Summary
Здесь мы представляем протокол для получения большого количества экзосом GMP-класса из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости с использованием 3D-биореактора.
Abstract
Экзосомы, секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), были предложены в качестве перспективных кандидатов для травм хряща и лечения остеоартрита. Экзосомы для клинического применения требуют крупномасштабного производства. С этой целью МСК синовиальной жидкости человека (hSF-МСК) выращивали на бусинах микроносителей, а затем культивировали в динамической трехмерной (3D) системе культивирования. Используя 3D-динамическую культуру, этот протокол успешно получил крупномасштабные экзосомы из супернатантов культуры SF-MSC. Экзосомы были собраны методом ультрацентрифугирования и проверены просвечивающим электронным микроскопом, анализом передачи наночастиц и западным блоттингом. Также выявлена микробиологическая безопасность экзосом. Результаты обнаружения экзосом свидетельствуют о том, что этот подход может привести к образованию большого количества экзосом надлежащей производственной практики (GMP). Эти экзосомы могут быть использованы в исследованиях биологии экзосом и клинического лечения остеоартрита.
Introduction
Остеоартрит (ОА), возникающий в результате разрушения суставного хряща и лежащей в его основе кости, остается серьезной проблемой, приводящей к инвалидности 1,2. Без крово- и нервного снабжения способность хряща к самовосстановлению минимальна после травмирования 3,4. В последние десятилетия методы лечения, основанные на аутологичной имплантации хондроцитов (ACI), достигли некоторого прогресса в лечении ОА5. Для выделения и расширения хондроцитов необходим сбор небольшого хряща из ненесущей области сустава ОА, что приводит к травмам хряща. Также процедура потребует повторной операции по имплантации расширенных хондроцитов6. Таким образом, одноэтапная терапия для лечения ОА без повреждений хряща находится в стадии обширного изучения.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были предложены в качестве перспективных альтернатив для лечения ОА 7,8. Происходящие из нескольких тканей, МСК могут дифференцироваться в хондроциты со специфической стимуляцией. Важно отметить, что МСК могут модулировать иммунные реакции с помощью противовоспалительногосредства 9. Таким образом, МСК обладают значительными преимуществами в лечении ОА, восстанавливая дефекты хряща и модулируя иммунный ответ, особенно в среде воспаления. Для лечения ОА МСК из синовиальной жидкости (SF-МСК) в последнее время привлекли большое внимание из-за их более сильной способности дифференцировки хондроцитов, чем другие источники МСК10,11. Примечательно, что в ортопедической клинике удаление воспалительной СФ из полости сустава является рутинной терапией для облегчения болевого симптома пациентов с ОА. Экстрагированная воспалительная НФ обычно утилизируется как медицинские отходы. Как пациенты, так и врачи готовы рассматривать аутологичные МСК, выделенные из воспалительной СФ, как лечение ОА с очень небольшим количеством этических конфликтов. Тем не менее, терапия SF-MSC скомпрометирована из-за опухолевых рисков, длительного хранения и отдаленных барьеров транспортировки.
Экзосомы, секретируемые многими типами клеток, включая МСК, несут большую часть биоинформации родительских клеток. Он был подробно исследован как бесклеточная терапия12,13. Согласно обновленным ресурсам, доступным на веб-сайте правительства по клиническим испытаниям (ClinicalTrials.gov), начинаются и проводятся более обширные клинические исследования экзосом в областях исследований рака, гипертонии и нейродегенеративных заболеваний. Лечение экзосом SF-MSC может быть захватывающим и сложным испытанием, чтобы справиться с ОА. Надлежащая производственная практика (GMP) и крупномасштабное производство экзосом имеют важное значение для клинического перевода. Мелкомасштабная изоляция экзосом была широко выполнена на основе двумерной (2D) клеточной культуры. Однако крупномасштабные стратегии производства экзосом нуждаются в оптимизации. В этом исследовании был разработан крупномасштабный метод производства экзосом, основанный на массивной культуре SF-MSC в условиях, свободных от ксено. После ультрацентрифугирования из супернатантов клеточной культуры была подтверждена безопасность и функция экзосом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Комитетом по этике человека Второй народной больницы Шэньчжэня. Принципиальная схема экзосом, выделенных из протокола hSF-MSC in vitro , показана на рисунке 1.
