Summary
De voorbereide DOX-CL steiger voldeed aan de vereisten van een ideaal DW-verband in mechanische sterkte, porositeit, waterabsorptie, afbraaksnelheid, aanhoudende afgifte, antibacteriële, biocompatibiliteit en ontstekingsremmende eigenschappen, die als essentieel worden beschouwd voor het herstel van beschadigd weefsel in DWs.
Abstract
Een belangrijke complicatie van diabetes mellitus zijn diabetische wonden (DW). De langdurige fase van ontsteking bij diabetes belemmert de verdere stadia van een verwonding die leidt tot vertraagde wondgenezing. We selecteerden doxycycline (DOX), als een potentieel medicijn naar keuze, vanwege de antibacteriële eigenschappen samen met de gerapporteerde ontstekingsremmende eigenschappen. De huidige studie is gericht op het formuleren van DOX geladen collageen-chitosan niet-gekruiste (NCL) & crosslinked (CL) steigers en evalueren van hun genezingsvermogen bij diabetische aandoeningen. Het karakteriseringsresultaat van steigers laat zien dat de DOX-CL steiger een ideale porositeit, een lage zwelling & afbraaksnelheid en een aanhoudende afgifte van DOX heeft in vergelijking met de DOX-NCL steiger. De in vitro studies tonen aan dat de DOX-CL steiger biocompatibel was en de celgroei verbeterde in vergelijking met cl steiger behandelde en controlegroepen. De antibacteriële studies hebben aangetoond dat de DOX-CL steiger effectiever was dan de CL steiger tegen de meest voorkomende bacteriën gevonden in DW. Met behulp van het streptozotocine en vetrijke dieet-geïnduceerde DW model, een significant (p≤0.05) snellere snelheid van wondcontractie in de DOX-CL steiger behandelde groep werd waargenomen in vergelijking met die in CL steiger behandelde en controlegroepen. Het gebruik van de DOX-CL steiger kan een veelbelovende aanpak blijken te zijn voor lokale behandeling voor DW's.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) is een aandoening waarbij het falen van het lichaam om insuline af te leveren of te reageren op de resultaten ervan bij abnormale vertering van ongecompliceerde suikers een toename van de bloedglucose 1tot gevolg heeft . De meest opeenvolgende en verpletterende verstrengeling van DM is de diabetische wond (DW). Ongeveer 25% van de patiënten met DM heeft de mogelijkheid om een DW op te bouwen in hun leven 1. De gehinderde genezing van DW is geaccrediteerd voor een triopathie van DM: immunopathie, vasculopathie en neuropathie. Wanneer DW onbehandeld blijft, kan dit leiden tot de ontwikkeling van gangreen, waardoor het betrokken orgaan wordt verwijderd 2.
Tal van behandelingen, zoals het instrueren van de patiënten (de wond dagelijks inspecteren, de wond reinigen, activiteiten vermijden die druk op de wond creëren, periodieke glucosecontrole, enz.), het beheersen van hun bloedglucose, wonddebridement, drukaflossing, medische procedure, hyperbare zuurstoftherapie en geavanceerde therapieën zijn in de praktijk 3,4. De meeste van deze geneesmiddelen voldoen niet aan alle voorwaarden die van vitaal belang zijn voor DW-zorg in het licht van de multifactoriële pathofysiologische aandoeningen en onverwachte uitgaven in verband met deze geneesmiddelen 5. Hoewel de DW pathogenese multifactorieel is, wordt de aanhoudende ontsteking met ongepast weefselbeheer verklaard als de werkelijke reden voor vertraagde genezing in DWs 5,6.
Verhoogde niveaus van inflammatoire en pro-inflammatoire mediatoren in DW resulteren in verminderde groeifactoren die verantwoordelijk zijn voor vertraagde wondgenezing 2,6. Onjuiste vorming van extracellulaire matrix (ECM) in DWs is geaccrediteerd voor verhoogde niveaus van matrix metalloproteinases (MMP's) die verantwoordelijk zijn voor de snelle afbraak van gevormde ECM. In MMP's wordt MMP-9 gerapporteerd als een belangrijke intermediair die verantwoordelijk is voor langdurige ontsteking en snelle ECM-afbraak 7. Er wordt gesteld dat lokale behandeling met een ontstekingsremmend geneesmiddel dat de verhoogde niveaus van MMP-9 verlaagt, cutane homeostase, kaderregeling en een betere genezing van DWs 8,9opnieuw vaststelt .
