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Bioengineering

당뇨병 상처의 가속 치유를 위한 독시사이클린 로드 콜라겐-치토산 복합 비계

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62184
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1
1Department of Pharmaceutics, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, North Dakota state university, 3Department of Pharmacology, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research

Summary

준비된 DOX-CL 스캐폴드는 DW에서 손상된 조직의 회복을 위해 필수적인 것으로 간주되는 기계적 강도, 다공성, 수분 흡수, 분해속도, 지속적 방출, 항균, 생체 적합성 및 항염증 성질에서 이상적인 DW 드레싱의 전제 조건을 충족시켰습니다.

Abstract

당뇨병 의 한 가지 주요 합병증은 당뇨병 상처 (DW)입니다. 당뇨병에 있는 염증의 연장된 단계는 연기된 상처 치유로 이끌어 내는 상해의 추가 단계를 방해합니다. 우리는 독시 사이클린을 선택 (DOX), 선택의 잠재적인 약물로, 그것의 보고 된 항 염증 속성과 함께 그것의 항 균 속성으로 인해. 현재 연구는 DOX로드 콜라겐 치토산 비 교차 연결 (NCL) 및 교차 링크 (CL) 비계 (CL) 비계를 공식화하고 당뇨병 조건에서 치유 능력을 평가하는 것을 목표로합니다. 스캐폴드의 특성화 결과 DOX-CL 스캐폴드는 이상적인 다공성, 낮은 부종 및 분해율, DOX-NCL 스캐폴드에 비해 DOX의 지속적인 방출을 보유하고 있음을 보여줍니다. 시험관 내 연구는 DOX-CL 스캐폴드가 CL 스캐폴드 처리 및 대조군에 비해 생체 적합성 및 향상된 세포 성장이었다는 것을 보여줍니다. 항균 연구는 DOX-CL 스캐폴드가 DW에서 발견되는 가장 흔한 박테리아에 대한 CL 스캐폴드보다 더 효과적이었다는 것을 보여주었습니다. 연쇄토조토신 및 고지방 식이 유도 DW 모델을 사용하여, DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 의 상처 수축의 상당히 빠른 속도(p≤0.05) 빠른 속도는 CL 스캐폴드 처리 및 대조군에 비해 관찰되었다. DOX-CL 스캐폴드의 사용은 DW에 대한 지역 치료에 대한 유망한 접근 법으로 입증 될 수 있습니다.

Introduction

당뇨병 mellitus (DM)는 인슐린을 전달하거나 간단한 설탕의 비정상적인 소화에 그 결과에 반응하는 바디의 실패가 혈당 1의상승을 초래하는 조건입니다. DM의 가장 연속적이고 분쇄 얽힘은 당뇨병 상처 (DW)입니다. DM 환자의 약 25%는 일생 1에서 DW를 구축할 기회가 있습니다. DW의 방해된 치유는 DM의 삼총병증에 인가됩니다: 면역병증, 혈관병증 및 신경병증. DW가 치료되지 않을 때마다 회지 발달이 발생할 수 있으므로 관련 기관 2의제거를 촉구합니다.

환자를 가르치는 등 치료(매일 상처를 검사하고, 상처를 정화하고, 상처에 압력을 가하는 활동, 주기적인 포도당 모니터링 등), 혈당 조절, 상처 탈모, 압력 하역, 의료 절차, 고압 산소 요법 및 고급 치료법은 실제로 3,4에있습니다. 이들 약물의 대부분은 다인자적 병리학적 조건 및 이러한 의약품과 관련된 예기치 않은 비용에 비추어 DW 치료에 필수적인 모든 전제 조건을 해결하지 못한다 5. DW 병인이 다인성임에도 불구하고 부적절한 조직 관리를 가진 지속적인 염증은 DW 5,6에서치유가 지연되는 실제 원인으로 명시된다.

DW에서 염증 및 프로 염증 성 중재자의 증강 수준은 지연 된 상처 치유에대한 책임이 감소 성장 인자 결과2,6. DWs의 부적절한 세포외 매트릭스(ECM) 형성은 형성된 ECM의 급속한 분해에 대한 책임을 받는 매트릭스 메탈로프로틴(MmPs) 레벨의 증가로 인가된다. MmPs에서, Mp-9는 장기간염증및 급속한 ECM 분해7을담당하는 주요 중개자로 보고된다. MMP-9의 높은 수준을 감소시키는 항염증제약물과의 국소치료는 칼골성 항상성, 프레임워크 배열을 재확립하고 DW 8,9의더 나은 치유를 촉구하는 것으로 명시되어 있다.

