Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera ett stort antal exosomer av GMP-kvalitet från synovialvätska mesenkymala stamceller med hjälp av en 3D-bioreaktor.
Abstract
Exosomer som utsöndras av mesenkymala stamceller (MSC) har föreslagits som lovande kandidater för broskskador och artrosbehandling. Exosomer för klinisk tillämpning kräver storskalig produktion. För detta ändamål odlades humana synovialvätska MSC (hSF-MSC) på mikrobärarpärlor och odlades sedan i ett dynamiskt tredimensionellt (3D) odlingssystem. Genom att använda 3D-dynamisk kultur erhöll detta protokoll framgångsrikt storskaliga exosomer från SF-MSC-kultursupernatanter. Exosomer skördades genom ultracentrifugering och verifierades av ett transmissionselektronmikroskop, nanopartikelöverföringsanalys och western blotting. Dessutom detekterades den mikrobiologiska säkerheten hos exosomer. Resultat av exosomdetektering tyder på att den här metoden kan producera ett stort antal exosomer av god tillverkningssed (GMP). Dessa exosomer kan användas i exosombiologisk forskning och klinisk artrosbehandling.
Introduction
Artros (OA), till följd av ledbrosk och underliggande bennedbrytning, är fortfarande en allvarlig utmaning som leder till funktionshinder 1,2. Utan blod- och nervtillförsel är broskets självläkande förmåga minimal när den väl har skadats 3,4. Under de senaste decennierna har terapier baserade på autolog kondrocytimplantation (ACI) gjort vissa framsteg i OA-behandling5. För kondrocytisolering och expansion är det nödvändigt att skörda litet brosk från OA-ledens icke-viktbärande område, vilket orsakar skador på brosket. Förfarandet kommer också att kräva en andra operation för att implantera de expanderade kondrocyterna6. Således är enstegsterapier för OA-behandling utan broskskador under omfattande utforskning.
Mesenkymala stamceller (MSC) har föreslagits som lovande alternativ för OA-behandling 7,8. MSC kommer från flera vävnader och kan differentieras till kondrocyter med specifik stimulering. Viktigt är att MSC kan modulera immunsvar via anti-inflammation9. Därför har MSC betydande fördelar vid OA-behandling genom att reparera broskdefekter och modulera immunsvaret, särskilt i inflammationsmiljön. För OA-behandling har MSC från synovialvätska (SF-MSC) nyligen väckt stor uppmärksamhet på grund av deras starkare kondrocytdifferentieringsförmåga än andra MSC-källor10,11. I synnerhet på den ortopediska kliniken är extraktionen av inflammatorisk SF från ledhålan en rutinbehandling för att lindra smärtsymptomet hos OA-patienter. Extraherad inflammatorisk SF bortskaffas vanligtvis som medicinskt avfall. Både patienter och läkare är redo att överväga autologa MSC isolerade från inflammatorisk SF som OA-behandling med mycket få etiska konflikter. SF-MSC-terapi äventyras dock på grund av tumörogena risker, långvarig lagring och avlägsna leveransbarriärer.
Exosomer, som utsöndras av många celltyper, inklusive MSC, bär det mesta av modercellens bioinformation. Det har undersökts ingående som en cellfri terapi12,13. Enligt de uppdaterade resurserna som finns tillgängliga på webbplatsen för kliniska prövningar (ClinicalTrials.gov) initieras och genomförs mer omfattande exosomkliniska studier inom forskningsområdena cancer, högt blodtryck och neurodegenerativa sjukdomar. SF-MSC exosombehandling kan vara en spännande och utmanande prövning för att hantera OA. God tillverkningssed (GMP) och storskalig exosomproduktion är avgörande för klinisk översättning. Småskalig exosomisolering har utförts i stor utsträckning baserat på tvådimensionell (2D) cellodling. Storskaliga exosomproduktionsstrategier behöver dock optimeras. En storskalig exosomtillverkningsmetod utvecklades i denna studie, baserad på massiv SF-MSC-kultur under xenofria förhållanden. Efter ultracentrifugering från cellodlingssupernatanter validerades exosomsäkerhet och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Human Ethics Committee of Shenzhen Second People's Hospital. Ett schematiskt diagram över exosomer isolerade från hSF-MSCs in vitro-protokoll visas i figur 1.