Doxycycline (DOX), een MMP-9-remmer, werd gekozen om de verhoogde niveaus van MMP-9 te onderdrukken, een belangrijke ontstekingsbemiddelaar die verantwoordelijk is voor aanhoudende ontsteking in DWs 10,11,12. Bovendien bezit DOX antioxidant (produceren vrije hydroxy- en fenoxyradicalen die zich kunnen binden met reactieve zuurstofsoorten) 13 en anti-apoptotisch (remmen caspaseexpressie en mitochondriale stabilisatie) 14 activiteiten die essentieel zijn voor de behandeling van DW. Er is gekozen voor de opstelling van kaders die DOX, collageen (COL) en chitosan (CS) bevatten. De keuze van COL hangt af van de manier waarop het helpt bij het bieden van het noodzakelijke kader dat verantwoordelijk is voor mechanische sterkte en weefselregeneratie 15. Aan de andere kant is CS structureel homologe glycosaminoglycan, geassocieerd met verschillende wondgenezingsfasen. Er wordt ook gemeld dat CS een significante antibacteriële eigenschap heeft 15. Daarom is de COL/CS steiger van DOX geformuleerd om de langdurige ontsteking te onderdrukken, gevolgd door het ondersteunen van de matrixvorming voor succesvolle wondgenezing in DM-omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle uitgevoerde dierprocedures werden goedgekeurd door de institutionele ethische commissie voor dieren van het JSS College of Pharmacy, Ooty, India.
1. Bereiding van dox geladen poreuze steigers door vriesdroogmethode
- Voeg 1,2 g COL toe aan 100 ml water (bijv. Millipore) en houd apart voor zwelling.
- Roer de gezwollen COL-dispersie 's nachts bij 2000 tpm om volledige oplossing van COL te garanderen.
- Bereid CS-oplossing door ongeveer 0,8 g CS op te lossen in 100 ml 1% azijnzuur.
- Roer de CS-oplossing 's nachts bij 2000 tpm om een gelijkmatige dispersie te garanderen.
- Meng DOX (1% w/v), gevolgd door CS-oplossing, tot de COL-oplossing en roer gedurende 30 min.
- Filtreer het verkregen fysische mengsel met een mousselinedoek om de deeltjes te verwijderen.
- Vries het verkregen filtraat gedurende ongeveer 24 uur in bij -85 °C ± 4 °C.
- Lyophiliseer het diepvriesmengsel bij -85 °C ± 4 °C gedurende 72 uur.
- Bewaar de verkregen steigers in een desiccator voor verdere analyse 16,17.
2. Crosslinking van steiger
- Los MES (0,488 g) op in 50 ml water.
- Week 50 mg van de DOX-geladen steiger gedurende 30 minuten in 20 ml van de MES-buffer.
- Meng 19,5 ml MES-buffer met 0,1264 g EDC en 0,014 g NHS in een apart bekerglas.
- Dompel de steiger gedurende 4 uur onder in het buffermengsel om crosslinking te bereiken 16.
- Bewaar de DOX geladen crosslinked (CL) en niet-gekruiste steigers (NCL) voor verdere evaluatie.
3. Karakterisering van steigers
- Morfologisch onderzoek met behulp van een scanning elektronenmicroscopie (SEM)
- Karakteriseer de steigers voor morfologische analyse met behulp van SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
- Bevlek de doorsnede en het buitenoppervlak van de steiger met de delicate laag goud (~ 150 Å).
- Leg het fotografische beeld vast bij de excitatiespanning van 5 kV en 10 kV.
- Plaats de monsters in aluminium stubs en omsluit ze met het goud op ongeveer 9 V.
- Meet de steiger met SEM met de verhoogde resolutie bij 10 kV.
- Porositeitsbepaling
- Meet de porositeit van de steigers met behulp van de vloeistofverplaatsingsmethode (ethanol) 18.
- Bereken de porositeit van de steigers met behulp van de onderstaande formules.
Ww = Nat gewicht van de steiger
Wd = Drooggewicht van de steiger
Wv = Volume van de steiger
- Bepalen van het waterabsorptievermogen
- Meet het droge gewicht van de steiger.
- Incubeer de gewogen steiger bij 37 °C gedurende 24 uur in fosfaatbufferoplossing (PBS) pH 7,4.
- Verwijder de overtollige PBS over de steiger met filterpapier.
- Meet het waterabsorptievermogen met behulp van de onderstaande formules 17.
WS = Percentage waterabsorptie
W1=Nat gewicht van de steiger
W0= Drooggewicht van de steiger
- Steigerdegradatie
- Incubeer de steiger (1cm x 1cm) bij 37 °C gedurende 7 dagen in een PBS van pH 7,4 die lysozymen bevat.
- Was de steiger om eventuele aanhechtingsionen op het oppervlak te verwijderen.
