Summary
Das präparierte DOX-CL-Gerüst erfüllte die Voraussetzungen für einen idealen DW-Verband in mechanischer Festigkeit, Porosität, Wasseraufnahme, Abbaurate, Verzögertfreisetzung, antibakterieller, Biokompatibilität und entzündungshemmender Eigenschaften, die als wesentlich für die Wiederherstellung von geschädigtem Gewebe in DWs angesehen werden.
Abstract
Eine Hauptkomplikation des Diabetes mellitus sind diabetische Wunden (DW). Die verlängerte Entzündungsphase bei Diabetes behindert die weiteren Stadien einer Verletzung, was zu einer verzögerten Wundheilung führt. Wir haben Doxycyclin (DOX) aufgrund seiner antibakteriellen Eigenschaften und seiner berichteten entzündungshemmenden Eigenschaften als potenzielles Medikament der Wahl ausgewählt. Die aktuelle Studie zielt darauf ab, DOX-belastete Kollagen-Chitosan-nicht-vernetzte (NCL) & vernetzte (CL) Gerüste zu formulieren und ihre Heilungsfähigkeit bei diabetischen Erkrankungen zu bewerten. Das Charakterisierungsergebnis von Gerüsten zeigt, dass das DOX-CL-Gerüst im Vergleich zum DOX-NCL-Gerüst eine ideale Porosität, eine geringe Quell- und Abbaurate und eine anhaltende Freisetzung von DOX aufwies. Die In-vitro-Studien zeigen, dass das DOX-CL-Gerüst biokompatibel war und das Zellwachstum im Vergleich zu CL-Gerüst-behandelten und Kontrollgruppen verbesserte. Die antibakteriellen Studien haben gezeigt, dass das DOX-CL-Gerüst gegen die häufigsten Bakterien in DW wirksamer war als das CL-Gerüst. Unter Verwendung des Streptozotocin- und fettreichen diätinduzierten DW-Modells wurde eine signifikant (p≤0,05) schnellere Wundkontraktionsrate in der DOX-CL-Gerüst-behandelten Gruppe im Vergleich zu denen in CL-Gerüst-behandelten und Kontrollgruppen beobachtet. Der Einsatz des DOX-CL-Gerüsts kann sich als vielversprechender Ansatz für die lokale Behandlung von DWs erweisen.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) ist ein Zustand, bei dem das Versagen des Körpers, Insulin zu liefern oder auf seine Ergebnisse bei abnormaler Verdauung von einfachen Zuckern zu reagieren, zu einem Anstieg des Blutzuckers führt 1. Die folgenreichste und erdrückendste Verwicklung von DM ist die diabetische Wunde (DW). Rund 25% der Patienten mit DM haben die Möglichkeit, im Laufe ihres Lebens eine DW aufzubauen 1. Die behinderte Heilung von DW ist auf eine Triopathie der DM anzuführen: Immunpathie, Vaskulopathie und Neuropathie. Wenn DW unbehandelt bleibt, kann es zu einer Gangränentwicklung kommen, was zur Entfernung des betroffenen Organs führt 2.
Viele Behandlungen, wie die Unterweisung der Patienten (Wund täglich untersuchen, die Wunde reinigen, Aktivitäten vermeiden, die Druck auf die Wunde erzeugen, regelmäßige Glukoseüberwachung usw.), Kontrolle ihres Blutzuckers, Wunddebridement, Druckabladung, medizinisches Verfahren, hyperbare Sauerstofftherapie und neuartige Therapien sind in der Praxis 3,4. Die Mehrheit dieser Medikamente erfüllt nicht alle Voraussetzungen, die für die DW-Versorgung angesichts der multifaktoriellen pathophysiologischen Zustände und unerwarteten Kosten im Zusammenhang mit diesen Arzneimitteln unerlässlich sind 5. Obwohl die DW-Pathogenese multifaktoriell ist, wird die anhaltende Entzündung mit ungeeignetem Gewebemanagement als der eigentliche Grund für die verzögerte Heilung in DWs 5,6angegeben.
Erhöhte Spiegel von Entzündungs- und Entzündungsmediatoren bei DW führen zu verminderten Wachstumsfaktoren, die für eine verzögerte Wundheilung verantwortlich sind 2,6. Eine unsachgemäße bildung extrazelluläre Matrix (ECM) in DWs ist auf erhöhte Konzentrationen von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) zurückzuführen, die für den schnellen Abbau von gebildetem ECM verantwortlich sind. Bei MMPs wird MMP-9 als hauptvermittler gemeldet, der für anhaltende Entzündungen und schnellen ECM-Abbau verantwortlich ist 7. Es wird festgestellt, dass die lokale Behandlung mit einem entzündungshemmenden Medikament, das die erhöhten MMP-9-Spiegel senkt, die kutane Homöostase, die Rahmenanordnung und eine bessere Heilung von DWs 8,9wieder herstellt.
