Summary
Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af et stort antal GMP-grade exosomer fra synovialvæskemesenkymale stamceller ved hjælp af en 3D-bioreaktor.
Abstract
Exosomer udskilt af mesenkymale stamceller (MSC'er) er blevet foreslået som lovende kandidater til bruskskader og slidgigtbehandling. Exosomer til klinisk anvendelse kræver produktion i stor skala. Til dette formål blev humane synovialvæske MSC'er (hSF-MSC'er) dyrket på mikrocarrierperler og derefter dyrket i et dynamisk tredimensionelt (3D) kultursystem. Ved at bruge 3D-dynamisk kultur opnåede denne protokol med succes store exosomer fra SF-MSC-kultursupernatanter. Exosomer blev høstet ved ultracentrifugering og verificeret af et transmissionselektronmikroskop, nanopartikeltransmissionsanalyse og western blotting. Også den mikrobiologiske sikkerhed af exosomer blev detekteret. Resultater af exosomdetektion tyder på, at denne tilgang kan producere et stort antal exosomer af god fremstillingspraksis (GMP) kvalitet. Disse exosomer kunne anvendes i exosombiologi forskning og klinisk slidgigt behandling.
Introduction
Slidgigt (OA), der skyldes ledbrusk og underliggende knoglenedbrydning, er fortsat en alvorlig udfordring, der fører til handicap 1,2. Uden blod og nerveforsyning er brusk selvhelbredende evne minimal, når man først er blevet skadet 3,4. I de sidste årtier har terapier baseret på autolog chondrocytimplantation (ACI) gjort nogle fremskridt i OA-behandling5. For chondrocytisolering og ekspansion er det nødvendigt at høste lille brusk fra OA-leddets ikke-vægtbærende område, hvilket forårsager skader på brusk. Proceduren vil også kræve en anden operation for at implantere de ekspanderede kondrocytter6. Således er et-trins terapier til OA-behandling uden bruskskader under omfattende udforskning.
Mesenkymale stamceller (MSC'er) er blevet foreslået som lovende alternativer til OA-behandling 7,8. MSC'er stammer fra flere væv og kan differentiere sig til kondrocytter med specifik stimulering. Det er vigtigt, at MSC'er kan modulere immunresponser via anti-inflammation9. Derfor har MSC'er betydelige fordele ved OA-behandling ved at reparere bruskdefekter og modulere immunresponset, især i inflammationsmiljøet. Til OA-behandling har MSC'er fra synovialvæske (SF-MSC'er) for nylig tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres stærkere chondrocytdifferentieringsevne end andre MSC-kilder10,11. Især på ortopædisk klinik er ekstraktionen af inflammatorisk SF fra ledhulen en rutinemæssig terapi for at lindre smertesymptomet hos OA-patienter. Ekstraheret inflammatorisk SF bortskaffes normalt som medicinsk affald. Både patienter og læger er klar til at betragte autologe MSC'er isoleret fra den inflammatoriske SF som OA-behandling med meget få etiske konflikter. Imidlertid er SF-MSC-terapi kompromitteret på grund af tumorfremkaldende risici, langvarig opbevaring og fjerne forsendelsesbarrierer.
Exosomer, der udskilles af mange celletyper, herunder MSC'er, bærer det meste af forældrecellens bioinformation. Det er blevet undersøgt i dybden som en cellefri terapi12,13. Ifølge de opdaterede ressourcer, der er tilgængelige på webstedet for klinisk forsøgsregering (ClinicalTrials.gov), indledes og gennemføres mere omfattende exosome kliniske undersøgelser inden for forskningsområderne kræft, hypertension og neurodegenerative sygdomme. SF-MSC exosome-behandling kan være et spændende og udfordrende forsøg til at klare OA. God fremstillingspraksis (GMP) og storstilet exosomproduktion er afgørende for klinisk oversættelse. Exosomisolering i lille skala er blevet udført bredt baseret på todimensionel (2D) cellekultur. Imidlertid skal store exosomproduktionsstrategier optimeres. En storstilet exosomfremstillingsmetode blev udviklet i denne undersøgelse baseret på massiv SF-MSC-kultur under xeno-fri forhold. Efter ultracentrifugering fra cellekultursupernatanter blev exosomsikkerhed og funktion valideret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Human Ethics Committee of Shenzhen Second People's Hospital. Figur 1 viser et skematisk diagram over exosomer isoleret fra hSF-MSC'er in vitro-protokollen.
