Summary
L'impalcatura DOX-CL preparata soddisfaceva i prerequisiti di una medicazione DW ideale in resistenza meccanica, porosità, assorbimento dell'acqua, tasso di degradazione, rilascio prolungato, proprietà antibatteriche, biocompatibilità e antinfiammatorie, che sono considerate essenziali per il recupero del tessuto danneggiato nei DW.
Abstract
Una delle principali complicanze del diabete mellito sono le ferite diabetiche (DW). La fase prolungata dell'infiammazione del diabete ostruisce le ulteriori fasi di una lesione che porta a una guarigione ritardata delle ferite. Abbiamo selezionato la doxciclina (DOX), come potenziale farmaco preferito, grazie alle sue proprietà antibatteriche insieme alle sue proprietà antinfiammatorie riportate. L'attuale studio mira a formulare impalcature dox caricate collagene-chitosano non retiche (NCL) e retille (CL) e valutare la loro capacità curativa in condizioni diabetiche. Il risultato della caratterizzazione delle impalcature rivela che l'impalcatura DOX-CL ha una porosità ideale, un basso tasso di gonfiore e degradazione e un rilascio prolungato di DOX rispetto all'impalcatura DOX-NCL. Gli studi in vitro rivelano che l'impalcatura DOX-CL era biocompatibile e ha migliorato la crescita cellulare rispetto ai gruppi di impalcatura e controllo CL. Gli studi antibatterici hanno dimostrato che l'impalcatura DOX-CL era più efficace dell'impalcatura CL contro i batteri più comuni trovati in DW. Utilizzando il modello di DW indotto dalla dieta streptozotocina e ad alto contenuto di grassi, è stato osservato un tasso significativamente (p≤0,05) più veloce di contrazione della ferita nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL rispetto a quelli nei gruppi di impalcatura e controllo CL. L'uso dell'impalcatura DOX-CL può rivelarsi un approccio promettente per il trattamento locale per le DW.
Introduction
Il diabete mellito (DM) è una condizione in cui l'incapacità del corpo di fornire insulina o reagire ai suoi esiti nella digestione anomala di zuccheri semplici porta a un aumento della glicemia 1. L'intreccio più consecutivo e schiacciante del DM è la ferita diabetica (DW). Circa il 25% dei pazienti con DM ha l'opportunità di costruire un DW nella loro vita 1. La guarigione ostacolata della DW è accreditata a una triopatia di DM: immunopatia, vasculopatia e neuropatia. Ogni volta che la DW non viene trattata, può provocare lo sviluppo della cancrena, provocando quindi la rimozione dell'organo interessato 2.
Molti trattamenti, come istruire i pazienti (ispezionare la ferita ogni giorno, pulire la ferita, evitare attività che creano pressione sulla ferita, monitoraggio periodico del glucosio, ecc.), controllare la glicemia, debridement delle ferite, scarico della pressione, procedura medica, ossigenoterapia iperbarica e terapie avanzate sono in pratica 3,4. La maggior parte di questi farmaci non affronta tutti i prerequisiti vitali per la cura della DW alla luce delle condizioni patofisiotiche multifattoriali e delle spese impreviste relative a questi farmaci 5. Anche se la patogenesi DW è multifattoriale, l'infiammazione persistente con gestione inappropriata dei tessuti è dichiarata come la vera ragione della guarigione ritardata in DWs 5,6.
I livelli aumentati di mediatori infiammatori e pro-infiammatori in DW si traducono in una diminuzione dei fattori di crescita responsabili della guarigione ritardata delle ferite 2,6. La formazione impropria di matrice extracellulare (ECM) nelle DW è accreditata per l'aumento dei livelli di metalloproteinasi matriciali (MMP) responsabili della rapida degradazione dell'ECM formato. Negli MMP, MMP-9 è segnalato come uno dei principali intermediari responsabili dell'infiammazione prolungata e della rapida degradazione dell'ECM 7. Si afferma che il trattamento locale con un farmaco antinfiammatorio che diminuisce i livelli elevati di MMP-9 rieche stabilisce l'omeostasi cutanea, la disposizione del quadro e richiede una migliore guarigione dei DWs 8,9.