1. Mänsklig SF-MSCs kultur och identifiering
- Skörda 20 ml SF med en spruta och nål från kliniska OA-patienter.
- Desinficera knäleden hos OA-patienten. Punktering från quadriceps femoris-senan utanför patella in i ledhålan med en 7# nål.
- Extrahera 10 ml av ledvätskan. Täck punkteringsstället med transfusionspinnen och tryck i 5 minuter.
- Kassera SF-supernatanten efter centrifugering vid 1 500 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Återsuspendera cellpelleten med 10 ml 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS), centrifugera vid 1 500 x g i 10 minuter vid 4 °C och kassera PBS.
- Återsuspendera pelleten med 10 ml humant MSC-odlingsmedium med en celltäthet på 5 x 104 celler/ml (se materialtabell) och platta sedan suspensionen i en 100 mm skål.
- Inkubera skålen vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5 %CO2.
- Efter 48 h, ta bort de icke-vidhäftande cellerna genom att byta medium och tvätta med 1x PBS. Byt ut mediet var 3: e dag i 2 veckor.
- Samla cellodlingssupernatanterna.
- Identifiera SF-MSC med hjälp av flödescytometri.
- Sammanfatta tredje generationens (P3) SF-MSC, centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och samla cellpelleten.
OBS: En passage känns igen som cellernas subkultur till en annan odlingsskål. De primära cellerna isolerade från SF och sådda på rätter är märkta som passage noll (P0). Vid cirka 75% sammanflöde smälts cellerna och lossnar från diskarna, utsädes på andra rätter och märks som P1. - Tillsätt 400 μl blockerande buffert (1 % BSA i 1x PBS) till cellpelleten (5 x 104) och låt den stå i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 μl 1x PBS.
- Tillsätt 1 μl CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, monoklonal fluorescerande HLA-DR-antikropp (utspädningsförhållande 1:100) (se materialtabell) per rör och inkubera vid rt i 30 minuter.
- Tvätta två gånger med 1x PBS och kassera supernatanten. Samla cellpelleten och återsuspendera i 100 μL 1x PBS.
- Detektera på en flödescytometer upp till 10 000 celler med filter på 525/50 och 585/40 för att detektera fluoroforerna.
- Sammanfatta tredje generationens (P3) SF-MSC, centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och samla cellpelleten.
2.3D odling av bioreaktorceller
- Mikrocarrier förberedelse
- Sväll de torra 0,75 g mikrobärarna (se materialtabellen) och hydratisera i 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) (50 ml/g mikrobärare) i minst 3 timmar vid RT.
- Dekantera supernatanten och tvätta mikrobärarna i 5 minuter i färsk DPBS (50 ml / g mikrobärare). Kassera PBS och ersätt den med färska 1x DPBS (50 ml / g mikrocarriers).
- Sterilisera mikrobärarna genom autoklavering (121 °C, 15 min, 15 psi). Låt de steriliserade mikrobärarna sätta sig, dekantera supernatanten.
- Skölj kortfattat mikrobärarna i odlingsmediet (50 ml/g mikrobärare) vid RT. Låt mikrobärarna sätta sig, kassera supernatanten.
- Bioreaktor för perfusion
- Sterilisera bioreaktorn genom autoklavering (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Räkna antalet SF-MSC och allokera 2,5 x 107 SF-MSC och mikrobärare till bioreaktorn perfuserad med GMP-grade MSC-odlingsmedium (250 ml).
- Sätt bioreaktorn i en inkubator med 5%CO2 vid 37 °C. Rotera bioreaktorn med en hastighet av 15 rpm. Byt odlingsmediet var 6: e dag.
