Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.
Abstract
Exosomen, die von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgesondert werden, wurden als vielversprechende Kandidaten für Knorpelverletzungen und die Behandlung von Arthrose vorgeschlagen. Exosomen für die klinische Anwendung erfordern eine großtechnische Produktion. Zu diesem Zweck wurden humane Synovialflüssigkeits-MSCs (hSF-MSCs) auf Mikroträgerperlen gezüchtet und dann in einem dynamischen dreidimensionalen (3D) Kultursystem kultiviert. Durch die Verwendung einer dynamischen 3D-Kultur gelang es diesem Protokoll, großräumige Exosomen aus SF-MSC-Kulturüberständen zu erhalten. Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation geerntet und durch ein Transmissionselektronenmikroskop, Nanopartikel-Transmissionsassay und Western Blotting verifiziert. Auch die mikrobiologische Sicherheit von Exosomen wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse des Exosomennachweises deuten darauf hin, dass dieser Ansatz eine große Anzahl von GMP-Exosomen (Good Manufacturing Practices) hervorbringen kann. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthrosebehandlung verwendet werden.
Introduction
Osteoarthritis (OA), die aus Gelenkknorpel und darunterliegendem Knochenabbau resultiert, bleibt eine schwere Herausforderung, die zu Behinderungen führt 1,2. Ohne Blut- und Nervenversorgung ist die Selbstheilungsfähigkeit des Knorpels minimal, sobald er verletzt ist 3,4. In den letzten Jahrzehnten haben Therapien, die auf autologer Chondrozytenimplantation (ACI) basieren, einige Fortschritte in der OA-Behandlung gemacht5. Für die Isolierung und Expansion von Chondrozyten ist die Ernte kleiner Knorpel aus dem nicht belastenden Bereich des OA-Gelenks erforderlich, was zu Verletzungen des Knorpels führt. Außerdem erfordert das Verfahren eine zweite Operation, um die expandierten Chondrozyten zu implantieren6. Daher werden einstufige Therapien für die OA-Behandlung ohne Knorpelverletzungen intensiv erforscht.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als vielversprechende Alternativen für die OA-Behandlung vorgeschlagen 7,8. MSCs stammen aus mehreren Geweben und können sich mit spezifischer Stimulation in Chondrozyten differenzieren. Wichtig ist, dass MSCs Immunantworten über entzündungshemmende Mittel modulieren können9. Daher haben MSCs signifikante Vorteile bei der OA-Behandlung, indem sie Knorpeldefekte reparieren und die Immunantwort modulieren, insbesondere im Entzündungsmilieu. Für die OA-Behandlung haben MSCs aus Synovialflüssigkeit (SF-MSCs) in letzter Zeit aufgrund ihrer stärkeren Chondrozytendifferenzierungsfähigkeit als andere MSC-Quellen viel Aufmerksamkeit erregt10,11. Insbesondere in der orthopädischen Klinik ist die Extraktion von entzündlicher SF aus der Gelenkhöhle eine Routinetherapie zur Linderung der Schmerzsymptome von OA-Patienten. Extrahierte entzündliche SF wird normalerweise als medizinischer Abfall entsorgt. Sowohl Patienten als auch Ärzte sind bereit, autologe MSCs, die aus der entzündlichen SF isoliert wurden, als OA-Behandlung mit sehr wenigen ethischen Konflikten in Betracht zu ziehen. Die SF-MSC-Therapie ist jedoch aufgrund von tumorigenen Risiken, Langzeitlagerung und entfernten Transportbarrieren beeinträchtigt.
Exosomen, die von vielen Zelltypen, einschließlich MSCs, sezerniert werden, tragen die meisten Bioinformationen der Elternzelle. Es wurde eingehend als zellfreie Therapieuntersucht 12,13. Laut den aktualisierten Ressourcen, die auf der Website der Regierung für klinische Studien (ClinicalTrials.gov) verfügbar sind, werden umfangreichere klinische Exosomenstudien in den Forschungsbereichen Krebs, Bluthochdruck und neurodegenerative Erkrankungen initiiert und durchgeführt. Die SF-MSC-Exosomenbehandlung könnte eine aufregende und herausfordernde Studie sein, um mit OA fertig zu werden. Good Manufacturing Practice (GMP)-Qualität und großflächige Exosomenproduktion sind für die klinische Translation unerlässlich. Die Exosomenisolierung in kleinem Maßstab wurde auf der Grundlage einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur durchgeführt. Großflächige Exosomenproduktionsstrategien müssen jedoch optimiert werden. In dieser Studie wurde eine groß angelegte Exosomenherstellungsmethode entwickelt, die auf einer massiven SF-MSC-Kultur unter xenofreien Bedingungen basiert. Nach Ultrazentrifugation aus Zellkulturüberständen wurden die Sicherheit und Funktion von Exosomen validiert.
