Summary
يفصل هذا البروتوكول استخدام قسطرة وريدية خاصة ، وأنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، والتحكم في درجة الحرارة تكملها مراقبة في الوقت الفعلي ، ونظام إنذار لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين لتحسين الاتساق في صلاحية خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة وإنتاجيتها ووظائفها.
Abstract
تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في البحوث الأساسية حول أمراض الكبد واختبار السمية في المختبر. يعد إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين لعزل خلايا الكبد الأولية تحديا تقنيا ، خاصة في تعليب الوريد البابي. الإجراء عرضة أيضا للتلوث العرضي والاختلافات في ظروف التروية بسبب الصعوبات في تجميع أو تحسين أو صيانة إعداد التروية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإجراء محسنة من خطوتين لتروية الكولاجيناز مع التحكم في التروية متعدد المعلمات. تم عزل خلايا كبد الفئران الأولية بنجاح وموثوقية من خلال اتخاذ الاحتياطات التقنية اللازمة في الخطوات الحرجة للإجراء ، وعن طريق الحد من الصعوبة التشغيلية والتخفيف من تباين معلمات التروية من خلال اعتماد قسطرة وريدية خاصة ، وأنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، والتحكم في درجة الحرارة ، ونظام المراقبة والإنذار في الوقت الفعلي. تظهر خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة باستمرار قابلية عالية للخلايا (85٪ -95٪) ، والعائد (2-5 × 108 خلايا لكل 200-300 غرام من الفئران) والوظائف (الألبومين واليوريا ونشاط CYP). وقد استكمل هذا الإجراء بنظام متكامل لتروية الدم، وهو مدمج بما يكفي ليتم إعداده في غطاء التدفق الرقائقي لضمان التشغيل المعقم.
Introduction
خلايا الكبد الأولية هي أدوات مهمة للبحوث الأساسية المتعلقة بالكبد ، وعلاج الأمراض ، والتطبيق مثل اختبار المخدرات. المعيار الذهبي الحالي لعزل خلايا الكبد الأولية هو إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين 1،2،3 الذي قدمه Seglen في 1970s4. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء يمثل تحديا تقنيا ولديه معدل فشل مرتفع عند إجرائه من قبل الجراحين المبتدئين. حتى عندما يعتبر التروية ناجحا ، يمكن ملاحظة اختلافات جذرية في صلاحية خلايا الكبد (عادة 60٪ -95٪) والعائد (0.5-5 × 108 لكل 200-300 غرام من الفئران) بين العزلات. وهذا يؤثر على جودة وحجم التجارب النهائية. بصرف النظر عن الإجراء الفني ، فإن إعداد التروية المستخدم في العزل ، سواء كان متاحا تجاريا أو مخصصا ، هو عامل مساهم. يجب إيلاء الاهتمام لتجميع وتحسين وصيانة إعداد التروية. الغرض من هذا البروتوكول هو تحسين معدل النجاح والاستقرار بين عزل خلايا كبد الفئران الأولية من خلال التحكم في التروية متعددة المعلمات للإجراء الفني وإعداد التروية لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين.
من الجانب التقني ، فإن الخطوة الأكثر صعوبة في الإجراء هي تعليب الوريد البابي. أما بالنسبة للخطوات الأخرى ، إذا لوحظت الممارسة الجيدة وتم اتخاذ الاحتياطات العامة ، يمكن تحسين استقرار العزل. لذلك ، فإن فهم المنطق لكل خطوة مهم حتى يتمكن الجراح من الاستجابة للمتغيرات المختلفة التي قد تحدث أثناء الإجراء.
تم نشر بروتوكولات مختلفة لعزل خلايا الكبد وخلايا الكبد غير المتنية من الفئران والفئران1،2،5،6،7،8،9. كان لإعدادات التروية المستخدمة في هذه البروتوكولات العديد من العيوب ، والتي تشمل إعادة استخدام أنابيب التروية ، ومشاكل في التحكم في درجة الحرارة ، والحاجة إلى التحسين الروتيني لمعلمات التروية ، و / أو استخدام نوع غير مناسب من القسطرة الوريدية (IV) لقنية الوريد البابي. ستزيد إعادة استخدام أنابيب التروية من فرص التلوث ، خاصة إذا لم يتم تنظيف الأنابيب وتطهيرها بشكل صحيح. كما أن إعادة استخدام الأنابيب دون استبدال روتيني سيعرض إعداد التروية لمشاكل مثل الأنابيب أو الموصلات المتسربة ، ومصيدة الفقاعات المسدودة والأنابيب الضيقة ، وكلها ستقلل بشكل كبير من ضغط البيرفوسات ومعدل التدفق ، وبالتالي ، مما يؤثر على كفاءة هضم الكبد. بدون مصدر حرارة ثابت في بعض الإعدادات للتحكم في درجة الحرارة ، سوف تبرد المخازن المؤقتة التي تم تسخينها مسبقا بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى انخفاض نشاط الكولاجيناز والهضم. على الرغم من أن الإعدادات الأخرى تستخدم مكثفا زجاجيا مغلفا متصلا بجهاز تدوير المياه لتدفئة المخزن المؤقت ، إلا أنها ضخمة وتتطلب تنظيفا دقيقا. يجب قياس درجة الحرارة والضغط ومعدل تدفق المخزن المؤقت الخارج من القسطرة وتحسينه قبل بدء العزل لضمان حالة تروية مستقرة. حتى بعد التحسين ، لا يزال من الممكن أن تتغير المعلمات في منتصف الطريق أثناء العزل بسبب تصرفات المشغل ، مما يؤدي إلى التروية والهضم دون المستوى الأمثل. معظم أنواع القسطرة الوريدية ليست مناسبة لتعليب الوريد البابي لأنها لا تسمح بالتروية المستمرة أثناء التعليب. إنهم غير قادرين على إبلاغ الجراح على الفور عند نجاح القنية. علاوة على ذلك ، من الصعب تأمين الوريد البابي على القسطرة الناعمة دون تشويهها.
