Summary
Det forberedte DOX-CL stillaset tilfredsstilte forutsetningene for en ideell DW-dressing i mekanisk styrke, porøsitet, vannabsorpsjon, nedbrytningshastighet, vedvarende frigjøring, antibakteriell, biokompatibilitet og antiinflammatoriske egenskaper, som anses å være avgjørende for utvinning av skadet vev i DWs.
Abstract
En stor komplikasjon av diabetes mellitus er diabetiske sår (DW). Den langvarige fasen av betennelse i diabetes hindrer de videre stadiene av en skade som fører til forsinket sårheling. Vi valgte doxycyklin (DOX), som et potensielt medikament av valg, på grunn av dets antibakterielle egenskaper sammen med de rapporterte antiinflammatoriske egenskapene. Den nåværende studien tar sikte på å formulere DOX lastet kollagen-chitosan ikke-krysskoblet (NCL) og krysskoblet (CL) stillaser og evaluere deres helbredende evne i diabetikere. Karakteriseringsresultatet av stillaser avslører at DOX-CL stillaset har ideell porøsitet, lav hevelse og nedbrytningshastighet og en vedvarende frigjøring av DOX sammenlignet med DOX-NCL stillaset. In vitro-studiene viser at DOX-CL-stillaset var biokompatibelt og forbedret cellevekst sammenlignet med CL-stillasbehandlede og kontrollgrupper. De antibakterielle studiene har vist at DOX-CL stillaset var mer effektivt enn CL-stillaset mot de vanligste bakteriene som finnes i DW. Ved hjelp av streptozotocin og fettfattig diettindusert DW-modell ble det observert en signifikant (p≤0,05) raskere grad av sårkontraksjon i dox-cl stillasbehandlet gruppe sammenlignet med de i CL stillas behandlet og kontrollgrupper. Bruken av DOX-CL stillaset kan vise seg å være en lovende tilnærming for lokal behandling for DWs.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) er en tilstand der kroppens manglende evne til å levere insulin eller reagere på resultatene i unormal fordøyelse av enkle sukkerarter fører til et oppsving av blodsukker 1. Den mest påfølgende og knusende innviklingen av DM er diabetisk sår (DW). Omtrent 25% av pasientene med DM har muligheten til å bygge opp en DW i løpet av livet 1. Den hindrede helbredelsen av DW er akkreditert til en triopati av DM: immunopati, vaskulopati og nevropati. Når DW blir ubehandlet, kan det føre til koldbrannutvikling, og dermed føre til fjerning av det aktuelle organet 2.
Mange behandlinger, for eksempel å instruere pasientene (inspisere sår daglig, rense såret, unngå aktiviteter som skaper press på såret, periodisk glukoseovervåking, etc.), kontrollere blodsukkeret, sårdebridement, trykkavlastning, medisinsk prosedyre, hyperbar oksygenbehandling og avanserte terapier er i praksis 3,4. Flertallet av disse medisinene klarer ikke å adressere alle forutsetninger som er avgjørende for DW-omsorg i lys av de multifaktorielle patofysiologiske forholdene og uventede utgifter knyttet til disse legemidlene 5. Selv om DW-patogenesen er multifaktoriell, er den vedvarende betennelsen med upassende vevshåndtering oppgitt å være den faktiske årsaken til forsinket helbredelse i DWs 5,6.
Forsterkede nivåer av inflammatoriske og proinflammatoriske mediatorer i DW resulterer i reduserte vekstfaktorer som er ansvarlige for forsinket sårheling 2,6. Feil ekstracellulær matrise (ECM) formasjon i DWs er akkreditert til økte nivåer av matrise metalloproteinaser (MMPs) ansvarlig for rask nedbrytning av dannet ECM. I MMP-er rapporteres MMP-9 som et stort mellomledd som er ansvarlig for langvarig betennelse og rask ECM-nedbrytning 7. Det sies at lokal behandling med et antiinflammatorisk stoff som reduserer de forhøyede nivåene av MMP-9 gjenoppretter kutan homeostase, rammearrangement og gir bedre helbredelse av DWs 8,9.