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Protocol
Diese Studie wurde vom Human Ethics Committee des Shenzhen Second People's Hospital genehmigt. Ein schematisches Diagramm der aus hSF-MSCs isolierten Exosomen im vitro-Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Kultur und Identifikation menschlicher SF-MSCs
- Ernten Sie 20 ml SF mit einer Spritze und Nadel von klinischen OA-Patienten.
- Desinfizieren Sie das Kniegelenk des OA-Patienten. Punktion von der Quadrizeps femoris-Sehne außerhalb der Patella in die Gelenkhöhle mit einer 7 # Nadel.
- Extrahieren Sie 10 ml der Gelenkflüssigkeit. Die Einstichstelle mit dem Transfusionsstift abdecken und 5 min drücken.
- Der SF-Überstand ist nach der Zentrifugation bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C zu verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 mL 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS), zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C und verwerfen Sie das PBS.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml humanem MSC-Kulturmedium bei einer Zelldichte von 5 x 104 Zellen/ml (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Suspension dann in einer 100-mm-Schale.
- Die Schale wird bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2 inkubiert.
- Nach 48 h die nicht adhärenten Zellen durch Mediumwechsel entfernen und mit 1x PBS waschen. Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage für 2 Wochen.
- Sammeln Sie die Zellkulturüberstände.
- Identifizieren Sie SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie.
- Aufschluss der dritten Generation (P3) von SF-MSCs, Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie das Zellpellet.
HINWEIS: Eine Passage wird als Subkultur der Zellen zu einer anderen Kulturschale erkannt. Die aus SF isolierten und auf Schalen ausgesäten Primärzellen werden als Durchgang Null (P0) bezeichnet. Bei etwa 75% Zusammenfluss werden die Zellen verdaut und vom Geschirr getrennt, auf anderen Schalen ausgesät und als P1 gekennzeichnet. - 400 μL Blockierpuffer (1% BSA in 1x PBS) in das Zellpellet (5 x 104) geben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen.
- Bei 1.000 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 μL 1x PBS resuspendieren.
- 1 μL monoklonaler fluoreszierender Antikörper CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (Verdünnungsverhältnis 1:100) (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen zugeben und bei RT für 30 min inkubieren.
- Zweimal mit 1x PBS waschen und den Überstand entsorgen. Sammeln Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie es in 100 μL 1x PBS.
- Detektieren Sie auf einem Durchflusszytometer bis zu 10.000 Zellen mit Filtern von 525/50 und 585/40, um die Fluorophore zu erkennen.
- Aufschluss der dritten Generation (P3) von SF-MSCs, Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie das Zellpellet.
2.3D Bioreaktor-Zellkultur
- Mikroträger-Vorbereitung
- Die trockenen 0,75 g Mikroträger quellen lassen (siehe Materialtabelle) und hydratisieren Sie 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 ml/g Mikroträger) für mindestens 3 h bei RT.
- Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie die Mikroträger für 5 min in frischem DPBS (50 ml/g Mikroträger). Entsorgen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch frisches 1x DPBS (50 ml/g Mikroträger).
- Sterilisieren Sie die Mikroträger durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi). Lassen Sie die sterilisierten Mikroträger absetzen, dekantieren Sie den Überstand.
- Spülen Sie die Mikroträger kurz im Kulturmedium (50 ml/g Mikroträger) bei RT. Lassen Sie die Mikroträger absetzen, verwerfen Sie den Überstand.
- Perfusionsbioreaktor
- Sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Zählen Sie die Anzahl der SF-MSCs und weisen Sie dem Bioreaktor, der mit GMP-fähigem MSC-Kulturmedium (250 ml) perfundiert ist, 2,5 x 107 SF-MSCs und Mikroträger zu.