La doxiciclina (DOX), un inibitore dell'MMP-9, è stata scelta per sopprimere i livelli elevati di MMP-9, un importante mediatore infiammatorio responsabile dell'infiammazione persistente in DWs 10,11,12. Inoltre, dox possiede antiossidanti (producono radicali idrossi e fenossidici liberi in grado di legarsi con specie reattive dell'ossigeno) 13 e anti-apoptotico (inibire l'espressione della caspasi e la stabilizzazione mitocondriale) 14 attività essenziali per il trattamento della DW. È stata scelta la disposizione di quadri contenenti DOX, collagene (COL) e chitosano (CS). La scelta del COL dipende dal modo in cui aiuta a fornire il quadro necessario responsabile della resistenza meccanica e della rigenerazione tissutale 15. D'altra parte, CS è strutturalmente omologo al glicosaminoglicano, associato a diverse fasi di guarigione delle ferite. È anche riportato che CS detiene una significativa proprietà antibatterica 15. Pertanto, l'impalcatura COL / CS di DOX è formulata per sopprimere l'infiammazione prolungata, seguita dal supporto della formazione della matrice per una guarigione efficace delle ferite in condizioni di DM.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali eseguite sono state approvate dal comitato etico istituzionale per gli animali del JSS College of Pharmacy, Ooty, India.
1. Preparazione di impalcature porose caricate con DOX con metodo di liofilizzazione
- Aggiungere 1,2 g di COL a 100 mL di acqua (ad esempio Millipore) e tenere da parte per il gonfiore.
- Mescolare la dispersione gonfia del COL a 2000 giri/min durante la notte per garantire la completa dissoluzione del COL.
- Preparare la soluzione CS sciogliendo circa 0,8 g di CS in 100 mL di acido acetico all'1%.
- Mescolare la soluzione CS durante la notte a 2000 giri/min per garantire una dispersione uniforme.
- Mescolare DOX (1% w/v), seguito dalla soluzione CS, alla soluzione COL e mescolare per 30 min.
- Filtrare la miscela fisica ottenuta utilizzando un panno di mussola per rimuovere il particolato.
- Congelare in profondità il filtrato ottenuto a -85 °C ± 4 °C per circa 24 ore.
- Liofilizzare la miscela di congelamento profondo a -85 °C ± 4 °C per 72 h.
- Conservare le impalcature ottenute in un essiccatore per ulteriori analisi 16,17.
2. Collegamento incrociato di impalcature
- Sciogliere mes (0,488 g) in 50 mL di acqua.
- Immergere 50 mg dell'impalcatura caricata dox in 20 mL del tampone MES per 30 minuti.
- Mescolare 19,5 mL di buffer MES con 0,1264 g di EDC e 0,014 g di NHS in un becher separato.
- Immergere l'impalcatura nella miscela tampone per 4 ore per ottenere il crosslinking 16.
- Conservare le impalcature a reti incrociate (CL) e non retiche DOX (NCL) per un'ulteriore valutazione.
3. Caratterizzazione delle impalcature
- Esame morfologico mediante microscopia elettronica a scansione (SEM)
- Caratterizzare le impalcature per l'analisi morfologica utilizzando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
- Macchiare la sezione trasversale e la superficie esterna dell'impalcatura con il delicato strato d'oro (~ 150 Å).
- Cattura l'immagine fotografica alla tensione di eccitazione di 5 kV e 10 kV.
- Posizionare i campioni in stub di alluminio e racchiuderli con l'oro a circa 9 V.
- Misurare l'impalcatura utilizzando SEM con una risoluzione aumentata a 10 kV.
- Determinazione della porosità
- Misurare la porosità delle impalcature utilizzando il metodo di spostamento del liquido (etanolo) 18.
- Calcolare la porosità delle impalcature utilizzando le formule seguenti.
Ww = Peso umido dell'impalcatura
Wd = Peso secco dell'impalcatura
Wv = Volume dell'impalcatura
- Determinazione della capacità di assorbimento dell'acqua
- Misurare il peso secco dell'impalcatura.
- Incubare l'impalcatura pesata a 37 °C per 24 ore in tampone fosfato saline (PBS) pH 7.4.
- Rimuovere il PBS in eccesso sull'impalcatura utilizzando carta da filtro.
- Misurare la capacità di assorbimento dell'acqua utilizzando le formule seguenti 17.
WS = Percentuale di assorbimento d'acqua
W1=Peso umido dell'impalcatura
W0= Peso secco dell'impalcatura
- Degradazione dell'impalcatura
- Incubare l'impalcatura (1 cm x 1 cm) a 37 °C per 7 giorni in un PBS di pH 7.4 contenente lisozima.
- Lavare l'impalcatura per rimuovere eventuali ioni aderenti sulla superficie.
- Congelare asciugare l'impalcatura lavata 17.
- Calcolare la velocità di degradazione utilizzando le formule.
Ww = Peso iniziale dell'impalcatura
Wd = Peso dell'impalcatura dopo la liofilizzazione
-
Studi sul rilascio in vitro
- Determinare il comportamento di rilascio del DOX dall'impalcatura utilizzando il metodo del sacco dialisi.