Doxycyklin (DOX), en MMP-9-hemmer, ble valgt for å undertrykke de forhøyede nivåene av MMP-9, en stor inflammatorisk mediator som er ansvarlig for vedvarende betennelse i DWs 10,11,12. I tillegg har DOX antioksidant (produserer frie hydroksy- og fenoksyradikaler som er i stand til å binde seg til reaktive oksygenarter) 13 og anti-apoptotisk (hemm caspaseuttrykk og mitokondriestabilisering) 14 aktiviteter som er avgjørende for behandling av DW. Arrangement av rammeverk som inneholder DOX, kollagen (COL) og chitosan (CS) ble valgt. Valget av COL avhenger av hvordan det bidrar til å gi det nødvendige rammeverket som er ansvarlig for mekanisk styrke og vevregenerering 15. På den annen side er CS strukturelt homologt for glykosaminoglykan, forbundet med flere sårhelingsfaser. Det rapporteres også at CS har betydelig antibakteriell egenskap 15. Derfor er COL / CS stillas av DOX formulert for å undertrykke langvarig betennelse, etterfulgt av å støtte matriseformasjonen for vellykket sårheling under DM-forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrene som ble utført ble godkjent av den institusjonelle dyreetiske komiteen for JSS College of Pharmacy, Ooty, India.
1. Fremstilling av DOX-ladde porøse stillaser ved frysetørkingsmetode
- Tilsett 1,2 g COL til 100 ml vann (f.eks. millipore) og hold til side for hevelse.
- Rør den hovne COL-dispersjonen ved 2000 rpm over natten for å sikre fullstendig oppløsning av COL.
- Forbered CS-oppløsning ved å oppløse ca. 0,8 g CS i 100 ml 1% eddiksyre.
- Rør CS-løsningen over natten ved 2000 o/min for å sikre jevn spredning.
- Bland DOX (1% m/v), etterfulgt av CS-oppløsning, til COL-oppløsningen, og rør i 30 min.
- Filtrer den oppnådde fysiske blandingen ved hjelp av en muslinklut for å fjerne partiklet.
- Dypfrysing av det oppnådde filtratet ved -85 °C ± 4 °C i ca. 24 timer.
- Lyofiliser dypfrysingsblandingen ved -85 °C ± 4 °C i 72 timer.
- Oppbevar de oppnådde stillasene i en desiccator for videre analyse 16,17.
2. Krysskobling av stillas
- Løs opp MES (0,488 g) i 50 ml vann.
- Bløtlegg 50 mg av det DOX-lastede stillaset i 20 ml MES-bufferen i 30 minutter.
- Bland 19,5 ml MES-buffer med 0,1264 g EDC og 0,014 g NHS i et separat beger.
- Senk stillaset ned i bufferblandingen i 4 timer for å oppnå krysskobling 16.
- Oppbevar DOX-lastede krysskoblede (CL) og ikke-krysskoblede stillaser (NCL) for videre evaluering.
3. Karakterisering av stillaser
- Morfologisk undersøkelse ved hjelp av en skanning elektronmikroskopi (SEM)
- Karakteriser stillasene for morfologisk analyse ved hjelp av SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
- Flekk tverrsnittet og den utvendige overflaten av stillaset med det delikate gulllaget (~150 Å).
- Ta det fotografiske bildet ved eksitasjonsspenningen på 5 kV og 10 kV.
- Plasser prøvene i aluminiumsstubber og legg dem med gullet på ca. 9 V.
- Mål stillaset ved hjelp av SEM med økt oppløsning ved 10 kV.
- Porøsitetsbestemmelse
- Mål porøsiteten til stillasene ved hjelp av væskeforskyvningsmetoden (etanol) 18.
- Beregn porøsiteten til stillasene ved hjelp av formelen nedenfor.
Ww = Våtvekt på stillaset
Wd = Tørrvekt på stillaset
Wv = Volum av stillaset
- Bestemme vannabsorpsjonskapasiteten
- Mål stillasets tørre vekt.
- Inkuber det veide stillaset ved 37 °C i 24 timer i fosfatbuffersallin (PBS) pH 7,4.
- Fjern overflødig PBS over stillaset ved hjelp av filterpapir.
- Mål vannabsorpsjonskapasiteten ved hjelp av formelen nedenfor 17.
WS = Prosentandel vannabsorpsjon
W1=Våtvekt på stillaset
W0= Tørrvekt på stillaset
- Nedbrytning av stillas
- Inkuber stillaset (1 cm x 1 cm) ved 37 °C i 7 dager i en PBS med pH 7,4 som inneholder lysozymer.
- Vask stillaset for å fjerne eventuelle festede ioner på overflaten.
- Frys det vaskede stillaset 17.
- Beregn forringelseshastigheten ved hjelp av formler.