- Samla cellodlingssupernatanterna och mikrobärarna för vidare analys efter odling i 14 dagar.
3. Exosomidentifiering och säkerhetsdetektering
- Ultracentrifugering
- Centrifugera cellodlingssupernatanten vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C och samla upp supernatanten. Kassera cellulära skräp.
- Centrifugera supernatanterna vid 2 000 x g i 10 minuter vid 4 °C och samla upp supernatanten. kassera de större vesiklarna (apoptotiska kroppar och några större mikrovesiklar).
- Centrifugera supernatanten igen vid 10 000 x g i 30 minuter vid 4 °C för att avlägsna större vesiklar. samla pellets och återsuspendera i 40 ml 1x PBS.
- Centrifugera de återsuspenderade pelletsen vid 120 000 x g i 70 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten och återsuspendera pelletsen som innehåller exosomer i 500 μl 1x PBS.
- Analys av nanopartikelspårning (NTA)
OBS: För varje omgång injicerades 500 μl av provet i kammaren med en flödeshastighet på 30 μl/min. Utför analysen vid 24,4 °C-24,5 °C.- Späd de nyligen isolerade exosomproverna med sterila 1x PBS till 1 ml innehållande 10 7-10 9 /ml partiklar och injicera dem i analyssystemet för nanopartikelspårning (se materialförteckning).
- Ställ in fångst- och analyssystemet manuellt enligt tillverkarens protokoll. Visualisera partiklarna genom laserljusspridning och fånga deras bruna rörelse på digital video.
- Analysera inspelade videoband med hjälp av programvara (se materialförteckning) baserat på spårning av minst 200 enskilda partiklar per körning.
- Transmissionselektronmikroskopi
- Fixera exosomerna i 4% paraformaldehyd (i kall 1x DPBS) i 5 min.
- Montera 5 μL av exosomerna på kopparnät. I detta experiment kvantifieras koncentrationen av exosomer med 1 mg/ml med hjälp av ett proteinanalyskit (se Materialförteckning).
- Bädda in exosomerna i 3% fosfotungstinsyra i 10 min på is. Ta bort överskottssyran och torka proverna vid RT.
- Avbilda exosomproverna med en TEM vid en accelerationsspänning på 100 kV.
- Västra blotting
- Tillsätt 300 μL lysbuffert (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) och proteashämmare cocktail (se Materialförteckning) till exosomerna.
- Blanda exosomerna i lysbufferten genom att pipettera upp och ner och låt den stå på is i 20 min.
- Centrifugera blandningen vid 9,391 x g i 10 min vid 4 °C och samla upp supernatanten. Mät proteinkoncentrationen med hjälp av ett proteinanalyskit (se Materialförteckning).
- Tillsätt 100 μl 4x proteinladdningsbuffert och värm vid 100 °C i 10 minuter.
- Ladda 15 μl proteiner i en koncentration av 10 mg/ml och driv med gelelektrofores (120 V, 70 min) och elektroblotting vid 100 V, 60 min vid 4 °C.
- Upptäck de icke-exosomspecifika markörerna (calnexin) och exosomala biomarkörer (CD9, CD63 och CD81) genom fluorescerande western blotting (se Materialförteckning).
- Säkerhetstest
- För bakterier, svampar och Mycobacterium tuberculosis detektion följ steg 3.5.2-3.5.5.
- Frö 100 μl av exosomlösningen (1 mg/ml) på en aragarodlingsplatta (se materialtabell) och inkubera odlingsplattan vid 37 °C i 24 timmar.
- Frö 100 μl av exosomlösningen (1 mg/ml) på en sabouraud agarmediumplatta (se materialtabellen) och inkubera vid 35 °C i 48 timmar.
- Frö 100 μl av exosomlösningen (1 mg/ml) på en odlingsplatta från Lowenstein-Jensen (se materialtabellen) och inkubera vid 37 °C i 3 veckor.