- Den Bioreaktor in einen Inkubator mit 5%CO2 bei 37 °C geben. Drehen Sie den Bioreaktor mit einer Drehzahl von 15 U/min. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 6 Tage.
- Sammeln Sie die Zellkulturüberstände und Mikroträger für die weitere Analyse nach der Kultur für 14 Tage.
3. Identifizierung von Exosomen und Sicherheitsnachweis
- Ultrazentrifugation
- Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 300 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Entsorgen Sie die Zelltrümmer.
- Zentrifugieren Sie die Überstände bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Verwerfen Sie die größeren Vesikel (apoptotische Körper und einige größere Mikrovesikel).
- Zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C, um größere Vesikel zu entfernen; Sammeln Sie die Pellets und resuspendieren Sie sie in 40 ml 1x PBS.
- Zentrifugieren Sie die resuspendierten Pellets bei 120.000 x g für 70 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets, die Exosomen enthalten, in 500 μL 1x PBS.
- Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
HINWEIS: Für jeden Durchlauf wurden 500 μL der Probe mit einer Durchflussrate von 30 μL/min in die Kammer injiziert. Führen Sie die Analyse bei 24,4 °C-24,5 °C durch.- Die frisch isolierten Exosomenproben werden mit sterilem 1x PBS auf 1 ml mit 107-10 9 /ml Partikeln verdünnt und in das Nanopartikel-Tracking-Analysesystem injiziert (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie das Erfassungs- und Analysesystem manuell gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Visualisieren Sie die Partikel durch Laserlichtstreuung und erfassen Sie ihre Brownsche Bewegung auf digitalem Video.
- Analysieren Sie die aufgezeichneten Videobänder mit Software (siehe Materialtabelle), basierend auf der Verfolgung von mindestens 200 einzelnen Partikeln pro Lauf.
- Transmissionselektronenmikroskopie
- Fixieren Sie die Exosomen in 4% Paraformaldehyd (in kaltem 1x DPBS) für 5 min.
- Montieren Sie 5 μL der Exosomen auf Kupfergittern. In diesem Experiment beträgt die Konzentration der Exosomen 1 mg/ml, quantifiziert durch ein Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
- Die Exosomen in 3% Phosphowolframsäure für 10 min auf Eis einbetten. Entfernen Sie die überschüssige Säure und trocknen Sie die Proben bei RT.
- Stellen Sie die Exosomenproben mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV vor.
- Western Blotting
- 300 μL Lysepuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) und Proteaseinhibitor-Cocktail (siehe Materialtabelle) zu den Exosomen hinzufügen.
- Mischen Sie die Exosomen im Lysepuffer, indem Sie auf und ab pipettieren und 20 min auf Eis stehen lassen.
- Die Mischung bei 9.391 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
- 100 μL 4x Proteinladepuffer zugeben und 10 min bei 100 °C erhitzen.
- Laden Sie 15 μL Proteine in einer Konzentration von 10 mg/ml und laufen durch Gelelektrophorese (120 V, 70 min) und Elektroblotting bei 100 V, 60 min bei 4 °C.
- Nachweis der nicht-exosomenspezifischen Marker (Calnexin) und exosomalen Biomarker (CD9, CD63 und CD81) durch fluoreszierendes Western Blotting (siehe Materialtabelle).
- Sicherheitsprüfung
- Für den Nachweis von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis folgen Sie den Schritten 3.5.2-3.5.5.
- 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) werden auf eine Blutagarkulturplatte gesät (siehe Materialtabelle) und die Kulturplatte bei 37 °C für 24 h inkubiert.
- 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf eine Sabouraud-Agar-Mediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und bei 35 °C 48 h inkubiert.
- 100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf einer Lowenstein-Jensen-Kulturmediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und 3 Wochen bei 37 °C inkubiert.
- Erkennen Sie das Auftreten von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis-Kolonien durch makroskopische Beobachtung.
HINWEIS: Kriterien für die Bewertung der Sicherheit von Exosomen sind das Fehlen von Mikroorganismen auf der Kulturplatte. - Führen Sie für den Mykoplasmennachweis die Schritte 3.5.7-3.5.9 aus.