- Disperdere l'impalcatura in alcuni millilitri di liquido avvolto simulato (pH 7.4) e trasferirla in un sacchetto di dialisi.
- Chiudere saldamente le estremità del sacchetto a membrana e immergersi nei 500 mL della soluzione di fluido avvolto simulato.
- Mescolare la soluzione di fluido avvolto contenente il sacchetto di dialisi a 200-250 giri/min.
- Raccogliere la soluzione supernatante e sostituirla con una quantità uguale di soluzione tampone fresco a intervalli di tempo definiti.
- Determinare la percentuale di rilascio DOX dalle impalcature nella soluzione supernatante utilizzando uno spettrometro visibile ai raggi UV a 240 nm.
4. Studi antibatterici in vitro
- Determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) delle impalcature CL e DOX-CL contro il S. aureus, S. epidermide, E. coli, P. aeruginosa utilizzando il metodo di diluizione del micro-brodo.
- Preparare le colture batteriche usando brodo di Mueller-Hinton con un rapporto di 1:1000 per ottenere 0,5 torbidità McFarland.
- Aggiungere D-glucosio (800 mg/dL) alle colture batteriche per l'iperglicazione 19,20.
- Tritare e solubilizzare cl e DOX-CL in DMSO (controllo negativo).
- Diluire in serie la sospensione batterica iperglicata (100 μL) e i campioni di prova (100 μL di soluzione di impalcature) in 96 piastre di pozzo.
- Incubare la piastra a 37 °C per 20-24 ore.
- Registrare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 600 nm 21.
5. Studi di biocompatibilità in vitro
- Valutate la biocompatibilità delle impalcature preparate utilizzando il saggio MTT [(3-(4, 5 dimetil tiazolo-2 yl) -2, 5-difenil tetrazolo bromuro)]
- Sterilizzare le impalcature di dimensioni standard e posizionarle in 24 piastre di pozzo.
- Aggiungere 3T3-L1 cellule alla piastra del pozzo 24 e incubare per 72 ore.
6. Studi sugli animali in vivo
- Induzione di DM e ferita da escissione
- Nutrire l'animale con una dieta ricca di grassi per due settimane e somministrare una singola dose di streptozotocina (STZ) (50 mg/kg di peso corporeo) in soluzione tampone di citrato intraperitonealmente ai ratti albini Wistar (180-200 g) per l'induzione del diabete di tipo 2.
- Scegli gli animali con una glicemia costante di 250 mg / dL per lo studio.
- Randomizzare gli animali selezionati per l'induzione delle ferite da escissione.
- Anestetizzare i ratti diabetici usando etere dietile (5 mL sono stati aggiunti alla camera di anestesia precedentemente satura) e confermare l'uso del metodo del dito del piede e del colore della mucosa.
- Radere l'area dorsale (toracico dorsale, regione lombare) usando un trimmer asettico e lame (A40).
- Sterilizzare l'area rasata con un tampone alcolico.
- Asportare la pelle (2 x 2 cm2 e una profondità di 1 mm) con una lama chirurgica asettica A40 sulla zona rasata per creare una ferita aperta.
- Dividere gli animali in tre gruppi (Gruppo 1- Controllo malattie (Controllo), Ponteggio Gruppo 2- CL (Placebo), Gruppo 3- PONTE CL DOX), ogni gruppo composto da 6 ratti.
- Apporre le impalcature CL e DOX CL utilizzando nastro chirurgico e coprire il gruppo di controllo con garza sterile per 21 giorni.
- Tracciare l'area della ferita su un foglio OHP sterile e misurare la riduzione percentuale della ferita utilizzando il metodo della griglia nei giorni 0, 7, 14 e 21 per tutti i gruppi.
- Calcola la percentuale di riduzione della ferita usando le formule seguenti.
7. Studi istopatologici
- Isolare l'area ferita guarita nei giorni 7, 14 e 21, conservare in soluzione di formalina (10%).
- Se sezionere i tessuti utilizzando un microtomo per ottenere uno spessore di 6 μm.
- Montare le sezioni su uno scivolo di vetro e macchia utilizzando ematossilina ed eosina 17.
- Cattura le immagini con ingrandimento 40x utilizzando un microscopio digitale.
8. Stima dell'idrossiprolina
- Isolare l'area ferita guarita nei giorni 0, 7, 14 e 21 per la valutazione.
- Stimare il contenuto di idrossiprolina secondo la procedura descritta da Reddy G et al., 1996 22.
9. Test di Elisa
- Stimare i livelli MMP-9 utilizzando il kit Elisa secondo le istruzioni del produttore.
