Summary
Det forberedte DOX-CL stillads opfyldte forudsætningerne for en ideel DW-dressing i mekanisk styrke, porøsitet, vandabsorption, nedbrydningshastighed, vedvarende frigivelse, antibakteriel, biokompatibilitet og antiinflammatoriske egenskaber, som anses for at være afgørende for genopretningen af beskadiget væv i VW.
Abstract
En stor komplikation af diabetes mellitus er diabetiske sår (DW). Den langvarige fase af inflammation i diabetes hindrer de yderligere stadier af en skade, der fører til forsinket sårheling. Vi valgte doxycyclin (DOX), som et potentielt lægemiddel efter eget valg, på grund af dets antibakterielle egenskaber sammen med dets rapporterede antiinflammatoriske egenskaber. Den nuværende undersøgelse har til formål at formulere DOX indlæst kollagen-chitosan ikke-crosslinked (NCL) &crosslinked (CL) stilladser og evaluere deres helbredende evne i diabetiske tilstande. Karakteriseringsresultatet af stilladser afslører, at DOX-CL stilladset har ideel porøsitet, en lav hævelse og nedbrydningshastighed og en vedvarende frigivelse af DOX sammenlignet med DOX-NCL stilladset. In vitro-undersøgelserne viser, at DOX-CL-stilladset var biokompatibelt og forbedret cellevækst sammenlignet med CL-stilladsbehandlede og kontrolgrupper. De antibakterielle undersøgelser har vist, at DOX-CL stilladset var mere effektivt end CL stilladset mod de mest almindelige bakterier, der findes i DW. Ved hjælp af streptozotocin og fedtfattig kost-induceret DW model, en betydeligt (p≤0,05) hurtigere sårsammentrækning i DOX-CL stillads behandlet gruppe blev observeret i forhold til dem i CL stillads behandlet og kontrol grupper. Brugen af DOX-CL stilladset kan vise sig at være en lovende tilgang til lokal behandling af VW.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) er en tilstand, hvor kroppens manglende evne til at levere insulin eller reagere på dens resultater i unormal fordøjelse af ligetil sukker medfører en stigning i blodsukkeret 1. Den mest på hinanden følgende og knusende sammenfiltring af DM er diabetisk sår (DW). Omkring 25% af patienter med DM har mulighed for at opbygge en DW i deres levetid 1. Den hindrede helbredelse af DW er akkrediteret til en triopati af DM: immunopati, vasculopati, og neuropati. Når DW ikke behandles, kan det resultere i koldbrandudvikling, hvilket medfører fjernelse af det pågældende organ 2.
Masser af behandlinger, såsom at instruere patienterne (inspicere sår dagligt, rense såret, undgå aktiviteter, der skaber pres på såret, periodisk glukoseovervågning osv.), kontrollere deres blodsukker, sårdebridement, trykaflastning, medicinsk procedure, hyperbar iltbehandling og avancerede terapier er i praksis 3,4. De fleste af disse medikamenter undlader at behandle alle forudsætninger afgørende for DW pleje i lyset af de multifaktorielle patofysiologiske tilstande og uventede udgifter i forbindelse med disse lægemidler 5. Selvom DW patogenese er multifaktoriel, den vedvarende betændelse med uhensigtsmæssig vævshåndtering er angivet til at være den faktiske årsag til forsinket heling i DWs 5,6.
Forstærkede niveauer af inflammatoriske og proinflammatoriske mæglere i DW resulterer i mindskede vækstfaktorer, der er ansvarlige for forsinket sårheling 2,6. Forkert ekstracellulær matrix (ECM) dannelse i VW er akkrediteret til øgede niveauer af matrix metalloproteinaser (MMP'er), der er ansvarlige for den hurtige nedbrydning af dannet ECM. I MMP'er rapporteres MMP-9 som en vigtig mellemmand med ansvar for langvarig inflammation og hurtig ECM-nedbrydning 7. Det siges, at lokal behandling med et antiinflammatorisk lægemiddel, der reducerer de forhøjede niveauer af MMP-9, genopretter kutane homøostase, rammearrangement og beder om bedre helbredelse af DWs 8,9.