- Resuspendieren Sie die Exosomen in 50 μL Pufferlösung, die im Kit enthalten ist, und erhitzen Sie sie bei 95 °C für 3 min.
- Amplifizieren Sie das Mykoplasma in Exosomenlösung mit einem PCR-Mykoplasmen-Detektionskit (siehe Materialtabelle).
- Nachweis der PCR-Produkte auf 1,5% Agarose-Gelelektrophorese (30 min, 120 V).
4. In-vitro-Nachweis der Exosomenfunktion
- Exosomen-Markierung
- 100 μL Exosomen (1 mg/ml) mit 1 mM Dil (1000x) markieren (siehe Materialtabelle) und bei RT für 30 min inkubieren.
- Die Exosomen werden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 70 min zurückgewonnen. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL 1x PBS.
- Laden von Cy3-miR-140 imitiert Exosomen
- Mischen Sie 1 μg/μL exosomales Protein und 5 μmol/ml Cy3-miR-140 in einem Endvolumen von 400 μL Elektroporationspuffer (1,15 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), 25 mM Kaliumchlorid und 21% (v/v) (siehe Materialtabelle).
- Die Mischung wird mit einem Gentransfektionssystem in kalte 0,4 cm Elektroporationsküvetten und Elektroporat mit einer Kapazität von 300 V/100 μF überführt (siehe Materialtabelle).
- Halten Sie die Mischung unmittelbar nach der Elektroporation 30 Minuten lang bei RT, um sicherzustellen, dass die Exosomenmembran vollständig wiederhergestellt ist.
- Behandeln Sie die Mischungen mit einer Einheit RNase A (siehe Materialtabelle) für 20 Minuten, um die miRNA-Nachahmungen außerhalb der Exosomen zu eliminieren.
- Ultrazentrifugieren Sie das Exosomengemisch bei 120.000 x g für 90 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Exosomen in 500 μL 1x PBS.
- Exosomen-Aufnahmetest
- Die Chondrozyten (1 x 107) werden in 35 mm konfokalen Schalen mit 1 ml DMEM/F12 mit 10% FBS ausgesät.
- Nach 24 h behandeln Sie die Chondrozyten 1 h lang mit DiI-markierten Exosomen (100 ng/ml) oder cy3-miR-140-beladenen Exosomen (100 ng/ml).
- Dreimal mit 1x PBS waschen und dann 10 min bei RT mit DAPI (10 ng/ml) etikettieren.
- Erfassen Sie das Fluoreszenzsignal in der konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) mit den entsprechenden Filtern (siehe Materialtabelle).
5. Statistische Auswertung
- Führen Sie statistische Analysen mit geeigneter statistischer Software durch.
ANMERKUNG: Die repräsentativen Daten in jeder Abbildung wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für den Vergleich zweier Gruppen mittels Statistiksoftware verwendet. Eine Einweg-ANOVA gefolgt von Tukey's Multiple wurde bei Vergleichen zwischen mehreren Gruppen durchgeführt. P-Werte <0,05 (*), <0,01 (**) oder <0,001 (***).
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Representative Results
Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs gemäß den von der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie14,15 empfohlenen Mindestkriterien zur Definition humaner MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass SF-MSCs, die in dieser Studie kultiviert wurden, die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten. Sie waren negativ für CD34, CD45 und HLA-DR (unter 3%) und positiv für CD73, CD90 und CD105 (über 95%) (Abbildung 2).
Unter inverser Mikroskopie wurde festgestellt, dass sich die SF-MSCs auf Mikroträgern vermehren (Abbildung 3A). Nachdem die Zellen verdaut und von der 2D-Kulturplatte und den 3D-Kulturmikroträgern gewaschen wurden, wurde die Zellzahl gezählt. Im Vergleich zur 2D-Kultur führte die 3D-Kultur dazu, dass sich die SF-MSC ab 6 Tagen schneller vermehrte (Abbildung 3B). Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten wurden vorgestellt.