- Isolare i campioni di tessuto dall'area della ferita guarita il giorno 21 e tritare utilizzando un omogeneizzatore tissutale.
- Centrifugare l'omogeneato ottenuto e raccogliere il supernatante.
- Diluire il supernatante a 100 volte utilizzando il tampone di dosaggio.
- Scansionare la piastra utilizzando un lettore di lastre multiple.
10. Analisi statistica
- Rappresentare i risultati ottenuti come SD ± media.
- Eseguire l'analisi statistica utilizzando il prisma del pad Graph v5.01.
- Raggiungi la significatività statistica usando l'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) e il test post hoc di Dunnet.
- Considerare significativi i valori con p≤0.05.
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Representative Results
Caratterizzazione dell'impalcatura NCL e CL caricata da DOX
All'esame visivo, l'impalcatura NCL e CL è stata trovata di colore crema. Inoltre, entrambe le impalcature sembrano essere come una spugna, rigida e anelastica se esaminate fisicamente. Le immagini SEM delle impalcature NCL e CL sono mostrate nella figura 1. Dalla figura, era chiaro che c'era una diminuzione delle dimensioni dei pori dopo il collegamento incrociato formando collegamenti intermolecolari. Inoltre, la porosità delle impalcature NCL e CL è stata riscontrata rispettivamente nel 92,3±4.21 e nel 71±2,65. La percentuale di assorbimento d'acqua delle impalcature NCL e CL era del 750±11,4% e del 492±8,66% a intervalli di tempo di 24 ore.
Inoltre, sono stati effettuati studi di biodegradazione per sette giorni nel fluido ferendone simulato di pH 7,4, comprendente lysozima. L'impalcatura NCL ha mostrato un tasso di degradazione più rapido inizialmente nei primi tre giorni e è diminuita lentamente per quattro giorni consecutivi. Dall'altro lato, l'impalcatura CL ha mostrato un prolungato tasso di degradazione. Il collegamento incrociato dell'impalcatura ha migliorato le proprietà meccaniche e la resistenza alla rete che, a sua volta, hanno comportato una diminuzione del tasso di degradazione, indicando una migliore resistenza alla degradazione (Figura 2).
Inoltre, il rilascio in vitro di DOX dall'impalcatura NCL e CL è stato eseguito per 120 h (Figura 3). Nell'iniziale 1 h, il 27,92±3,45% di DOX è stato rilasciato dall'impalcatura NCL, mentre solo il 16,54±2,21% di DOX è stato rilasciato dall'impalcatura CL. Dopo 6 ore, il rilascio di DOX dalle impalcature è aumentato del 63,15±3,78% nell'impalcatura NCL e del 44,43±3,57% nelle impalcature CL. Dopo 24 ore, c'è stato un rilascio del 70% di DOX dall'impalcatura NCL, mentre l'impalcatura CL ha impiegato più di 72 ore per rilasciare il 70% del DOX. Sulla base dei risultati ottenuti, l'impalcatura CL caricata DOX è stata selezionata per un'ulteriore valutazione e rappresentata come impalcatura DOX-CL. Mentre l'impalcatura CL senza DOX (placebo) è designata come impalcatura CL.
Studi antibatterici in vitro
I pazienti con DW di solito sperimentano infezioni che si traducono in una prolungata guarigione delle ferite. Pertanto, sono state esaminate impalcature preparate per la loro attività antibatterica utilizzando il MIC contro un gruppo selezionato di batteri(tabella 1). Dai risultati, è chiaro che il DOX ha mostrato attività inibitoria con un MIC di <4 μg/mL contro sia S. aureus che S. epidermide. Contro E. coli e P. aeruginosaè stato osservato un MIC di <8 μg/mL e <16 μg/mL . Solo estratto di impalcature chitosane e CL ha mostrato un'attività minima contro organismi selezionati come S. aureus (<64 μg/mL), S. epidermide (<64 μg/mL), E. coli (<128 μg/mL) e P. aeruginosa (<128 μg/mL). L'impalcatura DOX-CL ha mostrato un'attività inibitoria simile con un MIC di <2 μg/mL contro S. aureus e S. epidermide. Inoltre, l'impalcatura DOX-CL ha mostrato attività moderate con un MIC di <8 μg/mL contro E. coli e P. aeruginosa.
Studio sulla biocompatibilità in vitro
Il test MTT è stato eseguito per determinare la vitalità cellulare delle cellule 3T3-L1 in presenza di impalcature CL e DOX-CL. I risultati esemplificano che le impalcature CL e DOX-CL non stimolavano alcuna citotossicità. Inoltre, la vitalità cellulare era relativamente più elevata nei gruppi trattati con impalcature che nel controllo, il che rappresentava una maggiore crescita dei fibroblasti in presenza di impalcature(figura 4).