Doxycyclin (DOX), en MMP-9-hæmmer, blev valgt til at undertrykke de forhøjede niveauer af MMP-9, en stor inflammatorisk mægler, der er ansvarlig for vedvarende betændelse i DWs 10,11,12. Derudover besidder DOX antioxidant (producerer frie hydroxy- og phenoxyradikaler, der er i stand til at binde sig med reaktive iltarter) 13 og antiapptotiske (hæmme caspase-udtryk og mitokondriestabilisering) 14 aktiviteter, der er afgørende for behandlingen af DW. Arrangementet af rammer, der indeholder DOX, kollagen (COL), og chitosan (CS) blev valgt. Valget af COL afhænger af den måde, hvorpå det hjælper med at skabe de nødvendige rammer for mekanisk styrke og vævsgendannelse 15. På den anden side er CS strukturelt homolog til glykosaminoglycan, forbundet med flere sårhelingsfaser. Det forlyder også, at CS har betydelig antibakteriel egenskab 15. Derfor er COL / CS stilladset af DOX formuleret til at undertrykke den langvarige inflammation, efterfulgt af støtte matrixdannelsen for vellykket sårheling under DM-forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de udførte dyreforsøg blev godkendt af den institutionelle dyreetiske komité på JSS College of Pharmacy, Ooty, Indien.
1. Fremstilling af DOX-belastede porøse stilladser ved frysetørringsmetode
- Tilsæt 1,2 g COL til 100 mL vand (f.eks. Millipore) og hold til side til hævelse.
- Rør den hævede COL spredning på 2000 rpm natten over for at sikre fuldstændig opløsning af COL.
- CS-opløsningen fremstilles ved at opløse ca. 0,8 g CS i 100 ml 1% eddikesyre.
- Rør CS-opløsningen natten over ved 2000 omdrejninger i minuttet for at sikre ensartet spredning.
- Bland DOX (1% w/v), efterfulgt af CS-opløsning, til COL-opløsningen, og rør i 30 minutter.
- Filtrer den opnåede fysiske blanding ved hjælp af en musselin klud til at fjerne partiklerne.
- Dybfrys det opnåede filtrat ved -85 °C ± 4 °C i ca. 24 timer.
- Dybfryserblandingen ved -85 °C ± 4 °C i 72 timer.
- Opbevar de opnåede stilladser i en desiccator til yderligere analyse 16,17.
2. Krydsning af stillads
- MES opløses (0,488 g) i 50 mL vand.
- 50 mg dox-lastet stillads i 20 mL af MES-bufferen lægges i blød i 30 min.
- Bland 19,5 mL MES buffer med 0,1264 g EDC og 0,014 g NHS i et separat bægerglas.
- Fordyb stilladset i bufferblandingen i 4 timer for at opnå krydskobling 16.
- Gem de DOX-indlæste krydslinkede (CL) og ikke-krydskædede stilladser (NCL) for yderligere evaluering.
3. Karakterisering af stilladser
- Morfologisk undersøgelse ved hjælp af en scanningselektronmikroskopi (SEM)
- Karakterisere stilladserne til morfologisk analyse ved hjælp af SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
- Plette tværsnit og udvendige overflade af stilladset med det sarte lag af guld (~ 150 Å).
- Tag det fotografiske billede ved excitationsspændingen på 5 kV og 10 kV.
- Prøverne anbringes i aluminiumsstubbe, og de sættes sammen med guldet ved ca. 9 V.
- Mål stilladset ved hjælp af SEM med den øgede opløsning ved 10 kV.
- Bestemmelse af porøsitet
- Porøsiteten af stilladserne måles ved hjælp af den flydende forskydningsmetode (ethanol) 18.
- Beregn stilladsernes porøsitet ved hjælp af nedenstående formler.
Ww = Stilladsets våde vægt
Wd = Stilladsets tørre vægt
Wv = Stilladsets volumen
- Bestemmelse af vandabsorptionskapaciteten
- Mål stilladsets tørre vægt.
- Det vejede stillads inkuberes ved 37 °C i 24 timer i fosfatbuffers saltvand (PBS) pH 7.4.
- Fjern den overskydende PBS over stilladset med filterpapir.
- Vandabsorptionskapaciteten måles ved hjælp af nedenstående formler 17.
WS = Procentdel af vandoptagelse
W1=Stilladsets våde vægt
W0= Stilladsets tørre vægt
- Nedbrydning af stilladser
- Stilladset (1 cm x 1 cm) inkuberes ved 37 °C i 7 dage i en PBS på pH 7,4 indeholdende lysozymer.
- Vask stilladset for at fjerne eventuelle klæbende ioner på overfladen.
- Frys det vaskede stillads 17.
- Beregn nedbrydningshastigheden ved hjælp af formler.