Doxycyclin (DOX), ein MMP-9-Inhibitor, wurde ausgewählt, um die erhöhten Spiegel von MMP-9 zu unterdrücken, einem wichtigen Entzündungsmediator, der für anhaltende Entzündungen in DWs 10,11,12verantwortlich ist . Darüber hinaus besitzt DOX Antioxidans (produzieren freie Hydroxy- und Phenoxyradikale, die in der Lage sind, sich mit reaktiven Sauerstoffspezies zu binden) 13 und antiapoptotische (hemmen die Caspaseexpression und mitochondriale Stabilisierung) 14 Aktivitäten, die für die Behandlung von DW unerlässlich sind. Die Anordnung von Gerüsten, die DOX, Kollagen (COL) und Chitosan (CS) enthalten, wurde gewählt. Die Wahl von COL hängt davon ab, wie es hilft, den notwendigen Rahmen für mechanische Festigkeit und Geweberegeneration bereitzustellen 15. Auf der anderen Seite ist CS strukturell homolog zu Glykosaminoglykan, verbunden mit mehreren Wundheilungsphasen. Es wird auch berichtet, dass CS eine signifikante antibakterielle Eigenschaft besitzt 15. Daher ist das COL / CS-Gerüst von DOX formuliert, um die anhaltende Entzündung zu unterdrücken, gefolgt von der Unterstützung der Matrixbildung für eine erfolgreiche Wundheilung bei DM-Zuständen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle durchgeführten Tierverfahren wurden vom institutionellen Tierethischen Komitee des JSS College of Pharmacy, Ooty, Indien, genehmigt.
1. Herstellung von DOX-beladenen porösen Gerüsten durch Gefriertrocknungsverfahren
- Fügen Sie 1,2 g COL zu 100 ml Wasser (z. B. Millipore) hinzu und halten Sie es zum Anschwellen beiseite.
- Rühren Sie die geschwollene COL-Dispersion über Nacht bei 2000 U / min um, um eine vollständige Auflösung von COL zu gewährleisten.
- Cs-Lösung vorbereiten, indem etwa 0,8 g CS in 100 ml 1% Essigsäure gelöst werden.
- Rühren Sie die CS-Lösung über Nacht bei 2000 U / min, um eine gleichmäßige Dispersion zu gewährleisten.
- DOX (1% w/v), gefolgt von CS-Lösung, mit der COL-Lösung mischen und 30 min umrühren.
- Filtern Sie die erhaltene physikalische Mischung mit einem Musselintuch, um den Feinstaub zu entfernen.
- Das erhaltene Filtrat wird bei -85 °C ± 4 °C für ca. 24 h tiefgefroren.
- Lyophilisieren Sie das Tiefkühlgemisch bei -85 °C ± 4 °C für 72 h.
- Lagern Sie die erhaltenen Gerüste in einem Trockenmittel zur weiteren Analyse 16,17.
2. Vernetzung des Gerüsts
- MES (0,488 g) in 50 ml Wasser auflösen.
- 50 mg des DOX-beladenen Gerüsts in 20 ml MES-Puffer für 30 min einweichen.
- Mischen Sie 19,5 ml MES-Puffer mit 0,1264 g EDC und 0,014 g NHS in einem separaten Becherglas.
- Tauchen Sie das Gerüst für 4 h in das Puffergemisch, um eine Vernetzung von 16zu erreichen.
- Speichern Sie die DOX-geladenen vernetzten (CL) und nicht vernetzten Gerüste (NCL) zur weiteren Auswertung.
3. Charakterisierung von Gerüsten
- Morphologische Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM)
- Charakterisieren Sie die Gerüste für die morphologische Analyse mit SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
- Beflecken Sie den Querschnitt und die Außenfläche des Gerüsts mit der zarten Goldschicht (~150 Å).
- Erfassen Sie das fotografische Bild bei der Anregungsspannung von 5 kV und 10 kV.
- Legen Sie die Proben in Aluminiumstubs und umschließen Sie sie mit dem Gold bei ca. 9 V.
- Messen Sie das Gerüst mit SEM mit der erhöhten Auflösung bei 10 kV.
- Porositätsbestimmung
- Messen Sie die Porosität der Gerüste mit der Flüssigkeitsverdrängungsmethode (Ethanol) 18.
- Berechnen Sie die Porosität der Gerüste mit den folgenden Formeln.
Ww = Nassgewicht des Gerüsts
Wd = Trockengewicht des Gerüsts
Wv = Volumen des Gerüsts
- Bestimmung der Wasseraufnahmekapazität
- Messen Sie das Trockengewicht des Gerüsts.
- Inkubieren Sie das gewogene Gerüst bei 37 °C für 24 h in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) pH 7,4.
- Entfernen Sie das überschüssige PBS über dem Gerüst mit Filterpapier.
- Messen Sie die Wasseraufnahmekapazität mit den folgenden Formeln 17.
WS = Prozentsatz der Wasseraufnahme
W1=Nassgewicht des Gerüsts
W0= Trockengewicht des Gerüsts
- Gerüstabbau
- Inkubieren Sie das Gerüst (1 cm x 1 cm) bei 37 °C für 7 Tage in einem PBS von pH 7,4 mit Lysozymen.
- Waschen Sie das Gerüst, um anhaftende Ionen auf der Oberfläche zu entfernen.
- Gefriertrocknung des gewaschenen Gerüsts 17.
- Berechnen Sie die Abbaurate mithilfe von Formeln.