Studi di guarigione delle ferite in vivo
L'area media della ferita diminuita in tutti i gruppi è stata determinata utilizzando il metodo grafico nei giorni 0, 7, 14 e 21(figura 5). All'esame visivo, le ferite nei gruppi trattati con impalcature CL e DOX-CL erano libere da trasudare il settimo giorno. Allo stesso tempo, le ferite nel gruppo di controllo trasudavano. Il giorno 14, una crosta secca è stata osservata in tutti i gruppi; tuttavia, nell'impalcatura DOX-CL è stato osservato un tasso più rapido di contrazione delle ferite (89,663%). Il giorno 21, il 99,9% della ferita è stato guarito e si è formata una cicatrice nell'impalcatura DOX-CL, mentre la guarigione parziale è stata osservata nei gruppi di controllo e trattati con impalcature CL.
Studio istopatico
L'osservazione istopologica della guarigione delle ferite il settimo giorno ha mostrato l'interruzione di tutti gli strati della pelle ai bordi della ferita in tutti i gruppi. Non c'era visibilità dell'epidermide; tuttavia, nel gruppo di controllo sono stati osservati neutrofili predominanti con monociti intermittenti e linfociti. Nel gruppo trattato con impalcatura CL, è stata notata una visibilità moderata dell'epidermide insieme a pochi neutrofili e macrofagi. Mentre, nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL, la ferita era coperta da uno strato sottile dell'epidermide, che rappresentava la fase di reepithelizzazione. Neutrofili lievi e macrofagi, insieme al tessuto di granulazione, sono stati osservati più spesso anche nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL.
Il giorno 14, le ferite in tutti i gruppi sono state trovate coperte di epidermide. Nel gruppo di controllo, lo strato di epidermide formato è stato osservato come uno strato molto sottile insieme ai neutrofili prevalsi. Nel gruppo trattato con impalcatura CL, lo strato di epidermide formato era più spesso di quello del gruppo di controllo, insieme a lievi cellule massicce multinucleate. Nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL, l'epidermide sviluppata era più spessa rispetto ad altri gruppi, insieme a un numero abbondante di istiociti e cellule giganti multinucleate. La densa zona di fibroblasti è stata osservata anche nel gruppo trattato con impalcatura DOX-CL.
Il giorno 21 postinjury, nel gruppo di controllo, un numero dominante di neutrofili è stato diminuito insieme alla recidiva di macrofagi e istiociti che rappresentano la diminuzione dell'infiammazione. Mentre nel gruppo trattato con impalcatura CL è stato osservato un numero moderato di istociti e linfociti. L'epidermide formata è stata osservata essere sostanzialmente più spessa nel gruppo trattato con impalcatura DOX-CL rispetto a quelle del gruppo di controllo, insieme a un ricco numero di istiociti, linfociti e massicce cellule multinucleate. Nel gruppo trattato con impalcatura DOX-CL, il numero di neutrofili è diminuito il giorno 7. Inoltre, il raduno di macrofagi e le loro varianti morfologiche come cellule massicce multinucleate e istiociti sono stati notati nei giorni 14 e 21(Figura 6).
Stima idrossiprolina
La stima idrossiprolina è una misura indiretta della quantità di collagene presente nelle ferite curative. Una maggiore concentrazione di idrossiprolina designa una rapida percentuale di guarigione delle ferite. L'esame biochimico ha rivelato una maggiore quantità di idrossiprolina nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL seguito dal gruppo trattato con impalcatura CL rispetto a quelli del gruppo dicontrollo (figura 7).
Stima MMP-9 utilizzando il kit Elisa
Il contenuto di MMP-9 nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL è stato significativamente diminuito rispetto a quelli in controllo e il gruppo trattato con impalcature CL. Mentre il contenuto di MMP-9 nel gruppo trattato con impalcature CL era leggermente inferiore a quello del gruppo trattato con impalcature DOX-CL, come mostrato nella figura 8.