- Vries de gewassen steiger in 17.
- Bereken de afbraaksnelheid met behulp van formules.
Ww = Begingewicht van de steiger
Wd = Gewicht van de steiger na vriesdrogen
-
In vitro release studies
- Bepaal het afgiftegedrag van de DOX van de steiger met behulp van de dialysezakmethode.
- Verdeel de steiger in een paar milliliter gesimuleerd wondvocht (pH 7,4) en breng het over in een dialysezak.
- Sluit de uiteinden van de membraanzak goed en dompel onder in de 500 ml gesimuleerde wondvloeistofoplossing.
- Roer de wondvloeistofoplossing met de dialysezak bij 200-250 tpm.
- Verzamel de supernatantoplossing en vervang deze met een gelijke hoeveelheid verse bufferoplossing met bepaalde tijdsintervallen.
- Bepaal het percentage DOX-afgifte van de steigers in de supernatantoplossing met behulp van een UV-zichtbare spectrometer bij 240 nm.
4. In vitro antibacteriële studies
- Bepaal de minimale remmende concentratie (MIC) van de CL- en DOX-CL-steigers tegen de S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa met behulp van de microbouillonverdunningsmethode.
- Bereid de bacterieculturen voor met Mueller-Hinton bouillon in een verhouding van 1:1000 om 0,5 McFarland troebelheid te verkrijgen.
- Voeg D-glucose (800 mg/dl) toe aan de bacterieculturen voor hyperglycatie 19,20.
- Gehakt en solubiliseer de CL en DOX-CL in DMSO (negatieve controle).
- Verdun de hyperglycated bacteriële suspensie (100 μL) en testmonsters (100 μL steigeroplossing) in 96 putplaat.
- Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 20-24 uur.
- Neem de absorptie op bij een golflengte van 600 nm 21.
5. In vitro biocompatibiliteitsstudies
- Evalueer de biocompatibiliteit van de voorbereide steigers met behulp van MTT [(3-(4, 5 dimethylthiozol-2 yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromide)] test.
- Steriliseer de steigers van standaard afmeting en plaats ze in 24 putplaten.
- Voeg 3T3-L1 cellen toe aan de 24 putplaat en bebroed gedurende 72 uur.
6. In vivo dierproeven
- Inductie van DM en excisiewond
- Voed het dier gedurende twee weken met een vetrijk dieet en dien een enkele dosis streptozotocine (STZ) (50 mg/kg lichaamsgewicht) in citraatbufferoplossing intraperitoneaal toe aan Wistar albinoratten (180-200 g) voor de inductie van diabetes type 2.
- Kies de dieren met een constante bloedglucose van 250 mg/dl voor het onderzoek.
- Randomiseer de geselecteerde dieren voor de inductie van excisiewonden.
- Verdoof de diabetische ratten met behulp van diethylether (5 ml werd toegevoegd aan de eerder verzadigde anesthesiekamer) en bevestig met behulp van de teenknijpmethode en slijmvlieskleur.
- Scheer het dorsale gebied (dorsale thoracale, lumbale regio) met behulp van een aseptische trimmer en messen (A40).
- Steriliseer het geschoren gebied met een alcoholisch wattenstaafje.
- Verwijder de huid (2 x 2 cm2 en een diepte van 1 mm) met een aseptisch chirurgisch A40-mes op het geschoren gebied om een open wond te creëren.
- Verdeel de dieren in drie groepen (Groep 1- Ziektebestrijding (Controle), Groep 2- CL steiger (Placebo), Groep 3- DOX CL steiger), elke groep bestaande uit 6 ratten.
- Breng de CL- en DOX CL-steigers aan met behulp van chirurgische tape en bedek de controlegroep gedurende 21 dagen met steriel gaas.
- Traceer het wondgebied op een steriel OHP-vel en meet de procentuele vermindering van de wond met behulp van de rastermethode op dag 0, 7, 14 en 21 voor alle groepen.
- Bereken het percentage wondreductie met behulp van de onderstaande formules.
7. Histopathologische studies
- Isoleer het genezen wondgebied op dag 7, 14 en 21, bewaar in formalineoplossing (10%).
- Doorsnede van de weefsels met behulp van een microtome om een dikte van 6 μm te verkrijgen.
- Monteer de secties op een glazen glijbaan en vlek met Hematoxyline en eosine 17.
- Leg de beelden vast onder 40x vergroting met behulp van een digitale microscoop.
8. Hydroxyproline schatting
- Isoleer het genezen wondgebied op dag 0, 7, 14 en 21 voor evaluatie.
