של הפיגומים לספוג נוזל ביולוגי חיונית להערכת התאמתו כנשא סמים. מאפיין ספיגת המים לא רק משפיע על צורת הפיגומים אלא גם משפיע על צמיחת התא. נצפתה כי פיגום CL הראה שיעור ספיגת מים נמוך יותר מאשר פיגום NCL, אשר ניתן לייחס את crosslinking של הפיגומים. יתר על כן, ההידרופיליות של חומר פיגומים צומצמה באופן משמעותי לאחר crosslinking עקב (i) אובדן של קבוצות הידרופיליות (>COOH ו -NH) בתהליך של היווצרות הצמדת amide; (ii) עיכוב נפיחות על ידי היווצרות של קשרים חדשים (O = C-NH). תוצאות אלה הן בהסכמה טובה עם הדוחות שפורסמו בעבר 23,24.

מחקר ביזוימטי בוצע על ידי ניטור אחוז המסה השיורית לאחר שבעה ימים של דגירה בנוזל הפצע המדומה של pH 7.4, הכולל ליזוזים. פיגום NCL הראה קצב מהיר יותר של השפלה בתחילה בשלושת הימים הראשונים וירד לאט במשך ארבעה ימים רצופים. בצד השני, פיגום CL הציג קצב ממושך של השפלה. הצלבה של הפיגומים שיפרה תכונות מכניות וכוח רשת, שבתורו הביא לירידה בשיעור ההשפלה, והפגינו עמידות משופרת להשפלה.

מחקרי שחרור סמים בוצעו עבור פיגומי CL ו- NCL עבור 120 שעות. באופן כללי, מקדם שחרור התרופה של הפיגומים פוחת ככל שצפיפות הקישורים הצולבים גדלה עקב חיבורים משופרים בין הנקבוביות וירידה במרחב בין שרשראות הפוליפפטיד. מקדם שחרור התרופה מושפע גם ממדד הנקבוביות, תכולת המים, מדד הנפיחות ומידת הקישור הצולב. במחקר שלנו, 27.92±3.45% ו 63.15±3.78% של DOX מפיגומי NCL, בעוד 16.54±2.21% ו 44.43±3.57% של DOX מפיגומי CL שוחרר ב 1 שעות ו 6 שעות, בהתאמה. לאחר 24 שעות, היה שחרור של 70% של DOX מפיגומי NCL, ואילו; פיגום CL לקח יותר מ 72 שעות לשחרר 70% של DOX. התוצאות הראו כי הצלבת הפיגומים השפיעה הפוך על שחרור DOX על ידי הפחתת יחס הנפיחות ותכולת המים.

אין ויטרו מחקרים אנטי בקטריאלית
תמצית פיגומים DOX-CL הציגה פעילות מעכבת גבוהה יותר (MIC) נגד אורגניזמים חיוביים גרם. הפעילות הגבוהה יותר של תמצית פיגומי DOX-CL עשויה להיות בגלל ההידרופוביה המוגברת של המדגם. עם זאת, תמצית פיגומים DOX-CL הציגה פעילות מינימלית נגד אורגניזמים גרם שלילי, כנראה בשל כשל חדירה דופן התא. יתר על כן, המיקרופון של DOX-CL היה גבוה יחסית מדגימות CS, CL ו- DOX, אשר ניתן לייחס לפעילות הסינרגיסטית של DOX ו- CS בתמצית DOX-CL.

מחקר תאימות ביולוגית במבחנה
מחקר תאימות ביולוגית במבחנה בוצע על תאים פיברובלסט (3T3-L1). פיברובלסטים אחראים לייצור ECM וחלבונים. יתר על כן, הם ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על שלמות מבנית על ידי שיפור היווצרות המסגרת הנדרשת לריפוי פצעים. התוצאות מראות כי פיגום DOX-CL ופיגומי CL לא הניבו שום ציטוטוקסיות של תאים. עם זאת, שתי קבוצות הפיגומים נצפו עם צמיחת התא ובידול של פיברובלסטים בנקבוביות הפיגומים, מה שמצביע על כך שהפאגומים המוכנים היו תואמים ביולוגית. צמיחת תאים מוגברת ובידול בשתי הקבוצות נבעו בעיקר מנוכחות של CS ו- COL כמטריצה חוץ תאית במבנה הפיגומים.