هنا ، نعالج هذه المشكلات باستخدام أنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، وسترة سخان سيليكون للتحكم الدقيق والمستقر في درجة الحرارة ، ونظام المراقبة والإنذار في الوقت الفعلي مع تخزين البيانات وإدارتها واستخدام قسطرة IV خاصة ، والتي تسمح بالتروية المستمرة أثناء ثقب الوريد البابي أثناء التعليب. على حد علمنا ، نحن أول مجموعة تجمع بين كل هذه الميزات في نظام تروية متكامل (IPS) صغير الحجم ، مما يجعله محمولا للغاية وقادرا على وضعه في غطاء تدفق صفحي لضمان التشغيل المعقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وإسكان الحيوانات بموجب البروتوكول رقم R15-0027 و R19-0669 وفقا لمتطلبات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لجامعة سنغافورة الوطنية.
1. إعداد المحاليل والأدوات الجراحية
- قم بإعداد المخازن المؤقتة ووسائط زراعة الخلايا في الجدول 1 باستخدام مياه فائقة النقاء.
- قم بتسخين المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم والكولاجيناز مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام.
- قم بتعقيم الأدوات الجراحية والمعدات المختبرية التالية: زوج من المقصات الجراحية حادة حادة ، زوج من المقص الجراحي الحاد الحاد ، زوج من المقص الجراحي المنحني ، زوجان من ملقط أنسجة الأسنان ، زوجان من الملقط المنحني ، مشبكان للوريد ، خياطة جراحية حريرية بطول 5 سم 3-0 ، مرشح شبكة نايلون 100 ميكرومتر ، كوب 400 مل ، ومرحلة (رف أنبوب الطرد المركزي العائم).
2. إعداد IPS (انظر الشكل 1)
- امسح غطاء التدفق الرقائقي بنسبة 70٪ من الإيثانول. امسح IPS بنسبة 70٪ من الإيثانول وانقله إلى غطاء التدفق الرقائقي. تعقيم بواسطة الأشعة فوق البنفسجية لمدة >15 دقيقة قبل تشغيل غطاء المحرك.
تحذير: التعرض للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يسبب حروق مؤلمة في العينين والجلد. تأكد من إغلاق الوشاح بالكامل عند تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. - قم بتجميع مجموعة جديدة من الأنابيب التي يمكن التخلص منها على IPS. لف الأنابيب في اتجاه مجرى النهر للمضخة التمعجية في سترة سخان سيليكون. قم بتجميع جهاز مراقبة التروية على الأنابيب في اتجاه مجرى النهر لسترة سخان السيليكون.
- تأكد من أن المشابك الدوارة لكل من مداخل الأنابيب مخففة تماما. قم بتوصيل كل مدخل أنابيب بالطرف المدبب لماصة شفط معقمة سعة 2 مل. اترك كل من ماصات الشفط (المداخل) والقسطرة الوريدية (المخرج) في زجاجة سعة 1 لتر مع مخزن مؤقت خال من الكالسيوم للسماح بإعادة تدوير المخزن المؤقت أثناء خطوات التحضير اللاحقة.
الشكل 2: واجهة الاختبار الذاتي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بتشغيل IPS. قم بإجراء العمليات التالية على لوحة تحكم الشاشة التي تعمل باللمس. سيقوم البرنامج بإجراء اختبار ذاتي شامل في كل مرة يتم فيها تشغيله.
تنبيه: IPS عبارة عن جهاز كهربائي متصل بمصدر طاقة خارجي. قد تؤدي الانسكابات السائلة على IPS أو كابلات الطاقة إلى مخاطر كهربائية.- تأكد من عرض حالة الاختبار الذاتي على الشاشة (الشكل 2). سيتم عرض المكونات التي اجتازت الاختبار الذاتي باللون الأخضر ؛ سيتم عرض تلك التي فشلت باللون الأحمر. بعد التصحيح، اضغط على أيقونة الاختبار لتكرار الاختبار الذاتي مرة أخرى أو اضغط على أيقونة إدخال النظام للدخول مباشرة إلى واجهة التشغيل.
- انقر في أي مكان على الشاشة لتسجيل الدخول إلى واجهة التشغيل.