- Schatting van het hydroxyprolinegehalte volgens de procedure beschreven door Reddy G et al., 1996 22.
9. Elisa-test
- Schat de MMP-9-niveaus met behulp van de Elisa-kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Isoleer de weefselmonsters van het genezen wondgebied op dag 21 en gehakt met behulp van een weefselhomogenisator.
- Centrifugeer het verkregen homogenaat en verzamel het supernatant.
- Verdun het supernatant 100 keer met behulp van een testbuffer.
- Scan de plaat met een meervoudige plaatlezer.
10. Statistische analyse
- Vertegenwoordig de verkregen resultaten als Gemiddelde ± SD.
- Voer de statistische analyse uit met behulp van Graph pad prisma v5.01.
- Bereik de statistische significantie met behulp van One Way Analysis of Variance (ANOVA) en Dunnet's post hoc test.
- Beschouw de waarden met p≤0,05 als significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering van de DOX geladen NCL en CL steiger
Bij visueel onderzoek bleek de NCL- en CL-steiger crème van kleur te zijn. Bovendien lijken beide steigers op een spons, stijf en inelastisch wanneer ze fysiek worden onderzocht. Sem-afbeeldingen van de NCL- en CL-steigers zijn weergegeven in figuur 1. Uit de figuur bleek duidelijk dat er een afname was in poriegrootte na crosslinking door het vormen van intermoleculaire verbindingen. Ook bleken de porositeit van de NCL- en CL-steigers respectievelijk 92,3±4,21 en 71,35±2,65 te zijn. Het percentage waterabsorptie van de NCL- en CL-steigers was 750±11,4% en 492±8,66% bij tijdsintervallen van 24 uur.
Bovendien werden gedurende zeven dagen biodegradatiestudies uitgevoerd in het gesimuleerde wondvocht van pH 7,4, bestaande uit lysozymen. De NCL-steiger vertoonde aanvankelijk in de eerste drie dagen een snellere degradatiesnelheid en daalde vier opeenvolgende dagen langzaam. Aan de andere kant vertoonde de CL-steiger een langdurige degradatiesnelheid. Crosslinking van de steiger verbeterde mechanische eigenschappen en netwerksterkte die op hun beurt resulteerden in een verminderde degradatiesnelheid, wat wijst op een verbeterde weerstand tegen degradatie (figuur 2).
Verder werd de in vitro afgifte van DOX uit NCL- en CL-steigers gedurende 120 uur uitgevoerd (figuur 3). In de eerste 1 uur kwam 27,92±3,45% DOX vrij uit de NCL-steiger, terwijl slechts 16,54±2,21% DOX werd vrijgegeven van de CL-steiger. Na 6 uur steeg de DOX-release van de steigers met 63,15±3,78% in de NCL-steiger en 44,43±3,57% in CL-steigers. Na 24 uur was er een release van 70% DOX van de NCL-steiger, terwijl CL-steiger meer dan 72 uur nodig had om 70% van de DOX vrij te geven. Op basis van de verkregen resultaten werd de DOX-geladen CL-steiger geselecteerd voor verdere evaluatie en weergegeven als DOX-CL-steiger. Terwijl CL steiger zonder DOX (placebo) is aangeduid als CL Scaffold.
In vitro antibacteriële studies
Patiënten met DW ervaren meestal infecties die leiden tot langdurige wondgenezing. Zo werden voorbereide steigers onderzocht op hun antibacteriële activiteit met behulp van het MIC tegen een geselecteerd panel van bacteriën (Tabel 1). Uit de resultaten blijkt duidelijk dat DOX remmende activiteit vertoonde met een MIC van <4 μg/ml tegen zowel S. aureus als S. epidermis. Een MIC van <8 μg/ml en <16 μg/ml werd waargenomen tegen E. coli en P. aeruginosa. Alleen chitosan en CL steigerextract vertoonden minimale activiteit tegen geselecteerde organismen zoals S. aureus (<64 μg/ml), S. epidermis (<64 μg/ml), E. coli (<128 μg/ml) en P. aeruginosa (<128 μg/ml). DOX-CL steiger heeft een vergelijkbare remmende activiteit vertoond met een MIC van <2 μg/ml tegen zowel S. aureus als S. epidermis. Verder vertoonde de DOX-CL steiger matige activiteiten met een MIC van <8 μg/ml tegen E. coli en P. aeruginosa.