- Upptäck utseendet på bakterier, svampar och Mycobacterium tuberculosis kolonier genom makroskopisk observation.
OBS: Kriterier för utvärdering av säkerheten hos exosomer är frånvaron av mikroorganismer på odlingsplattan. - För Mycoplasma-detektion, följ steg 3.5.7-3.5.9.
- Återsuspendera exosomerna i 50 μl buffertlösning som ingår i satsen och värm vid 95 °C i 3 minuter.
- Förstärk Mycoplasma i exosomlösning med hjälp av ett PCR Mycoplasma-detektionssats (se Materialförteckning).
- Upptäck PCR-produkterna på 1,5% agarosgelelektrofores (30 min, 120 V).
4. Detektion av exosomfunktioner in vitro
- Exosom märkning
- Märk 100 μl exosomer (1 mg/ml) med 1 mM Dil (1000x) (se materialtabell) och inkubera vid RT i 30 minuter.
- Återställ exosomerna genom ultracentrifugering vid 100 000 x g i 70 minuter. Återsuspendera pelleten i 500 μL 1x PBS.
- Laddning av Cy3-miR-140 efterliknar i exosomer
- Blanda 1 μg/μl exosomalt protein och 5 μmol/ml cy3-miR-140 i en slutlig volym på 400 μl elektroporationsbuffert (1,15 mM kaliumfosfat (pH 7,2), 25 mM kaliumklorid och 21 % (v/v) (se materialförteckning).
- Överför blandningen till kalla 0,4 cm elektroporationskuvetter och elektropolera vid 300 V/100 μF kapacitans med hjälp av ett gentransfektionssystem (se materialförteckning).
- Omedelbart efter elektroporering, håll blandningen vid RT i 30 minuter för att säkerställa att exosommembranet är helt återställt.
- Behandla blandningarna med en enhet RNas A (se materialtabell) i 20 minuter för att eliminera miRNA-härmningarna utanför exosomerna.
- Ultracentrifugera exosomblandningen vid 120 000 x g i 90 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera exosomerna i 500 μL 1x PBS.
- Analys av exosomupptag
- Frö kondrocyterna (1 x 107) i 35 mm konfokala skålar med 1 ml DMEM/F12 innehållande 10 % FBS.
- Efter 24 h, behandla kondrocyterna med DiI-märkta exosomer (100 ng / ml) eller cy3-miR-140 laddade exosomer (100 ng / ml) i 1 h.
- Tvätta med 1x PBS tre gånger och märk sedan med DAPI (10 ng/ml) i 10 min vid RT.
- Registrera fluorescenssignalen i konfokal laserscanningsfluorescensmikroskopi (CLSM) med lämpliga filter (se materialförteckning).
5. Statistisk analys
- Utför statistisk analys med lämplig statistisk programvara.
OBS: Representativa data i varje figur uttrycktes som medelvärdet ± SD. Studentens t-test användes för jämförelse av två grupper med hjälp av statistikprogram. En enkelriktad ANOVA följt av Tukeys multipel utfördes vid jämförelser mellan flera grupper. P-värden <0,05 (*), <0,01 (**) eller <0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödescytometri användes för att identifiera ytmarkörerna för SF-MSC, enligt de minimala kriterierna för att definiera humana MSC som rekommenderas av International Society for Cellular Therapy14,15. Flödescytometrianalys avslöjade att SF-MSC som odlades i denna studie uppfyllde identifieringskriterierna för MSC. De var negativa för CD34, CD45 och HLA-DR (under 3%) och positiva för CD73, CD90 och CD105 (över 95%) (Figur 2).
Under inverterad mikroskopi noterades att SF-MSC: erna sprider sig på mikrobärare (figur 3A). Efter att celler smälts och tvättats från 2D-odlingsplattan och 3D-odlingsmikrobärare räknades cellnumret. Jämfört med 2D-kultur fick 3D-kulturen SF-MSC att sprida sig snabbare från 6 dagar och framåt (figur 3B). Resultat från tre oberoende experiment presenterades.