Ww = Stilladsets oprindelige vægt
Wd = Stilladsets vægt efter frysetørring
-
Undersøgelser vedrørende in vitro-udgivelse
- Find ud af, hvordan DOX'en skal slippes fra stilladset ved hjælp af dialysesækkemetoden.
- Stilladset spredes i nogle få milliliter simuleret sårvæske (pH 7.4) og overføres til en dialysepose.
- Luk enderne af membranposen tæt, og fordyb den simulerede sårvæskeopløsning i 500 ml.
- Rør sårvæskeopløsningen, der indeholder dialyseposen, ved 200-250 omdrejninger i minuttet.
- Den supernatantopløsning opsamles og erstattes med en tilsvarende mængde frisk bufferopløsning med bestemte tidsintervaller.
- Den procentdel af DOX-udslippet fra stilladserne i supernatantopløsningen bestemmes ved hjælp af et UV-synligt spektrometer ved 240 nm.
4. In vitro antibakterielle undersøgelser
- Den minimale hæmmende koncentration (MIC) af CL- og DOX-CL-stilladserne bestemmes i forhold til S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa ved hjælp af mikro bouillonfortyndingsmetoden.
- Forbered bakteriekulturer ved hjælp af Mueller-Hinton bouillon i et forhold på 1:1000 for at opnå 0,5 McFarland turbiditet.
- D-glukose (800 mg/dL) til bakteriekulturerne til hyperglycation 19,20.
- Hakkekød og opløse CL og DOX-CL i DMSO (negativ kontrol).
- Den hyperglycaterede bakteriele affjedring (100 μL) og testprøver (100 μL stilladsopløsning) fortyndes serielt i 96 brøndplade.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i 20-24 timer.
- Absorbansen registreres ved en bølgelængde på 600 nm 21.
5. Undersøgelser vedrørende in vitro-biokompatibilitet
- Vurdere biokompatibiliteten af de forberedte stilladser ved hjælp af MTT [(3-(4, 5 dimethyl thiazol-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromid)] assay.
- Steriliser stilladserne af standarddimension og læg dem i 24 brøndplader.
- Tilsæt 3T3-L1 celler til 24 brøndpladen og inkuberes i 72 timer.
6. Undersøgelser af dyr i Vivo
- Induktion af DM og excision sår
- Foder dyret med en fedtrig kost i to uger og indadministrer en enkelt dosis streptozotocin (STZ) (50 mg/kg legemsvægt) i citratbufferopløsning intraperitoneally til Wistar albino rotter (180-200 g) til induktion af type-2 diabetes.
- Vælg dyrene med en konstant blodsukker på 250 mg/dL til undersøgelsen.
- Randomiser de udvalgte dyr til induktion af excision sår.
- Bedøve diabetiske rotter ved hjælp af diethyl æter (5 mL blev tilføjet til den tidligere mættede anæstesi kammer) og bekræfte ved hjælp af tå knivspids metode og slimhinde farve.
- Barber dorsalområdet (Dorsal thoracic, lænderegion) ved hjælp af en aseptisk trimmer og knive (A40).
- Steriliser det barberede område med en alkoholisk vatpind.
- Punktafgift huden (2 x 2 cm2 og en dybde på 1 mm) med en aseptisk kirurgisk A40 klinge på barberet område for at skabe et åbent sår.
- Del dyrene op i tre grupper (Gruppe 1 - Sygdomsbekæmpelse (Kontrol), Gruppe 2- CL stillads (Placebo), Gruppe 3- DOX CL stillads), hver gruppe bestående af 6 rotter.
- Ansætter CL- og DOX CL-stilladserne ved hjælp af kirurgisk tape og dækker kontrolgruppen med steril gaze i 21 dage.
- Spor sårområdet på et sterilt OHP-ark, og mål den procentvise reduktion af såret ved hjælp af gittermetoden på dag 0, 7, 14 og 21 for alle grupper.
- Den procentvise sårreduktion beregnes ved hjælp af nedenstående formler.
7. Histopatologiske undersøgelser
- Isoler det helede sårområde på dag 7, 14 og 21, opbevar i formalinopløsning (10%).
- Væv, der anvender en mikrotome, afsnitsdels for at opnå en tykkelse på 6 μm.
- Afsnittene monteres på en glasrutsjebane og plet ved hjælp af Hematoxylin og eosin 17.
- Tag billederne under 40x forstørrelse ved hjælp af et digitalt mikroskop.
8. Hydroxyprolin skøn
- Isoler det helede sårområde på dag 0, 7, 14 og 21 til evaluering.