In vitro biocompatibiliteitsonderzoek
MTT-test werd uitgevoerd om de cellulaire levensvatbaarheid van 3T3-L1-cellen te bepalen in aanwezigheid van CL- en DOX-CL-steigers. De resultaten illustreerden dat de CL- en DOX-CL-steigers geen cytotoxiciteit stimuleerden. Bovendien was de cellulaire levensvatbaarheid in de met steigers behandelde groepen relatief hoger dan in controle, wat de toegenomen groei van fibroblasten in aanwezigheid van steigers vertegenwoordigt (figuur 4).
In vivo wondgenezingsstudies
Het gemiddelde wondgebied daalde in alle groepen met behulp van de grafische methode op dag 0, 7, 14 en 21 (figuur 5). Bij visueel onderzoek waren de wonden in de cl- en DOX-CL-steigerbehandelde groepen op dag zevende vrij van sijpelen. Tegelijkertijd sijpelden de wonden in de controlegroep uit. Op dag 14 werd in alle groepen een droge korst waargenomen; in de DOX-CL steiger werd echter een snellere mate van wondcontractie waargenomen (89,663%). Op dag 21 werd 99,9% van de wond genezen en werd een litteken gevormd in de DOX-CL steiger, terwijl gedeeltelijke genezing werd waargenomen in controle- en CL-steigerbehandelde groepen.
Histopathologie studie
Histopathologische observatie van wondgenezing op dag zeven postinjury vertoonde verstoring van alle huidlagen aan de randen van de wond in alle groepen. Er was geen zicht op de opperhuid; in de controlegroep werden echter overheersende neutrofielen met intermitterende monocyten en lymfocyten waargenomen. In cl steiger behandelde groep, werd de gematigde zichtbaarheid van epidermis opgemerkt samen met weinig neutrofielen en macrofagen. Terwijl in de met DOX-CL steiger behandelde groep de wond was bedekt met een dunne laag van de epidermis, die de fase van reepithelisatie vertegenwoordigde. Milde neutrofielen en macrofagen, samen met granulatieweefsel, werden ook vaker gezien in de dox-cl steiger behandelde groep.
Op dag 14 na het letsel bleken wonden in alle groepen bedekt te zijn met epidermis. In de controlegroep werd waargenomen dat de gevormde epidermislaag een zeer slanke laag was, samen met de geprevaleerde neutrofielen. In de cl steiger behandelde groep, de epidermis laag gevormd was dikker dan die in de controlegroep, samen met milde multinucleated massieve cellen. In de dox-cl steiger behandelde groep, de epidermis ontwikkeld was dikker in vergelijking met andere groepen, samen met een overvloedig aantal histiocyten en gigantische multinucleated cellen. De dichte zone van fibroblasten werd ook waargenomen in de dox-cl steiger behandelde groep.
Op dag 21 postinjury, in de controlegroep, werd een dominant aantal neutrofielen verminderd, samen met recidief van macrofagen en histiocyten die de verminderde ontsteking vertegenwoordigen. Terwijl in de cl-steiger behandelde groep een matig aantal histocyten en lymfocyten werd waargenomen. De gevormde epidermis werd waargenomen om wezenlijk dikker in de dox-CL steiger behandelde groep dan die in de controlegroep te zijn, samen met een rijk aantal histiocyten, lymfocyten, en massieve multinucleated cellen. In de dox-cl steiger behandelde groep, werd het aantal neutrofielen verminderd op dag 7. Ook het verzamelen van macrofagen en hun morfologische varianten zoals multinucleated massieve cellen en histiocyten werden opgemerkt op dag 14 en 21 (Figuur 6).
Hydroxyproline schatting
Hydroxyproline schatting is een indirecte maat voor de hoeveelheid collageen aanwezig in helende wonden. Hogere hydroxyprolineconcentratie duidt op een snel percentage wondgenezing. Uit het biochemisch onderzoek is gebleken dat de met DOX-CL-steiger behandelde groep een grotere hoeveelheid hydroxyproline heeft, gevolgd door de met CL-steigers behandelde groep dan die in de controlegroep (figuur 7).
MMP-9 schatting met behulp van de Elisa kit
Het MMP-9-gehalte in de dox-cl-met steigers behandelde groep was aanzienlijk verminderd in vergelijking met de groep die de controle had, en cl-steigerbehandelde groep. Terwijl het MMP-9-gehalte in de cl-met steigers behandelde groep iets minder was dan dat van de met DOX-CL-steiger behandelde groep , zoals blijkt uit figuur 8.