1. Культура и идентификация человека SF-MSC
- Соберите 20 мл SF с помощью шприца и иглы у клинических пациентов с ОА.
- Продезинфицируйте коленный сустав пациента с ОА. Пункция из сухожилия четырехглавой мышцы femoris вне надколенника в суставную полость с помощью иглы 7#.
- Экстракт 10 мл суставной жидкости. Накройте место прокола трансфузионной палочкой и надавите в течение 5 мин.
- Выбрасывайте супернатант SF после центрифугирования при 1 500 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Повторно суспендировать ячейку гранулы 10 мл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS), центрифугу при 1,500 x g в течение 10 мин при 4 °C и выбросить PBS.
- Повторно суспендируют гранулу 10 мл питательной среды MSC человека при плотности клеток 5 х 104 клеток/мл (см. Таблицу материалов), а затем нанесите суспензию в тарелку диаметром 100 мм.
- Инкубировать блюдо при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO2.
- Через 48 ч удалите неадгезивные клетки, изменив среду, и промыть 1x PBS. Заменяйте среду каждые 3 дня в течение 2 недель.
- Соберите супернатанты клеточной культуры.
- Идентификация SF-MSC с помощью проточной цитометрии.
- Переваривайте третье поколение (P3) SF-МСК, центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и соберите гранулу ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж распознается как субкультура клеток к другому культуральному блюду. Первичные клетки, выделенные из SF и посеянные на посуде, помечены как нулевой пассаж (P0). При слиянии примерно на 75% клетки перевариваются и отделяются от блюд, высеваются на другие блюда и маркируются как P1. - Добавьте 400 мкл блокирующего буфера (1% BSA в 1x PBS) в гранулу ячейки (5 x 104) и дайте ей постоять в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
- Центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин при 4 °C, выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл 1x PBS.
- Добавьте 1 мкл моноклонального флуоресцентного антитела CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (коэффициент разведения 1:100) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
- Дважды вымойте 1x PBS и выбросьте супернатант. Соберите гранулу ячейки и повторно суспендируйте в 100 мкл 1x PBS.
- Обнаружение на проточном цитометре до 10 000 клеток с помощью фильтров 525/50 и 585/40 для обнаружения флуорофоров.
- Переваривайте третье поколение (P3) SF-МСК, центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и соберите гранулу ячейки.
2.3D культура клеток биореактора
- Подготовка микронесущих
- Набухают сухими 0,75 г микроносителей (см. Таблицу материалов) и увлажняют в 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 мл/г микроносителей) в течение не менее 3 ч при RT.
- Декантируйте супернатант и мойте микроносители в течение 5 мин в свежем DPBS (50 мл/г микроносителей). Выбросьте PBS и замените его свежим 1x DPBS (50 мл / г микроносителей).
- Стерилизуйте микроносители автоклавированием (121 °C, 15 мин, 15 фунтов на кв. дюйм). Дайте стерилизованным микроносителям осесть, декантируйте супернатант.
- Кратко смойте микроносители в питательной среде (50 мл/г микроносителей) на RT. Дайте микроносителям осесть, выбросьте супернатант.
- Перфузионный биореактор
- Стерилизуют биореактор автоклавированием (121 °C, 15 мин, 15 psi).
- Подсчитайте количество SF-МСК и выделите 2,5 х 107 SF-МСК и микроносителей в биореактор, перфузированный питательной средой MSC класса GMP (250 мл).
- Поместите биореактор в инкубатор с 5% CO2 при 37 °C. Вращайте биореактор со скоростью 15 об/мин. Меняйте культуральную среду каждые 6 дней.