Figura 1: Morfologia dell'impalcatura COL-CS caricata da DOX a) prima di CL e b) dopo la determinazione cl da parte di SEM ad un intervallo di scala di 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: Degradazione matriciale del DOX caricato in ponteggi NCL e CL dal primo al 7° giorno in PBS pH 7.4 a 37 °C che mostra ncl degradato gradualmente per 7 giorni. Contrariamente a ciò, il tasso di degradazione dell'impalcatura CL ridotto indica considerevolmente una maggiore resistenza alla degradazione enzimatica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profilo di rilascio in vitro di DOX da impalcature NCL e CL in PBS pH 7.4 a 37°C che mostra un lento rilascio di farmaco in tutta la formulazione seguito da un rilascio prolungato. Dati espressi come media ± SD (n=3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Celle 3T3-L1 coltivate in presenza di ponteggi CL e DOX-CL che mostrano una crescita percentuale delle celle più nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL seguito da impalcature CL trattate e di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: (a) Immagini che rappresentano la riduzione dell'area media della ferita nei gruppi di controllo, ponteggi CL e impalcature DOX-CL nei giorni 0, 7, 14 e 21 post ferita. b Rappresentazionegrafica della riduzione dell'area media della ferita nei gruppi di controllo, impalcatura CL e ponteggi DOX-CL nei giorni 0, 7, 14 e 21 post ferita. I dati sono espressi come ± SD (n=6 ferite/gruppo). La significatività statistica è stata ottenuta mediante un'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Dunnet. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cambiamenti istologici durante il processo di guarigione delle ferite in STZ e diabete indotto dalla dieta ad alto contenuto di grassi nella pelle del ratto albino Wistar nei giorni 7, 14 e 21 senza (controllo) e con trattamento (impalcature CL e DOX-CL) in un modello di ferita da escissione a pieno spessore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Risultato che rappresenta il contenuto di idrossiprolina nelle ferite nei giorni 0, 7, 14 e 21 come indicatore della stima indiretta del livello di collagene. I risultati sono espressi in μg idrossiprolina/ mg di tessuto secco della ferita. I dati rappresentano la Mean±SD (n=6 ferite/gruppo). La significatività statistica è stata ottenuta mediante un'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Dunnet. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Grafico che rappresenta i livelli di MMP-9 negli omogeneati ottenuti da ferite guarite nella STZ e modello di ratto diabetico indotto dalla dieta ad alto contenuto di grassi il giorno 21. I livelli di MMP-9 sono stati determinati in aliquote 100 volte di fluidi avvolti utilizzando l'analisi ELISA. I dati rappresentano mean±SD (n=3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| MIC (μg/mL) | ||||
| Esempio di test | San aureo | S. epidermide | Coli | P. aeruginosa |
| Dox | <4 a) La commissione per i | <4 a) La commissione per i | <8 | <16 anni |
| CS | <64 anni | <64 anni | <128 | <128 |
| Estratto di impalcatura CL | <64 anni | <64 anni | <128 | <128 |
| Estratto ponteggi DOX-CL | <2 | <2 | <4 a) La commissione per i | <4 a) La commissione per i |
Tabella 1: Concentrazione inibitoria minima di impalcature CS, DOX, CL e DOX-CL contro un gruppo selezionato di batteri.
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Discussion
L'obiettivo principale di questo studio era determinare l'effetto dell'impalcatura COL-CS caricata da DOX sulla guarigione della DW nei ratti. CL e NCL sono stati preparati e valutati in termini di morfologia, indice di gonfiore, cinetica di rilascio in vitro e biocompatibilità.
Caratterizzazione dell'impalcatura NCL e CL caricata da DOX
Le impalcature preparate sono state trovate porose con pori interconnessi. Questi pori interconnessi assicurano la natura porosa e spugnosa che aiuta nella corretta diffusione di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule per la proliferazione e la migrazione, portando a una guarigione accelerata. Qui, la dimensione dei pori dipendeva principalmente dal retino. Il collegamento incrociato dell'impalcatura ha comportato una diminuzione delle dimensioni dei pori formando forti interazioni intramolecolari da parte di EDC /NHS con CS e COL, aumentando la resistenza meccanica dell'impalcatura.
L'indice di porosità si basa sulla densità relativa, che è una funzione della massa dei montanti di spugna e del volume. Generalmente, il restringimento del volume dell'impalcatura si verifica se un agente reticoltorio altera la posizione dei montanti trascinandoli più vicini l'uno all'altro, portando alla densificazione delle impalcature. Tuttavia, nel caso della chimica della carbodiimide, non è previsto un aumento della massa dell'impalcatura a causa del suo meccanismo unico, cioè l'introduzione del collegamento ammide (O=C-NH) utilizzando il gruppo carbossilico (>COOH) e ammina (-NH) della catena peptidica adiacente senza entrare nell'impalcatura. Contemporaneamente, durante il crosslinking, può verificarsi una piccola perdita di massa a causa della dissoluzione e della migrazione di catene polimeriche non attaccate. Tuttavia, in caso di trattamento con impalcature con EDC/NHS non ha prodotto alcun effetto notevole sulla morfologia delle impalcature.