- في الزاوية العلوية اليمنى من واجهة التشغيل (الشكل 3)، اضغط على أي من أيقونات الأسهم الدائرية لتعيين اتجاه دوران المضخة التمعجية. في اللوحة اليمنى من الواجهة ، انقر فوق أيقونات الأسهم لأعلى / لأسفل لتعيين قيم للمعلمات المقابلة. اضبط التدفق على وضع التدفق المستمر ؛ درجة حرارة سترة السخان إلى 42 درجة مئوية (يتم تعديلها لضمان الحفاظ على درجة حرارة البيرفوسات عند 37 درجة مئوية) ؛ وسرعة المضخة إلى 38 دورة في الدقيقة لمعدل تدفق ~ 33 مل / دقيقة.
- في اللوحة السفلية اليسرى من واجهة التشغيل، تحقق من حالة إنذار الفقاعة، وتنبيه إيقاف التروية، وأيقونة كتم الصوت.
- تحقق من درجة الحرارة والضغط ومعدل تدفق العطر في اللوحة اليسرى. قم بتعيين الفواصل الزمنية يدويا من خلال النقر على الأسهم لأعلى ولأسفل في أعلى وأسفل الأعمدة. تحقق من البيانات في الوقت الفعلي المعروضة كقيم في منتصف الأعمدة. سيتحول لون العمود من الأخضر إلى الأحمر إذا تحركت البيانات في الوقت الفعلي خارج النطاق المحدد.
- حدد موقع الأيقونات لبدء التروية وإيقافها مؤقتا وإيقافها، والرمز للتبديل من عرض البيانات في الوقت الفعلي إلى وضع المخطط في اللوحة الوسطى. اضغط على أيقونة البدء لبدء التروية وتجهيز الأنابيب بمخزن مؤقت خال من الكالسيوم. سيتم إنشاء سجل جديد. أدخل اسم الملف واسم المستخدم في النافذة المنبثقة (الشكل 4).
الشكل 3: واجهة التشغيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نافذة منبثقة تطالب باسم الملف واسم المستخدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- املأ غرفة التنقيط إلى نصف ممتلئ. تأكد من عدم وجود جيوب هوائية محاصرة في الأنابيب أثناء التحضير.
- قم بإزالة أي فقاعة تتشكل في اتجاه مجرى مرشح الفقاعة عن طريق النقر على الأنبوب لفصل الفقاعة والسماح بطردها.
ملاحظة: قد تتشكل الفقاعات على طول الأنابيب حيث يتم تسخين المخزن المؤقت بواسطة سترة السخان. - املأ دورقا سعة 400 مل ب 200 مل من الكولاجيناز العازل. ضع المسرح فوق الدورق. دون إدخال أي هواء إلى الأنابيب ، قم بتشديد المشبك الأسطواني بالكامل لأحد مداخل الأنابيب وحرك ماصة الشفط للمدخل إلى الدورق.
3. الإجراء الحيواني
- إعداد الفئران الذكور الشباب البالغين Wistar حوالي 200-300 غرام في وزن الجسم.
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للفئران حوالي 200-300 غرام في وزن الجسم. يفضل ذكور الفئران لأن التغيرات الهرمونية خلال دورة استروس في إناث الفئران ستؤثر على وظيفة خلايا الكبد. - تخدير
- ارسم الحجم المطلوب من الهيبارين المضاد للتخثر (5000 وحدة دولية / مل ؛ 0.2 مل / 100 غرام من وزن الجسم) وكوكتيل تخدير الفئران الكيتامين / الزيلازين (37.5 ملغ / مل كيتامين ، 5 ملغ / مل زيلازين ؛ 0.2 مل / 100 غرام من وزن الجسم) في محاقن 1 مل مع إبرة 27 غرام.
تحذير: التخدير والهيبارين من المواد الضارة. كن حذرا عند التعامل مع الأدوات الحادة. - كبح جماح الفئران. حقن الهيبارين داخل الصفاق متبوعا بكوكتيل الكيتامين / الزيلازين في الربع الأيمن السفلي من البطن.
ملاحظة: لدى caecum احتمال أكبر لوجوده على اليسار. تجنب ثقب الكاكوم أثناء الحقن لتقليل خطر التلوث. - بعد 10 دقائق ، تحقق من عمق التخدير عن طريق تقييم رد فعل الدواسة على قدمي الفئران. استمر في التحقق من وقت لآخر وانتظر حتى لا يستجيب الفئران لقرصات أصابع القدم. يمكن حقن تخدير إضافي ، حسب الضرورة.
- ارسم الحجم المطلوب من الهيبارين المضاد للتخثر (5000 وحدة دولية / مل ؛ 0.2 مل / 100 غرام من وزن الجسم) وكوكتيل تخدير الفئران الكيتامين / الزيلازين (37.5 ملغ / مل كيتامين ، 5 ملغ / مل زيلازين ؛ 0.2 مل / 100 غرام من وزن الجسم) في محاقن 1 مل مع إبرة 27 غرام.
- ضع الفئران في وضع ضعيف مع أطراف ممدودة على منصة البوليسترين المغطاة بورق الألمنيوم أعلى صينية. قم بربط أقدام الفئران وقم بتثبيت الشريط بشكل آمن على المنصة باستخدام إبر 27 G.