MMP-9 억제제인 독시사이클린(DOX)은 DW 10,11,12의지속적인 염증을 담당하는 주요 염증 중재자인 MMP-9의 높은 수준을 억제하기 위해 선택되었다. 또한, DOX는 항산화제(반응성 산소 종과 결합할 수 있는 자유 하이드록시 및 페녹스 라디칼을 생성) 13 및 항석포성(카스파제 발현 및 미토콘드리아 안정화 억제) 14가지 활성을 가지고 DW의 치료에 필수적이다. DOX, 콜라겐(COL), 치토산(CS)을 포함하는 프레임워크의 배열이 선택되었다. COL의 선택은 기계적 강도 와 조직 재생을 담당하는 필요한 프레임 워크를 제공하는 데 도움이되는 방법에 따라 달라집니다 15. 한편, CS는 여러 상처 치유 단계와 관련된 글리코아미노글리칸에 구조적으로 동종이다. 또한 CS가 상당한 항균 성질을 가지고 있는 것으로 보고된다 15. 따라서 DOX의 COL/CS 스캐폴드는 장기간 염증을 억제하기 위해 공식화되고, DM 조건에서 성공적인 상처 치유를 위한 매트릭스 형성을 지원한다.

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Protocol

수행 된 모든 동물 절차는 약국의 JSS 대학의 기관 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다, Ooty, 인도.

1. 동결 건조 방법에 의한 DOX 장전다공스 비계 의 준비

  1. 1.2 g의 COL을 100mL의 물(예: 밀리포어)에 넣고 붓기를 위해 따로 둡니다.
  2. 2000rpm에서 밤새 부어오른 COL 분산을 저어 COL의 완전한 용해를 보장합니다.
  3. 1%아세트산의 100mL에서 약 0.8g의 CS를 용해시켜 CS 용액을 준비한다.
  4. 균일한 분산을 보장하기 위해 2000 rpm에서 하룻밤 CS 솔루션을 저어줍니다.
  5. DOX(1% w/v)를 혼합한 다음 CS 용액을 COL 용액에 넣고 30분 동안 저어줍니다.
  6. 모슬린 천을 사용하여 얻은 물리적 혼합물을 걸과하여 미립자 물질을 제거합니다.
  7. -85°C에서 얻은 여과물을 약 24시간 동안 4°C ± 깊은 동결한다.
  8. -85°C에서 72h의 4°C± 깊은 동결 혼합물을 lyophilize.
  9. 추가 분석을 위해 수득된 스캐폴드를 건조기에저장하여 16,17을추가로 분석한다.

2. 비계의 교차 연결

  1. 50mL의 물에 MES(0.488g)를 녹입니다.
  2. MES 버퍼의 20mL에 DOX로드 스캐폴드 50 mg을 30분 동안 담급니다.
  3. 별도의 비커에 0.1264 G의 EDC 및 0.014 G의 NHS와 MES 버퍼19.5 mL을 혼합합니다.
  4. 4h에 대한 버퍼 혼합물에 스캐폴드를 담그고 16을교차연결한다.
  5. 추가 평가를 위해 DOX로드 크로스링크드(CL) 및 교차 연결이 아닌 스캐폴드(NCL)를 저장합니다.

3. 스캐폴드의 특성화

  1. 스캐닝 전자 현미경 검사(SEM)를 이용한 형태학적 검사
    1. SEM(1cm × 1cm × 0.5cm)을 사용하여 형태학적 분석을 위한 스캐폴드를 특성화합니다.
    2. 스캐폴드의 단면과 외부 표면에 골드(~150 Å)의 섬세한 레이어를 더럽힌다.
    3. 5kV와 10kV의 흥분 전압에서 사진 이미지를 캡처합니다.
    4. 샘플을 알루미늄 스텁에 놓고 약 9V의 골드로 둘러싸십시오.
    5. 10kV에서 향상된 해상도로 SEM을 사용하여 스캐폴드를 측정합니다.
  2. 다공성 결정
    1. 액체 변위 방법(에탄올) (18)를사용하여 비계의 다공성을 측정한다.
    2. 아래 공식을 사용하여 비계의 다공성을 계산합니다.
      Equation 1
      Ww = 비계의 젖은 무게
      Wd = 스캐폴드의 건조 중량
      Wv = 비계의 부피
  3. 수흡수 능력 결정
    1. 스캐폴드의 건조 중량을 측정합니다.
    2. 인산염 완충식염(PBS) pH 7.4에서 24시간 동안 37°C에서 계량 된 비계를 배양한다.
    3. 필터 용지를 사용하여 스캐폴드위에 과도한 PBS를 제거합니다.
    4. 아래 포뮬러(17)를사용하여 수분 흡수 용량을 측정한다.
      Equation 2
      WS = 수질 흡수비율
      W1= 비계의 젖은 무게
      W0= 스캐폴드의 건조 중량
  4. 스캐폴드 분해
    1. 리소지메를 함유한 pH 7.4의 PBS에서 7일간 37°C에서 스캐폴드(1cm x 1cm)를 배양한다.
    2. 스캐폴드를 세척하여 표면에 부착된 이온을 제거합니다.
    3. 세척 된 비계 17을건조 동결하십시오.
    4. 수식을 사용하여 분해 속도를 계산합니다.
      Equation 3
      Ww = 스캐폴드의 초기 중량
      WD = 동결 건조 후 비계의 무게
  5. 체외 방출 연구
    1. 투석 자루 방법을 사용하여 스캐폴드에서 DOX의 방출 동작을 결정합니다.
    2. 시뮬레이션 된 상처 유체 (pH 7.4)의 몇 밀리리터에 비계를 분산하고 투석 가방에 전송합니다.
    3. 멤브레인 백의 끝을 단단히 닫고 시뮬레이션 된 상처 유체 용액의 500 mL에 담급하십시오.
    4. 투석 봉이 들어 있는 상처 액액을 200-250 rpm에서 저어줍니다.
    5. 상체 솔루션을 수집하고 명확한 시간 간격으로 동일한 양의 신선한 버퍼 솔루션으로 대체합니다.
    6. 240 nm에서 UV 가시 분광계를 사용하여 상피 용액의 스캐폴드에서 DOX 방출의 백분율을 결정합니다.