- Собирают в культуре клеток супернатанты и микроносители для дальнейшего анализа после культивирования в течение 14 дней.
3. Идентификация экзосом и обнаружение безопасности
- Ультрацентрифугирование
- Центрифугируют супернатант клеточной культуры при 300 х г в течение 10 мин при 4°С и собирают супернатант; выбросьте клеточный мусор.
- Центрифугировать супернатанты при 2 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и собирать супернатант; отбросить более крупные везикулы (апоптотические тела и некоторые более крупные микровезикулы).
- Центрифугировать супернатант снова при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C для удаления более крупных везикул; собрать гранулы и повторно суспендировать в 40 мл 1x PBS.
- Центрифугируют повторно суспендированные гранулы при 120 000 х г в течение 70 мин при 4 °C, выбрасывают супернатант и повторно суспендируют гранулы, содержащие экзосомы, в 500 мкл 1x PBS.
- Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого прогона 500 мкл образца вводили в камеру со скоростью потока 30 мкл/мин. Выполните анализ при температуре 24,4 °C -24,5 °C.- Разбавляют свежеизолированные образцы экзосом стерильными 1x PBS на 1 мл, содержащими 107-10 9 /мл частиц, и вводят их в систему анализа отслеживания наночастиц (см. Таблицу материалов).
- Вручную настройте систему захвата и анализа в соответствии с протоколом производителя. Визуализируйте частицы с помощью лазерного рассеяния света и захватите их броуновское движение на цифровом видео.
- Анализируйте записанные видеокассеты с помощью программного обеспечения (см. Таблицу материалов) на основе отслеживания не менее 200 отдельных частиц за прогон.
- Просвечивающая электронная микроскопия
- Зафиксируйте экзосомы в 4% параформальдегиде (в холодном 1x DPBS) в течение 5 мин.
- Установите 5 мкл экзосом на медные решетки. В этом эксперименте концентрация экзосом составляет 1 мг/мл, количественно определяемая набором для анализа белка (см. Таблицу материалов).
- Вставить экзосомы в 3% фосфовольфрамовую кислоту в течение 10 мин на льду. Удалите избыток кислоты и высушите образцы на RT.
- Изображение образцов экзосом с помощью ТЭМ при напряжении ускорения 100 кВ.
- Вестерн блоттинг
- Добавьте к экзосомам 300 мкл лизисного буфера (1% тритона X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, рН 7) и коктейль ингибиторов протеазы (см. Таблицу материалов).
- Смешайте экзосомы в буфере лизиса путем пипетки вверх и вниз и дайте ему постоять на льду в течение 20 минут.
- Центрифугируют смесь при 9,391 х г в течение 10 мин при 4 °C и собирают надосадочное вещество. Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 100 мкл 4x буфера белковой нагрузки и нагрейте при 100 °C в течение 10 мин.
- Загружают 15 мкл белков в концентрации 10 мг/мл и запускают гелевым электрофорезом (120 В, 70 мин) и электроблоттингом при 100 В, 60 мин при 4 °С.
- Обнаружение неэкзосом-специфических маркеров (кальнексин) и экзосомальных биомаркеров (CD9, CD63 и CD81) путем флуоресцентного западного блоттинга (см. Таблицу материалов).
- Испытание на безопасность
- Для обнаружения бактерий, грибков и микобактерий туберкулеза выполните шаги 3.5.2-3.5.5.
- Посейте 100 мкл раствора экзосомы (1 мг/мл) на культуральную пластину агара крови (см. Таблицу материалов) и инкубируйте культуральную пластину при 37 °C в течение 24 ч.
- Посеять 100 мкл раствора экзосомы (1 мг/мл) на средней пластине агара сабуро (см. Таблицу материалов) и инкубировать при 35 °С в течение 48 ч.