Um die Exosomen (Exos) aus SF-MSCs der 2D- und 3D-Kultur zu identifizieren, wurden die Exosom-assoziierten Proteine (CD63, CD9 und CD81) und das negative Protein (Calnexin) mittels Western Blotting nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass die 2D-Exos und 3D-Exos CD63, CD9 und CD81 exprimieren, während sie für Calnexin negativ sind (Abbildung 4A). Auch der Exosomendurchmesser und die Morphologie wurden mit NTA und TEM untersucht. Die Nanosight-Analyse zeigte, dass der Durchmesser von 2D-Exos (Abbildung 4B) und 3D-Exos (Abbildung 4D) etwa 120 nm beträgt. Die elektronische Transmissionsmikroskopanalyse zeigte die Morphologie von 2D-Exos und 3D-Exos und zeigte ungefähr kugelförmige Vesikel (Abbildung 4C,E).
Nach 3D-Kultur beträgt die Partikelkonzentration von 30-160 nm großen Partikeln 4,0 x 106 pro ml, analysiert mit NTA. Nach der 2D-Kultur beträgt die Partikelkonzentration von 30-160 nm-Partikeln jedoch 2,5 x 106 pro ml (Abbildung 5A). Bei der Berechnung der Exosomenproteinausbeute im Medium produzierte die 3D-Kultur mehr Exosomenprotein als die 2D-Kultur (Abbildung 5B). Im Vergleich zur 2D-Kultur verbesserte die 3D-Kultur die Exosomenausbeute signifikant.
Die Exosomen wurden zuerst mit Dil markiert und dann in einer Konzentration von 10 μg/ml mit den Chondrozyten für 1 h, 2 h und 3 h inkubiert, um zu untersuchen, ob Exosomen in vitro in primäre Chondrozyten eindringen können. Dil-markierte Exosomen traten in primäre Chondrozyten ein, wobei der Peak bei 3 h beobachtet wurde (Abbildung 6).
Um die Funktion von Exosomen als Nanoträger nachzuweisen, wurden Exosomen durch Elektroporation mit Cy3-markiertem miR-140 beladen und dann mit Chondrozyten in einer Konzentration von 10 μg/ml für 3 h behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass Exosomen miR-140 an Chondrozyten abgeben können (Abbildung 7). Alle Ergebnisse entsprachen den Spezifikationen; alle Proben waren steril und negativ für Mykoplasmen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung von Exosomen, die in vitro aus hSF-MSCs isoliert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Identifizierung von SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie. Die Durchflusszytometrie zeigt den positiven oder negativen Immunphänotyp von hSF-MSCs. (A) Markierung mit einem IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper. (B) CD73 ist positiv und CD34 ist negativ. (C) CD90 ist positiv und CD45 ist negativ. (D) CD105 ist positiv und HLA-DR ist negativ, bekannt als MSC-Marker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: SF-MSC-Wachstumskurve. (A) Repräsentative Bilder von SF-MSCs (rote Pfeile) auf Mikroträgern unter inverser Mikroskopie (Maßstabsbalken = 100 μm). (B) Die Wachstumskurve von SF-MSC unter 2D- und 3D-Kultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Identifizierung von Exosomen . (A) Western Blotting Ergebnisse der 2D-Exos und 3D-Exos. (B) Nanosight-Analyse des Durchmessers von 2D-Exos und 3D-Exos. (C) TEM-Detektion der Morphologie von 2D-Exos und 3D-Exos. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Die erhöhte Ausbeute der Exosomenproduktion durch 3D-Bioreaktorkultur . (A) Repräsentative Ergebnisse der Exosomengröße, analysiert von NTA. (B) Proteinausbeute = exosomales Protein (μg)/konditioniertes Medium (ml). Die Diagramme zeigen die Ausbeute für jede Methode und den Mittelwert ± SD aller Messungen (** p < 0,01). Statistische Vergleiche wurden mittels Einweg-ANOVA mit post-hoc-Bonferroni-Korrektur und durch Student's t-Test durchgeführt. ** p < 0,01 wurde als signifikante Differenz angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6 Repräsentative Bilder, die die Internalisierung von Dil-markierten Exosomen durch primäre Chondrozyten zeigen. Chondrozyten wurden mit Dil-markierten Exosomen für 1 h, 2 h und 3 h inkubiert. Exosomen wurden mit Dil (rot) und Kerne mit Hoechst (blau) markiert. Die Proben wurden bei 60-facher Vergrößerung detektiert. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: In-vitro-Verabreichung von miR-140 durch MSC-Exosomen . Nach der Aufnahme von Cy3-markiertem miR-140, das in SF-MSCs-abgeleiteten Exosomen eingekapselt war, wurden Chondrozyten abgebildet. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die mesenchymalen Stammzellen sind in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Selbsterneuerung, differenziert in Gewebezellen mit spezialisierten Funktionen und parakrinen Effekten weit verbreitet16,17. Insbesondere die parakrinen Wirkungen von Exosomen haben viel Aufmerksamkeit erregt18. Exosomen tragen die Bioinformationen von MSCs und erfüllen ihre biologische Funktion und überwinden MSC-Mängel wie lästige Lagerung und Transport. So wurden aus MSCs abgeleitete Exosomen für therapeutische Interventionen verwendet, die in der OA-Therapie die größte Aufmerksamkeit erregt haben.