4. 체외 항균 연구

  1. 마이크로국물 희석 방법을 이용하여 S. 아우레우스, S. 표피, 대장균, P. 아루기노사에 대한 CL 및 DOX-CL 스캐폴드의 최소 억제 농도(MIC)를 결정한다.
  2. 뮬러-힌튼 국물을 사용하여 세균 배양을 1:1000의 비율로 준비하여 0.5 맥팔랜드 탁도를 얻습니다.
  3. 고혈당을 위한 세균 배양에 D-포도당(800 mg/dL)을 첨가19,20.
  4. DMSO(음의 제어)에서 CL 및 DOX-CL을 용해시키고 용해합니다.
  5. 96웰 플레이트에서 고혈당식 서스펜션(100 μL) 및 테스트 샘플(100 μL 의 비계 용액)을 직렬적으로 희석합니다.
  6. 플레이트를 37°C에서 20-24h에 배양한다.
  7. 600 nm 21의파장에서 흡광도를 기록합니다.

5. 체외 생체 적합성 연구

  1. MTT를 사용하여 준비된 비계의 생체 적합성평가[(3-(4, 5 디메틸 티아졸-2 yl) -2, 5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)] 분석.
  2. 표준 치수의 비계를 살균하고 24 개의 웰 플레이트에 넣습니다.
  3. 3T3-L1 셀을 24 웰 플레이트에 추가하고 72h에 배양합니다.

6. 생체 동물 연구에서

  1. DM 및 절제 상처의 유도
    1. 2 주 동안 고지방 식단으로 동물을 먹이고 형광완액에서 연쇄상 구균 (50 mg /kg 체중)을 단일 용량으로 관리하여 Wistar albino rats (180-200 g)에 인하여 타입-2 당뇨병을 유도합니다.
    2. 연구를 위해 250 mg/dL의 일정한 혈액 포도당을 가진 동물을 선택하십시오.
    3. 절제 상처의 유도를 위해 선택한 동물을 무작위로 한다.
    4. 디틸 에테르(5mL를 이전에 포화마취챔버에 첨가)를 사용하여 당뇨병 쥐를 마취시키고 발가락 핀치 방법 및 점막 색상을 사용하여 확인한다.
    5. 무균 트리머와 블레이드 (A40)를 사용하여 등쪽 영역 (도르살 흉부, 요추 영역)을 면도합니다.
    6. 면도 부위를 알코올 면봉으로 살균합니다.
    7. 면도 부위에 무균 수술 A40 블레이드를 사용하여 피부(2 x 2cm2cm 및 깊이 1mm)를 소비하여 열린 상처를 만듭니다.
    8. 동물을 3개 그룹(그룹 1-질병통제(대조군), 그룹 2-CL 스캐폴드(위약), 그룹 3-DOX CL 스캐폴드)로 나눕니다.
    9. 수술용 테이프를 사용하여 CL 및 DOX CL 스캐폴드를 부착하고 21일 동안 멸균 거즈로 대조군을 덮는다.
    10. 멸균 OHP 시트의 상처 부위를 추적하고 모든 그룹에 대해 그리드 방법을 사용하여 상처의 백분율 감소를 측정한다.
    11. 아래 공식을 사용하여 백분율 상처 감소를 계산합니다.
      Equation 4

7. 조직 병리학 연구

  1. 7일, 14일, 21일에 치유된 상처 부위를 분리하여 포르말린 용액(10%)에 보관합니다.
  2. 마이크로토메를 사용하여 조직을 제면하여 6 μm의 두께를 얻습니다.
  3. 헤마톡클린과 에신(17)을사용하여 유리 슬라이드와 스테인에 섹션을 마운트한다.
  4. 디지털 현미경을 사용하여 40배 배율 아래 이미지를 캡처합니다.