Ww = Startvekten på stillaset
Wd = Vekten av stillaset etter frysetørking
-
In vitro-utgivelsesstudier
- Bestem frigjøringsvirkemåten til DOX fra stillaset ved hjelp av dialysesekkmetoden.
- Spre stillaset i noen få milliliter simulert sårvæske (pH 7.4) og overfør det til en dialysepose.
- Lukk endene av membranposen tett og senk i 500 ml simulert sårvæskeoppløsning.
- Rør sårvæskeløsningen som inneholder dialyseposen ved 200-250 o/min.
- Samle den supernatante løsningen og erstatt den med en lik mengde fersk bufferløsning ved bestemte tidsintervaller.
- Bestem prosentandelen av DOX-frigjøring fra stillasene i den supernatante løsningen ved hjelp av et UV-synlig spektrometer ved 240 nm.
4. In vitro antibakterielle studier
- Bestem minimum hemmende konsentrasjon (MIC) av CL- og DOX-CL-stillasene mot S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa ved hjelp av mikrobuljongfortynningsmetoden.
- Forbered bakteriekulturene ved hjelp av Mueller-Hinton buljong med et forhold på 1:1000 for å oppnå 0,5 McFarland turbiditet.
- Tilsett D-glukose (800 mg/dl) i bakteriekulturene for hypergly kation 19,20.
- Hakk og solubiliser CL og DOX-CL i DMSO (negativ kontroll).
- Fortynn den hyperglykatterte bakterielle suspensjonen (100 μL) og testprøvene (100 μL stillasoppløsning) i 96 brønnplater.
- Inkuber platen ved 37 °C i 20-24 timer.
- Registrer absorbansen ved en bølgelengde på 600 nm 21.
5. In vitro biokompatibilitetsstudier
- Evaluer biokompatibiliteten til de tilberedte stillasene ved hjelp av MTT [(3-(4, 5 dimetyltiazol-2 yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid)] analyser.
- Steriliser stillasene av standarddimensjon og legg dem i 24 brønnplater.
- Tilsett 3T3-L1 celler til 24 brønnplaten og inkubert i 72 timer.
6. In vivo dyrestudier
- Induksjon av DM og eksisjonssår
- Fôr dyret med et fettfattig kosthold i to uker og administrer en enkelt dose streptozotocin (STZ) (50 mg / kg kroppsvekt) i sitratbufferoppløsning intraperitonealt til Wistar albinorotter (180-200 g) for induksjon av type 2 diabetes.
- Velg dyrene med en konstant blodsukker på 250 mg/dl for studien.
- Tilfeldiggjør de valgte dyrene for induksjon av eksisjonssår.
- Bedøv diabetikerrottene ved hjelp av dietyleter (5 ml ble lagt til det tidligere mettede anestesikammeret) og bekreft ved hjelp av tåklemmemetoden og slimhinnefarge.
- Barber dorsalområdet (Dorsal thoracic, lumbal region) ved hjelp av en aseptisk trimmer og kniver (A40).
- Steriliser det barberte området med en alkoholholdig vattpinne.
- Slukk huden (2 x 2 cm2 og en dybde på 1 mm) med et aseptisk kirurgisk A40-blad på det barberte området for å skape et åpent sår.
- Del dyrene i tre grupper (Gruppe 1- Sykdomskontroll (Kontroll), Gruppe 2- CL stillas (Placebo), Gruppe 3- DOX CL stillas), hver gruppe bestående av 6 rotter.
- Fest CL- og DOX CL-stillasene ved hjelp av kirurgisk tape og dekk kontrollgruppen med steril gasbind i 21 dager.
- Spor sårområdet på et sterilt OHP-ark og mål den prosentvise reduksjonen av såret ved hjelp av rutenettmetoden på dag 0, 7, 14 og 21 for alle grupper.
- Beregn prosentvis sårreduksjon ved hjelp av formelen nedenfor.
7. Histopatologiske studier
- Isoler det helbredede sårområdet på dag 7, 14 og 21, oppbevar i formalinoppløsning (10%).
- Seksjon vevet ved hjelp av en mikrotom for å oppnå en tykkelse på 6 μm.
- Monter seksjonene på en glasssklie og flekk ved hjelp av Hematoxylin og eosin 17.
- Ta bildene under 40x forstørrelse ved hjelp av et digitalt mikroskop.