- تطهير الصدر والبطن عن طريق رشها وغمرها بنسبة 70٪ من الإيثانول. الحلاقة قبل التطهير اختيارية. ضع الفئران في غطاء محرك السيارة. استمر في الخطوة التالية بينما لا يزال الفراء رطبا.
ملاحظة: الغمر بالإيثانول بنسبة 70٪ يحافظ أيضا على غبار الوبر والفراء إلى الحد الأدنى. - افصل الجلد عن العضلات.
- مع زوج من ملقط أنسجة الأسنان في يد واحدة ، ارفع الجلد بالقرب من قاعدة البطن. مع زوج من المقص الجراحي الحاد الحاد في اليد الأخرى ، قم بقطع جلد الخيام. ادفع الطرف الحاد للمقص تحت الجلد وقم بعمل شق في خط الوسط على الجلد من فوق الساقين الخلفيتين مباشرة إلى أسفل الساقين الأماميتين مباشرة.
- أثناء سحب الجلد وتمديده برفق باستخدام الملقط ، قم بقطع أي نسيج ضام يحمل الجلد على العضلات في الصدر والبطن. لتقليل خطر التلوث ، منع الفراء الفضفاض من السقوط على العضلات. لإزالة الفراء الفضفاض المتراكم على المقص ، امسحه على الجانب الخارجي المطهر من الجلد.
- قم بعمل شقوق جانبية على الجلد ، من خط الوسط إلى جانبي الفئران فوق الساقين الخلفيتين قليلا وأسفل الساقين الأماميتين بقليل. ادفع اللوحات الجلدية إلى الجانبين لفضح العضلات.
- قطع عضلة البطن مفتوحة لفضح الأعضاء.
- مع زوج جديد من ملقط أنسجة الأسنان في يد واحدة ، ارفع العضلات بالقرب من قاعدة البطن. مع زوج من المقص الجراحي الحاد الحاد في اليد الأخرى ، قم بقطع العضلات بعناية دون أن تضرب أي من الأعضاء. قم بعمل شق في خط الوسط على العضلات من أعلى الساقين الخلفيتين قليلا إلى القص.
- قم بعمل شقوق جانبية على العضلات ، من خط الوسط إلى جانبي الفئران فوق الساقين الخلفيتين قليلا وأسفل القفص الصدري مباشرة ، دون أن تضرب أي من الأعضاء. ادفع اللوحات العضلية إلى الجانبين لفضح الأعضاء. تأكد من أن الشقوق الجانبية للجلد والعضلات تصل إلى جانبي الفئران للسماح للدم والمخازن المؤقتة بالتدفق من تجويف البطن في خطوات لاحقة.
- قنية الوريد البابي
- مع الجزء الخلفي من ملقط منحني ، ادفع الأمعاء بلطف إلى اليمين. اقلب فصوص الكبد برفق لأعلى لفضح الوريد البابي.
- استخدم خياطة جراحية حريرية 3-0 لإنشاء رباط فضفاض للغاية حول الوريد البابي بالقرب من الكبد ، قبل فروع الوريد مباشرة إلى اليسار واليمين في فصوص الكبد المختلفة. لا تشد الرباط لتجنب تعطيل تدفق الدم عبر الوريد البابي. يجب اختراق غشاء رقيق جدا أسفل القناة الصفراوية بطرف الملقط المنحني قبل أن يمر الخيط تحته ويدور حول الوريد البابي (والقناة الصفراوية).
- باستخدام أطراف زوجين من الملقط المنحني ، قم بثقب ثقب بعناية عبر الأنسجة الموجودة أسفل الوريد البابي ، دون إتلاف الوريد البابي. افعل ذلك حوالي 2-3 سم في المنبع من الرباط الأول ، قبل أن يتفرع الوريد المعدي مباشرة من الوريد البابي. الأنسجة أرق في هذا الموقع المحدد.
- قم بتمديد الثقب بعناية أكبر باستخدام الملقط. سيسمح هذا الثقب للملقط بدعم الوريد البابي أثناء التعليب.
- قلل من سرعة المضخة إلى 4 دورات في الدقيقة للحصول على معدل تدفق يبلغ ~ 3 مل / دقيقة. تأكد من تقليل تدفق المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم من القسطرة الوريدية إلى تنقيط بطيء.
ملاحظة: تراكم الضغط في الكبد سوف يسبب موت خلايا الكبد. يجب أن يؤدي انخفاض معدل التدفق إلى إبطاء تراكم الضغط في الكبد عند الإدخال الناجح للقنية في الوريد البابي في خطوة لاحقة. - ادعم بلطف الوريد البابي باستخدام الملقط. من ناحية أخرى ، تمسك بالقسطرة الوريدية مع شطبة الإبرة متجهة لأعلى. وجه الإبرة إلى الوريد البابي بزاوية 10-20 درجة وتقدم ببطء حتى يصبح الشطب بأكمله داخل الوريد. بمجرد إدخال الإبرة بشكل صحيح في الوريد البابي ، سيبدأ الكبد في التبييض ويفقد لونه الأحمر الداكن.