- Посейте 100 мкл раствора экзосомы (1 мг/мл) на пластине культуральной среды Лоуэнсштейна-Йенсена (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение 3 недель.
- Обнаружение появления бактерий, грибков и колоний микобактерий туберкулеза путем макроскопического наблюдения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критериями оценки безопасности экзосом являются отсутствие микроорганизмов на культуральной пластине. - Для обнаружения микоплазмы выполните действия 3.5.7-3.5.9.
- Повторно суспендируют экзосомы в 50 мкл буферного раствора, входящего в комплект, и нагревают при 95 °C в течение 3 мин.
- Амплифицируйте микоплазму в экзосомном растворе с помощью набора для детектирования микоплазмы ПЦР (см. Таблицу материалов).
- Обнаруживают препараты ПЦР на 1,5% агарозном гелевом электрофорезе (30 мин, 120 В).
4. Обнаружение функции экзосом in vitro
- Маркировка экзосом
- Этикетка 100 мкл экзосом (1 мг/мл) с 1 мМ Dil (1000x) (см. Таблицу материалов) и инкубация на RT в течение 30 мин.
- Восстанавливают экзосомы ультрацентрифугированием при 100 000 х г в течение 70 мин. Повторно суспендировать гранулу в 500 мкл 1x PBS.
- Загрузка Cy3-miR-140 имитирует в экзосомы
- Смешайте 1 мкг/мкл экзосомального белка и 5 мкмоль/мл Cy3-miR-140 в конечном объеме 400 мкл электропорационного буфера (1,15 мМ фосфата калия (рН 7,2), 25 мМ хлорида калия и 21% (v/v) (см. Таблицу материалов).
- Переведите смесь в холодные электропорационные кюветы 0,4 см и электропорат с емкостью 300 В/100 мкФ с помощью системы трансфекции генов (см. Таблицу материалов).
- Сразу после электропорации выдерживайте смесь при РТ в течение 30 мин, чтобы обеспечить полное восстановление экзосомной мембраны.
- Обрабатывайте смеси одной единицей РНКазы А (см. Таблицу материалов) в течение 20 мин для устранения имитации миРНК вне экзосом.
- Ультрацентрифугируйте экзосомную смесь при 120 000 х г в течение 90 мин, отбросьте надосадочную и повторно суспендируйте экзосомы в 500 мкл 1x PBS.
- Анализ поглощения экзосом
- Засейте хондроциты (1 х 107) в 35 мм конфокальные блюда 1 мл DMEM/F12, содержащий 10% FBS.
- Через 24 ч обрабатывают хондроциты диI-мечеными экзосомами (100 нг/мл) или экзосомами, нагруженными cy3-miR-140 (100 нг/мл) в течение 1 ч.
- Трижды вымойте 1x PBS, а затем нанесите этикетку с помощью DAPI (10 нг/мл) в течение 10 минут при RT.
- Запись флуоресцентного сигнала в конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии (CLSM) с использованием соответствующих фильтров (см. Таблицу материалов).
5. Статистический анализ
- Выполнять статистический анализ с использованием соответствующего статистического программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные на каждом рисунке были выражены как среднее ± УР. T-тест студента использовался для сравнения двух групп с использованием статистического программного обеспечения. Односторонняя ANOVA с последующим мультипликатором Туки была выполнена в случае сравнения между несколькими группами. Значения P <0,05 (*), <0,01 (**) или <0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Проточная цитометрия использовалась для идентификации поверхностных маркеров SF-МСК в соответствии с минимальными критериями для определения МСК человека, рекомендованными Международным обществом клеточной терапии14,15. Анализ проточной цитометрии показал, что SF-MSC, культивируемые в этом исследовании, соответствовали критериям идентификации МСК. Они были отрицательными для CD34, CD45 и HLA-DR (ниже 3%) и положительными для CD73, CD90 и CD105 (выше 95%) (рисунок 2).