8. Hydroksyprolin estimering
- Isoler det helbredede sårområdet på dag 0, 7, 14 og 21 for evaluering.
- Beregn hydroksyprolininnholdet ved hjelp av prosedyren beskrevet av Reddy G et al., 1996 22.
9. Elisa-test
- Beregn MMP-9-nivåene ved hjelp av Elisa-settet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Isoler vevsprøvene fra det helbredede sårområdet på dag 21 og hakk ved hjelp av en vevshomogenisator.
- Sentrifuger det oppnådde homogenatet og samle supernatanten.
- Fortynn supernatanten ved 100 ganger ved hjelp av analysebufferen.
- Skann platen med en multippel plateleser.
10. Statistisk analyse
- Representer de oppnådde resultatene som Mean ± SD.
- Utfør den statistiske analysen ved hjelp av Graph pad prism v5.01.
- Oppnå den statistiske betydningen ved hjelp av ANOVA (One Way Analysis of Variance) og Dunnets post hoc-test.
- Se på verdiene med p≤0,05 som signifikante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av det DOX-lastede NCL- og CL-stillaset
Ved visuell undersøkelse ble NCL og CL stillas funnet å være krem i farge. Dessuten ser begge stillasene ut til å være som en svamp, stiv og uelastisk når de undersøkes fysisk. SEM-bilder av stillasene NCL og CL er vist i figur 1. Fra figuren var det klart at det var en nedgang i porestørrelse etter krysskobling ved å danne intermolekylære koblinger. Også NCL- og CL-stillasenes porøsitet ble funnet å være henholdsvis 92,3±4,21 og 71,35±2,65. Andelen vannabsorpsjon av NCL- og CL-stillasene var 750±11,4% og 492±8,66% ved 24 timers tidsintervaller.
I tillegg ble biodegraderingsstudier utført i syv dager i den simulerte sårvæsken til pH 7.4, bestående av lysozymer. NCL-stillaset viste en raskere nedbrytning i utgangspunktet de første tre dagene og gikk sakte ned i fire påfølgende dager. På den andre siden viste CL-stillaset en langvarig nedbrytningshastighet. Krysskobling av stillaset forbedret mekaniske egenskaper og nettverksstyrke som igjen resulterte i redusert nedbrytningshastighet, noe som indikerer forbedret motstand mot nedbrytningen (figur 2).
Videre ble in vitro-utgivelsen av DOX fra NCL og CL stillas utført i 120 timer (figur 3). I de første 1 h, 27.92±3.45% DOX ble utgitt fra NCL stillas, mens bare 16.54±2.21% DOX ble utgitt fra CL stillas. Etter 6 timer økte DOX-utslippet fra stillasene med 63,15±3,78% i NCL-stillaset og 44,43±3,57% i CL stillaser. Etter 24 timer var det en frigjøring på 70% DOX fra NCL stillas, mens CL stillas tok mer enn 72 timer å frigjøre 70% av DOX. Basert på resultatene som ble oppnådd, ble det DOX-ladde CL-stillaset valgt for videre evaluering og representert som DOX-CL stillas. Mens CL stillas uten DOX (placebo) er utpekt som CL Stillas.
In vitro antibakterielle studier
Pasienter med DW opplever vanligvis infeksjoner som resulterer i langvarig sårtilheling. Dermed ble forberedte stillaser undersøkt for deres antibakterielle aktivitet ved hjelp av MIC mot et valgt bakteriepanel (tabell 1). Fra resultatene er det klart at DOX utviste hemmende aktivitet med en MIC på <4 μg /ml mot både S. aureus og S. epidermis. En MIC på <8 μg/ml og <16 μg/ml ble observert mot E. coli og P. aeruginosa. Alene chitosan og CL stillas ekstrakt utvist minimal aktivitet mot utvalgte organismer som S. aureus (<64 μg/ml), S. epidermis (<64 μg/ml), E. coli (<128 μg/ml) og P. aeruginosa (<128 μg/ml). DOX-CL stillas har vist lignende hemmende aktivitet med en MIC på <2 μg/ml mot både S. aureus og S. epidermis. Videre viste DOX-CL stillas moderate aktiviteter med en MIC på <8 μg/ml mot E. coli og P. aeruginosa.