יתר על כן, צמיחת תאים גבוהה יחסית נצפתה עם קבוצת פיגומי DOX-CL מזו של פיגום CL עקב הפעלת אות PI3K-AKT על ידי DOX, אחראי על צמיחת התא והישרדות 25.

במחקרי ריפוי פצעים של Vivo
הסיבוכים השונים של DM אחראים לריפוי הממושך של DW. כדי לחקות את המצב הסוכרתי בחולדות, דיאטה עתירת שומן ניתנה, ואחריו הזרקה תוך אינטריתונית של STZ. לאחר 2-3 ימים של אישור סוכרת, פצעים פתוחים נוצרו על ידי כריתת העור באזור בית החזה של העור. הטיפול בוצע במשך 21 ימים עם פיגומים בהתאמה. צמצום שטח הפצע נקבע עבור כל הקבוצות בימים 0, 7, 14 ו -21. חולדות סוכרת שטופלו בפיגומי DOX-CL הציגו מידה משמעותית של התכווצות פצעים בהשוואה לקבוצות פיגומים CL וקבוצות לא מטופלות.

השלב הדלקתי של ריפוי הפצע אחראי על היווצרות מחסום תפקודי. בשלב הבא, השלב הפורח של ריפוי פצעים תופס תשומת לב בטיפול בפצעים, שבו 43% של הפחתת אזור הפצע נצפתה עם קבוצת פיגומים DOX-CL. לשם השוואה, רק 23% ו -7% נצפו עם פיגומים CL וקבוצות לא מטופלות ביום 7, בהתאמה. מהתמונות (איור 5)החלה התכווצות הפצע לאחר השלמת השלב הדלקתי והשגשוג. קבוצת פיגומים DOX-CL הציגה התכווצות פצע משמעותית בשל נוכחותו של DOX, אשר אחראי על ההשפעות האנטי דלקתיות ואנטי זיהומיות. יתר על כן, COL ו- CS בפיגומים עזרו להתפשטות תאים, בידול ונדידה וכתוצאה מכך 99% של ריפוי DW ב 21 ימים.

פצעים כריתתיים שלא טופלו הראו נויטרופילים, לימפוציטים ומונוציטים ביום 7 לאחר המוות. כאמור, נויטרופילים מסייעים בפירוק פצעים בשלב מוקדם של ריפוי הפצעים. חוץ מזה, עודף של נויטרופילים עלול להשפיע לרעה על תהליך הריפוי על ידי פגיעה ברקמה הרגילה. כפי שדווח על ידי דובי ואח ', מספר מינימלי של נויטרופילים מאיץ את תהליך האפיתל מחדש 26.

יתר על כן, מקרופאגים מוגברים, היסטיוציטים ותאים רב-גרעיניים מסיביים בקבוצת פיגומי DOX-CL העדיפו את הסביבה לריפוי פצעים מואץ על ידי תיקון התאים הפגועים וקידום סינתזת COL. יתר על כן, מיזוג COL עם רקמה נקבע באמצעות רמות הידרוקסיפרולין בכל הקבוצות. עם זאת, רמות הידרוקסיפרולין גבוהות יחסית נצפו עם קבוצת פיגומי DOX-CL שטופלו מאשר הקבוצה שלא טופלה ופיגומי CL. כפי שנאמר בספרות, השלב הדלקתי הממושך במצב הסוכרתי מעכב את השלבים האחרים של הריפוי. ניתן לייחס את הקצב המהיר יותר של התכווצות הפצע בפיגומי DOX-CL לרכוש האנטי דלקתי של DOX, וכתוצאה מכך השלבים הנוספים של הפצע המתרחשים בשלב הזמן הנכון המוביל לריפוי פצעים מואץ.