- Vandforkalkningsindholdet anslås efter proceduren i Reddy G et al., 1996 22.
9. Elisa-test
- Anslå MMP-9-niveauerne ved hjælp af Elisa-sættet i henhold til producentens anvisninger.
- Isoler vævsprøverne fra det helede sårområde på dag 21 og hakkekød ved hjælp af en vævs homogenisator.
- Centrifuge den opnåede homogenisere og indsamle supernatant.
- Supernatanten fortyndes ved 100 gange ved hjælp af analysebuffer.
- Scan pladen ved hjælp af en flerpladelæser.
10. Statistisk analyse
- Repræsenter de opnåede resultater som Middel ± SD.
- Udfør den statistiske analyse ved hjælp af Graph pad prism v5.01.
- Opnå den statistiske signifikans ved hjælp af One Way Analysis of Variance (ANOVA) og Dunnets post hoc-test.
- Betragt værdierne med p≤0,05 som betydelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering af det DOX-indlæste NCL- og CL-stillads
Ved visuel undersøgelse blev NCL og CL stilladset fundet at være creme i farve. Desuden synes begge stilladser at være som en svamp, stiv og elastisk, når den undersøges fysisk. SEM-billeder af NCL- og CL-stilladserne er vist i figur 1. Ud fra figuren fremgik det klart, at der var et fald i porestørrelsen efter krydsning ved at danne intermolekylære forbindelser. Det konstateredes også, at NCL- og CL-stilladserne var henholdsvis 92,3 ±4,21 og 71,35±2,65. Procentdelen af vandabsorption af NCL- og CL-stilladserne var 750±11,4% og 492±8,66% ved tidsintervaller på 24 timer.
Derudover blev der udført bionedbrydningsundersøgelser i syv dage i den simulerede sårvæske på pH 7,4, bestående af lysozymer. NCL stilladset udviste en hurtigere nedbrydningshastighed i første omgang i de første tre dage og faldt langsomt i fire på hinanden følgende dage. På den anden side viste CL-stilladset en langvarig nedbrydningshastighed. Krydsklinking af stilladset forbedrede mekaniske egenskaber og netværksstyrke, hvilket igen resulterede i nedsat nedbrydningshastighed, hvilket indikerer forbedret modstandsdygtighed over for nedbrydningen (Figur 2).
Endvidere blev in vitro-frigivelsen af DOX fra NCL- og CL-stilladset udført i 120 timer (figur 3). I de første 1 timer blev 27,92±3,45% DOX frigivet fra NCL stilladset, mens kun 16,54±2,21% DOX blev frigivet fra CL stilladset. Efter 6 timer steg DOX-frigivelsen fra stilladserne med 63,15±3,78% i NCL-stilladset og 44,43±3,57% i CL stilladser. Efter 24 timer var der en frigivelse på 70% DOX fra NCL stilladset, mens CL stillads tog mere end 72 timer at frigive 70% af DOX. Baseret på de opnåede resultater blev det DOX-indlæste CL-stillads udvalgt til yderligere evaluering og repræsenteret som DOX-CL stillads. Mens CL stillads uden DOX (placebo) er udpeget som CL Stillads.
In vitro antibakterielle undersøgelser
Patienter med DW oplever normalt infektioner, der resulterer i langvarig sårheling. Således blev forberedte stilladser undersøgt for deres antibakterielle aktivitet ved hjælp af MIC mod et udvalgt panel af bakterier (Tabel 1). Af resultaterne fremgår det klart, at DOX udviste hæmmende aktivitet med en MIC på <4 μg/mL mod både S. aureus og S. epidermis. Der blev observeret en MIC på <8 μg/mL og <16 μg/mL mod E. coli og P. aeruginosa. Alene chitosan og CL stilladsekstrakt udviste minimal aktivitet mod udvalgte organismer som S. aureus (<64 μg/mL), S. epidermis (<64 μg/mL), E. coli (<128 μg/mL) og P. aeruginosa (<128 μg/mL). DOX-CL stillads har vist lignende hæmmende aktivitet med en MIC på <2 μg/mL mod både S. aureus og S. epidermis. Endvidere udviste DOX-CL stilladset moderate aktiviteter med en MIC på <8 μg/mL mod E. coli og P. aeruginosa.