In vitro biokompatibilitetsstudie
MTT-analyse ble utført for å bestemme cellulær levedyktighet av 3T3-L1 celler i nærvær av CL- og DOX-CL stillaser. Resultatene eksemplifiserte at CL- og DOX-CL-stillasene ikke stimulerte noen cytotoksisitet. Videre var den cellulære levedyktigheten relativt høyere i stillasbehandlede grupper enn i kontroll, noe som representerer den forbedrede veksten av fibroblaster i nærvær av stillaser (figur 4).
In vivo sår healing studier
Det gjennomsnittlige sårområdet som ble redusert i alle gruppene, ble bestemt ved hjelp av den grafiske metoden på dag 0, 7, 14 og 21 (figur 5). Ved visuell undersøkelse var sårene i CL- og DOX-CL stillasbehandlede grupper fri for oser på dag syvende. Samtidig oser sårene i kontrollgruppen. På dag 14 ble det observert en tørr scab i alle grupper; Imidlertid ble det observert en raskere grad av sårkontraksjon i DOX-CL stillaset (89,663%). På dag 21 ble 99,9% av såret helbredet, og et arr ble dannet i DOX-CL stillaset, mens delvis helbredelse ble observert i kontroll og CL stillasbehandlede grupper.
Histopatologi studie
Histopatologisk observasjon av sårheling på dag syvende postinjury viste forstyrrelse av alle hudlag på kantene av såret i alle grupper. Det var ingen synlighet av epidermis; Imidlertid ble dominerende nøytrofiler med intermitterende monocytter og lymfocytter observert i kontrollgruppen. I CL stillasbehandlet gruppe ble moderat synlighet av epidermis lagt merke til sammen med få nøytrofiler og makrofager. Mens såret i den DOX-CL stillasbehandlede gruppen var dekket med et slankt lag av epidermis, som representerer fasen av reepithelization. Milde nøytrofiler og makrofager, sammen med granuleringsvev, ble også sett oftere i den DOX-CL stillasbehandlede gruppen.
På dag 14 postinjury ble sår i alle gruppene funnet å være dekket med epidermis. I kontrollgruppen ble epidermislaget dannet observert å være et veldig slankt lag sammen med rådne nøytrofiler. I CL stillasbehandlet gruppe var epidermislaget dannet tykkere enn det i kontrollgruppen, sammen med milde multinukleerte massive celler. I den DOX-CL stillasbehandlede gruppen var epidermis utviklet tykkere sammenlignet med andre grupper, sammen med et rikelig antall histiocytter og gigantiske multinukleerte celler. Den tette sonen av fibroblaster ble også observert i den DOX-CL stillasbehandlede gruppen.
På dag 21 postinjury, i kontrollgruppen, ble et dominerende antall nøytrofiler redusert sammen med tilbakefall av makrofager og histiocytter som representerer den reduserte betennelsen. Mens i CL stillasbehandlet gruppe ble det observert et moderat antall histocytter og lymfocytter. Epidermis dannet ble observert å være vesentlig tykkere i DOX-CL stillasbehandlet gruppe enn de i kontrollgruppen, sammen med et rikt antall histiocytter, lymfocytter og massive multinukleerte celler. I den DOX-CL stillasbehandlede gruppen ble nøytrofiler redusert på dag 7. Også innsamlingen av makrofager og deres morfologiske varianter som flernukleerte massive celler og histiocytter ble lagt merke til på dag 14 og 21 (Figur 6).
Hydroksyprolin estimering
Hydroksyprolinestimering er et indirekte mål på mengden kollagen tilstede i helbredende sår. Høyere hydroksyprolinkonsentrasjon betegner en rask prosentandel av sårheling. Den biokjemiske undersøkelsen avdekket en høyere mengde hydroksyprolin i den DOX-CL stillasbehandlede gruppen etterfulgt av CL stillasbehandlet gruppe enn de i kontrollgruppen (Figur 7).
MMP-9-estimering ved hjelp av Elisa-settet
MMP-9-innholdet i den DOX-CL stillasbehandlede gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med de som hadde kontroll, og CL stillasbehandlet gruppe. Mens MMP-9-innholdet i cl stillasbehandlet gruppe var marginalt mindre sammenlignet med dox-cl stillasbehandlet gruppe, som vist i figur 8.