Figuur 1: Morfologie van DOX geladen COL-CS steiger a) vóór CL en b) na CL bepaling door SEM op een schaalbereik van 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Matrixdegradatie van DOX geladen in NCL- en CL-steigers van dag 1 tot 7 in PBS pH 7,4 bij 37 °C, waarbij NCL gedurende 7 dagen geleidelijk afdrijfde. In tegenstelling tot dit, de CL steiger degradatie tarief aanzienlijk verminderd duidt op een verhoogde weerstand tegen enzymatische degradatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: In vitro drug release profiel van DOX uit NCL en CL steigers in PBS pH 7,4 bij 37° C met een langzame afgifte van geneesmiddel in alle formulering gevolgd door een aanhoudende afgifte. Gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n=3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: 3T3-L1 cellen gekweekt in aanwezigheid van CL en DOX-CL steigers die een procentuele celgroei meer laten zien in dox-cl steiger behandelde groep gevolgd door CL steiger behandeld en controle. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: (a) Afbeeldingen die de vermindering van het gemiddelde wondgebied in de controle-, CL-steiger- en DOX-CL-steigerbehandelde groepen op dag 0, 7, 14 en 21 na de wond vertegenwoordigen. b) Grafische weergave van de vermindering van het gemiddelde wondgebied in de controlegroepen, cl-steiger en dox-cl-steigerbehandelde groepen op dag 0, 7, 14 en 21 na het verwonden. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n=6 wonden/groep). Statistische significantie werd verkregen door One Way Analysis of Variance (ANOVA) gevolgd door Dunnet's post hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Histologische veranderingen tijdens het wondgenezingsproces bij STZ en vetrijke dieet-geïnduceerde diabetes in wistar albino rattenhuid op dag 7, 14 en 21 zonder (controle) en met behandeling (CL en DOX-CL steigers) in een volledige dikte excisie wondmodel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Resultaat dat het hydroxyprolinegehalte in wonden op dag 0, 7, 14 en 21 weergeeft als indicator voor de schatting van het indirecte collageengehalte. De resultaten worden uitgedrukt in μg hydroxyproline/mg droog wondweefsel. De gegevens vertegenwoordigen de Mean±SD (n=6 wonden/groep). Statistische significantie werd verkregen door One Way Analysis of Variance (ANOVA) gevolgd door Dunnet's post hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Grafiek die de MMP-9-niveaus weergeeft in homogenaten verkregen uit genezen wonden in STZ en vetrijk dieet-geïnduceerd diabetisch rattenmodel op dag 21. De MMP-9-spiegels werden bepaald in 100-voudige aliquots wondvloeistoffen met behulp van ELISA-analyse. De gegevens vertegenwoordigen Mean±SD (n=3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| MIC (μg/ml) | ||||
| Testmonster | S. aureus | S. epidermis | E. Coli | P. aeruginosa |
| DOX | <4 | <4 | <8 | <16 |
| CS | <64 | <64 | <128 | <128 |
| CL steiger extract | <64 | <64 | <128 | <128 |
| DOX-CL steigerextract | <2 | <2 | <4 | <4 |
Tabel 1: Minimale remmende concentratie CS-, DOX-, CL- en DOX-CL-steigers tegen een geselecteerd panel van bacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste doel van deze studie was om het effect van DOX geladen COL-CS steiger op DW genezing bij ratten te bepalen. CL en NCL werden voorbereid en geëvalueerd in termen van morfologie, zwellingsindex, kinetiek in vitro afgifte en biocompatibiliteit.
Karakterisering van de DOX geladen NCL en CL steiger
De voorbereide steigers bleken poreus te zijn met onderling verbonden poriën. Deze onderling verbonden poriën verzekeren de poreuze, sponsachtige aard die helpt bij de juiste verspreiding van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen voor proliferatie en migratie, wat leidt tot versnelde genezing. Hier was de poriegrootte vooral afhankelijk van de crosslinking. Crosslinking van de steiger resulteerde in een verminderde poriegrootte door sterke intramoleculaire interacties te vormen door EDC/NHS met CS en COL, waardoor de mechanische sterkte van de steiger werd verhoogd.
De porositeitsindex is afhankelijk van de relatieve dichtheid, wat een functie is van de massa van sponsveren en volume. Over het algemeen treedt krimp van het steigervolume op als een crosslinking-agent de positie van de stutten verandert door ze dichter bij elkaar te slepen, wat leidt tot steigerverdichting. In het geval van carbodiimidechemie wordt echter geen toename van de massa van steigers verwacht vanwege het unieke mechanisme, d.w.z. de introductie van amidekoppeling (O = C-NH) met behulp van carboxyl (>COOH) en amine (-NH) groep van aangrenzende peptideketen zonder in de steiger te komen. Tegelijkertijd kan tijdens crosslinking een klein massaverlies optreden als gevolg van het oplossen en migreren van niet-gebonden polymeerketens. In het geval van steigerbehandeling met EDC/NHS had dit echter geen merkbaar effect op de steigermorfologie.