Undersøgelse af in vitro-biokompatibilitet
MTT assay blev udført for at bestemme cellulær levedygtighed af 3T3-L1 celler i nærværelse af CL og DOX-CL stilladser. Resultaterne var et eksempel på, at CL- og DOX-CL-stilladserne ikke stimulerede nogen cytotoksicitet. Desuden var den cellulære levedygtighed forholdsvis højere i de stilladsbehandlede grupper end i kontrol, hvilket repræsenterer den øgede vækst af fibroblaster i nærværelse af stilladser (figur 4).
Undersøgelser af sårheling i vivo
Det gennemsnitlige sårareal faldt i alle grupperne ved hjælp af den grafiske metode på dag 0, 7, 14 og 21 (Figur 5). Ved visuel undersøgelse var sårene i CL- og DOX-CL-stilladsbehandlede grupper fri for at sive på dag syvende. Samtidig sivede sårene i kontrolgruppen. På dag 14 blev der observeret en tør skorpe i alle grupper; der blev dog observeret en hurtigere sårsammentrækning i DOX-CL stilladset (89.663%). På dag 21 blev 99,9% af såret helet, og der blev dannet et ar i DOX-CL stilladset, mens delvis heling blev observeret i kontrol og CL stillads behandlede grupper.
Histopatologi undersøgelse
Histopatologiske observation af sårheling på dag syvende postinjury udstillet forstyrrelse af alle hudlag i kanterne af såret i alle grupper. Epidermis var ikke synlig. der blev dog observeret fremherskende neutrofiler med intermitterende monocytter og lymfocytter i kontrolgruppen. I CL stilladsbehandlet gruppe blev moderat synlighed af epidermis bemærket sammen med få neutrofiler og makrofager. Mens såret i den DOX-CL stilladsbehandlede gruppe var dækket af et slankt lag af epidermis, der repræsenterer reepitheliseringsfasen. Milde neutrofiler og makrofager, sammen med granulering væv, blev også set oftere i DOX-CL stillads behandlet gruppe.
På dag 14 efter domstiden blev det konstateret, at sår i alle grupper var dækket af epidermis. I kontrolgruppen blev det dannede epidermislag observeret som et meget slankt lag sammen med fremherskende neutrofiler. I cl-stilladsbehandlede gruppe var det dannede epidermis-lag tykkere end i kontrolgruppen sammen med milde multinukleerede massive celler. I dox-CL stilladsbehandlede gruppe, epidermis udviklet var tykkere i forhold til andre grupper, sammen med et rigeligt antal histiocytter og gigantiske multinukleerede celler. Den tætte zone af fibroblaster blev også observeret i DOX-CL stilladsbehandlede gruppe.
På dag 21 postinjury, i kontrolgruppen, et dominerende antal neutrofiler blev reduceret sammen med gentagelse af makrofager og histiocytter, der repræsenterer nedsat inflammation. Mens der i cl stilladsbehandlede gruppe, et moderat antal histocytter og lymfocytter blev observeret. Den epidermis dannet blev observeret at være væsentligt tykkere i DOX-CL stillads behandlet gruppe end dem i kontrolgruppen, sammen med et rigt antal histiocytter, lymfocytter, og massive multinukleerede celler. I den DOX-CL stilladsbehandlede gruppe blev antallet af neutrofiler reduceret på dag 7. Også indsamlingen af makrofager og deres morfologiske varianter såsom multinukleerede massive celler og histiocytter blev bemærket på dag 14 og 21 (Figur 6).
Hydroxyproline-skøn
Hydroxyproline estimering er et indirekte mål for mængden af kollagen til stede i helbredende sår. Højere hydroxyprolinkoncentration angiver en hurtig procentdel af sårheling. Den biokemiske undersøgelse viste en større mængde hydroxyprolin i den DOX-CL stilladsbehandlede gruppe efterfulgt af cl-stilladsbehandlede gruppe end dem i kontrolgruppen (Figur 7).
MMP-9-estimering ved hjælp af Elisa-sættet
MMP-9-indholdet i dox-CL-stilladsbehandlede gruppe blev reduceret betydeligt sammenlignet med dem, der havde kontrollen, og CL-stilladsbehandlet gruppe. Mens MMP-9-indholdet i cl-stilladsbehandlede gruppe var marginalt mindre end indholdet af dox-CL stilladsbehandlede gruppe, som vist i figur 8.