Figur 1: Morfologi av DOX lastet COL-CS stillas a) før CL og b) etter CL-bestemmelse av SEM i et skalaområde på 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Matriseforringelse av DOX lastet i NCL- og CL-stillaser fra dag 1 til 7 i PBS pH 7,4 ved 37 °C som viser at NCL ble degradert gradvis i 7 dager. I motsetning til dette indikerer CL stillasforringelseshastigheten betydelig forbedret motstand mot enzymatisk nedbrytning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: In vitro drug release profile of DOX from NCL and CL stillaser i PBS pH 7,4 ved 37 ° C viser en langsom frigjøring av stoffet i all formulering etterfulgt av en vedvarende frigjøring. Data uttrykt som gjennomsnittlig ± SD (n=3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: 3T3-L1 celler dyrket i nærvær av CL og DOX-CL stillaser som viser prosent cellevekst mer i DOX-CL stillas behandlet gruppe etterfulgt av CL stillas behandlet og kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: (a) Bilder som representerer reduksjonen i gjennomsnittlig sårområde i kontrollen, CL stillas og DOX-CL stillasbehandlede grupper på dag 0, 7, 14 og 21 etter såring. (b) Grafisk fremstilling av reduksjon i gjennomsnittlig sårområde i kontroll, CL stillas og DOX-CL stillasbehandlede grupper på dag 0, 7, 14 og 21 post sår. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD (n =6 sår/gruppe). Statistisk signifikans ble oppnådd av One Way Analysis of Variance (ANOVA) etterfulgt av Dunnets post hoc-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Histologiske endringer under sårhelingsprosessen i STZ og fettfattig diettindusert diabetes i Wistar albino rottehud på dag 7, 14 og 21 uten (kontroll) og med behandling (CL og DOX-CL stillas) i en full-tykkelse eksisjonssårmodell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Resultat som representerer hydroksyprolininnholdet i sår på dag 0, 7, 14 og 21 som en indikator på indirekte estimering av kollagennivå. Resultatene uttrykkes i μg hydroksyprolin/mg tørt sårvev. Dataene representerer Middelverdi±SD (n=6 sår/gruppe). Statistisk signifikans ble oppnådd av One Way Analysis of Variance (ANOVA) etterfulgt av Dunnets post hoc-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Graf som representerer MMP-9-nivåene i homogenater hentet fra helbredede sår i STZ og fettfattig diettindusert indusert diabetiker rotte modell på dag 21. Nivåer av MMP-9 ble bestemt i 100 ganger aliquots av sårvæsker ved hjelp av ELISA-analyse. Dataene representerer Middelverdi±SD (n=3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| MIC (μg/ml) | ||||
| Eksempel på test | S. aureus | S. epidermis | E. coli | P. aeruginosa |
| DOX | <4 | <4 | <8 | <16 |
| CS | <64 | <64 | <128 | <128 |
| CL stillas ekstrakt | <64 | <64 | <128 | <128 |
| DOX-CL stillas ekstrakt | <2 | <2 | <4 | <4 |
Tabell 1: Minimum hemmende konsentrasjon av CS-, DOX-, CL- og DOX-CL-stillaser mot et valgt bakteriepanel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedmålet med denne studien var å bestemme effekten av DOX lastet COL-CS stillas på DW healing hos rotter. CL og NCL ble utarbeidet og evaluert når det gjelder morfologi, hevelsesindeks, in vitro-frigjøringskinetikk og biokompatibilitet.
Karakterisering av det DOX-lastede NCL- og CL-stillaset
De forberedte stillasene ble funnet å være porøse med sammenkoblede porer. Disse sammenkoblede porene sikrer den porøse, svampete naturen som hjelper til med riktig diffusjon av oksygen og næringsstoffer til cellene for spredning og migrasjon, noe som fører til akselerert helbredelse. Her var porestørrelsen hovedsakelig avhengig av krysskoblingen. Krysskobling av stillaset resulterte i redusert porestørrelse ved å danne sterke intramolekylære interaksjoner av EDC /NHS med CS og COL, noe som økte stillasets mekaniske styrke.
Porøsitetsindeksen er avhengig av relativ tetthet, som er en funksjon av massen av svampstenger og volum. Generelt oppstår krymping av stillasvolum hvis et krysskoblingsmiddel endrer stivernes posisjon ved å dra dem nærmere hverandre, noe som fører til stillasfortetting. Når det gjelder karbodiimidkjemi, forventes det imidlertid ikke en økning i massen av stillas på grunn av sin unike mekanisme, det vil si innføring av amide linkage (O = C-NH) ved hjelp av karboksyl (>COOH) og amin (-NH) gruppe tilstøtende peptidkjede uten å gå inn i stillaset. Samtidig, under krysskobling, kan mindre massetap oppstå på grunn av oppløsning og migrasjon av ikke-festet polymerkjeder. Likevel, i tilfelle stillasbehandling med EDC / NHS ga ingen merkbar effekt på stillasmorfologi.