ملاحظة: يجب إدخال شطبة الإبرة بالكامل في الوريد لإنشاء ثقب كبير بما يكفي لإدخال الكانيولا. ومع ذلك ، لا تدخل الإبرة بعمق كبير لتجنب ثقب الوريد. - تقدم القنية فوق الإبرة وفي الوريد. ثم ، سحب الإبرة حتى تكون 2-3 مم خلف القنية. يكفي فقط بحيث يكون الطرف الحاد بأمان داخل الكانيولا. استخدم الإبهام والإصبع الأوسط للتمسك بالقسطرة واستخدم السبابة لسحب الجناح إلى الخلف لسحب الإبرة.
- قم بتثبيت الوريد البابي بسرعة على القسطرة باستخدام مشبك الوريد. لا تقم بالتثبيت مباشرة على الفتحة الجانبية للإبرة لتجنب تعطيل تدفق العطريات. بدلا من ذلك ، قص أسفله.
- قطع على الفور الوريد الأجوف السفلي السفلي (IVC) لمنع تراكم الضغط في الكبد. الآن سيتم حجب IVC تحت الراحتي والأوعية الدموية المجاورة بالدم من الوريد البابي. للتأكد من أن IVC قد تم قطعه وقطعه بشكل صحيح ، راقب تدفق الدم في البقول ؛ سوف يتدفق الدم فقط من الأوعية المجاورة.
ملاحظة: إن أخذ وقت طويل جدا لقطع IVC تحت الراحتي بعد القنية أو الفشل في قطعه قبل الانتقال إلى الخطوة التالية سيؤدي إلى موت خلايا الكبد. يتم القتل الرحيم للحيوان تحت التخدير عن طريق الطرد (من خلال قطع IVC) خلال هذه الخطوة. يجب أن يستمر الإجراء أثناء استمرار فقدان الدم. يمكن تأكيد الوفاة من خلال الملاحظة البصرية لتوقف ضربات القلب / التنفس عند فتح تجويف الصدر في خطوة لاحقة. - قم بزيادة سرعة المضخة إلى 38 دورة في الدقيقة للحصول على معدل تدفق يبلغ ~ 33 مل / دقيقة. اغسل الكبد ثلاث مرات عن طريق إغلاق IVC بالملقط لمدة 2-3 ثوان (ولكن ليس لفترة طويلة) وإعادة فتحه.
ملاحظة: أثناء التنظيف ، سوف يتوسع الكبد قليلا قبل العودة إلى طبيعته. التنظيف يسهل نفاذية البيرفوسات في جميع أنحاء الكبد كله. بعد التنظيف ، يجب أن يكون لون الكبد بني فاتح بالكامل. - تأكد من وضع طرف القنية قبل النقطة التي يتفرع فيها الوريد البابي إلى فصوص كبد مختلفة ، لضمان تروية جميع فصوص الكبد. إذا لزم الأمر ، قم بفك وريد البوابة وضبط موضع الكانيولا. أعد القص بعد ذلك.
- شد الرباط الفضفاض حول الوريد البابي ، عند المنبع قليلا من نقطة التفرع. اصنع ثلاث عقد على المكان الذي يتم فيه دعم القنية الناعمة بواسطة إبرة معدنية صلبة ، بين الشطبة والثقب الجانبي. تأكد من أن العقد تثبت القنية في موضعها ، وتثبيتها على الوريد البابي ، ومنع التدفق العكسي للمخازن المؤقتة.
- استئصال الكبد كله سليما.
- قم بدمج الكبد مع مخزن مؤقت خال من الكالسيوم بمعدل تدفق ~ 33 مل / دقيقة لمدة 12 دقيقة التالية (انظر الشكل 5A). في غضون ذلك ، قم بإجراء استئصال الكبد. يمكن تمديد وقت التروية إذا لزم الأمر ولكن تأكد من عدم نفاد المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم.
- باستخدام زوج من المقصات المنحنية ، افصل الوريد البابي بعناية عن الأمعاء عن طريق قطع المساريق الذي يربطهما معا. لا تقم بتنظيف الجهاز الهضمي (المريء والمعدة والأمعاء الدقيقة والغليظة) لضمان عدم حدوث أي تلوث.
ملاحظة: هذا لمنع الوريد البابي من التمزق عند تحريك الكبد أثناء الاستئصال. - فصل الكبد عن الجهاز الهضمي عن طريق قطع الأنسجة الضامة والبنكرياس والمساريق الذي يربط الكبد بالجهاز الهضمي. للفصل ، قم دائما بقص المقص ولا تسحب إلى الدموع. مرة أخرى ، لا أو قطع الجهاز الهضمي.
- اقلب الكبد برفق لأسفل لكشف الحجاب الحاجز. قطع الحجاب الحاجز بعد جدران الأضلاع. تأكد من أن معظم الحجاب الحاجز لا يزال متصلا بالكبد. احرص على عدم كزة أو كدمات الكبد.
- بمجرد فتح تجويف الصدر ، يمكن رؤية قناتين: IVC فوق الكبدي الأبيض على اليسار ، والمريء المصفر على اليمين. قم بقص IVC فوق الكبدي وقطعه فوق المقطع مباشرة. قطع IVC فوق الكبدي اختياري. يمنع تجويف الصدر من الفيضانات.