Figur 1: Morfologi af DOX-indlæst COL-CS stillads a) før CL og b) efter CL-bestemmelse af SEM i et skalaområde på 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Matrixforringelse af DOX læsset i NCL- og CL-stilladser fra dag 1 til 7 i PBS pH 7,4 ved 37 °C, hvilket viser, at NCL gradvist er nedbrudt i 7 dage. I modsætning hertil indikerer cl-stilladsforringelseshastigheden, der er reduceret betydeligt, øget modstand mod enzymatisk nedbrydning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:In vitro drug release profil af DOX fra NCL og CL stilladser i PBS pH 7,4 ved 37 ° C viser en langsom frigivelse af narkotika i alle formuleringer efterfulgt af en vedvarende frigivelse. Data udtrykt som middel ± SD (n=3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: 3T3-L1 celler dyrket i nærværelse af CL- og DOX-CL-stilladser, der viser den procentvise cellevækst mere i DOX-CL stilladsbehandlet gruppe efterfulgt af CL stillads behandlet og kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: (a) Billeder, der repræsenterer reduktionen i det gennemsnitlige sårområde i kontrol-, CL-stillads- og DOX-CL-stilladsbehandlede grupper på dag 0, 7, 14 og 21 efter sår. b)Grafisk fremstilling af reduktion i det gennemsnitlige sårområde i kontrol-, CL-stillads- og DOX-CL-stilladsbehandlede grupper på dag 0, 7, 14 og 21 efter sår. Data udtrykkes som middelværdi ± SD (n=6 sår/gruppe). Statistisk signifikans blev opnået ved One Way Analysis of Variance (ANOVA) efterfulgt af Dunnets post hoc-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Histologiske ændringer under sårhelingsprocessen i STZ og fedtrig kostinduceret diabetes i Wistar albino rottehud på dag 7, 14 og 21 uden (kontrol) og med behandling (CL og DOX-CL stilladser) i en excision sårmodel med fuld tykkelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Resultat, der repræsenterer hydroxyprolinindholdet i sår på dag 0, 7, 14 og 21 som en indikator for skøn over indirekte kollagenniveau. Resultaterne udtrykkes i μg hydroxyprolin/ mg tørt sårvæv. Dataene repræsenterer Middelværdien±SD (n=6 sår/gruppe). Statistisk signifikans blev opnået ved One Way Analysis of Variance (ANOVA) efterfulgt af Dunnets post hoc-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Graf, der repræsenterer MMP-9-niveauerne i homogenater opnået fra helede sår i STZ og fedtfattig kostinduceret diabetisk rottemodel på dag 21. Niveauer af MMP-9 blev bestemt i 100 gange aliquots af sårvæsker ved hjælp af ELISA-analyse. Dataene repræsenterer Middelværdi±SD (n=3). Klik her for at se en større version af dette tal.
| MIC (μg/mL) | ||||
| Prøveeksempel | S. aureus | S. Epidermis | E. coli | P. aeruginosa |
| DOX | <4 | <4 | <8 | <16 |
| CS | <64 | <64 | <128 | <128 |
| CL stilladsekstrakt | <64 | <64 | <128 | <128 |
| DOX-CL stilladsekstrakt | <2 | <2 | <4 | <4 |
Tabel 1: Mindste hæmmende koncentration af CS, DOX, CL og DOX-CL Stilladser mod et udvalgt bakteriepanel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedformålet med denne undersøgelse var at bestemme effekten af DOX-indlæst COL-CS stillads på DW-heling hos rotter. CL og NCL blev udarbejdet og evalueret i form af morfologi, hævelse indeks, in vitro frigivelse kinetik, og biokompatibilitet.
Karakterisering af det DOX-indlæste NCL- og CL-stillads
De forberedte stilladser viste sig at være porøse med sammenkoblede porer. Disse sammenkoblede porer sikrer den porøse, svampede natur, der hjælper med korrekt diffusion af ilt og næringsstoffer til cellerne til spredning og migration, hvilket fører til accelereret helbredelse. Her var porestørrelsen hovedsagelig afhængig af krydskoblingen. Krydsning af stilladset resulterede i nedsat porestørrelse ved at danne stærke intramolekylære interaktioner fra EDC/NHS med CS og COL, hvilket øgede stilladsets mekaniske styrke.
Porøsitetsindekset er afhængig af relativ tæthed, som er en funktion af svampestativmassen og volumen. Generelt opstår krympning af stilladsvolumen, hvis et krydslinkingmiddel ændrer stivernes position ved at trække dem tættere på hinanden, hvilket fører til stilladsfortætning. I tilfælde af karbodiimidekemi forventes der imidlertid ikke en stigning i stilladsmassen på grund > af dens unikke mekanisme, dvs. Samtidig kan der under krydsning forekomme mindre massetab på grund af opløsning og migration af ubundne polymerkæder. Ikke desto mindre har amfirfologi ikke haft nogen mærkbar effekt i tilfælde af stilladsbehandling med EDC/NHS.