1. Menneskets SF-MSC'ers kultur og identifikation
- Høst 20 ml SF ved hjælp af en sprøjte og nål fra kliniske OA-patienter.
- Desinficer knæleddet hos OA-patienten. Punktering fra quadriceps femoris senen uden for patellaen ind i ledhulen med en 7 # nål.
- Ekstraher 10 ml af ledvæsken. Dæk punkteringsstedet med transfusionspinden og tryk i 5 min.
- SF-supernatanten kasseres efter centrifugering ved 1.500 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Cellepelleten gensuspenderes med 10 ml 1x phosphatbuffersaltvand (PBS), centrifuge ved 1.500 x g i 10 minutter ved 4 °C, og PBS kasseres.
- Pelleten genudsættes med 10 ml humant MSC-kulturmedium ved en celletæthed på 5 x 104 celler/ml (se Materialetabel), og hæld derefter suspensionen i en 100 mm skål.
- Skålen inkuberes ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5 % CO2.
- Efter 48 timer fjernes de ikke-klæbende celler ved at skifte medium og vaskes med 1x PBS. Udskift mediet hver 3. dag i 2 uger.
- Saml cellekulturens supernatanter.
- Identificer SF-MSC'er ved hjælp af flowcytometri.
- Fordøjes tredje generation (P3) af SF-MSC'er, centrifuge ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten og saml cellepellet.
BEMÆRK: En passage anerkendes som cellernes underkultur til en anden kulturskål. De primære celler isoleret fra SF og podet på retter er mærket som passage nul (P0). Ved ca. 75% sammenløb fordøjes cellerne og løsnes fra opvasken, sås på andre retter og mærkes som P1. - Tilsæt 400 μL blokeringsbuffer (1% BSA i 1x PBS) til cellepelleten (5 x 104) og lad den stå i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten centrifugeres ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og pelleten suspenderes i 100 μL 1x PBS.
- Der tilsættes 1 μL CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR monoklonalt fluorescerende antistof (fortyndingsforhold 1:100) (se materialetabel) pr. rør og inkuberes ved RT i 30 min.
- Vask to gange med 1x PBS og kassér supernatanten. Cellepelleten opsamles og resuspenderes i 100 μL 1x PBS.
- Detekter på et flowcytometer op til 10.000 celler ved hjælp af filtre på 525/50 og 585/40 for at detektere fluorophorerne.
- Fordøjes tredje generation (P3) af SF-MSC'er, centrifuge ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten og saml cellepellet.
2.3D bioreaktorcellekultur
- Mikrocarrier forberedelse
- Svulme de tørre 0,75 g mikrocarriers (se materialetabel) og hydrere i 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) (50 ml / g mikrocarriers) i mindst 3 timer ved RT.
- Dekantér supernatanten og vask mikrocarriers i 5 min i frisk DPBS (50 ml/g mikrocarriers). Kassér PBS'en og erstat den med friske 1x DPBS (50 ml/g mikrocarriers).
- Steriliser mikrocarriers ved autoklavering (121 °C, 15 min, 15 psi). Lad de steriliserede mikrocarriers afregne, dekantere supernatanten.
- Skyl kort mikrocarriers i kulturmediet (50 ml / g mikrocarriers) ved RT. Lad mikrocarriers sætte sig, kassér supernatanten.
- Perfusion bioreaktor
- Steriliser bioreaktoren ved autoklavering (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Tæl antallet af SF-MSC'er og tildel 2,5 x 107 SF-MSC'er og mikrocarriers til bioreaktoren, der er perfunderet med GMP-grade MSC-kulturmedium (250 ml).