Ww = Anfangsgewicht des Gerüsts
Wd = Gewicht des Gerüsts nach der Gefriertrocknung
-
In-vitro-Freisetzungsstudien
- Bestimmen Sie das Freisetzungsverhalten des DOX vom Gerüst mit der Dialysesackmethode.
- Verteilen Sie das Gerüst in einigen Millilitern simulierter Wundflüssigkeit (pH 7,4) und geben Sie es in einen Dialysebeutel.
- Schließen Sie die Enden des Membranbeutels fest und tauchen Sie in die 500 ml simulierte Wundflüssigkeitslösung ein.
- Rühren Sie die Wundflüssigkeitslösung, die den Dialysebeutel enthält, bei 200-250 U / min.
- Sammeln Sie die Überstandslösung und ersetzen Sie sie in bestimmten Zeitintervallen durch eine gleiche Menge frischer Pufferlösung.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz der DOX-Freisetzung von den Gerüsten in der Überstandslösung mit einem UV-sichtbaren Spektrometer bei 240 nm.
4. In-vitro-Antibakterielle Studien
- Bestimmen Sie die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) der CL- und DOX-CL-Gerüste gegen die Scaffolds S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa mit der Mikrobrühe-Verdünnungsmethode.
- Bereiten Sie die Bakterienkulturen mit Mueller-Hinton-Brühe im Verhältnis 1:1000 vor, um eine Trübung von 0,5 McFarland zu erhalten.
- D-Glucose (800 mg/ dL) in die Bakterienkulturen zur Hyperglykation 19,20 geben.
- CL und DOX-CL in DMSO (Negativkontrolle) zerhacken und lösen.
- Die hyperglykierte Bakteriensuspension (100 μL) und die Testproben (100 μL Gerüstlösung) in 96 Wellplatten werden seriell verdünnt.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 20-24 h.
- Zeichnen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm 21auf.
5. In-vitro-Biokompatibilitätsstudien
- Bewerten Sie die Biokompatibilität der präparierten Gerüste mit MTT [(3-(4,5 Dimethylthiazol-2 yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)]-Assay.
- Sterilisieren Sie die Gerüste in Standardmaß und legen Sie sie in 24 Brunnenplatten.
- 3T3-L1-Zellen auf die 24-Well-Platte geben und für 72 h inkubieren.
6. In-vivo-Tierversuche
- Induktion von DM und Exzisionswunde
- Füttern Sie das Tier zwei Wochen lang mit einer fettreichen Diät und verabreichen Sie Wistar albino-Ratten (180-200 g) intraperitoneal eine Einzeldosis Streptozotocin (STZ) (50 mg/kg Körpergewicht) in Citratpufferlösung zur Induktion von Typ-2-Diabetes.
- Wählen Sie die Tiere mit einem konstanten Blutzucker von 250 mg / dl für die Studie.
- Randomisieren Sie die ausgewählten Tiere für die Induktion von Exzisionswunden.
- Betäuben Sie die diabetischen Ratten mit Diethylether (5 ml wurden in die zuvor gesättigte Anästhesiekammer gegeben) und bestätigen Sie mit der Zehenquetschmethode und der Schleimhautfarbe.
- Rasieren Sie den dorsalen Bereich (dorsaler Thorax, Lendenbereich) mit einem aseptischen Trimmer und Klingen (A40).
- Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit einem alkoholischen Tupfer.
- Schneiden Sie die Haut (2 x 2 cm2 und eine Tiefe von 1 mm) mit einer aseptischen chirurgischen A40-Klinge auf dem rasierten Bereich heraus, um eine offene Wunde zu erzeugen.
- Teilen Sie die Tiere in drei Gruppen ein (Gruppe 1 - Krankheitskontrolle (Kontrolle), Gruppe 2 - CL-Gerüst (Placebo), Gruppe 3 - DOX CL-Gerüst), jede Gruppe bestehend aus 6 Ratten.
- Befestigen Sie die CL- und DOX CL-Gerüste mit chirurgischem Klebeband und bedecken Sie die Kontrollgruppe 21 Tage lang mit steriler Gaze.
- Verfolgen Sie den Wundbereich auf einem sterilen OHP-Blatt und messen Sie die prozentuale Reduktion der Wunde mit der Gittermethode an den Tagen 0, 7, 14 und 21 für alle Gruppen.
- Berechnen Sie die prozentuale Wundreduktion mit den folgenden Formeln.
7. Histopathologische Untersuchungen
- Isolieren Sie den verheilten Wundbereich an den Tagen 7, 14 und 21, lagern Sie ihn in Formalinlösung (10%).
- Teilen Sie die Gewebe mit einem Mikrotom, um eine Dicke von 6 μm zu erhalten.
- Montieren Sie die Abschnitte auf einem Glasobjektträger und beflecken Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin 17.
- Nehmen Sie die Bilder unter 40-facher Vergrößerung mit einem digitalen Mikroskop auf.
8. Hydroxyprolin-Schätzung
- Isolieren Sie den verheilten Wundbereich an den Tagen 0, 7, 14 und 21 zur Beurteilung.