Stilladsets evne til at absorbere biologisk væske er afgørende for at vurdere dets egnethed som lægemiddelbærer. Vandabsorptionsegenskaben påvirker ikke kun stilladsets form, men påvirker også cellevæksten. Det blev bemærket, at CL-stilladset havde vist en lavere vandabsorptionshastighed end NCL-stilladset, hvilket kan tilskrives stilladsets krydsning. Desuden blev stilladsmaterialets hydrofilicitet reduceret betydeligt efter krydsning på grund af (i) tab af hydrofile grupper (>COOH & NH) i processen med at forbinde dannelse; — hæmning af hævelse ved dannelse af nye bindinger (O=C-NH). Disse resultater er i god overensstemmelse med de tidligere offentliggjorte rapporter 23,24.
Der blev udført en enzymatisk bionedbrydningsundersøgelse ved at overvåge procentdelen af en restmasse efter syv dages inkubation i den simulerede sårvæske på pH 7,4, bestående af lysozymer. NCL stilladset viste en hurtigere nedbrydningshastighed i første omgang i de første tre dage og faldt langsomt i fire på hinanden følgende dage. På den anden side viste CL-stilladset en langvarig nedbrydningshastighed. Krydsklinking af stilladset forbedrede mekaniske egenskaber og netværksstyrke, hvilket igen resulterede i nedsat nedbrydningshastighed, hvilket demonstrerede forbedret modstand mod nedbrydningen.
Drug release undersøgelser blev udført for CL og NCL stilladser i 120 timer. Generelt falder stilladsets lægemiddelfrigivelseskoefficient, efterhånden som krydskoblingstætheden øges på grund af forbedrede sammenkoblinger mellem porerne og nedsat plads mellem polypeptidkæder. Lægemiddelfrigivelseskoefficienten påvirkes også af porøsitetsindekset, vandindholdet, hævelsesindekset og graden af krydslinking. I vores undersøgelse blev 27,92±3,45% og 63,15±3,78% af DOX fra NCL stilladset, mens 16,54±2,21% og 44,43±3,57% af DOX fra CL stilladset blev frigivet ved henholdsvis 1 time og 6 timer. Efter 24 timer var der en frigivelse på 70% af DOX fra NCL stilladset, mens; CL stillads tog mere end 72 timer at frigive 70% af DOX. Resultaterne viste, at stilladset crosslinking omvendt påvirket DOX frigivelse ved at reducere hævelse forholdet og vandindholdet.
In vitro antibakterielle undersøgelser
DOX-CL stilladsekstrakt udviste højere hæmmende aktivitet (MIC) mod gram-positive organismer. Den højere aktivitet af DOX-CL stilladsekstraktet kan skyldes prøvens øgede hydrofobitet. Dox-CL stilladsekstrakt udviste imidlertid minimal aktivitet mod gram-negative organismer, sandsynligvis på grund af cellevægsindtrængningssvigt. Desuden var MIC af DOX-CL forholdsvis højere end CS, CL stillads, og DOX prøver, som kan tilskrives synergistisk aktivitet DOX og CS i DOX-CL ekstrakt.
Undersøgelse af in vitro-biokompatibilitet
In vitro-biokompatibilitetsundersøgelsen blev udført på fibroblalastceller (3T3-L1). Fibroblaster er ansvarlige for produktionen af ECM og proteiner. Desuden spiller de en afgørende rolle i opretholdelsen af strukturel integritet ved at forbedre dannelsen af de rammer, der kræves for sårheling. Resultaterne viser, at DOX-CL stilladset og CL stilladset ikke producerede nogen cellecytotoksicitet. Begge stilladsgrupper blev imidlertid observeret med cellevækst og differentiering af fibroblaster i stilladsporerne, hvilket indikerer, at de forberedte stilladser var biokompatible. Øget cellevækst og differentiering i begge grupper skyldtes hovedsagelig tilstedeværelsen af CS og COL som en ekstracellulær matrix i stilladsstrukturen.
Desuden blev der observeret forholdsvis højere cellevækst med DOX-CL stilladsgruppen end CL-stilladsets på grund af AKTIVERING af PI3K-AKT-signalet af DOX, der er ansvarlig for cellevækst og overlevelse 25.