För att identifiera exosomerna (Exos) från SF-MSC i 2D- och 3D-kultur detekterades de exosomassocierade proteinerna (CD63, CD9 och CD81) och det negativa proteinet (calnexin) med hjälp av western blotting. Resultaten avslöjade att 2D-Exos och 3D-Exos uttrycker CD63, CD9 och CD81, medan de är negativa för calnexin (figur 4A). Även exosomdiametern och morfologin analyserades med hjälp av NTA och TEM. Nanosight-analys visade att diametern på 2D-Exos (figur 4B) och 3D-Exos (figur 4D) är ungefär 120 nm. Transmissionselektronisk mikroskopanalys avslöjade morfologin hos 2D-Exos och 3D-Exos, som visar ungefär sfäroida vesiklar (figur 4C,E).
Efter 3D-odling är partikelkoncentrationen av partiklar med en storlek på 30-160 nm 4,0 x 106 per ml analyserad med NTA. Efter 2D-kulturen är emellertid partikelkoncentrationen av 30-160 nm partiklar 2,5 x 106 per ml (Figur 5A). Vid beräkning av exosomproteinutbytet i mediet producerade 3D-kulturen mer exosomprotein än 2D-kultur (figur 5B). Således, jämfört med 2D-kultur, förbättrade 3D-kulturen signifikant exosomutbytet.
Exosomerna märktes först med DiL och inkuberades sedan i en koncentration av 10 μg / ml med kondrocyterna i 1 h, 2 h och 3 h för att undersöka om exosomer kan komma in i primära kondrocyter in vitro. Dil-märkta exosomer gick in i primära kondrocyter, med toppen sett vid 3 h (figur 6).
För att detektera exosomernas funktion som nanobärare laddades exosomer med Cy3-märkt miR-140 genom elektroporering och behandlades sedan med kondrocyter i en koncentration av 10 μg / ml i 3 timmar. Resultaten visade att exosomer kunde leverera miR-140 till kondrocyter (figur 7). Alla resultat uppfyllde specifikationerna; alla prover var sterila och negativa för Mycoplasma.
Figur 1: Schematiskt diagram över exosomer isolerade från hSF-MSC in vitro. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Identifiering av SF-MSC med flödescytometri. Flödescytometri visar den positiva eller negativa immunofenotypen av hSF-MSC. (A) Märkning med en IgG1 isotypkontrollantikropp. (B) CD73 är positivt och CD34 är negativt. (C) CD90 är positivt och CD45 är negativt. (D) CD105 är positivt och HLA-DR är negativt, så kallade MSC-markörer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: SF-MSC tillväxtkurva. (A) Representativa bilder som visar SF-MSC (röda pilar) på mikrobärare under inverterad mikroskopi (skalstreck = 100 μm). (B) Tillväxtkurvan för SF-MSC under 2D- och 3D-kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Identifiering av exosomer . (A) Western blotting-resultat av 2D-Exos och 3D-Exos. (B) Nanosight-analys av diametern på 2D-Exos och 3D-Exos. (C) TEM-detektion av morfologin hos 2D-Exos och 3D-Exos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Det förbättrade utbytet av exosomproduktion genom 3D-bioreaktorkultur . (A) Representativa resultat av exosomstorlek analyserade av NTA. (B) Proteinutbyte = exosomalt protein (μg)/konditionerat medium (ml). Diagrammen visar utbytet för varje metod och medelvärdet ± SD för alla mätningar (** p < 0,01). Statistiska jämförelser utfördes av enkelriktad ANOVA med post-hoc Bonferronis korrigering och av Students t-test. ** p < 0,01 ansågs vara en signifikant skillnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Representativa bilder som visar internaliseringen av Dil-märkta exosomer av primära kondrocyter. Kondrocyter inkuberades med Dil-märkta exosomer i 1 h, 2 h och 3 h. Exosomer märktes med Dil (röd) och kärnor märktes med Hoechst (blå). Prover upptäcktes vid 60x förstoring. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: In vitro-leverans av miR-140 av MSC-exosomer. Efter att ha tagit upp Cy3-märkt miR-140 som var inkapslad i SF-MSCs-härledda exosomer, avbildades kondrocyter. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mesenkymala stamcellerna har använts i stor utsträckning inom regenerativ medicin på grund av deras självförnyelse, differentierade till vävnadsceller med specialiserade funktioner och parakrina effekter16,17. I synnerhet har de parakrina effekterna som utövas av exosomer väckt stor uppmärksamhet18. Exosomer bär bioinformation från MSC och utför sin biologiska funktion och övervinner MSC-brister, såsom besvärlig lagring och leverans. Således har exosomer härledda från MSC använts för terapeutiska ingrepp, som har väckt mest uppmärksamhet vid OA-terapi.