Het vermogen van de steiger om biologische vloeistof te absorberen is cruciaal bij het evalueren van de geschiktheid ervan als medicijndrager. De waterabsorptie-eigenschap heeft niet alleen invloed op de vorm van de steiger, maar heeft ook invloed op de celgroei. Er werd opgemerkt dat de CL-steiger een lagere waterabsorptiesnelheid had vertoond dan de NCL-steiger, wat kan worden toegeschreven aan de kruiskoppeling van de steiger. Bovendien werd de hydrofieliteit van steigermateriaal aanzienlijk verminderd na crosslinking als gevolg van (i) verlies van hydrofiele groepen (>COOH & -NH) tijdens de vorming van amidekoppeling; ii) remming van zwelling door de vorming van nieuwe bindingen (O=C-NH). Deze resultaten zijn in goede overeenstemming met de eerder gepubliceerde rapporten 23,24.
Een enzymatische biodegradatiestudie werd uitgevoerd door het percentage van een restmassa na zeven dagen incubatie te controleren in het gesimuleerde wondvocht van pH 7,4, bestaande uit lysozymen. De NCL-steiger vertoonde aanvankelijk in de eerste drie dagen een snellere degradatiesnelheid en daalde vier opeenvolgende dagen langzaam. Aan de andere kant vertoonde de CL-steiger een langdurige degradatiesnelheid. Crosslinking van de steiger verbeterde mechanische eigenschappen en netwerksterkte die op hun beurt resulteerden in een verminderde degradatiesnelheid, wat een verbeterde weerstand tegen degradatie aantoonde.
Geneesmiddelenafgiftestudies werden uitgevoerd voor CL- en NCL-steigers gedurende 120 uur. Over het algemeen neemt de afgiftecoëfficiënt van het steigergeneesmiddel af naarmate de crosslinkingdichtheid toeneemt als gevolg van verbeterde verbindingen tussen de poriën en verminderde ruimte tussen polypeptideketens. De afgiftecoëfficiënt van het geneesmiddel wordt ook beïnvloed door de porositeitsindex, het watergehalte, de zwellingsindex en de mate van crosslinking. In onze studie werd 27,92±3,45% en 63,15±3,78% van dox uit de NCL-steiger, terwijl 16,54±2,21% en 44,43±3,57% van dox uit de CL-steiger werd vrijgegeven om respectievelijk 1 uur en 6 uur. Na 24 uur kwam er 70% DOX vrij van de NCL-steiger, terwijl; CL steiger duurde meer dan 72 uur om 70% van de DOX vrij te geven. De resultaten toonden aan dat de steiger crosslinking omgekeerd de DOX-afgifte beïnvloedde door de zwellingsverhouding en het watergehalte te verlagen.
In vitro antibacteriële studies
DOX-CL steigerextract vertoonde een hogere remmende activiteit (MIC) tegen grampositieve organismen. De hogere activiteit van het DOX-CL steigerextract kan te maken hebben met de verhoogde hydrofobiciteit van het monster. Dox-CL steigerextract vertoonde echter minimale activiteit tegen gramnegatieve organismen, waarschijnlijk als gevolg van penetratie van de celwand. Verder was de MIC van DOX-CL relatief hoger dan CS-, CL-steiger- en DOX-monsters, wat kan worden toegeschreven aan de synergetische activiteit van DOX en CS in het DOX-CL-extract.
In vitro biocompatibiliteitsonderzoek
Het in vitro biocompatibiliteitsonderzoek werd uitgevoerd op fibroblastcellen (3T3-L1). Fibroblasten zijn verantwoordelijk voor de productie van ECM en eiwitten. Verder spelen ze een cruciale rol bij het handhaven van structurele integriteit door de vorming van het kader dat nodig is voor wondgenezing te verbeteren. De resultaten tonen aan dat de DOX-CL steiger en CL steiger geen celcytotoxiciteit hebben opgeleverd. Beide steigergroepen werden echter waargenomen met de celgroei en differentiatie van fibroblasten in de steigerporiën, wat aangeeft dat de voorbereide steigers biocompatibel waren. Verhoogde celgroei en differentiatie in beide groepen waren voornamelijk te wijten aan de aanwezigheid van CS en COL als een extracellulaire matrix in de steigerstructuur.
Bovendien werd een relatief hogere celgroei waargenomen bij de DOX-CL-steigergroep dan die van de CL-steiger als gevolg van activering van het PI3K-AKT-signaal door DOX, verantwoordelijk voor celgroei en overleving 25.