- Schätzung des Hydroxyprolingehalts nach dem von Reddy G et al., 1996 22beschriebenen Verfahren.
9. Elisa-Test
- Schätzen Sie die MMP-9-Werte mit dem Elisa-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Isolieren Sie die Gewebeproben am 21. Tag aus dem verheilten Wundbereich und hacken Sie mit einem Gewebehomogenisator.
- Zentrifugieren Sie das erhaltene Homogenat und sammeln Sie den Überstand.
- Verdünnen Sie den Überstand mit einem Assay-Puffer um das 100-fache.
- Scannen Sie die Platte mit einem Lesegerät mit mehreren Platten.
10. Statistische Auswertung
- Stellen Sie die erhaltenen Ergebnisse als Mittelwert ± SD dar.
- Führen Sie die statistische Analyse mit Graph pad prism v5.01 durch.
- Erreichen Sie die statistische Signifikanz mithilfe der Einwegvarianzanalyse (ANOVA) und des Post-hoc-Tests von Dunnet.
- Betrachten Sie die Werte mit p≤0,05 als signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Charakterisierung des DOX-belasteten NCL- und CL-Gerüsts
Bei der visuellen Untersuchung wurde festgestellt, dass das NCL- und CL-Gerüst cremefarben war. Außerdem scheinen beide Gerüste wie ein Schwamm zu sein, steif und unelastisch, wenn sie körperlich untersucht werden. REM-Bilder der NCL- und CL-Gerüste sind in Abbildung 1 dargestellt. Aus der Abbildung wurde deutlich, dass die Porengröße nach der Vernetzung durch die Bildung intermolekularer Verbindungen abgenommen hat. Auch die Porosität der NCL- und CL-Gerüste wurde mit 92,3±4,21 bzw. 71,35±2,65 festgestellt. Der Prozentsatz der Wasseraufnahme der NCL- und CL-Gerüste betrug 750±11,4% und 492±8,66% in 24-Stunden-Zeitintervallen.
Darüber hinaus wurden sieben Tage lang biologische Abbaustudien in der simulierten Wundflüssigkeit von pH 7,4 durchgeführt, die Lysozyme ent. Das NCL-Gerüst zeigte zunächst in den ersten drei Tagen eine schnellere Abbaurate und nahm an vier aufeinanderfolgenden Tagen langsam ab. Auf der anderen Seite zeigte das CL-Gerüst eine anhaltende Abbaurate. Die Vernetzung des Gerüsts verbesserte die mechanischen Eigenschaften und die Netzwerkfestigkeit, was wiederum zu einer verringerten Abbaurate führte, was auf eine verbesserte Beständigkeit gegen die Degradation hinweist (Abbildung 2).
Weiterhin wurde die In-vitro-Freisetzung von DOX aus NCL- und CL-Gerüst für 120 h durchgeführt (Abbildung 3). In den ersten 1 h wurden 27,92±3,45% DOX vom NCL-Gerüst freigesetzt, während nur 16,54 ±2,21% DOX vom CL-Gerüst freigesetzt wurden. Nach 6 h stieg die DOX-Freisetzung von den Gerüsten um 63,15,15±3,78% im NCL-Gerüst und um 44,43 ±3,57% im CL-Gerüst. Nach 24 h gab es eine Freisetzung von 70% DOX vom NCL-Gerüst, während CL-Gerüst mehr als 72 h brauchte, um 70% des DOX freizugeben. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurde das DOX-belastete CL-Gerüst zur weiteren Bewertung ausgewählt und als DOX-CL-Gerüst dargestellt. Während CL-Gerüst ohne DOX (Placebo) als CL-Gerüst bezeichnet wird.
In vitro antibakterielle Studien
Patienten mit DW erleben in der Regel Infektionen, die zu einer längeren Wundheilung führen. So wurden präparierte Gerüste mit dem MIC gegen ein ausgewähltes Bakterienpanel auf ihre antibakterielle Wirkung untersucht (Tabelle 1). Aus den Ergebnissen geht hervor, dass DOX eine inhibitorische Aktivität mit einem MIC von <4 μg/ml sowohl gegen S. aureus als auch gegen S. epidermis aufwies. Gegen E. coli und P. aeruginosawurde ein MIC von <8 μg/ml und <16 μg/ml beobachtet. Allein Chitosan und CL-Gerüstextrakt zeigten eine minimale Aktivität gegen ausgewählte Organismen wie S. aureus (<64 μg/ml), S. epidermis (<64 μg/ml), E. coli (<128 μg/ml) und P. aeruginosa (<128 μg/ml). DoX-CL Gerüst hat eine ähnliche hemmende Aktivität mit einem MIC von <2 μg/ml sowohl gegen S. aureus als auch gegen S. epidermisgezeigt. Darüber hinaus zeigte das DOX-CL-Gerüst moderate Aktivitäten mit einem MIC von <8 μg/ml gegen E. coli und P. aeruginosa.