8. 하이드록시프린 추정

  1. 평가용으로 0일, 7, 14일, 21일에 치유된 상처 부위를 분리한다.
  2. 레디 G 등, 1996 년 22에의해 설명 된 절차를 사용하여 하이드록시 프린소함량을 추정한다.

9. 엘리사 테스트

  1. 제조업체의 지침에 따라 엘리사 키트를 사용하여 MMP-9 수준을 추정합니다.
  2. 조직 균질화제를 사용하여 21일째에 치유된 상처 부위로부터 조직 샘플을 분리하고 다진다.
  3. 원심분리기 획득된 동형화와 상체를 수집한다.
  4. 분석 버퍼를 사용하여 100 배로 상체를 희석합니다.
  5. 여러 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 스캔합니다.

10. 통계 분석

  1. 얻은 결과를 평균 ± SD로 나타냅니다.
  2. 그래프 패드 프리즘 v5.01을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  3. 분산(ANOVA) 및 던넷의 포스트 호크 테스트를 통해 통계적 유의성을 달성합니다.
  4. p≤0.05의 값을 중요로 고려하십시오.

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Representative Results

DOX로드 NCL 및 CL 스캐폴드의 특성화
육안으로NCL과 CL 스캐폴드는 크림색으로 밝혀졌다. 게다가, 두 비계는 물리적으로 검사 할 때 스폰지처럼 나타납니다, 뻣뻣하고 탄성. NCL 및 CL 스캐폴드의 SEM 이미지가 도 1에표시됩니다. 그림에서, 분자 간 연계를 형성하여 교차 연결 후 모공 크기가 감소했다는 것이 분명했다. 또한 NCL과 CL 스캐폴드 다공성은 각각 92.3±4.21및 71.35±2.65로 나타났다. NCL및CL스비폴드의 수분 흡수율은 24시간 간격으로 750±11.4%, 492±8.66%였다.

또한, 생분해 연구는 리소지메를 포함하는 pH 7.4의 모의 상처 유체에서 7일 동안 수행되었다. NCL 스캐폴드는 처음 3일 만에 더 빠른 열화 속도를 보였고 4일 연속 하락했다. 다른 한편으로는, CL 스캐폴드는 저하의 연장된 비율을 보여주었습니다. 스캐폴드의 교차 연결은 기계적 특성및 네트워크 강도를 향상시켰으며, 그 결과 분해율이 저하되어 분해에 대한 저항이 향상되었음을나타낸다(도 2).

또한, NCL 및 CL 스캐폴드로부터 DOX의 체외 방출은 120h(도3)에대해 수행되었다. 초기 1h에서는 27.92±3.45%의 DOX가 NCL 스캐폴드에서 출시되었으며, CL 스캐폴드에서 16.54±2.21%만이 출시되었다. 6시간 후, 비계에서 DOX 방출은 NCL 스캐폴드에서 63.15±3.78%, CL 스캐폴드에서 44.43±3.57% 증가했다. 24시간 후 NCL 스캐폴드에서 70%의 DOX가 출시된 반면 CL 스캐폴드는 72시간 이상 을 가져와 DOX의 70%를 방출했습니다. 획득한 결과에 기초하여, DOX 로드 CL 스캐폴드는 추가 평가를 위해 선택되었고 DOX-CL 스캐폴드로 표현되었다. DOX(위약)가 없는 CL 스캐폴드는 CL 스캐폴드로 지정되어 있습니다.

체외 항균 연구
DW를 가진 환자는 일반적으로 장기간감상처 치유귀착되는 감염을 경험합니다. 따라서, 준비된 비계는 선택된 박테리아패널(표 1)에대하여 MIC를 사용하여 항균 활성을 검사하였다. 결과에서 DOX는 S. 아우레우스와 S. 표피 모두에 대해 <4 μg/mL의 MIC를 가진 억제 활성을 나타낸다는 것이 분명합니다. <8 μg/mL 및 <16 μg/mL의 MIC는 대장균 및 P. aeruginosa에대하여 관찰되었다. 단독으로 키토산과 CL 스캐폴드 추출물은 S. 아우레우스(<64 μg/mL), S. 표피(<64 μg/mL), 대장균(<128 μg/mL), P. 아루기노사(<128 μg/mL)와 같은 선택된 유기체에 대해 최소한의 활성을 나타냈다. DOX-CL 스캐폴드는 s. 아우레우스 및 S. 표피모두에 대해 <2 μg/mL의 MIC와 유사한 억제 활성을 보였다. 또한, DOX-CL 스캐폴드는 대장균 및 P. 아루기노사에대해 <8 μg/mL의 MIC와 함께 적당한 활동을 나타냈다.