La capacità dell'impalcatura di assorbire il fluido biologico è fondamentale per valutarne l'idoneità come portatore di farmaci. La proprietà di assorbimento dell'acqua non solo influisce sulla forma dell'impalcatura, ma influisce anche sulla crescita cellulare. È stato osservato che l'impalcatura CL aveva mostrato un tasso di assorbimento dell'acqua inferiore rispetto all'impalcatura NCL, che può essere attribuito al collegamento incrociato dell'impalcatura. Inoltre, l'idrofilidicità del materiale dell'impalcatura è stata significativamente ridotta dopo il reticolamento a causa (i) della perdita di gruppi idrofili (>COOH & -NH) nel processo di formazione del collegamento dell'ammide; — inibizione del gonfiore mediante la formazione di nuovi legami (O=C-NH). Questi risultati sono in buoni rapporti con le relazioni precedentemente pubblicate 23,24.
Uno studio enzimatico di biodegradazione è stato effettuato monitorando la percentuale di una massa residua dopo sette giorni di incubazione nel fluido liquido della ferita simulato di pH 7,4, comprendente lisozima. L'impalcatura NCL ha mostrato un tasso di degradazione più rapido inizialmente nei primi tre giorni e è diminuita lentamente per quattro giorni consecutivi. Dall'altro lato, l'impalcatura CL mostrava una prolungata velocità di degradazione. Il collegamento incrociato dell'impalcatura ha migliorato le proprietà meccaniche e la resistenza alla rete che, a sua volta, ha comportato una diminuzione del tasso di degradazione, dimostrando una migliore resistenza alla degradazione.
Sono stati eseguiti studi sul rilascio di farmaci per impalcature CL e NCL per 120 h. In generale, il coefficiente di rilascio del farmaco dell'impalcatura diminuisce con l'aumentare della densità di reti incrociate a causa delle maggiori interconnessioni tra i pori e della diminuzione dello spazio tra le catene polipeptidiche. Il coefficiente di rilascio del farmaco è anche influenzato dall'indice di porosità, dal contenuto di acqua, dall'indice di gonfiore e dal grado di reticolo. Nel nostro studio, il 27,92±3,45% e il 63,15±3,78% del DOX dall'impalcatura NCL, mentre il 16,54±2,21% e il 44,43±3,57% del DOX dall'impalcatura CL sono stati rilasciati rispettivamente a 1 h e 6 ore. Dopo 24 ore, c'è stato un rilascio del 70% di DOX dall'impalcatura NCL, mentre; L'impalcatura CL ha impiegato più di 72 ore per rilasciare il 70% del DOX. I risultati hanno mostrato che il collegamento incrociato dell'impalcatura ha influenzato inversamente il rilascio di DOX diminuendo il rapporto di gonfiore e il contenuto di acqua.
Studi antibatterici in vitro
L'estratto di impalcatura DOX-CL ha mostrato una maggiore attività inibitoria (MIC) contro gli organismi gram-positivi. L'attività più elevata dell'estratto di impalcatura DOX-CL potrebbe essere a causa dell'aumento dell'idrofobicità del campione. Tuttavia, l'estratto di impalcatura DOX-CL mostrava un'attività minima contro gli organismi gram-negativi, probabilmente a causa di un fallimento della penetrazione della parete cellulare. Inoltre, il MIC di DOX-CL era relativamente più alto dei campioni CS, CL e DOX, che possono essere attribuiti all'attività sinergica di DOX e CS nell'estratto DOX-CL.
Studio sulla biocompatibilità in vitro
Lo studio di biocompatibilità in vitro è stato eseguito su cellule fibroblatrici (3T3-L1). I fibroblasti sono responsabili della produzione di ECM e proteine. Inoltre, svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'integrità strutturale migliorando la formazione del quadro necessario per la guarigione delle ferite. I risultati mostrano che l'impalcatura DOX-CL e l'impalcatura CL non hanno prodotto alcuna citotossicità cellulare. Tuttavia, entrambi i gruppi di impalcature sono stati osservati con la crescita cellulare e la differenziazione dei fibroblasti nei pori dell'impalcatura, indicando che le impalcature preparate erano biocompatibili. L'aumento della crescita cellulare e la differenziazione in entrambi i gruppi erano principalmente dovuti alla presenza di CS e COL come matrice extracellulare nella struttura dell'impalcatura.
Inoltre, con il gruppo di impalcature DOX-CL è stata osservata una crescita cellulare relativamente più elevata di quella dell'impalcatura CL a causa dell'attivazione del segnale PI3K-AKT da parte di DOX, responsabile della crescita cellulare e della sopravvivenza 25.