- Bioreaktoren anbringes i en inkubator med 5 % CO2 ved 37 °C. Drej bioreaktoren med en hastighed på 15 o / min. Skift kulturmediet hver 6. dag.
- Saml cellekultursupernatanter og mikrocarriers til yderligere analyse efter dyrkning i 14 dage.
3. Identifikation af exosome og sikkerhedsdetektion
- Ultracentrifugering
- Cellekulturens supernatant centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten opsamles; Kassér celleaffaldet.
- Supernatanterne centrifugeres ved 2 000 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten opsamles. Kassér de større vesikler (apoptotiske legemer og nogle større mikrovesikler).
- Supernatanten centrifugeres igen ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 °C for at fjerne større vesikler. opsamling af pellets og resuspend i 40 ml 1x PBS.
- De resuspenderede pellets centrifugeres ved 120.000 x g i 70 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres, og pelleterne, der indeholder exosomer, genudsættes i 500 μL 1x PBS.
- Nanopartikel sporing analyse (NTA)
BEMÆRK: For hver kørsel blev 500 μL af prøven injiceret i kammeret med en strømningshastighed på 30 μL/min. Analysen udføres ved 24,4 °C-24,5 °C.- De friskisolerede exosomprøver fortyndes med sterile 1x PBS til 1 ml indeholdende 107-10 9 /ml partikler, og injiceres i nanopartikelsporingsanalysesystemet (se Materialetabel).
- Indstil manuelt optagelses- og analysesystemet i henhold til producentens protokol. Visualiser partiklerne ved hjælp af laserlysspredning og optag deres brownske bevægelse på digital video.
- Analyser de optagede videobånd ved hjælp af software (se Materialetabel) baseret på sporing af mindst 200 individuelle partikler pr. Kørsel.
- Transmission elektronmikroskopi
- Fix exosomerne i 4% paraformaldehyd (i kold 1x DPBS) i 5 min.
- Monter 5 μL af exosomerne på kobbergitter. I dette eksperiment er koncentrationen af exosomer 1 mg / ml kvantificeret ved et proteinassaysæt (se Materialetabel).
- Integrer exosomerne i 3% phosphotungstic acid i 10 min på is. Fjern den overskydende syre, og tør prøverne ved RT.
- Forestil dig exosomprøverne med en TEM ved en accelerationsspænding på 100 kV.
- Western blotting
- Tilsæt 300 μL lysisbuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) og proteasehæmmere cocktail (se Materialetabel) til exosomerne.
- Bland exosomerne i lysisbufferen ved at pipettere op og ned og lad det stå på is i 20 min.
- Blandingen centrifugeres ved 9,391 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten opsamles. Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af et proteinanalysesæt (se Materialetabel).
- Tilsæt 100 μL 4x proteinbelastningsbuffer og opvarm ved 100 °C i 10 min.
- Der indlæses 15 μL proteiner i en koncentration på 10 mg/ml og køres ved gelelektroforese (120 V, 70 min) og elektroblotting ved 100 V, 60 min ved 4 °C.
- Detekter de ikke-exosomspecifikke markører (calnexin) og exosomale biomarkører (CD9, CD63 og CD81) ved fluorescerende western blotting (se Materialetabel).
- Sikkerhedstest
- For bakterier, svampe og Mycobacterium tuberkulose detektion følg trin 3.5.2-3.5.5.
- Der udsås 100 μL af exosomopløsningen (1 mg/ml) på en blodagarkulturplade (se Materialetabel), og dyrkningspladen inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
- Der udsås 100 μL af exosomopløsningen (1 mg/ml) på en sabouraud agar-medium plade (se materialetabel) og inkuberes ved 35 °C i 48 timer.
- Der sås 100 μL exosomopløsning (1 mg/ml) på en Lowenstein-Jensen dyrkningsmedium plade (se Materialetabel) og inkuberes ved 37 °C i 3 uger.
- Detekter udseendet af bakterier, svampe og Mycobacterium tuberculosis kolonier ved makroskopisk observation.