ملاحظة: راقب بصريا لوقف ضربات القلب / التنفس لتأكيد موت الحيوان. - المريء محاط بالحجاب الحاجز. لعزل المريء عن الحجاب الحاجز ، قم بقطع الحجاب الحاجز من اليمين نحو المريء. قطع أي أنسجة ضامة متبقية تربط المريء والمعدة بالكبد والحجاب الحاجز.
- ادفع الجهاز الهضمي بعيدا إلى اليمين. نقل مشبك الوريد من IVC فوق الكبدي إلى IVC تحت الرهابية. سوف العازلة الآن تنفجر من IVC فوق الكبدي.
ملاحظة: أثناء التروية ، سيتم تغطية القنية و IVC تحت الرهابية بواسطة الكبد. سيساعد التدفق العازل القوي من IVC فوق الكبدي الجراح على استبعاد تسرب التروية. - قطع أي حجاب حاجز متبقي يربط الكبد بتجويف الصدر. قطع الأنسجة التي تربط الكبد بتجويف البطن. احرص على عدم قطع IVC تحت الشبكية فوق المشبك لتجنب فصل المشبك عن الكبد.
- لضمان استئصال الكبد بالكامل ، ارفع الكبد بعناية عن طريق التمسك بالحجاب الحاجز باستخدام الملقط. إذا كان هناك أي أنسجة متبقية تربط الكبد بتجويف البطن ، فقم بقطعها. إذا كانت الكلى والطحال لا يزالان متصلين بالكبد ، فافصلهما.
4. تروية الكبد والهضم
- إذا تم الانتهاء من الاستئصال مبكرا ، فانتظر حتى يتم دمج الكبد مع مخزن مؤقت خال من الكالسيوم لمدة 12 دقيقة.
- تغيير المخزن المؤقت للتروية إلى مخزن كولاجيناز مؤقت. قم بفك المشبك الأسطواني تماما للحصول على مخزن كولاجيناز مؤقت قبل شد المشبك الأسطواني بالكامل للحصول على مخزن مؤقت خال من الكالسيوم (انظر الشكل 5B). بمجرد وصول الكولاجيناز العازل إلى الكبد من خلال الأنابيب ، اغسل الكبد ثلاث مرات عن طريق إغلاق IVC فوق الكبدي لمدة 2-3 ثانية وإعادة فتحه.
- حرك الكبد بعناية إلى المرحلة الموجودة أعلى الكأس لإعادة تدوير الكولاجيناز العازل. حرك الكبد عن طريق التمسك بالحجاب الحاجز باستخدام ملقط مع دعم القسطرة. تجنب السحب على القسطرة لمنع انفصال القسطرة العرضي.
ملاحظة: إذا انفصلت القسطرة وكان الوريد البابي تالفا جدا بحيث لا يمكن إعادة تعبئته، فقم بتعليب IVC فوق الكبدي واسمح للمخزن المؤقت بالخروج من الوريد البابي. تأكد من أن IVC تحت الرحم لا يزال مقطوعا. - هضم الكبد لمدة 12 دقيقة. راقب ظهور بقع / شبكة شفافة حيث يبدأ الكبد في فقدان قوامه البني الناعم. سوف يصبح الكبد أكبر وأكثر ليونة عندما يتم هضمه. بمجرد أن يكون للكبد اتساق طري ، توقف عن التروية. يمكن تمديد وقت الهضم ، إذا لزم الأمر.
ملاحظة: إذا تم كسر كبسولة غليسون، فقد يتحول مخزن الكولاجيناز العازل في الكأس إلى غائم بسبب خلايا الكبد الهاربة.
5. عزل خلايا الكبد
- قم بإزالة القنية بعناية عن طريق قطع الوريد البابي. قم بإزالة المقطع بعناية. انقل الكبد إلى طبق 150 مم يحتوي على 60 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو البارد (DMEM).
- اضغط بلطف على الكبد باستخدام الجانب الخلفي من الملقط المنحني لكسر وتقشير كبسولة غليسون. ثم ، تمايل الكبد بلطف من جانب إلى آخر في DMEM لإطلاق خلايا الكبد. استمر في القيام بذلك حتى يتم فصل خلايا الكبد بالكامل في DMEM.
ملاحظة: في بعض الأحيان يتم هضم الكبد كله أو بعض الفصوص جزئيا فقط. من خلال عدم كشط الكبد الذي سيزيل بالقوة ، ويتلف خلايا الكبد غير المنفصلة ، يمكن الحصول على صلاحية أعلى وأكثر اتساقا للخلايا. - هز بلطف طبق 150 ملم حتى يتم توزيع خلايا الكبد بشكل جيد في DMEM. لإزالة قطع الأنسجة وكتل الخلايا ، صب تعليق الخلية من خلال مرشح شبكة نايلون بحجم 100 ميكرومتر يوضع فوق طبق جديد بحجم 150 مم. شطف الطبق القديم مع 30 مل من DMEM ونقل التعليق إلى مرشح شبكة. اضغط برفق على مرشح الشبكة للسماح لخلايا الكبد المفردة المحاصرة بالمرور.
- قم بإزالة الفلتر الشبكي وقم بهز الطبق الجديد مقاس 150 مم بلطف حتى يتم توزيع خلايا الكبد بشكل جيد. قسم التعليق بالتساوي إلى أنابيب 4 × 50 مل. شطف الطبق مع 30 مل من DMEM وتقسيم التعليق بالتساوي إلى نفس الأنابيب. تأكد من أن كل أنبوب يحتوي على حجم متساو من تعليق الخلايا.