In-vitro-Biokompatibilitätsstudie
Der MTT-Assay wurde durchgeführt, um die zelluläre Lebensfähigkeit von 3T3-L1-Zellen in Gegenwart von CL- und DOX-CL-Gerüsten zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die CL- und DOX-CL-Gerüste keine Zytotoxizität stimulierten. Darüber hinaus war die Zelllebensfähigkeit in den mit Gerüsten behandelten Gruppen vergleichsweise höher als in der Kontrolle, was das verstärkte Wachstum von Fibroblasten in Gegenwart von Gerüsten darstellt (Abbildung 4).
In-vivo-Wundheilungsstudien
Die mittlere Wundfläche, die in allen Gruppen abnahm, wurde mit der grafischen Methode an den Tagen 0, 7, 14 und 21 bestimmt (Abbildung 5). Bei der visuellen Untersuchung waren die Wunden in den mit CL und DOX-CL behandelten Gruppen am siebten Tag frei von Nässen. Gleichzeitig sickerten die Wunden in der Kontrollgruppe. Am Tag 14 wurde in allen Gruppen ein trockener Schorf beobachtet; im DOX-CL-Gerüst wurde jedoch eine schnellere Wundkontraktion beobachtet (89,663%). Am Tag 21 wurden 99,9% der Wunde geheilt und eine Narbe im DOX-CL-Gerüst gebildet, während in Kontroll- und CL-Gerüstgruppen eine teilweise Heilung beobachtet wurde.
Studium der Histopathologie
Die histopathologische Beobachtung der Wundheilung am siebten Tag nach der Verletzung zeigte in allen Gruppen eine Störung aller Hautschichten an den Wundrändern. Es gab keine Sichtbarkeit der Epidermis; in der Kontrollgruppe wurden jedoch vorherrschende Neutrophile mit intermittierenden Monozyten und Lymphozyten beobachtet. In der mit CL-Gerüsten behandelten Gruppe wurde eine moderate Sichtbarkeit der Epidermis zusammen mit wenigen Neutrophilen und Makrophagen festgestellt. Während in der DOX-CL-Gerüstgruppe die Wunde mit einer schlanken Schicht der Epidermis bedeckt war, die die Phase der Reepithelisierung darstellte. Leichte Neutrophile und Makrophagen wurden zusammen mit Granulationsgewebe auch häufiger in der mit DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppe beobachtet.
Am 14. Tag nach der Verletzung wurde festgestellt, dass Wunden in allen Gruppen mit Epidermis bedeckt waren. In der Kontrollgruppe wurde beobachtet, dass die gebildete Epidermisschicht zusammen mit vorherrschenden Neutrophilen eine sehr schlanke Schicht war. In der cl-gerüstbehandelten Gruppe war die gebildete Epidermisschicht dicker als in der Kontrollgruppe, zusammen mit milden mehrkernigen massiven Zellen. In der mit DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppe war die entwickelte Epidermis im Vergleich zu anderen Gruppen dicker, zusammen mit einer reichlichen Anzahl von Histiozyten und riesigen mehrkernigen Zellen. Die dichte Zone der Fibroblasten wurde auch in der mit DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppe beobachtet.
Am Tag 21 nach der Verletzung war in der Kontrollgruppe eine dominante Anzahl von Neutrophilen zusammen mit dem Wiederauftreten von Makrophagen und Histiozyten, die die verminderte Entzündung darstellten, verringert. Während in der mit CL-Gerüsten behandelten Gruppe eine moderate Anzahl von Histozyten und Lymphozyten beobachtet wurde. Es wurde beobachtet, dass die gebildete Epidermis in der mit DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppe wesentlich dicker war als in der Kontrollgruppe, zusammen mit einer reichen Anzahl von Histiozyten, Lymphozyten und massiven mehrkernigen Zellen. In der mit DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppe war die Anzahl der Neutrophilen am 7. Tag verringert. Auch die Ansammlung von Makrophagen und ihre morphologischen Varianten wie mehrkernige Massivzellen und Histiozyten wurden an Tag 14 und 21 bemerkt (Abbildung 6).
Hydroxyprolin-Schätzung
Die Hydroxyprolinschätzung ist ein indirektes Maß für die Menge an Kollagen, die in heilenden Wunden vorhanden ist. Eine höhere Hydroxyprolinkonzentration bezeichnet einen schnellen Prozentsatz der Wundheilung. Die biochemische Untersuchung ergab eine höhere Menge an Hydroxyprolin in der DOX-CL-Gerüst-behandelten Gruppe, gefolgt von der CL-Gerüst-behandelten Gruppe als in der Kontrollgruppe (Abbildung 7).
MMP-9-Schätzung mit dem Elisa-Kit
Der MMP-9-Gehalt in der mit DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppe war im Vergleich zu denen in der Kontrollgruppe und der mit CL-Gerüsten behandelten Gruppe signifikant verringert. Während der MMP-9-Gehalt in der cl-gerüstbehandelten Gruppe geringfügig geringer war als der der doX-CL-gerüstbehandelten Gruppe, wie in Abbildung 8dargestellt.