In vivo wondgenezingsstudies
De verschillende complicaties van DM zijn verantwoordelijk voor de langdurige genezing van DW. Om de diabetische aandoening bij ratten na te bootsen, werd een vetrijk dieet gegeven, gevolgd door een intraperitoneale injectie met STZ. Na 2-3 dagen diabetische bevestiging werden open wonden gecreëerd door de excisie van de huid in het dorsale thoracale gebied. De behandeling werd gedurende 21 dagen uitgevoerd met respectievelijke steigers. Vermindering van het wondgebied werd bepaald voor alle groepen op dag 0, 7, 14 en 21. Diabetische ratten behandeld met de DOX-CL steiger vertoonden een significante mate van wondcontractie in vergelijking met CL-steigergroepen en onbehandelde groepen.
De ontstekingsfase van wondgenezing is verantwoordelijk voor functionele barrièrevorming. In de volgende fase trekt de proliferatieve fase van wondgenezing de aandacht in de wondverzorging, waarbij 43% van de wondgebiedsreductie werd waargenomen met de DOX-CL steigergroep. Ter vergelijking: slechts 23% en 7% werden waargenomen met CL-steigers en onbehandelde groepen op respectievelijk dag 7. Uit de afbeeldingen (figuur 5) is de samentrekking van de wond geïnitieerd nadat de ontstekings- en proliferatieve fase is voltooid. DOX-CL steigergroep vertoonde een significante wondcontractie als gevolg van de aanwezigheid van DOX, dat verantwoordelijk is voor de ontstekingsremmende en anti-infectieuze effecten. Bovendien hielpen COL en CS in de steiger bij celproliferatie, differentiatie en migratie, wat resulteerde in 99% van dw-genezing in 21 dagen.
Onbehandelde excisionele wonden vertoonden neutrofielen, lymfocyten en monocyten op dag 7 postinjury. Zoals eerder vermeld, helpen neutrofielen bij wonddebridement in het vroege stadium van wondgenezing. Bovendien kan de overdaad aan neutrofielen het genezingsproces negatief beïnvloeden door het normale weefsel te beschadigen. Zoals gemeld door Dovi et al., versnelt een minimaal aantal neutrofielen het re-epithelialisatieproces 26.
Verder gaven verhoogde macrofagen, histiocyten en massieve multinucleated cellen in de dox-CL steiger behandelde groep de voorkeur aan de omgeving voor versnelde wondgenezing door de beschadigde cellen te herstellen en de COL-synthese te bevorderen. Bovendien werd col-samensmelting met weefsel bepaald met behulp van de hydroxyprolineniveaus in alle groepen. Bij de met DOX-CL-steiger behandelde groep werden echter relatief hogere hydroxyprolinespiegels waargenomen dan bij de onbehandelde en cl-steigerbehandelde groep. Zoals vermeld in de literatuur, belemmert de langdurige ontstekingsfase in de diabetische aandoening de andere fasen van genezing. De snellere snelheid van wondcontractie in de DOX-CL steiger kan worden toegeschreven aan de ontstekingsremmende eigenschap van DOX, wat resulteert in de verdere stadia van de wond die optreden in de juiste tijdsfase, wat leidt tot versnelde wondgenezing.
Uit de biochemische schatting van de MMP-9-niveaus met behulp van de ELISA-test blijkt dat de met DOX-CL-steiger behandelde groep verlaagde niveaus van MMP-9 vertoonde in vergelijking met die in cl-steigerbehandelde en onbehandelde groepen. Volgens de literatuur, verhoogde niveaus van MMP-9 verantwoordelijk voor matrix degradatie, die op zijn beurt, verlengt het wondgenezingsproces. DOX, een ontstekingsremmend middel, remde de MMP-9-niveaus, wat wordt beschouwd als de reden om de COL-afbraak te voorkomen, wat resulteert in versnelde DW-genezing. Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerder gepubliceerde studies van Lindeman et al., 2009 en Zhang et al., 2014 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs danken Dr. Ashish D Wadhwani. (Universitair docent en hoofd van de afdeling farmaceutische biotechnologie, JSS College of Pharmacy, Ooty, India) voor het assisteren bij in vitro cel levensvatbaarheidsstudies.
De auteurs willen het Department of Science and Technology - Fund for Improvement of Science and Technology Infrastructure in Universities and Higher Educational Institutions (DST-FIST), New Delhi, bedanken voor het ondersteunen van onze afdeling.
De auteurs willen ook Mr. Sanju bedanken. S en Mr Sriram. Narukulla M. Pharm studenten voor hun steun in de videoshoot.
Dit onderzoek werd ondersteund door de JSS Academy of Higher Education &Research (JSSAHER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