Stillasets evne til å absorbere biologisk væske er avgjørende for å evaluere egnetheten som legemiddelbærer. Vannabsorpsjonsegenskapen påvirker ikke bare stillasets form, men påvirker også celleveksten. Det ble observert at CL-stillaset hadde vist en lavere vannabsorpsjonshastighet enn NCL stillaset, som kan tilskrives krysskoblingen av stillaset. Videre ble hydrofiliteten til stillasmaterialet betydelig redusert etter krysskobling på grunn av (i) tap av hydrofile grupper (>COOH &-NH) i prosessen med amidkoblingsdannelse; (ii) hemming av hevelse ved dannelse av nye bindinger (O=C-NH). Disse resultatene er i god samsvar med de tidligere publiserte rapportene 23,24.
En enzymatisk biologisk nedbrytningsstudie ble utført ved å overvåke prosentandelen av en restmasse etter syv dager med inkubasjon i den simulerte sårvæsken til pH 7.4, bestående av lysozymer. NCL-stillaset viste en raskere nedbrytning i utgangspunktet de første tre dagene og gikk sakte ned i fire påfølgende dager. På den andre siden viste CL-stillaset en langvarig nedbrytningshastighet. Krysskobling av stillaset forbedret mekaniske egenskaper og nettverksstyrke som igjen resulterte i redusert nedbrytningshastighet, noe som viste forbedret motstand mot nedbrytningen.
Narkotikautgivelsesstudier ble utført for CL- og NCL-stillaser i 120 timer. Generelt reduseres stillasets legemiddelfrigjøringskoeffisient etter hvert som den krysskoblede tettheten øker på grunn av forbedrede forbindelser mellom porene og redusert plass mellom polypeptidkjeder. Legemiddelfrigjøringskoeffisienten påvirkes også av porøsitetsindeksen, vanninnholdet, hevelsesindeksen og graden av krysskobling. I vår studie ble 27,92±3,45% og 63,15±3,78% av DOX fra NCL-stillaset, mens 16,54±2,21% og 44,43±3,57% av DOX fra CL-stillaset ble utgitt med henholdsvis 1 t og 6 h. Etter 24 timer var det en frigjøring på 70% av DOX fra NCL stillas, mens; CL stillas tok mer enn 72 timer å frigjøre 70% av DOX. Resultatene viste at stillaset krysskobling omvendt påvirket DOX-frigjøring ved å redusere hevelsesforholdet og vanninnholdet.
In vitro antibakterielle studier
DOX-CL stillasekstrakt viste høyere hemmende aktivitet (MIC) mot gram-positive organismer. Den høyere aktiviteten til DOX-CL stillasekstraktet kan skyldes den økte hydrofobiske prøven. Imidlertid viste DOX-CL stillasekstrakt minimal aktivitet mot gram-negative organismer, sannsynligvis på grunn av gjennomtrengningssvikt i celleveggen. Videre var MIC av DOX-CL relativt høyere enn CS, CL stillas og DOX-prøver, som kan tilskrives den synergistiske aktiviteten til DOX og CS i DOX-CL-ekstraktet.
In vitro biokompatibilitetsstudie
In vitro biokompatibilitetsstudien ble utført på fibroblalastceller (3T3-L1). Fibroblaster er ansvarlige for produksjon av ECM og proteiner. Videre spiller de en avgjørende rolle i å opprettholde strukturell integritet ved å forbedre dannelsen av rammen som kreves for sårheling. Resultatene viser at DOX-CL stillas og CL stillas ikke ga noen cellecytotoksisitet. Imidlertid ble begge stillasgruppene observert med cellevekst og differensiering av fibroblaster i stillasporene, noe som indikerer at de forberedte stillasene var biokompatible. Økt cellevekst og differensiering i begge gruppene skyldtes hovedsakelig tilstedeværelsen av CS og COL som en ekstracellulær matrise i stillasstrukturen.
Videre ble det observert relativt høyere cellevekst med DOX-CL stillasgruppen enn cl stillaset på grunn av aktivering av PI3K-AKT-signalet av DOX, ansvarlig for cellevekst og overlevelse 25.