체외 생체 적합성 연구
MTT 분석은 CL 및 DOX-CL 스캐폴드의 존재에서 3T3-L1 세포의 세포 생존가능성을 결정하기 위해 수행되었다. 결과는 CL과 DOX-CL 비계가 어떤 세포 독성도 자극하지 않았다는 것을 예시했습니다. 더욱이, 세포 생존가능성은 스캐폴드(도4)의존재시 섬유아세포의 향상된 성장을 나타내는 대조군보다 스캐폴드 처리군에서 비교적 높았다.

생체 내 상처 치유 연구에서
모든 그룹에서 감소된 평균 상처 영역은 0일, 7, 14 및 21일(그림5)에그래픽 방법을 사용하여 결정되었다. 육안으로는 씨엘과 DOX-CL 비계치료단의 상처가 7일째에 흘러도 없었다. 동시에 대조군의 상처가 스며들고 있었다. 14일째에는 모든 그룹에서 마른 딱지가 관찰되었습니다. 그러나, DOX-CL 스캐폴드(89.663%)에서 상처 수축속도가 더 빠른 것으로 나타났다. 21일에는 99.9%의 상처가 치유되었고, DOX-CL 스캐폴드에서 흉터가 형성된 반면, 부분치유는 대조군과 CL 스캐폴드 치료군에서 관찰되었다.

조직 병리학 연구
7일째 부상 후 상처 치유의 조직 병리학적 관찰은 모든 그룹에서 상처의 가장자리에 있는 모든 피부 층의 혼란을 나타냈다. 표피의 가시성은 없었다; 그러나, 간헐적인 단핵구및 림프구를 가진 우세한 호중구는 대조군에서 관찰되었다. CL 스캐폴드 처리 단에서는, 표피의 적당한 가시성은 몇몇 호중구 및 대식세포와 더불어 주의되었습니다. 반면, DOX-CL 스캐폴드 처리 군에서 상처는 표피의 슬림층으로 덮여 재발의 단계를 나타냅니다. 온화한 호중구 및 대식세포는 과립 조직과 더불어, 또한 DOX-CL 비계 처리단에서 더 자주 보였습니다.

14일 차 상해후, 모든 집단의 상처는 표피로 덮여 있는 것으로 밝혀졌다. 대조군에서 형성된 표피 층은 호중구와 함께 매우 슬림한 층으로 관찰되었다. CL 스캐폴드 처리군에서 형성된 표피 층은 대조군보다 두껍고, 온화한 다핵거세포와 함께 하였다. DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 개발된 표피는 다른 그룹에 비해 두껍고, 히티오시테와 거대한 다핵세포의 수가 많았다. 섬유아세포의 조밀한 영역은 DOX-CL 스캐폴드 처리군에서도 관찰되었다.

21일 차, 사후 부상, 대조군에서는 대장식세포의 재발과 함께 호중구의 지배적인 수가 감소하여 염증감소를 나타내는 것으로 나타났습니다. 반면, CL 스캐폴드 처리군에서는 적당한 수의 히스토사이클및 림프구가 관찰되었다. 형성된 표피는 DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 실질적으로 두껍게 관찰되었으며, 풍부한 수의 히시오시테, 림프구 및 대규모 다핵세포와 함께 대조군에 있는 이들보다 더 두꺼운 것으로 나타났다. DOX-CL 스캐폴드 처리군에서는 7일째호중구 수가 감소했다. 또한, 대식세포와 다핵거세포와 히시오시테 와 같은 형태학적 변이체의 집합은 14일과 21일(도6)에발견되었다.

하이드록시프린 추정
하이드록시프린 추정은 치유 상처에 존재하는 콜라겐의 양을 간접적으로 측정합니다. 높은 하이드록시프린 농도는 상처 치유의 빠른 비율을 지정합니다. 생화학검사는 DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 더 많은 양의 하이드록시프린을 밝혀냈으며, 그 다음으로 CL 스캐폴드 처리군이 대조군(도7)에그 뒤를 이었다.

엘리사 키트를 사용한 MMP-9 추정
DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 MMP-9 함량은 대조군에 비해 현저히 감소하였고, CL 스캐폴드 처리군. CL 스캐폴드 처리군의 MMP-9 함량은 도 8에도시된 바와 같이 DOX-CL 스캐폴드 처리군의 MMP-9 함량과 비교하면 소폭 낮았다.

Figure 1
그림 1: DOX로드 COL-CS 스캐폴드 a)전 CL 및 b)50 μm의 스케일 범위에서 SEM에 의한 CL 판정 후.

Figure 2
그림 2: NCL 및 CL 스캐폴드에 로드된 DOX의 매트릭스 분해는 7일 동안 서서히 저하된 NCL을 보여주는 37°C에서 PBS pH 7.4에서 1일째부터 7일까지 입니다. 이와는 달리, CL 스캐폴드 분해율이 상당히 감소하여 효소 저하에 대한 저항력이 향상했음을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: PBS pH 7.4에서 PBS pH 7.4에서 NCL 및 CL 스캐폴드로부터 DOX의 체외 약물 방출 프로파일은 모든 제형에서 약물의 느린 방출을 보여주는 다음 지속적인 방출에 선행된다. 평균 ± SD(n=3)로 표현된 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 3T3-L1 세포는 CL 및 DOX-CL 스캐폴드 의 존재에서 배양되어 DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 세포 성장을 더 많이 나타내고 CL 스캐폴드 처리 및 대조군이 그 뒤를 따랐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5:(a)대조군의 평균 상처 영역의 감소를 나타내는 이미지, CL 스캐폴드 및 DOX-CL 스캐폴드 처리군은 0일, 7, 14 및 21포스트 상처에 있다. (b)대조군의 평균 상처 부위의 감소, CL 스캐폴드 및 DOX-CL 스캐폴드 처리군의 그래픽 표현은 0일, 7, 14 및 21일째에 후진하였다. 데이터는 평균 ± SD(n=6 상처/그룹)로 표현됩니다. 통계적 유의성은 분산(ANOVA)의 편도 분석(ANOVA)에 의해 얻어졌으며, 그 다음으로 던넷의 포스트 호크 테스트가 뒤따랐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: STZ 및 고지방 식이 유발 당뇨병의 상처 치유 과정에서 조직학적 변화(control) 없이 7일, 14일, 21일 위스타 알비노 쥐 피부에서 의전성 변화(대조)와 치료(CL 및 DOX-CL 스캐폴드)를 풀 두께 절제 상처 모델에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 간접 콜라겐 수준 추정의 지표로서 0, 7, 14 및 21일에 상처의 하이드록시프린 함량을 나타내는 결과. 결과는 건조 상처 조직의 μg 하이드록시프롤린 / mg으로 표현됩니다. 데이터는 Mean±SD(n=6 상처/그룹)를 나타냅니다. 통계적 유의성은 분산(ANOVA)의 편도 분석(ANOVA)에 의해 얻어졌으며, 그 다음으로 던넷의 포스트 호크 테스트가 뒤따랐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: 21일째STZ 및 고지방 식이 유발 당뇨병 쥐 모델에서 치유된 상처로부터 얻어진 균질화에서 MMP-9 수준을 나타내는 그래프. MMP-9의 수준은 ELISA 분석을 사용하여 상처 유체의 100 배 알리쿼트에서 결정되었다. 데이터는 평균±SD(n=3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MIC (μg/mL)
테스트 샘플 S. 아우레우스 S. 표피 대장균 P. 아루기노사
DOX <4 <4 <8 <16
CS <64 <64 <128 <128
CL 스캐폴드 추출물 <64 <64 <128 <128
DOX-CL 스캐폴드 추출물 <2 <2 <4 <4

표 1: CS, DOX, CL 및 DOX-CL 스캐폴드의 최소 억제 농도가 선택한 박테리아 패널에 대해 서식합니다.

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Discussion

이 연구의 주요 목적은 쥐에서 DW 치유에 DOX로드 COL-CS 비계의 효과를 결정하는 것이었습니다. CL과 NCL은 형태학, 붓기 지수, 체외 방출 운동 및 생체 적합성 측면에서 제조 및 평가되었다.

DOX로드 NCL 및 CL 스캐폴드의 특성화
준비된 발판은 상호 연결된 모공과 다공성인 것으로 나타났습니다. 이 상호 연결된 모공은 증식 및 이동을 위해 세포에 산소와 영양소의 적절한 확산에 도움이 다공성, 해면질 자연을 보장, 가속 치유로 이어지는. 여기서, 모공 크기는 주로 교차 연결에 의존했다. 스캐폴드를 교차 연결하면 EDC/NHS와 CS 및 COL에 의한 강력한 분자 내 상호 작용을 형성하여 모공 크기가 감소하여 스캐폴드 기계적 강도를 증가시켰습니다.

다공성 지수는 스폰지 스트럿과 볼륨의 질량의 함수인 상대 밀도에 의존합니다. 일반적으로 스캐폴드 볼륨의 수축은 교차 연결 에이전트가 스트럿 위치를 서로 더 가깝게 드래그하여 스트럿 위치를 변경하여 스캐폴드 밀도로 이어지는 경우에 발생합니다. 그러나, 카르보디미드 화학의 경우, 스캐폴드의 질량증가는 스캐폴드로 들어가지 않고 인접한 펩타이드 체인의 카복실릭(>COOH) 및 아민(-NH) 그룹을 이용한 아미드 링키지(O=C-NH)의 도입으로 인해 예상되지 않는다. 동시에 교차 연결 중에 부착되지 않은 폴리머 체인의 용해 및 마이그레이션으로 인해 경미한 질량 손실이 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 EDC/NHS를 가진 스캐폴드 치료의 경우 비계 형태에 눈에 띄는 영향을 미치지 않았다.

생물학적 유체를 흡수하는 스캐폴드의 능력은 약물 운반체로서의 적합성을 평가하는 데 매우 중요합니다. 수분 흡수 특성은 스캐폴드의 모양에 영향을 미칠 뿐만 아니라 세포 성장에도 영향을 미칩니다. CL 스캐폴드는 NCL 스캐폴드보다 낮은 수분 흡수율을 보였으며, 이는 스캐폴드의 교차 연결에 기인할 수 있다. 더욱이, 비계 물질의 친성성은 (i) 아미드 연계 형성 과정에서 친혈구 집단(>COOH 및-NH)의 손실로 인한 교차연결 후 현저히 감소하였다. (ii) 새로운 채권의 형성에 의한 부종 억제(O=C-NH). 이러한 결과는 이전에 게시된 보고서 23,24와양호한 일치합니다.

효소 생분해 연구는 리소지메를 포함하는 pH 7.4의 모의 상처 유체에서 7일간의 배양 후 잔류 질량의 백분율을 모니터링하여 수행되었다. NCL 스캐폴드는 처음 3일 만에 열화 속도가 빨라졌고 4일 연속 하락했다. 다른 한편으로는, CL 스캐폴드는 저하의 연장된 비율을 표시했습니다. 스캐폴드의 교차 연결은 기계적 특성과 네트워크 강도를 향상시켰으며, 이로 인해 분해 속도가 저하되어 성능 저하에 대한 저항력이 향상되었습니다.

약물 방출 연구는 120h에 대한 CL 및 NCL 스캐폴드를 위해 수행되었다. 일반적으로, 스캐폴드의 약물 방출 계수는 모공 간의 상호 연결 강화와 폴리펩티드 체인 간의 공간 감소로 인해 교차 연결 밀도가 증가함에 따라 감소합니다. 약물 방출 계수는 또한 다공성 지수, 수분 함량, 붓기 지수 및 교차 연결 정도에 의해 영향을 받습니다. 본 연구에서는 NCL 스캐폴드에서 27.92±3.45%, 63.15±3.78%,CL 스캐폴드에서 DOX의 16.54±2.21%, 44.43±3.57%가 각각 1시간 6시에 출시되었다. 24 시간 후, NCL 스캐폴드에서 DOX의 70 %의 릴리스가 있었다, 반면; CL 스캐폴드는 DOX의 70%를 출시하기 위해 72시간 이상을 이용했습니다. 그 결과 비계가 교차하는 것은 팽창비와 수분 함량을 감소시킴으로써 DOX 방출에 역영향을 미쳤다는 것을 보여주었다.

체외 항균 연구
DOX-CL 스캐폴드 추출물은 그람 양성 생물에 대해 더 높은 억제 활성(MIC)을 나타냈다. DOX-CL 스캐폴드 추출물의 더 높은 활성은 시료의 증가된 소수성 때문일 수 있다. 그러나, DOX-CL 스캐폴드 추출물은 세포벽 침투 실패로 인해 그람 음성 유기체에 대한 최소한의 활성을 나타냈다. 또한, DOX-CL의 MIC는 DOX-CL 추출물에서 DOX 및 CS의 시너지 활성에 기인할 수 있는 CS, CL 스캐폴드 및 DOX 샘플보다 비교적 높았다.

체외 생체 적합성 연구
체외 생체 적합성 연구는 섬유아세포 세포(3T3-L1)에서 수행되었다. 섬유아세포는 ECM과 단백질의 생산을 담당합니다. 또한 상처 치유에 필요한 프레임워크의 형성을 강화하여 구조적 무결성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 결과는 DOX-CL 스캐폴드와 CL 스캐폴드가 세포 세포 독성을 생성하지 않았다는 것을 보여줍니다. 그러나, 두 스캐폴드 그룹은 비계 모공에서 섬유아세포의 세포 성장 및 분화로 관찰되었으며, 이는 준비된 스캐폴드가 생체 적합성임을 나타낸다. 두 그룹에서 세포 성장 및 분화증가는 주로 스캐폴드 구조에서 세포외 매트릭스로서 CS 및 COL의 존재 때문이었다.

더욱이, DOX에 의한 PI3K-AKT 신호의 활성화에 의한 CL 스캐폴드보다 비교적 높은 세포 성장을 관찰하였으며, 세포 성장 및 생존(25)을담당하였다.

생체 내 상처 치유 연구에서
DM의 다양한 합병증은 DW의 장기간 치유에 대한 책임이 있습니다. 쥐에서 당뇨병 상태를 모방 하기 위해, 고지방 다이어트 주어졌다, STZ의 관면 주사 다음. 당뇨 확인의 2-3 일 후에, 열린 상처는 등쪽 흉부 부위에 있는 피부의 절제에 의해 만들어졌습니다. 치료는 각각의 비계로 21 일 동안 수행되었다. 상처 부위의 감소는 0, 7, 14 및 21일에 모든 그룹에 대해 결정되었다. DOX-CL 스캐폴드로 치료된 당뇨쥐는 CL 스캐폴드 그룹과 치료되지 않은 그룹에 비해 상당한 정도의 상처 수축을 나타냈다.

상처 치유의 염증 단계는 기능적 장벽 형성에 책임이 있습니다. 다음 단계에서는 상처 치유의 증식 단계가 상처 치료에 주의를 기울이고 있으며, 이 때 DOX-CL 스캐폴드 그룹과 함께 상처 부위 감소의 43%가 관찰되었다. 이에 비해, 7일째에 CL 스캐폴드와 치료되지 않은 그룹으로 각각 23%와 7%만이 관찰되었다. 이미지(도5)에서염증 및 증식 단계가 완료된 후 상처의 수축이 시작되었다. DOX-CL 스캐폴드 그룹은 항염증 및 항감염 효과를 담당하는 DOX의 존재로 인해 상당한 상처 수축을 나타냈다. 더욱이, 스캐폴드의 COL과 CS는 세포 증식, 분화 및 이주를 도왔으며, 21일 만에 DW 치유의 99%를 발생시켰다.

치료되지 않은 절제 된 상처는 7 일째에 호중구, 림프구 및 단핵구를 보였습니다. 앞서 언급했듯이, 호중구는 상처 치유의 초기 단계에서 상처 치브라이드를 돕습니다. 게다가, 호중구의 과잉은 일반적인 조직을 손상시켜 치유 과정에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. Dovi et al.에 의해 보고된 바와 같이, 호중구의 최소 수는 재상피화 프로세스(26)를가속화한다.

또한, DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 대식세포, 히티오시테 및 대규모 다핵세포가 손상된 세포를 수리하고 COL 합성을 촉진함으로써 가속상처 치유환경을 선호하였다. 더욱이, 조직과의 COL 융합은 모든 군에서 하이드록시프린 수준을 사용하여 결정되었다. 그러나, 비교적 높은 하이드록시프린 수준은 치료되지 않은 및 CL 스캐폴드 처리군보다 DOX-CL 스캐폴드 처리군으로 관찰되었다. 문헌에 명시된 바와 같이, 당뇨병 상태의 장기간 염증 단계는 치유의 다른 단계를 방해한다. DOX-CL 스캐폴드에서의 상처 수축 속도가 빨라질수록 DOX의 항염증 특성에 기인할 수 있으며, 이로 인해 적절한 시간 단계에서 발생하는 상처의 추가 단계가 발생하여 상처 치유가 가속화될 수 있다.

ELISA 시험을 이용한 MMP-9 수준의 생화학적 추정에 따르면 DOX-CL 스캐폴드 처리된 그룹은 CL 스캐폴드 처리 및 치료되지 않은 그룹에 비해 MMP-9의 감소된 수준을 나타냈다. 문학에 따르면, 매트릭스 저하에 대한 책임 MMP-9의 증가 수준, 차례로, 상처 치유 과정을 연장. DOX, 항 염증 제, MMP-9 수준을 억제, COL 고장을 방지 하는 이유로 간주 됩니다., 가속 DW 치유의 결과. 이러한 결과는 Lindeman 외, 2009 및 장 외, 2014 년 27,28에의해 이전에 발표 된 연구와 일치한다.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

저자들은 아시쉬 D 와드와니 박사에게 감사드립니다. (조교수 겸 머리, 제약 생명 공학의 학과, 약학의 JSS 대학, Ooty, 인도) 체외 세포 생존 성 연구를 지원하기위한.

저자는 과학 기술학과에 감사드립니다 - 대학과 고등 교육 기관의 과학 기술 인프라 개선을위한 기금 (DST-FIST), 뉴 델리, 우리의 부서를 지원하기위한.

저자는 또한 산주 씨에게 감사를 표합니다. S씨와 스리람 씨. 나루쿨라 M. 팜 학생들이 비디오 촬영에 응원을 하고 있다.

이 연구는 고등 교육 및 연구의 JSS 아카데미에 의해 지원되었다 (JSSAHER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Merck Millipore, Mumbai, India E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) Merck Millipore, Mumbai, India 137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Thermo Fisher, Mumbai, India M6494
Deep freezer verticle Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack Merck Millipore, Mumbai, India D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India D9891
Elisa kit R&D Systems RMP900
Escherichia coli (E. coli) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 2567
Ethanol Merck Millipore, Mumbai, India 100983
Lyophilizer-SZ042 Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India 18824
Microtome-RM2135 Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS) Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India 130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets Qualigen fine chemicals, Mumbai, India Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis) National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India NCIM 5270
Streptozotocin (STZ) Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India 14653
Type-1 rat Collagen Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 Shimadzu

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생명공학 제174 당뇨병 상처 독시사이클린 콜라겐 치토산 스캐폴드
당뇨병 상처의 가속 치유를 위한 독시사이클린 로드 콜라겐-치토산 복합 비계
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Sanapalli, B. K. R., Chinna Gounder, … More

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