BEMÆRK: Kriterier for evaluering af sikkerheden ved exosomer er fraværet af mikroorganismer på dyrkningspladen. - For Mycoplasma-detektion skal du følge trin 3.5.7-3.5.9.
- Exosomerne gensuspenderes i 50 μL bufferopløsning inkluderet i sættet og opvarmes ved 95 °C i 3 min.
- Forstærk Mycoplasma i exosomopløsning ved hjælp af et PCR Mycoplasma-detektionssæt (se Materialetabel).
- Detekter PCR-produkterne på 1,5% agarosegelelektroforese (30 min, 120 V).
4. Registrering af in vitro-exosomfunktion
- Exosome mærkning
- Mærk 100 μL exosomer (1 mg/ml) med 1 mM Dil (1000x) (se materialetabel) og inkuber ved RT i 30 min.
- Gendan exosomerne ved ultracentrifugering ved 100.000 x g i 70 min. Resuspender pelleten i 500 μL 1x PBS.
- Indlæsning af Cy3-miR-140 efterligner i exosomer
- Der blandes 1 μg/μL exosomalt protein og 5 μmol/ml Cy3-miR-140 i et slutvolumen på 400 μL elektroporationsbuffer (1,15 mM kaliumphosphat (pH 7,2), 25 mM kaliumchlorid og 21 % (v/v) (se materialetabel).
- Blandingen overføres til kolde 0,4 cm elektroporationskuvetter og elektroprat ved 300 V/100 μF kapacitans ved hjælp af et gentransfektionssystem (se Materialetabel).
- Umiddelbart efter elektroporation skal blandingen holdes ved RT i 30 minutter for at sikre, at exosommembranen gendannes fuldstændigt.
- Behandl blandingerne med en enhed RNase A (se Materialetabel) i 20 minutter for at eliminere miRNA-efterligningerne uden for exosomerne.
- Ultracentrifugate exosomblandingen ved 120.000 x g i 90 minutter, kassér supernatanten og suspender exosomerne i 500 μL 1x PBS.
- Exosome optagelse assay
- Chondrocytterne (1 x 107) sås i 35 mm konfokale skåle med 1 ml DMEM/F12 indeholdende 10% FBS.
- Efter 24 timer behandles kondrocytterne med DiI-mærkede exosomer (100 ng/ml) eller cy3-miR-140 fyldte exosomer (100 ng/ml) i 1 time.
- Vask med 1x PBS tre gange, og mærk derefter med DAPI (10 ng/ml) i 10 minutter ved RT.
- Fluorescenssignalet optages i konfokal laserscanningsfluorescensmikroskopi (CLSM) ved hjælp af de relevante filtre (se Materialetabel).
5. Statistisk analyse
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af passende statistisk software.
BEMÆRK: Repræsentative data i hver figur blev udtrykt som gennemsnittet ± SD. Studentens t-test blev brugt til sammenligning af to grupper ved hjælp af statistiksoftware. En envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple blev udført i tilfælde af sammenligninger mellem flere grupper. P-værdier <0,05 (*), <0,01 (**) eller <0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flowcytometri blev brugt til at identificere overflademarkører for SF-MSC'er i henhold til de minimale kriterier for at definere humane MSC'er anbefalet af International Society for Cellular Therapy14,15. Flowcytometrianalyse afslørede, at SF-MSC'er dyrket i denne undersøgelse opfyldte identifikationskriterierne for MSC'er. De var negative for CD34, CD45 og HLA-DR (under 3%) og positive for CD73, CD90 og CD105 (over 95%) (figur 2).
Under omvendt mikroskopi blev det bemærket, at SF-MSC'erne spredes på mikrocarriers (figur 3A). Efter at celler blev fordøjet og vasket fra 2D-kulturpladen og 3D-kulturmikrocarriers, blev cellenummeret talt. Sammenlignet med 2D-kultur fik 3D-kulturen SF-MSC til at sprede sig hurtigere fra 6 dage og fremefter (figur 3B). Resultaterne af tre uafhængige eksperimenter blev præsenteret.