Abbildung 1: Morphologie des DOX-geladenen COL-CS-Gerüsts a) vor CL und b) nach CL-Bestimmung durch REM in einem Skalenbereich von 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Matrixabbau von DOX, der in NCL- und CL-Gerüsten von Tag 1 bis 7 bei PBS pH 7,4 bei 37 °C belastet ist, zeigt, dass NCL für 7 Tage allmählich abgebaut wurde. Im Gegensatz dazu deutet die deutlich reduzierte CL-Gerüstabbaurate auf eine erhöhte Resistenz gegen enzymatischen Abbau hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: In-vitro-Wirkstofffreisetzungsprofil von DOX aus NCL- und CL-Gerüsten in PBS pH 7,4 bei 37 ° C, das eine langsame Freisetzung des Arzneimittels in allen Formulierungen zeigt, gefolgt von einer verzögerten Freisetzung. Daten, ausgedrückt als Mittelwert ± SD (n=3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: 3T3-L1-Zellen, die in Gegenwart von CL- und DOX-CL-Gerüsten kultiviert wurden und ein prozentuales Zellwachstum in der DOX-CL-Gerüstgruppe zeigen, gefolgt von CL-Gerüst behandelt und kontrolliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5:a) Bilder, die die Verringerung der mittleren Wundfläche in den mit Kontroll-, CL-Gerüst- und DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppen an den Tagen 0, 7, 14 und 21 nach der Verwundung darstellen. b) Grafische Darstellung der Verringerung der mittleren Wundfläche in den mit Kontroll-, CL-Gerüst- und DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppen an den Tagen 0, 7, 14 und 21 nach der Verwundung. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n=6 Wunden/Gruppe) ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch One Way Analysis of Variance (ANOVA) erhalten, gefolgt von Dunnets Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Histologische Veränderungen während des Wundheilungsprozesses bei STZ und fettreicher diätinduzierter Diabetes bei Wistar albino Rattenhaut an den Tagen 7, 14 und 21 ohne (Kontrolle) und mit Behandlung (CL- und DOX-CL-Gerüste) in einem Exzisionswundmodell mit voller Dicke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Ergebnis, das den Hydroxyprolingehalt in Wunden an den Tagen 0, 7, 14 und 21 als Indikator für die indirekte Kollagenspiegelschätzung darstellt. Die Ergebnisse werden in μg Hydroxyprolin/ mg trockenem Wundgewebe ausgedrückt. Die Daten stellen die Mittlere ±SD (n=6 Wunden/Gruppe) dar. Die statistische Signifikanz wurde durch One Way Analysis of Variance (ANOVA) erhalten, gefolgt von Dunnets Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Grafik, die die MMP-9-Spiegel in Homogenaten darstellt, die aus verheilten Wunden in STZ und fettreichem diätinduziertem induziertem diabetischem Rattenmodell am Tag 21 gewonnen wurden. Die MMP-9-Spiegel wurden in 100-fachen Aliquoten von Wundflüssigkeiten mittels ELISA-Analyse bestimmt. Die Daten stellen Mittelwert±SD (n=3) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| MIC (μg/ml) | ||||
| Testbeispiel | S. aureus | S. epidermis | E. coli | P. aeruginosa |
| DOX | <4 | <4 | <8 | <16 |
| CS | <64 | <64 | <128 | <128 |
| CL-Gerüstextrakt | <64 | <64 | <128 | <128 |
| DOX-CL Gerüstextrakt | <2 | <2 | <4 | <4 |
Tabelle 1: Minimale hemmende Konzentration von CS-, DOX-, CL- und DOX-CL-Gerüsten gegen ein ausgewähltes Bakterienpanel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Hauptziel dieser Studie war es, die Wirkung von DOX-geladenen COL-CS-Gerüsten auf die DW-Heilung bei Ratten zu bestimmen. CL und NCL wurden in Bezug auf Morphologie, Quellindex, In-vitro-Freisetzungskinetik und Biokompatibilität hergestellt und bewertet.
Charakterisierung des DOX-belasteten NCL- und CL-Gerüsts
Die vorbereiteten Gerüste erwiesen sich als porös mit miteinander verbundenen Poren. Diese miteinander verbundenen Poren gewährleisten die poröse, schwammige Natur, die bei der richtigen Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen zu den Zellen für die Proliferation und Migration hilft, was zu einer beschleunigten Heilung führt. Hier war die Porengröße hauptsächlich von der Vernetzung abhängig. Die Vernetzung des Gerüsts führte zu einer verringerten Porengröße, indem starke intramolekulare Wechselwirkungen durch EDC / NHS mit CS und COL entstanden, wodurch die mechanische Festigkeit des Gerüsts erhöht wurde.
Der Porositätsindex beruht auf der relativen Dichte, die eine Funktion der Masse der Schwammstreben und des Volumens ist. Im Allgemeinen tritt eine Schrumpfung des Gerüstvolumens auf, wenn ein Vernetzungsmittel die Position der Streben verändert, indem es sie näher aneinander zieht, was zu einer Gerüstverdichtung führt. Im Falle der Carbodiimidchemie ist jedoch aufgrund seines einzigartigen Mechanismus, d.h. der Einführung der Amidverknüpfung (O = C-NH) unter Verwendung der Carbonsäuregruppe (>COOH) und Amingruppe (-NH) der benachbarten Peptidkette, ohne in das Gerüst einzutreten, keine Zunahme der Masse des Gerüsts zu erwarten. Gleichzeitig kann es bei der Vernetzung durch die Auflösung und Migration von nicht befestigten Polymerketten zu geringen Massenverlusten kommen. Im Falle einer Gerüstbehandlung mit EDC/NHS hatte die Gerüstbehandlung jedoch keinen spürbaren Effekt auf die Gerüstmorphologie.