ההערכה הביוכימית של רמות MMP-9 באמצעות בדיקת ELISA מגלה כי קבוצת פיגומי DOX-CL שטופלו הציגה רמות מופחתות של MMP-9 בהשוואה לאלה שבקבוצות פיגומי CL שטופלו ולא טופלו. על פי הספרות, רמות גבוהות של MMP-9 אחראי על השפלת מטריצה, אשר, בתורו, מאריך את תהליך ריפוי הפצע. DOX, סוכן אנטי דלקתי, עכב את רמות MMP-9, אשר נחשב הסיבה למנוע את התמוטטות COL, וכתוצאה מכך ריפוי DW מואץ. תוצאות אלה עולות בהסכמה עם מחקרים שפורסמו מוקדם יותר על ידי לינדמן ואח ', 2009 ו Zhang ואח ', 2014 27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר אשיש ד וודהואני. (עוזר פרופסור וראש המחלקה לביוטכנולוגיה פרמצבטית, המכללה לרוקחות JSS, אוטי, הודו) לסיוע במחקרי כדאיות תאי במבחנה.

המחברים רוצים להודות למחלקה למדע וטכנולוגיה - קרן לשיפור תשתיות המדע והטכנולוגיה באוניברסיטאות ובמוסדות להשכלה גבוהה (DST-FIST), ניו דלהי, על תמיכתם במחלקה שלנו.

המחברים גם אוהבים להודות למר סנג'ו. ס' ומר סרירם. תלמידי נרוקולה מ. פארם על תמיכתם בצילומי הווידאו.

מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה להשכלה גבוהה JSS (JSSAHER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Merck Millipore, Mumbai, India E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) Merck Millipore, Mumbai, India 137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Thermo Fisher, Mumbai, India M6494
Deep freezer verticle Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack Merck Millipore, Mumbai, India D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India D9891
Elisa kit R&D Systems RMP900
Escherichia coli (E. coli) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 2567
Ethanol Merck Millipore, Mumbai, India 100983
Lyophilizer-SZ042 Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India 18824
Microtome-RM2135 Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS) Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India 130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets Qualigen fine chemicals, Mumbai, India Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 5270
Streptozotocin (STZ) Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India 14653
Type-1 rat Collagen Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 Shimadzu

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
  2. Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
  3. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the treatment of chronic wounds. Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).
  4. Alexiadou, K., Doupis, J. Management of diabetic foot ulcers. Diabetes Therapy. 3 (1), 1-15 (2012).
  5. Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
  6. Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
  7. Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A. Metalloproteinases and wound healing. Advances in Wound Care. 4 (4), 225-234 (2015).
  8. Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
  9. Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
  10. Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
  11. Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
  12. Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
  13. Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
  14. Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
  15. Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
  16. Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
  17. Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
  18. Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
  19. Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
  20. Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
  21. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
  22. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
  23. Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
  24. Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
  25. Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
  26. Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
  27. Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R. Clinical Perspective. Circulation. 119 (16), 2209-2216 (2009).
  28. Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 174 פצע סוכרתי דוקסיציקלין קולגן צ'יטוסאן פיגומים
פיגום מרוכבים קולגן-צ'יטוסן טעון דוקסיציקלין לריפוי מואץ של פצעים סוכרתיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanapalli, B. K. R., Chinna Gounder, … More

Sanapalli, B. K. R., Chinna Gounder, K., Ambhore, N. S., Kuppuswamy, G., Thaggikuppe Krishnamurthy, P., Karri, V. V. S. R. Doxycycline Loaded Collagen-Chitosan Composite Scaffold for the Accelerated Healing of Diabetic Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62184, doi:10.3791/62184 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter