Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.
Abstract
Gli esosomi secreti dalle cellule staminali mesenchimali (MSC) sono stati suggeriti come candidati promettenti per le lesioni della cartilagine e il trattamento dell'osteoartrite. Gli esosomi per applicazioni cliniche richiedono una produzione su larga scala. A tal fine, le MSC del liquido sinoviale umano (hSF-MSCs) sono state coltivate su perle di microcarrier e quindi coltivate in un sistema di coltura dinamico tridimensionale (3D). Attraverso l'utilizzo di colture dinamiche 3D, questo protocollo ha ottenuto con successo esosomi su larga scala da supernatanti di coltura SF-MSC. Gli esosomi sono stati raccolti mediante ultracentrifugazione e verificati da un microscopio elettronico a trasmissione, saggio di trasmissione di nanoparticelle e western blotting. Inoltre, è stata rilevata la sicurezza microbiologica degli esosomi. I risultati del rilevamento degli esosomi suggeriscono che questo approccio può produrre un gran numero di esosomi di grado GMP (Good Manufacturing Practices). Questi esosomi potrebbero essere utilizzati nella ricerca sulla biologia degli esosomi e nel trattamento clinico dell'osteoartrite.
Introduction
L'osteoartrite (OA), derivante dalla cartilagine articolare e dalla rottura ossea sottostante, rimane una grave sfida che porta alla disabilità 1,2. Senza l'apporto di sangue e nervi, la capacità di auto-guarigione della cartilagine è minima una volta feriti 3,4. Negli ultimi decenni, le terapie basate sull'impianto autologo di condrociti (ACI) hanno fatto alcuni progressi nel trattamento dell'OA5. Per l'isolamento e l'espansione dei condrociti, è necessario raccogliere una piccola cartilagine dall'area non portante dell'articolazione OA, causando lesioni alla cartilagine. Inoltre, la procedura richiederà una seconda operazione per impiantare i condrociti espansi6. Pertanto, le terapie in un'unica fase per il trattamento dell'OA senza lesioni della cartilagine sono in fase di ampia esplorazione.
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state suggerite come alternative promettenti per il trattamento dell'OA 7,8. Originate da più tessuti, le MSC possono differenziarsi in condrociti con una stimolazione specifica. È importante sottolineare che le MSC possono modulare le risposte immunitarie tramite l'anti-infiammazione9. Pertanto, le MSC hanno vantaggi significativi nel trattamento dell'OA riparando i difetti della cartilagine e modulando la risposta immunitaria, specialmente nell'ambiente infiammatorio. Per il trattamento dell'OA, le MSC da liquido sinoviale (SF-MSCs) hanno recentemente attirato molta attenzione a causa della loro più forte capacità di differenziazione dei condrociti rispetto ad altre fonti di MSC10,11. In particolare, presso la clinica ortopedica, l'estrazione di SF infiammatoria dalla cavità articolare è una terapia di routine per alleviare il sintomo del dolore dei pazienti con OA. La SF infiammatoria estratta di solito viene smaltita come rifiuto medico. Sia i pazienti che i medici sono pronti a considerare le MSC autologhe isolate dalla SF infiammatoria come trattamento OA con pochissimi conflitti etici. Tuttavia, la terapia con SF-MSC è compromessa a causa dei rischi tumorigenici, della conservazione a lungo termine e delle barriere di spedizione distanti.
Gli esosomi, secreti da molti tipi di cellule, comprese le MSC, trasportano la maggior parte delle bio-informazioni della cellula madre. È stato studiato in modo approfondito come terapia cell-free12,13. Secondo le risorse aggiornate disponibili sul sito web del governo della sperimentazione clinica (ClinicalTrials.gov), vengono avviati e intrapresi studi clinici sugli esosomi più ampi nei campi di ricerca del cancro, dell'ipertensione e delle malattie neurodegenerative. Il trattamento degli esosomi SF-MSC potrebbe essere uno studio entusiasmante e impegnativo per far fronte all'OA. La produzione di esosomi di grado GMP e su larga scala è essenziale per la traduzione clinica. L'isolamento degli esosomi su piccola scala è stato ampiamente eseguito sulla base di colture cellulari bidimensionali (2D). Tuttavia, le strategie di produzione di esosomi su larga scala devono essere ottimizzate. In questo studio è stato sviluppato un metodo di produzione di esosomi su larga scala, basato su una massiccia coltura SF-MSC in condizioni prive di xeno. Dopo l'ultracentrifugazione da supernatanti di coltura cellulare, sono state convalidate la sicurezza e la funzione degli esosomi.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato di etica umana del secondo ospedale popolare di Shenzhen. Un diagramma schematico di esosomi isolati dal protocollo hSF-MSCs in vitro è mostrato in Figura 1.
1. Cultura e identificazione delle SF-MSC umane
- Raccogliere 20 ml di SF usando una siringa e un ago da pazienti clinici con OA.
- Disinfettare l'articolazione del ginocchio del paziente OA. Puntura dal tendine del quadricipite femorale al di fuori della rotula nella cavità articolare con un ago 7#.
- Estrarre 10 ml del liquido articolare. Coprire il sito di puntura con il bastone trasfusionale e premere per 5 minuti.
- Eliminare il surnatante SF dopo centrifugazione a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Risospendere il pellet cellulare con 10 mL di 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il PBS.
- Risospendere il pellet con 10 ml di terreno di coltura MSC umano ad una densità cellulare di 5 x 104 cellule/ml (vedere Tabella dei materiali), quindi placcare la sospensione in un piatto da 100 mm.
- Incubare il piatto a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
- Dopo 48 ore, rimuovere le cellule non aderenti cambiando il mezzo e lavare con 1x PBS. Sostituire il mezzo ogni 3 giorni per 2 settimane.
- Raccogliere i supernatanti di coltura cellulare.
- Identificare le SF-MSC utilizzando la citometria a flusso.
- Digerire la terza generazione (P3) di SF-MSC, centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
NOTA: Un passaggio viene riconosciuto come la sottocoltura delle cellule in un altro piatto di coltura. Le cellule primarie isolate da SF e seminate sui piatti sono etichettate come passaggio zero (P0). A circa il 75% di confluenza, le cellule vengono digerite e staccate dai piatti, seminate su altri piatti ed etichettate come P1. - Aggiungere 400 μL di tampone bloccante (1% BSA in 1x PBS) al pellet cellulare (5 x 104) e lasciarlo riposare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di 1x PBS.
- Aggiungere 1 μL di CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticorpo fluorescente monoclonale HLA-DR (rapporto di diluizione 1:100) (vedere Tabella dei materiali) per provetta e incubare a RT per 30 minuti.
- Lavare due volte con 1x PBS e gettare il surnatante. Raccogliere il pellet cellulare e risospendere in 100 μL di 1x PBS.
- Rileva su un citometro a flusso fino a 10.000 cellule utilizzando filtri di 525/50 e 585/40 per rilevare i fluorofori.
- Digerire la terza generazione (P3) di SF-MSC, centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
2.3D Coltura cellulare di bioreattore
- Preparazione microcarrier
- Gonfiare i 0,75 g secchi di microcarrier (vedi Tabella dei materiali) e idratare in 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) (50 mL/g di microcarrier) per almeno 3 ore a RT.
- Decantare il surnatante e lavare i microcarrier per 5 minuti in DPBS fresco (50 mL/g di microcarrier). Eliminare il PBS e sostituirlo con 1x DPBS fresco (50 mL/g di microcarrier).
- Sterilizzare i microcarrier mediante autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Lasciare che i microvettori sterilizzati si depositino, decantare il surnatante.
- Risciacquare brevemente i microcarrier nel terreno di coltura (50 mL/g di microcarrier) a RT. Lasciare che i microcarrier si depositino, scartare il surnatante.
- Bioreattore a perfusione
- Sterilizzare il bioreattore mediante autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Contare il numero di SF-MSC e allocare 2,5 x 107 SF-MSC e microcarrier al bioreattore perfuso con terreno di coltura MSC di grado GMP (250 ml).
- Mettere il bioreattore in un incubatore con il 5% di CO2 a 37 °C. Ruotare il bioreattore ad una velocità di 15 giri / min. Cambiare il terreno di coltura ogni 6 giorni.
- Raccogliere i supernatanti e i microcarrier della coltura cellulare per ulteriori analisi dopo la coltura per 14 giorni.
3. Identificazione degli esosomi e rilevamento della sicurezza
- Ultracentrifugazione
- Centrifugare il surnatante di coltura cellulare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante; Scartare i detriti cellulari.
- Centrifugare i surnatanti a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante; scartare le vescicole più grandi (corpi apoptotici e alcune microvescicole più grandi).
- Centrifugare nuovamente il surnatante a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere le vescicole più grandi; raccogliere i pellet e risospenderli in 40 ml di 1x PBS.
- Centrifugare i pellet risospesi a 120.000 x g per 70 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere i pellet che contengono esosomi in 500 μL di 1x PBS.
- Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
NOTA: Per ogni corsa, 500 μL del campione sono stati iniettati nella camera ad una portata di 30 μL/min. Eseguire l'analisi a 24,4 °C-24,5 °C.- Diluire i campioni di esosoma appena isolati con 1x PBS sterile a 1 mL contenente 107-10 9 /mL di particelle e iniettarli nel sistema di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (vedere Tabella dei materiali).
- Impostare manualmente il sistema di acquisizione e analisi in base al protocollo del produttore. Visualizza le particelle mediante diffusione della luce laser e cattura il loro movimento browniano su video digitali.
- Analizza le videocassette registrate utilizzando un software (vedi Tabella dei materiali) in base al tracciamento di almeno 200 singole particelle per esecuzione.
- Microscopia elettronica a trasmissione
- Fissare gli esosomi in paraformaldeide al 4% (in freddo 1x DPBS) per 5 minuti.
- Montare 5 μL di esosomi su griglie di rame. In questo esperimento, la concentrazione di esosomi è di 1 mg/ml quantificata da un kit di analisi delle proteine (vedi Tabella dei materiali).
- Incorporare gli esosomi in acido fosfotungstico al 3% per 10 minuti sul ghiaccio. Rimuovere l'acido in eccesso e asciugare i campioni a RT.
- Immagini dei campioni di esosoma mediante un TEM ad una tensione di accelerazione di 100 kV.
- Western blotting
- Aggiungere 300 μL di tampone di lisi (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) e cocktail di inibitori della proteasi (vedere Tabella dei materiali) agli esosomi.
- Mescolare gli esosomi nel tampone di lisi mediante pipettaggio su e giù e lasciarlo riposare sul ghiaccio per 20 minuti.
- Centrifugare la miscela a 9,391 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi delle proteine (vedere la tabella dei materiali).
- Aggiungere 100 μL di 4x tampone di carico proteico e riscaldare a 100 °C per 10 minuti.
- Caricare 15 μL di proteine ad una concentrazione di 10 mg/mL ed eseguire mediante elettroforesi su gel (120 V, 70 min) ed elettroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.
- Rilevare i marcatori non esosomi-specifici (calnexina) e i biomarcatori esosomici (CD9, CD63 e CD81) mediante western blotting fluorescente (vedere Tabella dei materiali).
- Test di sicurezza
- Per il rilevamento di batteri, funghi e Mycobacterium tuberculosis seguire i passaggi 3.5.2-3.5.5.
- Semie 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra di coltura di agar sanguigno (vedere tabella dei materiali) e incubare la piastra di coltura a 37 °C per 24 ore.
- Semie 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra media di agar sabouraud (vedere tabella dei materiali) e incubare a 35 °C per 48 ore.
- Semare 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra di terreno di coltura Lowenstein-Jensen (vedere tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 3 settimane.
- Rilevare la comparsa di batteri, funghi e colonie di Mycobacterium tuberculosis mediante osservazione macroscopica.
NOTA: I criteri per valutare la sicurezza degli esosomi sono l'assenza di microrganismi sulla piastra di coltura. - Per il rilevamento del micoplasma, seguire i passaggi 3.5.7-3.5.9.
- Risospendere gli esosomi in 50 μL di soluzione tampone inclusa nel kit e riscaldare a 95 °C per 3 minuti.
- Amplificare il Mycoplasma in soluzione di esosoma utilizzando un kit di rilevamento del Mycoplasma PCR (vedere Tabella dei materiali).
- Rilevare i prodotti PCR con elettroforesi su gel di agarosio all'1,5% (30 min, 120 V).
4. Rilevamento della funzione degli esosomi in vitro
- Etichettatura degli esosomi
- Etichettare 100 μL di esosomi (1 mg/ml) con 1 mM Dil (1000x) (vedi Tabella dei materiali) e incubare a RT per 30 minuti.
- Recuperare gli esosomi mediante ultracentrifugazione a 100.000 x g per 70 minuti. Risospendere il pellet in 500 μL di 1x PBS.
- Il caricamento di Cy3-miR-140 imita negli esosomi
- Mescolare 1 μg/μL di proteina esosomica e 5 μmol/mL di Cy3-miR-140 in un volume finale di 400 μL di tampone per elettroporazione (1,15 mM di fosfato di potassio (pH 7,2), 25 mM di cloruro di potassio e 21% (v/v) (vedere Tabella dei materiali).
- Trasferire la miscela in cuvette di elettroporazione fredda da 0,4 cm ed elettroporate con capacità di 300 V/100 μF utilizzando un sistema di trasfezione genica (vedi Tabella dei materiali).
- Immediatamente dopo l'elettroporazione, mantenere la miscela a RT per 30 minuti per garantire che la membrana dell'esosoma sia completamente ripristinata.
- Trattare le miscele con un'unità di RNasi A (vedere Tabella dei materiali) per 20 minuti per eliminare i miRNA imitatori al di fuori degli esosomi.
- Ultracentrifugare la miscela di esosomi a 120.000 x g per 90 minuti, scartare il surnatante e risospendere gli esosomi in 500 μL di 1x PBS.
- Saggio di assorbimento degli esosomi
- Seminare i condrociti (1 x 107) in piatti confocali da 35 mm con 1 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS.
- Dopo 24 ore, trattare i condrociti con esosomi marcati con DiI (100 ng/mL) o esosomi caricati con cy3-miR-140 (100 ng/mL) per 1 ora.
- Lavare con 1x PBS tre volte, quindi etichettare con DAPI (10 ng / mL) per 10 minuti a RT.
- Registrare il segnale di fluorescenza in microscopia a fluorescenza a scansione laser confocale (CLSM) utilizzando i filtri appropriati (vedi Tabella dei materiali).
5. Analisi statistica
- Eseguire analisi statistiche utilizzando software statistici appropriati.
NOTA: I dati rappresentativi in ciascuna figura sono stati espressi come media ± DS. Il t-test di Student è stato utilizzato per il confronto di due gruppi utilizzando software di statistica. Un ANOVA unidirezionale seguito dal multiplo di Tukey è stato eseguito nel caso di confronti tra più gruppi. Valori P <0,05 (*), <0,01 (**) o <0,001 (***).
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Representative Results
La citometria a flusso è stata utilizzata per identificare i marcatori di superficie delle SF-MSCs, secondo i criteri minimi per definire le MSC umane raccomandati dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare14,15. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che le SF-MSC coltivate in questo studio hanno soddisfatto i criteri di identificazione delle MSC. Sono risultati negativi per CD34, CD45 e HLA-DR (inferiori al 3%) e positivi per CD73, CD90 e CD105 (superiore al 95%) (Figura 2).
Sotto microscopia invertita, è stato notato che le SF-MSC proliferano su microcarrier (Figura 3A). Dopo che le cellule sono state digerite e lavate dalla piastra di coltura 2D e dai microcarrier di coltura 3D, è stato contato il numero di cellule. Rispetto alla cultura 2D, la cultura 3D ha indotto l'SF-MSC a proliferare più rapidamente da 6 giorni in poi (Figura 3B). Sono stati presentati i risultati di tre esperimenti indipendenti.
Per identificare gli esosomi (Exos) da SF-MSC di coltura 2D e 3D, le proteine associate agli esosomi (CD63, CD9 e CD81) e le proteine negative (calnexina) sono state rilevate utilizzando western blotting. I risultati hanno rivelato che 2D-Exos e 3D-Exos esprimono CD63, CD9 e CD81, mentre sono negativi per la calnexina (Figura 4A). Inoltre, il diametro e la morfologia dell'esosoma sono stati saggiati utilizzando NTA e TEM. L'analisi di Nanosight ha dimostrato che il diametro di 2D-Exos (Figura 4B) e 3D-Exos (Figura 4D) è di circa 120 nm. L'analisi al microscopio elettronico a trasmissione ha rivelato la morfologia di 2D-Exos e 3D-Exos, mostrando vescicole approssimativamente sferoidali (Figura 4C,E).
Dopo la coltura 3D, la concentrazione di particelle di particelle di dimensioni 30-160 nm è 4,0 x 106 per mL analizzate utilizzando NTA. Tuttavia, dopo la coltura 2D, la concentrazione di particelle di particelle 30-160 nm è 2,5 x 106 per ml (Figura 5A). Nel calcolare la resa proteica dell'esosoma nel mezzo, la coltura 3D ha prodotto più proteine esosomiche rispetto alla coltura 2D (Figura 5B). Pertanto, rispetto alla cultura 2D, la cultura 3D ha migliorato significativamente la resa degli esosomi.
Gli esosomi sono stati prima marcati con Dil, e poi incubati ad una concentrazione di 10 μg / mL con i condrociti per 1 ora, 2 ore e 3 ore per esaminare se gli esosomi possono entrare nei condrociti primari in vitro. Gli esosomi marcati con Dil sono entrati nei condrociti primari, con il picco osservato a 3 ore (Figura 6).
Per rilevare la funzione degli esosomi come nanocarrier, gli esosomi sono stati caricati con miR-140 marcato con Cy3 attraverso l'elettroporazione e quindi trattati con condrociti ad una concentrazione di 10 μg / ml per 3 ore. I risultati hanno dimostrato che gli esosomi potrebbero fornire miR-140 ai condrociti (Figura 7). Tutti i risultati hanno soddisfatto le specifiche; tutti i campioni erano sterili e negativi per Mycoplasma.
Figura 1: Diagramma schematico di esosomi isolati da hSF-MSCs in vitro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Identificazione delle SF-MSCs mediante citometria a flusso. La citometria a flusso mostra l'immunofenotipo positivo o negativo delle hSF-MSCs. (A) Etichettatura con un anticorpo di controllo dell'isotipo IgG1. (B) CD73 è positivo e CD34 è negativo. (C) CD90 è positivo e CD45 è negativo. (D) CD105 è positivo e HLA-DR è negativo, noti come marcatori MSC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Curva di crescita SF-MSC. (A) Immagini rappresentative che mostrano SF-MSC (frecce rosse) su microvettori al microscopio invertito (barra di scala = 100 μm). (B) La curva di crescita di SF-MSC sotto la cultura 2D e 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Identificazione degli esosomi . (A) Risultati del Western blotting dei 2D-Exos e 3D-Exos. (B) Analisi nanosight del diametro di 2D-Exos e 3D-Exos. (C) Rilevamento TEM della morfologia di 2D-Exos e 3D-Exos. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: La maggiore resa della produzione di esosomi mediante la coltura di bioreattori 3D . (A) Risultati rappresentativi delle dimensioni degli esosomi analizzati dall'NTA. (B) Resa proteica = proteina esosomica (μg)/mezzo condizionato (ml). I grafici mostrano la resa per ciascun metodo e la media ± SD di tutte le misurazioni (** p < 0,01). I confronti statistici sono stati eseguiti da ANOVA unidirezionale con correzione post-hoc di Bonferroni e dal t-test di Student. ** p < 0,01 è stata considerata una differenza significativa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6 Immagini rappresentative che mostrano l'internalizzazione degli esosomi marcati con Dil da parte dei condrociti primari. I condrociti sono stati incubati con esosomi marcati con Dil per 1 ora, 2 ore e 3 ore. Gli esosomi sono stati etichettati con Dil (rosso) e i nuclei sono stati etichettati con Hoechst (blu). I campioni sono stati rilevati con un ingrandimento di 60x. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Somministrazione in vitro di miR-140 da parte degli esosomi MSC. Dopo l'assorbimento di miR-140 marcato con Cy3 che è stato incapsulato in esosomi derivati da SF-MSCs, sono stati visualizzati i condrociti. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Le cellule staminali mesenchimali sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa grazie al loro auto-rinnovamento, differenziate in cellule tissutali con funzioni specializzate ed effetti paracrini16,17. In particolare, gli effetti paracrini esercitati dagli esosomi hanno attirato molta attenzione18. Gli esosomi trasportano le bioinformazioni delle MSC e svolgono la loro funzione biologica e superano le carenze delle MSC, come lo stoccaggio e la spedizione problematici. Pertanto, gli esosomi derivati dalle MSC sono stati utilizzati per interventi terapeutici, che hanno attirato la massima attenzione nella terapia OA.
Attualmente, ci sono due metodi per propagare MSC, cultura 2D e cultura tridimensionale (3D)19. La coltura 2D è un modo convenzionale per coltivare MSC per studi in vitro a basso costo. Tuttavia, è dispendioso in termini di tempo e limitato nel potenziale di scala. Inoltre, la propagazione delle MSC nel microambiente 2D deduce rapidamente la staminalità20,21, una delle caratteristiche più critiche delle MSC. Pertanto, la cultura 2D non può soddisfare i requisiti per la terapia MSC. In questo studio, allo scopo di SF-MSCs nella terapia OA, ci sforziamo di mantenere le caratteristiche SF-MSC utilizzando la coltura di un bioreattore 3D, che può imitare più accuratamente il microambiente biologico. Recentemente, altri ricercatori hanno utilizzato scaffold o 3D basati su microcarrier per coltivare MSC. Abbiamo scoperto che gli scaffold di collagene 3D hanno permesso esosomi più concentrati prodotti da MSC derivate dal midollo osseo umano rispetto alla coltura2D 23.
Poiché gli esosomi possono svolgere gran parte della funzione MSC evitando alcune carenze delle MSC, miriamo a produrre esosomi per la terapia OA. Questo studio ha inoltre rilevato la funzione di produzione e consegna degli esosomi utilizzando questo sistema basato sulla grande quantità e l'alta qualità della propagazione MSC della coltura 3D. Il Rotary Cell Culture System (RCCS) è stato utilizzato per la coltura 3D per produrre esosomi dalla propagazione MSC su larga scala. Rispetto alla tradizionale coltura in pallone 2D, questo sistema di coltura 3D può evitare la contaminazione da ripetuti cambiamenti del mezzo e passaggio cellulare. Ancora più importante, questo studio ha dimostrato che un bioreattore 3D potrebbe migliorare la produzione di esosomi per soddisfare i requisiti dello studio clinico. Da notare che gli esosomi isolati da supernatanti di coltura 3D possono fornire miRNA nelle cellule, suggerendo che la coltura 3D non interferisce con la funzione degli esosomi. I risultati del rilevamento microbico ed endotossinico supportano ulteriormente che questo studio ha stabilito un protocollo che potrebbe produrre esosomi, che sono biologicamente sicuri e promettenti per la terapia OA. Allo stato attuale, la quantità di esosomi prodotta in questo studio non può soddisfare le esigenze commerciali. Quindi, è necessario sviluppare strategie per un'enorme quantità di produzione di esosomi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
National Natural Science Foundation of China (n. 81972116, n. 81972085, n. 81772394); Programma chiave della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong (No.2018B0303110003); Progetto di cooperazione internazionale del Guangdong (n. 2021A0505030011); Progetti scientifici e tecnologici di Shenzhen (n. GJHZ20200731095606019, n. JCYJ20170817172023838, n. JCYJ20170306092215436, n. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Progetto Sanming di Medicina a Shenzhen (SZSM201612079); Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia del Guangdong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
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