Studi di guarigione delle ferite in vivo
Le varie complicazioni del DM sono responsabili della guarigione prolungata di DW. Per imitare la condizione diabetica nei ratti, è stata somministrata una dieta ricca di grassi, seguita da un'iniezione intraperitoneale di STZ. Dopo 2-3 giorni di conferma diabetica, le ferite aperte sono state create dall'escissione della pelle nella regione toracica dorsale. Il trattamento è stato effettuato per 21 giorni con le rispettive impalcature. La riduzione dell'area della ferita è stata determinata per tutti i gruppi nei giorni 0, 7, 14 e 21. I ratti diabetici trattati con l'impalcatura DOX-CL presentavano un grado significativo di contrazione della ferita rispetto ai gruppi di impalcature CL e ai gruppi non trattati.
La fase infiammatoria della guarigione delle ferite è responsabile della formazione di barriere funzionali. Nella fase successiva, la fase proliferativa della guarigione delle ferite attira l'attenzione nella cura delle ferite, in cui è stato osservato il 43% della riduzione dell'area della ferita con il gruppo di impalcature DOX-CL. In confronto, solo il 23% e il 7% sono stati osservati con impalcature CL e gruppi non trattati rispettivamente il giorno 7. Dalle immagini ( Figura5), la contrazione della ferita è stata iniziata dopo il completamento della fase infiammatoria e proliferativa. Il gruppo di impalcature DOX-CL ha mostrato una significativa contrazione della ferita a causa della presenza di DOX, che è responsabile degli effetti antinfiammatori e anti-infettivi. Inoltre, COL e CS nell'impalcatura hanno aiutato la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare con conseguente guarigione del 99% della DW in 21 giorni.
Ferite escisionali non trattate mostravano neutrofili, linfociti e monociti il giorno 7 postinjury. Come detto in precedenza, i neutrofili aiutano nel debridemento delle ferite nella fase iniziale della guarigione delle ferite. Inoltre, la sovrabbondanza di neutrofili può influenzare negativamente il processo di guarigione danneggiando il tessuto normale. Come riportato da Dovi et al., un numero minimo di neutrofili accelera il processo di roelitelizzazione 26.
Inoltre, l'aumento dei macrofagi, degli istiociti e delle massicce cellule multinucleate nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL favorì l'ambiente per una guarigione accelerata delle ferite riparando le cellule danneggiate e promuovendo la sintesi col. Inoltre, l'amalgama col con il tessuto è stata determinata utilizzando i livelli di idrossiprolina in tutti i gruppi. Tuttavia, con il gruppo trattato con impalcatura DOX-CL sono stati osservati livelli di idrossiprolina relativamente più elevati rispetto al gruppo trattato con impalcature non trattate e CL. Come affermato in letteratura, la fase infiammatoria prolungata nella condizione diabetica ostacola le altre fasi di guarigione. Il tasso più veloce di contrazione della ferita nell'impalcatura DOX-CL può essere attribuito alla proprietà antinfiammatoria del DOX, con il risultato che le ulteriori fasi della ferita si verificano nella fase di tempo corretta che porta alla guarigione accelerata della ferita.
La stima biochimica dei livelli di MMP-9 utilizzando il test ELISA rivela che il gruppo trattato con impalcature DOX-CL ha mostrato livelli ridotti di MMP-9 rispetto a quelli nei gruppi trattati con impalcature CL e non trattati. Secondo la letteratura, aumento dei livelli di MMP-9 responsabile della degradazione della matrice, che, a sua volta, prolunga il processo di guarigione delle ferite. Dox, un agente antinfiammatorio, ha inibito i livelli di MMP-9, che è considerato il motivo per prevenire la rottura del COL, con conseguente guarigione accelerata del DW. Questi risultati sono in accordo con i precedenti studi pubblicati da Lindeman et al., 2009 e Zhang et al., 2014 27,28.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Ashish D Wadhwani. (Professore assistente e capo, Dipartimento di biotecnologie farmaceutiche, JSS College of Pharmacy, Ooty, India) per l'assistenza negli studi di vitalità cellulare in vitro.
Gli autori ringraziano il Dipartimento di Scienza e Tecnologia - Fondo per il miglioramento delle infrastrutture scientifiche e tecnologiche nelle università e nelle istituzioni educative superiori (DST-FIST), Nuova Delhi, per aver supportato il nostro dipartimento.
Gli autori ringraziano anche il Sig. Sanju. S e il signor Sriram. Narukulla M. Pharm studenti per il loro supporto nelle riprese video.
Questa ricerca è stata supportata dalla JSS Academy of Higher Education & Research (JSSAHER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
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