För närvarande finns det två metoder för att sprida MSC, 2D-kultur och tredimensionell (3D) kultur19. 2D-kultur är ett konventionellt sätt att odla MSC för in vitro-studier med låga kostnader. Det är dock tidskrävande och begränsat i skala potential. MSC-utbredning i 2D-mikromiljön härleder också snabbt stammen20,21, en av de mest kritiska egenskaperna hos MSC. Således kan 2D-kultur inte uppfylla kraven för MSC-terapi. I denna studie, i syfte att SF-MSC i OA-terapi, strävar vi efter att upprätthålla SF-MSC-egenskaper med hjälp av kulturen hos en 3D-bioreaktor, som mer exakt kan efterlikna den biologiska mikromiljön. Nyligen har andra forskare använt byggnadsställningar eller mikrocarrier-baserad 3D för att odla MSC. Vi fann att 3D-kollagenställningarna tillät mer koncentrerade exosomer som produceras av humana benmärgs-härledda MSC än2D-kultur 23.
Eftersom exosomer kan utföra en stor del av MSC-funktionen samtidigt som vi undviker vissa brister i MSC, strävar vi efter att producera exosomer för OA-terapi. Denna studie upptäckte vidare exosomproduktions- och leveransfunktionen med hjälp av detta system baserat på den stora kvantiteten och den höga kvaliteten på MSC-förökning av 3D-kultur. Rotary Cell Culture System (RCCS) användes för 3D-odling för att producera exosomer från storskalig MSC-förökning. Jämfört med traditionell 2D-kolvkultur kan detta 3D-odlingssystem undvika kontaminering från upprepad mediumförändring och cellpassage. Ännu viktigare var att denna studie visade att en 3D-bioreaktor kunde förbättra exosomproduktionen för att uppfylla kraven i kliniska studier. Observera att exosomer isolerade från supernatanter från 3D-odling kan leverera miRNA till celler, vilket tyder på att 3D-kultur inte stör exosomfunktionen. Mikrobiella och endotoxindetektionsresultat stöder ytterligare att denna studie har upprättat ett protokoll som kan producera exosomer, som är biologiskt säkra och lovande för OA-terapi. För närvarande kan den exosommängd som produceras i denna studie inte tillgodose kommersiella behov. Därför måste strategier för en enorm mängd exosomproduktion utvecklas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
National Natural Science Foundation of China (nr 81972116, nr 81972085, nr 81772394); Nyckelprogram för naturvetenskapliga stiftelsen i Guangdong-provinsen (nr 2018B0303110003); Guangdongs internationella samarbetsprojekt (nr 2021A0505030011); Shenzhen vetenskaps- och teknikprojekt (nr. GJHZ20200731095606019, Nej. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kinas postdoktorala vetenskapsstiftelse (nr 2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr 2021A1515010985); Sanming-projektet för medicin i Shenzhen (SZSM201612079); Särskilda medel för byggandet av sjukhus på hög nivå i Guangdong-provinsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