For at identificere exosomerne (Exos) fra SF-MSC'er af 2D- og 3D-kultur blev de exosomassocierede proteiner (CD63, CD9 og CD81) og negativt protein (calnexin) detekteret ved anvendelse af western blotting. Resultaterne afslørede, at 2D-Exos og 3D-Exos udtrykker CD63, CD9 og CD81, mens de er negative for calnexin (figur 4A). Også exosomdiameteren og morfologien blev analyseret ved hjælp af NTA og TEM. Nanosight-analyse viste, at diameteren af 2D-Exos (figur 4B) og 3D-Exos (figur 4D) er ca. 120 nm. Transmission elektronisk mikroskop analyse afslørede morfologien af 2D-Exos og 3D-Exos, der viser omtrent sfæroidale vesikler (figur 4C, E).
Efter 3D-kultur er partikelkoncentrationen af partikler på 30-160 nm størrelse 4,0 x 106 pr. ml analyseret ved hjælp af NTA. Efter 2D-kulturen er partikelkoncentrationen af 30-160 nm partikler imidlertid 2,5 x 106 pr. ml (figur 5A). Ved beregning af exosomproteinudbyttet i mediet producerede 3D-kultur mere exosomprotein end 2D-kultur (figur 5B). Sammenlignet med 2D-kultur forbedrede 3D-kulturen således eksosomudbyttet betydeligt.
Exosomerne blev først mærket med DiL og derefter inkuberet i en koncentration på 10 μg / ml med chondrocytterne i 1 time, 2 timer og 3 timer for at undersøge, om exosomer kan komme ind i primære chondrocytter in vitro. Dil-mærkede exosomer kom ind i primære kondrocytter, med toppen set ved 3 timer (figur 6).
For at detektere exosomernes funktion som nanocarriers blev exosomer fyldt med Cy3-mærket miR-140 gennem elektroporation og derefter behandlet med chondrocytter i en koncentration på 10 μg / ml i 3 timer. Resultaterne viste, at exosomer kunne levere miR-140 til kondrocytter (figur 7). Alle resultaterne opfyldte specifikationerne; alle prøver var sterile og negative for Mycoplasma.
Figur 1: Skematisk diagram over exosomer isoleret fra hSF-MSC'er in vitro. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Identifikation af SF-MSC'er ved flowcytometri. Flowcytometri viser den positive eller negative immunophenotype af hSF-MSC'er. (A) Mærkning med et IgG1-isotypekontrolantistof. (B) CD73 er positiv, og CD34 er negativ. (C) CD90 er positiv, og CD45 er negativ. (D) CD105 er positiv, og HLA-DR er negativ, kendt som MSC-markører. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: SF-MSC vækstkurve. (A) Repræsentative billeder, der viser SF-MSC'er (røde pile) på mikrocarriers under inverteret mikroskopi (skalabjælke = 100 μm). (B) Vækstkurven for SF-MSC under 2D- og 3D-kultur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Identifikation af exosomer . (A) Western blotting resultater af 2D-Exos og 3D-Exos. (B) Nanosight analyse af diameteren af 2D-Exos og 3D-Exos. (C) TEM-detektion af morfologien af 2D-Exos og 3D-Exos. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Det forbedrede udbytte af exosomproduktion ved 3D-bioreaktorkultur . (A) Repræsentative resultater af exosomstørrelse analyseret af NTA. (B) Proteinudbytte = exosomalt protein (μg)/konditioneret medium (ml). Plots viser udbyttet for hver metode og den gennemsnitlige SD ± alle målinger (** p < 0,01). Statistiske sammenligninger blev udført ved envejs ANOVA med post-hoc Bonferronis korrektion og ved Student's t-test. ** p < 0,01 blev anset for at være en væsentlig forskel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6 Repræsentative billeder, der viser internaliseringen af Dil-mærkede exosomer af primære kondrocytter. Kondrocytter blev inkuberet med Dil-mærkede exosomer i 1 time, 2 timer og 3 timer. Exosomer blev mærket med Dil (rød), og kerner blev mærket med Hoechst (blå). Prøver blev påvist ved 60x forstørrelse. Skala bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: In vitro levering af miR-140 af MSC exosomer. Efter at have taget Cy3-mærket miR-140, der blev indkapslet i SF-MSC-afledte exosomer, blev chondrocytter afbildet. Skala bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mesenkymale stamceller er blevet meget udbredt i regenerativ medicin på grund af deres selvfornyelse, differentieret til vævsceller med specialiserede funktioner og parakrine virkninger16,17. Især har de parakrine virkninger, der udøves af exosomer, tiltrukket sig stor opmærksomhed18. Exosomer bærer bioinformation fra MSC'er og udfører deres biologiske funktion og overvinder MSC-mangler, såsom besværlig opbevaring og forsendelse. Således er exosomer afledt af MSC'er blevet brugt til terapeutiske interventioner, som har tiltrukket sig mest opmærksomhed i OA-terapi.