При инвертированной микроскопии было замечено, что SF-МСК размножаются на микроносителях (рисунок 3А). После того, как клетки были переварены и вымыты из 2D-культуральной пластины и микроносителей 3D-культуры, количество клеток подсчитывали. По сравнению с 2D-культурой, 3D-культура индуцировала более быстрое распространение SF-MSC с 6 дней (рисунок 3B). Были представлены результаты трех независимых экспериментов.
Для идентификации экзосом (Exos) из SF-MSC 2D и 3D культуры были обнаружены экзосомно-ассоциированные белки (CD63, CD9 и CD81) и отрицательный белок (кальнексин) с использованием западного блоттинга. Результаты показали, что 2D-Exos и 3D-Exos экспрессируют CD63, CD9 и CD81, в то время как они отрицательны для кальнексина (рисунок 4A). Кроме того, диаметр экзосомы и морфология были проанализированы с использованием NTA и TEM. Наноприцел-анализ показал, что диаметр 2D-Exos (рисунок 4B) и 3D-Exos (рисунок 4D) составляет примерно 120 нм. Анализ трансмиссионного электронного микроскопа выявил морфологию 2D-Exos и 3D-Exos, показывая примерно сфероидальные везикулы (рисунок 4C, E).
После 3D-культуры концентрация частиц размером 30-160 нм составляет 4,0 х 106 на мл, проанализированных с использованием NTA. Однако после 2D культуры концентрация частиц 30-160 нм частиц составляет 2,5 х 106 на мл (рисунок 5А). При расчете выхода экзосомного белка в среде 3D-культура продуцировала больше экзосомного белка, чем 2D-культура (рисунок 5B). Таким образом, по сравнению с 2D-культурой, 3D-культура значительно увеличила выход экзосом.
Экзосомы сначала маркировали Дилом, а затем инкубировали в концентрации 10 мкг/мл с хондроцитами в течение 1 ч, 2 ч и 3 ч, чтобы изучить, могут ли экзосомы проникать в первичные хондроциты in vitro. Дил-меченые экзосомы входили в первичные хондроциты, причем пик наблюдался через 3 ч (рисунок 6).
Чтобы обнаружить функцию экзосом как нанонесущих, экзосомы нагружали Cy3-меченым miR-140 посредством электропорации, а затем обрабатывали хондроцитами в концентрации 10 мкг/мл в течение 3 ч. Результаты показали, что экзосомы могут доставлять miR-140 к хондроцитам (рисунок 7). Все результаты соответствовали спецификациям; все образцы были стерильными и отрицательными на микоплазму.
Рисунок 1: Принципиальная схема экзосом, выделенных из hSF-MSC in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Идентификация SF-MSC с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия показывает положительный или отрицательный иммунофенотип hSF-МСК. (A) Маркировка контрольным антителом изотипа IgG1. (B) CD73 является положительным, а CD34 отрицательным. (C) CD90 является положительным, а CD45 отрицательным. (D) CD105 является положительным, а HLA-DR отрицательным, известным как маркеры MSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Кривая роста SF-MSC. (A) Репрезентативные изображения, показывающие SF-MSC (красные стрелки) на микроносителях при инвертированной микроскопии (шкала = 100 мкм). (B) Кривая роста SF-MSC при 2D и 3D культуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Идентификация экзосом. (A) Результаты вестерн-блоттинга 2D-Exos и 3D-Exos. (B) Наноприцелевой анализ диаметра 2D-Exos и 3D-Exos. (C) Обнаружение ТЕА морфологии 2D-Exos и 3D-Exos. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Повышенный выход производства экзосом культурой 3D-биореактора. (A) Репрезентативные результаты размера экзосом, проанализированные NTA. (B) Выход белка = экзосомальный белок (мкг)/кондиционированная среда (мл). Графики показывают выход для каждого метода и среднее ± SD всех измерений (** p < 0,01). Статистические сравнения проводились односторонним ANOVA с пост-специальной коррекцией Бонферрони и t-тестом Стьюдента. ** p < 0,01 было сочтено существенным отличием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6 Репрезентативные изображения, показывающие интернализацию dil-меченых экзосом первичными хондроцитами. Хондроциты инкубировали с Dil-мечеными экзосомами в течение 1 ч, 2 ч и 3 ч. Экзосомы были помечены Dil (красный), а ядра были помечены Hoechst (синий). Образцы были обнаружены при 60-кратном увеличении. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Доставка in vitro miR-140 экзосомами MSC. После приема Cy3-меченого miR-140, который был инкапсулирован в экзосомах, полученных из SF-MSCs, хондроциты были визуализированы. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мезенхимальные стволовые клетки широко используются в регенеративной медицине благодаря их самообновлению, дифференцированному в тканевые клетки со специализированными функциями и паракринным эффектам16,17. Примечательно, что паракринные эффекты, оказываемые экзосомами, привлекли большое внимание18. Экзосомы несут биоинформацию МСК и выполняют свою биологическую функцию и преодолевают недостатки МСК, такие как проблемное хранение и транспортировка. Таким образом, экзосомы, полученные из МСК, использовались для терапевтических вмешательств, которые привлекли наибольшее внимание в терапии ОА.
В настоящее время существует два метода распространения МСК: 2D-культура и трехмерная (3D) культура19. 2D-культура является традиционным способом культивирования МСК для исследований in vitro с низкими затратами. Однако это отнимает много времени и ограничен по масштабу потенциал. Кроме того, размножение MSC в 2D микросреде быстро выводит стволовость20,21, одну из наиболее критических характеристик МСК. Таким образом, 2D культура не может соответствовать требованиям, предъявляемым к МСК-терапии. В этом исследовании, с целью SF-MSC в терапии ОА, мы стремимся поддерживать характеристики SF-MSC, используя культуру 3D-биореактора, который может более точно имитировать биологическую микросреду. В последнее время другие исследователи использовали каркасы или 3D на основе микронесущих для культивирования МСК. Мы обнаружили, что 3D-коллагеновые каркасы позволяют создавать более концентрированные экзосомы, продуцируемые МСК, полученными из костного мозга человека, чем 2D-культура23.
Поскольку экзосомы могут выполнять большую часть функции MSC, избегая некоторых недостатков МСК, мы стремимся производить экзосомы для терапии ОА. Это исследование также выявило функцию производства и доставки экзосом с использованием этой системы, основанную на большом количестве и высоком качестве распространения MSC 3D-культуры. Система ротационной клеточной культуры (RCCS) использовалась для 3D-культуры для получения экзосом из крупномасштабного распространения MSC. По сравнению с традиционной 2D-культурой колбы, эта система 3D-культуры может избежать загрязнения от повторного изменения среды и прохождения клеток. Что еще более важно, это исследование показало, что 3D-биореактор может улучшить производство экзосом для удовлетворения требований клинического исследования. Следует отметить, что экзосомы, выделенные из супернатантов 3D-культуры, могут доставлять микроРНК в клетки, предполагая, что 3D-культура не влияет на функцию экзосом. Результаты обнаружения микробов и эндотоксинов еще раз подтверждают, что это исследование установило протокол, который может производить экзосомы, которые биологически безопасны и перспективны для терапии ОА. В настоящее время количество экзосом, полученное в этом исследовании, не может удовлетворить коммерческие потребности. Следовательно, необходимо разработать стратегии для производства огромного количества экзосом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Национальный фонд естественных наук Китая (No 81972116, No 81972085, No 81772394); Ключевая программа Фонда естественных наук провинции Гуандун (No2018B0303110003); Гуандунский проект международного сотрудничества (No 2021A0505030011); Шэньчжэньские научно-технические проекты (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Китайский постдокторский научный фонд (No 2020M682907); Гуандунский фонд фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (No 2021A1515010985); Санминский медицинский проект в Шэньчжэне (SZSM201612079); Специальные фонды для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