Derzeit gibt es zwei Methoden zur Verbreitung von MSCs, die 2D-Kultur und die dreidimensionale (3D) Kultur19. Die 2D-Kultur ist eine konventionelle Methode zur Kultivierung von MSCs für In-vitro-Studien mit geringen Kosten. Es ist jedoch zeitaufwendig und in seinem Skalenpotenzial begrenzt. Auch die MSC-Ausbreitung in der 2D-Mikroumgebung leitet schnell die Stammheit20,21 ab, eine der kritischsten Eigenschaften von MSCs. Daher kann die 2D-Kultur die Anforderungen für die MSC-Therapie nicht erfüllen. In dieser Studie bemühen wir uns mit dem Ziel von SF-MSCs in der OA-Therapie, die SF-MSC-Eigenschaften mit der Kultur eines 3D-Bioreaktors zu erhalten, der die biologische Mikroumgebung genauer nachahmen kann. Kürzlich haben andere Forscher Gerüste oder Mikroträger-basiertes 3D verwendet, um MSCs zu kultivieren. Wir fanden heraus, dass die 3D-Kollagengerüste konzentriertere Exosomen ermöglichten, die von MSCs aus menschlichem Knochenmark produziert wurden, als 2D-Kultur23.
Da Exosomen einen großen Teil der MSC-Funktion übernehmen können, während sie einige Mängel von MSCs vermeiden, wollen wir Exosomen für die OA-Therapie herstellen. Diese Studie untersuchte außerdem die Exosomenproduktion und -abgabefunktion mit diesem System, basierend auf der großen Menge und hohen Qualität der MSC-Ausbreitung der 3D-Kultur. Das Rotary Cell Culture System (RCCS) wurde für die 3D-Kultur verwendet, um Exosomen aus großflächiger MSC-Vermehrung herzustellen. Im Vergleich zur herkömmlichen 2D-Kolbenkultur kann dieses 3D-Kultursystem eine Kontamination durch wiederholten Mediumwechsel und Zellpassage vermeiden. Noch wichtiger ist, dass diese Studie zeigte, dass ein 3D-Bioreaktor die Exosomenproduktion verbessern könnte, um die Anforderungen der klinischen Studie zu erfüllen. Bemerkenswert ist, dass Exosomen, die aus 3D-Kulturüberständen isoliert wurden, miRNAs in Zellen abgeben können, was darauf hindeutet, dass die 3D-Kultur die Exosomenfunktion nicht beeinträchtigt. Mikrobielle und Endotoxin-Nachweisergebnisse unterstützen weiter, dass diese Studie ein Protokoll etabliert hat, das Exosomen produzieren könnte, die biologisch sicher und vielversprechend für die OA-Therapie sind. Derzeit kann die in dieser Studie produzierte Exosomenmenge den kommerziellen Bedarf nicht decken. Daher müssen Strategien für eine enorme Menge an Exosomenproduktion entwickelt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
National Natural Science Foundation of China (Nr. 81972116, Nr. 81972085, Nr. 81772394); Schlüsselprogramm der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong International Cooperation Project (No.2021A0505030011); Shenzhen Science and Technology Projects (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Sanming Projekt der Medizin in Shenzhen (SZSM201612079); Sonderfonds für den Bau von Krankenhäusern auf hohem Niveau in der Provinz Guangdong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
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