I øjeblikket er der to metoder til at udbrede MSC'er, 2D-kultur og tredimensionel (3D) kultur19. 2D-kultur er en konventionel måde at dyrke MSC'er til in vitro-undersøgelser med lave omkostninger. Det er dog tidskrævende og begrænset i skalapotentiale. MSC-udbredelse i 2D-mikromiljøet udleder også hurtigt stammen20,21, en af de mest kritiske egenskaber ved MSC'er. 2D-kultur kan således ikke opfylde kravene til MSC-terapi. I denne undersøgelse, med det formål at SF-MSC'er i OA-terapi, bestræber vi os på at opretholde SF-MSC-egenskaber ved hjælp af kulturen i en 3D-bioreaktor, som mere præcist kan efterligne det biologiske mikromiljø. For nylig har andre forskere brugt stilladser eller mikrocarrier-baseret 3D til at dyrke MSC'er. Vi fandt ud af, at 3D-kollagenstilladserne tillod mere koncentrerede exosomer produceret af humane knoglemarvsafledte MSC'er end 2D-kultur23.
Da exosomer kan udføre en stor del af MSC-funktionen og samtidig undgå nogle mangler ved MSC'er, sigter vi mod at producere exosomer til OA-terapi. Denne undersøgelse opdagede yderligere exosomproduktions- og leveringsfunktionen ved hjælp af dette system baseret på den store mængde og høje kvalitet af MSC-udbredelse af 3D-kultur. Rotary Cell Culture System (RCCS) blev brugt til 3D-kultur til at producere exosomer fra storskala MSC-formering. Sammenlignet med traditionel 2D-kolbekultur kan dette 3D-kultursystem undgå forurening fra gentagen medium ændring og cellepassage. Endnu vigtigere viste denne undersøgelse, at en 3D-bioreaktor kunne forbedre exosomproduktionen for at opfylde kravene til klinisk undersøgelse. Bemærk, at exosomer isoleret fra 3D-kultursupernatanter kan levere miRNA'er i celler, hvilket tyder på, at 3D-kultur ikke forstyrrer exosomfunktionen. Mikrobielle og endotoksindetektionsresultater understøtter yderligere, at denne undersøgelse har etableret en protokol, der kan producere exosomer, som er biologisk sikre og lovende til OA-terapi. På nuværende tidspunkt kan den eksosommængde, der produceres i denne undersøgelse, ikke tilfredsstille kommercielle behov. Derfor skal der udvikles strategier for en enorm mængde exosomproduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Nøgleprogram for naturvidenskabsfonden i Guangdong-provinsen (nr. 2018B0303110003); Guangdong internationalt samarbejdsprojekt (nr. 2021A0505030011); Shenzhen videnskabs- og teknologiprojekter (nr. GJHZ20200731095606019, nr. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kina Postdoctoral Science Foundation (nr. 2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr. 2021A1515010985); Sanming Projekt af Medicin i Shenzhen (SZSM201612079); Særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