Undersøgelser af sårheling i vivo
De forskellige komplikationer af DM er ansvarlige for den langvarige helbredelse af DW. For at efterligne den diabetiske tilstand hos rotter blev der givet en fedtrig kost efterfulgt af en intraperitoneal injektion af STZ. Efter 2-3 dages diabetisk bekræftelse blev åbne sår skabt af excision af huden i den dorsale brystregion. Behandlingen blev udført i 21 dage med respektive stilladser. Reduktion i sårområdet blev bestemt for alle grupper på dag 0, 7, 14 og 21. Diabetiske rotter behandlet med DOX-CL stilladset udviste en betydelig grad af sårsammentrækning sammenlignet med CL stilladsgrupper og ubehandlede grupper.
Den inflammatoriske fase af sårheling er ansvarlig for funktionel barrieredannelse. I næste fase fanger den proliferative fase af sårheling opmærksomheden i sårpleje, hvor 43% af reduktionen af sårareal blev observeret med DOX-CL stilladsgruppen. Til sammenligning blev kun 23% og 7% observeret med CL stillads og ubehandlede grupper på henholdsvis dag 7. Fra billederne (Figur 5) blev sammentrækning af såret indledt, efter at den inflammatoriske og proliferative fase er afsluttet. DOX-CL stilladsgruppe udviste betydelig sårsammentrækning på grund af tilstedeværelsen af DOX, som er ansvarlig for de antiinflammatoriske og antiinficerende virkninger. Desuden hjalp COL og CS i stilladset cellespredning, differentiering og migration, hvilket resulterede i 99% af DW-heling på 21 dage.
Ubehandlede ekscisionssår viste neutrofiler, lymfocytter og monocytter på dag 7 efter domsafsigelser. Som tidligere nævnt hjælper neutrofiler med sårdebrider i den tidlige fase af sårheling. Desuden kan overabundance af neutrofiler have en negativ indflydelse på helingsprocessen ved at beskadige det normale væv. Som rapporteret af Dovi et al., et minimalt antal neutrofiler fremskynder re-epitelisering proces 26.
Yderligere, øget makrofager, histiocytter, og massive multinukleerede celler i DOX-CL stillads behandlet gruppe favoriserede miljøet for accelereret sårheling ved at reparere de beskadigede celler og fremme COL syntese. Desuden blev COL-sammenlægning med væv bestemt ved hjælp af hydroxyprolinniveauerne i alle grupper. Der blev imidlertid observeret forholdsvis højere hydroxyprolinniveauer med den DOX-CL stilladsbehandlede gruppe end den ubehandlede og CL stilladsbehandlede gruppe. Som anført i litteraturen hindrer den langvarige inflammatoriske fase i diabetisk tilstand de andre faser af helbredelse. Den hurtigere sårsammentrækning i DOX-CL stilladset kan tilskrives DOX's antiinflammatoriske egenskab, hvilket resulterer i, at de yderligere stadier af såret forekommer i den rette tidsfase, hvilket fører til accelereret sårheling.
Det biokemiske skøn over MMP-9-niveauerne ved hjælp af ELISA-testen viser, at den DOX-CL stilladsbehandlede gruppe udviste reducerede niveauer af MMP-9 sammenlignet med niveauet i CL stillads behandlede og ubehandlede grupper. Ifølge litteraturen, øgede niveauer af MMP-9 ansvarlig for matrix nedbrydning, hvilket igen forlænger sårheling proces. DOX, et antiinflammatorisk middel, hæmmede MMP-9-niveauerne, hvilket betragtes som årsagen til at forhindre COL-nedbrydningen, hvilket resulterer i accelereret DW-heling. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser af Lindeman et al., 2009 og Zhang et al., 2014 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Ashish D Wadhwani. (Adjunkt og leder, Institut for Farmaceutisk Bioteknologi, JSS College of Pharmacy, Ooty, Indien) for at bistå i In vitro celle levedygtighed undersøgelser.
Forfatterne vil gerne takke Institut for Videnskab og Teknologi - Fonden for Forbedring af Videnskab og Teknologi Infrastruktur på universiteter og højere uddannelsesinstitutioner (DST-FIST), New Delhi, for at støtte vores afdeling.
Forfatterne vil også gerne takke Mr. Sanju. S og Mr. Sriram. Narukulla M. Pharm studerende for deres støtte i videooptagelsen.
Denne forskning blev støttet af JSS Academy of Higher Education &Research (JSSAHER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