- جهاز طرد مركزي أنابيب 4 × 50 مل من تعليق الخلية عند 50 × غرام لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استنشق بعناية supernatant دون إزعاج الكريات فضفاضة. تخلص من السوبرناتانت. أضف 20 مل من DMEM إلى كل أنبوب وهز الأنابيب بلطف لإعادة تعليق حبيبات الخلية. ادمج تعليق الخلية من أربعة أنابيب إلى أنبوبين.
- جهاز طرد مركزي أنابيب 2 × 50 مل عند 20 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. شفط والتخلص من supernatant. أضف 20 مل من DMEM إلى كل أنبوب وهز الأنابيب بلطف لإعادة تعليق حبيبات الخلية. الجمع بين تعليق الخلية من أنبوبين في واحد. حافظ على الخلايا على الجليد حتى الاستخدام.
- تحضير محلول التربان الأزرق عن طريق خلط 400 ميكرولتر من 1x PBS مع 50 ميكرولتر من التربان الأزرق. أضف 50 ميكرولتر من تعليق خلايا الكبد إلى محلول تريبان الأزرق. احسب عدد خلايا الكبد القابلة للحياة والميتة باستخدام مقياس الدم تحت المجهر الضوئي.
6. ثقافة خلايا الكبد
- قم بتنفيذ جميع خطوات زراعة الخلايا في غطاء المحرك. أضف محلول طلاء الكولاجين 1 مل إلى طبق 35 مم واحتضنه لمدة 4 ساعات. شطف الأطباق ثلاث مرات مع 1x PBS.
- تمييع تعليق خلايا الكبد في زراعة خلايا الكبد وسط إلى تركيز 0.8 مليون خلية / مل. أضف 1 مل من تعليق خلايا الكبد المخفف إلى الطبق 35 مم.
ملاحظة: خلايا الكبد حساسة لإجهاد القص أثناء السحب. فكر في استخدام أطراف ماصة واسعة التجويف. - صخرة الطبق لتوزيع خلايا الكبد بالتساوي. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 لمدة 3-4 ساعات للسماح لخلايا الكبد بالتعلق.
- لثقافة الشطائر.
- إزالة وسط ثقافة خلايا الكبد. شطف مرة واحدة مع 1 مل من زراعة خلايا الكبد المتوسطة لإزالة الخلايا غير المتصلة. أضف 1 مل من محلول تراكب الكولاجين. أضف محلول تراكب الكولاجين على جدران الطبق لتجنب إدخال فقاعات في المحلول.
- احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها للسماح هلام الكولاجين.
- أضف 1 مل من وسط زراعة خلايا الكبد الطازجة. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- للثقافة أحادية الطبقة.
- بعد الخطوة 6.3 ، قم بإزالة وسط زراعة خلايا الكبد. شطف مرة واحدة مع 1 مل من خلايا الكبد ثقافة الوسط لإزالة الخلايا غير المتصلة.
- أضف 1 مل من وسط زراعة خلايا الكبد الطازجة. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- تقييم نقاء خلايا الكبد ووظيفتها عن طريق إجراء تلطيخ مناعي للعلامات الخاصة بخلايا الكبد والمقايسات الوظيفية كما هو موضح سابقا10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن للجراح معرفة ما إذا كان تروية الكبد تسير بسلاسة من خلال مراقبة النتيجة بعد خطوات معينة. يمكن ملاحظة النتيجة الأولى عند القنية ، وقطع IVC تحت الرهابية ، واستعادة معدل تدفق التروية. يجب أن يكون الكبد قد تغير لونه تماما من الأحمر الداكن إلى البني ، مع الحفاظ على حجمه. إذا كان الكبد يبدو منكمشا قليلا وله لون ضارب إلى الحمرة أو بقع حمراء ، فهذا يعني أن معدل تدفق التروية قد تم تعيينه بشكل خاطئ (منخفض جدا) ، أو أن الوريد البابي لم يتم تعبئته بشكل صحيح. إذا لم يتحول الكبد إلى اللون البني فحسب ، بل أصبح منتفخا وقاسيا ، فهذا يعني أن معدل التدفق قد تم تعيينه بشكل خاطئ (مرتفع جدا) ، أو لم يتم قطع IVC تحت الراحتي بشكل صحيح. إذا لم يتم تنفيذ عدد قليل من الفصوص بشكل جيد ، فهذا يعني أن القسطرة تم إدخالها بعمق شديد ولا تؤدي إلا إلى فرع واحد من الوريد البابي. يمكن ملاحظة النتيجة الثانية بعد استئصال وقص IVC تحت الراحتي. إذا كان التدفق الخارجي من IVC فوق الكبدي بطيئا وضعيفا ، فقد يعني ذلك أن القسطرة قد انفصلت أثناء الاستئصال ، أو أن IVC تحت الراحتي لم يتم قطعه بشكل صحيح. يمكن ملاحظة النتيجة الثالثة أثناء الهضم. على الكبد البني ، يجب أن تظهر بقع / شبكة شفافة وتتضخم. يجب أن يفقد الكبد اتساقه الربيعي ويصبح ناعما وطريا. نقوم بتحسين تركيز الكولاجيناز لدينا بحيث يمكن الوصول إلى هذه الحالة في غضون 12 دقيقة. عند تجربة الكثير من الكولاجيناز الجديد ، يجب تمديد وقت الهضم حتى يتم الوصول إلى هذه الحالة. يمكن ملاحظة النتيجة الرابعة عندما يتم إطلاق الخلايا من الكبد. عندما يتم تحرير الخلايا ، يجب أن تبدو الوسائط غائمة. إذا لوحظ الكثير من الملمس المحبب ، فقد يعني ذلك أن الكبد لم يتم هضمه بشكل كاف. إذا اكتمل الهضم ، فيجب ترك أوعية بيضاء تشبه الويب فقط. حتى لو كان الهضم جزئيا (الشكل 6) ، فلا يزال من الممكن الحصول على خلايا جيدة.