Die Fähigkeit des Gerüsts, biologische Flüssigkeit aufzunehmen, ist entscheidend für die Beurteilung seiner Eignung als Arzneimittelträger. Die Wasseraufnahmeeigenschaft beeinflusst nicht nur die Form des Gerüsts, sondern auch das Zellwachstum. Es wurde beobachtet, dass das CL-Gerüst eine geringere Wasseraufnahmerate als das NCL-Gerüst gezeigt hatte, was auf die Vernetzung des Gerüsts zurückzuführen ist. Darüber hinaus war die Hydrophilie von Gerüstmaterial nach der Vernetzung aufgrund von (i) Verlust hydrophiler Gruppen (>COOH & -NH) im Prozess der Amidbindungsbildung signifikant reduziert; (ii) Hemmung der Schwellung durch Bildung neuer Bindungen (O=C-NH). Diese Ergebnisse stehen in gutem Einvernehmen mit den zuvor veröffentlichten Berichten 23,24.
Eine enzymatische biologische Abbaustudie wurde durchgeführt, indem der Prozentsatz einer Restmasse nach sieben Tagen Inkubation in der simulierten Wundflüssigkeit von pH 7,4, einschließlich Lysozyme, überwacht wurde. Das NCL-Gerüst zeigte zunächst in den ersten drei Tagen eine schnellere Abbaurate und nahm an vier aufeinanderfolgenden Tagen langsam ab. Auf der anderen Seite zeigte das CL-Gerüst eine längere Abbaurate. Die Vernetzung des Gerüsts verbesserte die mechanischen Eigenschaften und die Netzwerkfestigkeit, was wiederum zu einer verringerten Abbaurate führte und eine verbesserte Beständigkeit gegen die Degradation zeigte.
Drug Release Studien wurden für CL- und NCL-Gerüste für 120 h durchgeführt. Im Allgemeinen nimmt der Wirkstofffreisetzungskoeffizient des Gerüsts ab, wenn die Vernetzungsdichte aufgrund verbesserter Verbindungen zwischen den Poren und verringertem Raum zwischen Polypeptidketten zunimmt. Der Wirkstofffreisetzungskoeffizient wird auch durch den Porositätsindex, den Wassergehalt, den Quellindex und den Grad der Vernetzung beeinflusst. In unserer Studie wurden 27,92±3,45% und 63,15±3,78% des DOX aus dem NCL-Gerüst freigesetzt, während 16,54±2,21% bzw±44,43,3,57% des DOX aus dem CL-Gerüst nach 1 h bzw. 6 h freigesetzt wurden. Nach 24 h gab es eine Freisetzung von 70% DOX aus dem NCL-Gerüst, während; CL Gerüst brauchte mehr als 72 Stunden, um 70% des DOX freizugeben. Die Ergebnisse zeigten, dass die Gerüstvernetzung die DOX-Freisetzung umgekehrt beeinflusste, indem sie das Quellverhältnis und den Wassergehalt verringerte.
In vitro antibakterielle Studien
DOX-CL Gerüstextrakt zeigte eine höhere hemmende Aktivität (MIC) gegen grampositive Organismen. Die höhere Aktivität des DOX-CL-Gerüstextrakts könnte auf die erhöhte Hydrophobie der Probe liegt. DOX-CL-Gerüstextrakt zeigte jedoch eine minimale Aktivität gegen gramnegative Organismen, wahrscheinlich aufgrund eines Versagens der Zellwanddurchdringung. Darüber hinaus war der MIC von DOX-CL vergleichsweise höher als CS-, CL-Gerüst- und DOX-Proben, was auf die synergistische Aktivität von DOX und CS im DOX-CL-Extrakt zurückzuführen ist.
In-vitro-Biokompatibilitätsstudie
Die In-vitro-Biokompatibilitätsstudie wurde an Fibroblastenzellen (3T3-L1) durchgeführt. Fibroblasten sind für die Produktion von ECM und Proteinen verantwortlich. Darüber hinaus spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität, indem sie die Bildung des für die Wundheilung erforderlichen Gerüsts verbessern. Die Ergebnisse zeigen, dass das DOX-CL-Gerüst und das CL-Gerüst keine Zellzytotoxizität erzeugten. Beide Gerüstgruppen wurden jedoch mit dem Zellwachstum und der Differenzierung von Fibroblasten in den Gerüstporen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die vorbereiteten Gerüste biokompatibel waren. Erhöhtes Zellwachstum und Differenzierung in beiden Gruppen waren hauptsächlich auf das Vorhandensein von CS und COL als extrazelluläre Matrix in der Gerüststruktur zurückzuführen.
Darüber hinaus wurde bei der DOX-CL-Gerüstgruppe ein vergleichsweise höheres Zellwachstum beobachtet als beim CL-Gerüst aufgrund der Aktivierung des PI3K-AKT-Signals durch DOX, das für das Zellwachstum und -überleben verantwortlich ist 25.