In vivo sår healing studier
De ulike komplikasjonene av DM er ansvarlige for langvarig helbredelse av DW. For å etterligne diabetikertilstanden hos rotter ble det gitt et fettfattig kosthold, etterfulgt av en intraperitoneal injeksjon av STZ. Etter 2-3 dager med diabetiker bekreftelse, ble åpne sår opprettet ved eksisjon av hud i dorsal thoracic regionen. Behandlingen ble utført i 21 dager med respektive stillaser. Reduksjon i sårområdet ble bestemt for alle gruppene på dag 0, 7, 14 og 21. Diabetikerrotter behandlet med DOX-CL stillas viste en betydelig grad av sårkontraksjon sammenlignet med CL stillasgrupper og ubehandlede grupper.
Den inflammatoriske fasen av sårheling er ansvarlig for funksjonell barrieredannelse. I neste fase fanger den proliferative fasen av sårheling oppmerksomhet i sårpleie, hvor 43% av sårområdereduksjonen ble observert med DOX-CL stillasgruppen. Til sammenligning ble bare 23% og 7% observert med CL stillas og ubehandlede grupper på henholdsvis dag 7. Fra bildene (figur 5) ble sammentrekningen av såret initiert etter at den inflammatoriske og proliferative fasen er fullført. DOX-CL stillasgruppe viste betydelig sårkontraksjon på grunn av tilstedeværelsen av DOX, som er ansvarlig for de antiinflammatoriske og antiinfektive effektene. Videre hjalp COL og CS i stillaset celleproliferasjon, differensiering og migrasjon, noe som resulterte i 99% av DW-helbredelsen på 21 dager.
Ubehandlede eksisjonssår viste nøytrofiler, lymfocytter og monocytter på dag 7 postinjury. Som nevnt tidligere, hjelper nøytrofiler i sårdebridering i det tidlige stadiet av sårheling. Dessuten kan overflod av nøytrofiler påvirke helbredelsesprosessen negativt ved å skade det normale vevet. Som rapportert av Dovi et al., akselererer et minimalt antall nøytrofiler re-epitelialiseringsprosessen 26.
Videre favoriserte økte makrofager, histiocytter og massive multinukleerte celler i den DOX-CL stillasbehandlede gruppen miljøet for akselerert sårheling ved å reparere de skadede cellene og fremme COL-syntesen. Videre ble COL-sammenslåing med vev bestemt ved hjelp av hydroksyprolinnivåene i alle gruppene. Imidlertid ble relativt høyere hydroksyprolinnivåer observert med DOX-CL stillasbehandlet gruppe enn den ubehandlede og CL stillasbehandlede gruppen. Som nevnt i litteraturen hindrer den langvarige inflammatoriske fasen i diabetikertilstanden de andre fasene av helbredelse. Den raskere graden av sårkontraksjon i DOX-CL stillaset kan tilskrives DOX's antiinflammatoriske egenskap, noe som resulterer i de videre stadiene av såret som oppstår i riktig tidsfase som fører til akselerert sårheling.
Den biokjemiske estimeringen av MMP-9-nivåer ved hjelp av ELISA-testen viser at den STILLASbehandlede gruppen DOX-CL viste reduserte nivåer av MMP-9 sammenlignet med de i CL stillasbehandlede og ubehandlede grupper. Ifølge litteraturen forlenger økte nivåer av MMP-9 som er ansvarlig for matriseforringelse, som igjen forlenger sårhelingsprosessen. DOX, et antiinflammatorisk middel, hemmet MMP-9-nivåene, som regnes som årsaken til å forhindre COL-sammenbruddet, noe som resulterer i akselerert DW-helbredelse. Disse resultatene er i samsvar med tidligere publiserte studier av Lindeman et al., 2009 og Zhang et al., 2014 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Ashish D Wadhwani. (Universitetslektor og leder, Institutt for farmasøytisk bioteknologi, JSS College of Pharmacy, Ooty, India) for å bistå i in vitro celle levedyktighetsstudier.
Forfatterne vil takke Institutt for vitenskap og teknologi - Fund for Improvement of Science and Technology Infrastructure in Universities and Higher Educational Institutions (DST-FIST), New Delhi, for å støtte vår avdeling.
Forfatterne liker også å takke Mr. Sanju. S og Mr. Sriram. Narukulla M. Pharm studenter for deres støtte i videoopptaket.
Denne forskningen ble støttet av JSS Academy of Higher Education &Research (JSSAHER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019).
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Alexiadou, K., Doupis, J.
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A.
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R.
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