In-vivo-Wundheilungsstudien
Die verschiedenen Komplikationen der DM sind für die verlängerte Heilung der DW verantwortlich. Um den diabetischen Zustand bei Ratten nachzuahmen, wurde eine fettreiche Diät gegeben, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von STZ. Nach 2-3 Tagen diabetischer Bestätigung wurden offene Wunden durch die Exzision der Haut an der dorsalen Brustregion erzeugt. Die Behandlung wurde 21 Tage lang mit entsprechenden Gerüsten durchgeführt. Eine Verringerung des Wundbereichs wurde für alle Gruppen an den Tagen 0, 7, 14 und 21 bestimmt. Diabetische Ratten, die mit dem DOX-CL-Gerüst behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu CL-Gerüstgruppen und unbehandelten Gruppen einen signifikanten Grad an Wundkontraktion.
Die entzündliche Phase der Wundheilung ist für die funktionelle Barrierebildung verantwortlich. In der nächsten Stufe erregt die proliferative Phase der Wundheilung Aufmerksamkeit in der Wundversorgung, in der 43% der Wundflächenreduktion mit der DOX-CL-Gerüstgruppe beobachtet wurden. Im Vergleich dazu wurden nur 23% bzw. 7% mit CL-Gerüst und unbehandelten Gruppen an Tag 7 beobachtet. Aus den Bildern (Abbildung 5) wurde die Kontraktion der Wunde eingeleitet, nachdem die Entzündungs- und Proliferationsphase abgeschlossen war. Die DOX-CL-Gerüstgruppe zeigte eine signifikante Wundkontraktion aufgrund des Vorhandenseins von DOX, das für die entzündungshemmende und antiinfektiöse Wirkung verantwortlich ist. Darüber hinaus halfen COL und CS im Gerüst bei der Zellproliferation, Differenzierung und Migration, was zu 99% der DW-Heilung in 21 Tagen führte.
Unbehandelte Exzisionswunden zeigten am Tag 7 nach der Verletzung Neutrophile, Lymphozyten und Monozyten. Wie bereits erwähnt, helfen Neutrophile beim Wunddebridement im frühen Stadium der Wundheilung. Außerdem kann der Überfluss an Neutrophilen den Heilungsprozess negativ beeinflussen, indem er das normale Gewebe schädigt. Wie von Dovi et al. berichtet, beschleunigt eine minimale Anzahl von Neutrophilen den Re-Epithelisierungsprozess 26.
Darüber hinaus begünstigten erhöhte Makrophagen, Histiozyten und massive mehrkernige Zellen in der mit DOX-CL-Gerüsten behandelten Gruppe die Umgebung für eine beschleunigte Wundheilung, indem sie die beschädigten Zellen reparierten und die COL-Synthese förderten. Darüber hinaus wurde die COL-Amalgamierung mit Gewebe anhand der Hydroxyprolinspiegel in allen Gruppen bestimmt. Mit der DOX-CL-Gerüst-behandelten Gruppe wurden jedoch vergleichsweise höhere Hydroxyprolinspiegel beobachtet als mit der unbehandelten und CL-Gerüst-behandelten Gruppe. Wie in der Literatur erwähnt, behindert die verlängerte Entzündungsphase bei diabetischen Erkrankungen die anderen Heilungsphasen. Die schnellere Rate der Wundkontraktion im DOX-CL-Gerüst kann auf die entzündungshemmende Eigenschaft von DOX zurückgeführt werden, was dazu führt, dass die weiteren Stadien der Wunde in der richtigen Zeitphase auftreten und zu einer beschleunigten Wundheilung führen.
Die biochemische Abschätzung der MMP-9-Spiegel mit dem ELISA-Test zeigt, dass die mit DOX-CL-Gerüsten behandelte Gruppe im Vergleich zu denen in CL-Gerüst-behandelten und unbehandelten Gruppen verringerte MMP-9-Spiegel aufwies. Laut Literatur sind erhöhte MMP-9-Spiegel für den Matrixabbau verantwortlich, was wiederum den Wundheilungsprozess verlängert. DOX, ein entzündungshemmendes Mittel, hemmte die MMP-9-Spiegel, was als Grund für die Verhinderung des COL-Abbaus gilt, was zu einer beschleunigten DW-Heilung führte. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit früheren veröffentlichten Studien von Lindeman et al., 2009 und Zhang et al., 2014 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Ashish D Wadhwani. (Assistenzprofessor und Leiter, Department of Pharmaceutical Biotechnology, JSS College of Pharmacy, Ooty, Indien) für die Unterstützung bei In-vitro-Zelllebensfähigkeitsstudien.
Die Autoren danken dem Department of Science and Technology - Fund for Improvement of Science and Technology Infrastructure in Universities and Higher Educational Institutions (DST-FIST), Neu-Delhi, für die Unterstützung unserer Abteilung.
Die Autoren danken auch Herrn Sanju. S und Herr Sriram. Narukulla M. Pharm Studenten für ihre Unterstützung beim Videodreh.
Diese Forschung wurde von der JSS Academy of Higher Education & Research (JSSAHER) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