يولد بروتوكولنا الموصوف هنا باستمرار إنتاجية خلوية أعلى تصل إلى 5 × 10 8 خلايا كبدية لكل عزلة من الفئران التي تزن 200-300 جم وصلاحية الخلية بين 88٪ -94.8٪ كما هو محدد من خلال العد الأزرق التريبان 12،13،14،15،16 (الجدول 2). كانت نقاء خلايا الكبد التي تم الحصول عليها كما هو محدد من خلال تلطيخ المناعة للألبومين 96.8 ± 2.0٪ 11 (الشكل 7). شكلت خلايا الكبد في مزرعة الساندويتش قناة صفراوية متميزة وكان لها اتصال جيد بالخلايا الخلوية (الشكل 8). تتمتع خلايا الكبد بوظائف عالية كما هو موضح في اختبارات الألبومين واليوريا وCYP10 (الجدول 3).
الشكل 1: رسم تخطيطي ل IPS. يبدأ العطر في كيس أو زجاجة العطر (1 ، 2). يعمل منظما التدفق (3 ، 4) معا للتحكم في مرور البيرفوسات. ينتقل العطر إلى فخ الفقاعة (5). يتم التحكم في العمليات اللاحقة بواسطة شاشة LCD التي تعمل باللمس (6) للنظام الرئيسي. ثم يتم سحب الفوسات بواسطة مضخة تمعجية (7) ويمر عبر سخان إلكتروني مغطى بالسيليكون (8) ، والذي يسخن العطر إلى درجة الحرارة المطلوبة. يتم توصيل سترة سخان السيليكون (8) بالنظام الرئيسي بواسطة موصل (9). عند الضرورة ، يمكن توصيل مستشعر الضغط القابل للتصرف (10) بالنظام الرئيسي بواسطة موصل (11) ، للسماح بقياس ضغط التروية. ثم يمر الفوسات عبر جهاز مراقبة التروية (12) ، الذي يقيس درجة حرارة العطر ويكتشف وجود فقاعات. يمكن للشاشة أيضا تحديد ما إذا كان العطر قد نفد. يتم إرسال قراءات الشاشة إلى النظام الرئيسي عبر LoRa. ثم ينتقل العطر إلى مرشح فقاعة (13) ويدخل الكبد من خلال قنية الوريد البابي (14). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رسم تخطيطي لتروية الكولاجيناز المكونة من خطوتين لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران . (أ) تروية المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم. يتم فك المشبك الأسطواني بالكامل للمدخل 1 وشده بالكامل للمدخل 2. (ب) هضم الكبد مع الكولاجيناز العازل. يتم نقل الكبد المقطوع إلى الجزء العلوي من الكأس للسماح بإعادة تدوير المخزن المؤقت. المشبك الأسطواني مفكوك تماما للمدخل 2 ومشدود تماما للمدخل 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الكبد بعد هضم الكولاجيناز وعزل خلايا الكبد. يظهر فص الكبد المهضوم جزئيا. بقيت الأجزاء غير المهضومة من الكبد بنية. في الأجزاء المهضومة من الكبد ، تركت الأوعية البيضاء فقط وراءها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تلطيخ مناعي لعلامة خلايا الكبد لقياس نقاء خلايا الكبد. (أ) زراعة الساندويتش لتعليق خلايا الكبد غير النقية (قبل الطرد المركزي التفاضلي ؛ اليسار) وتعليق خلايا الكبد النقية (بعد الطرد المركزي التفاضلي ؛ اليمين) البذرة بكثافة الخلايا المنخفضة. (ب) تظهر الصور التمثيلية خلايا ملطخة ب DAPI (نواة ؛ أزرق) والأجسام المضادة ضد الألبومين (علامة خاصة بخلايا الكبد ؛ خضراء). (ج) التحديد الكمي لنقاء خلايا الكبد. تم تحديد النقاء عن طريق حساب الخلايا الملطخة بالفلورسنت الإيجابية للألبومين فيما يتعلق بإجمالي عدد الخلايا المتصور بواسطة التلطيخ النووي DAPI. تم عرض الصور بألوان زائفة. الألبومين (الأخضر) ، نواة الخلايا مع الألبومين (الأزرق) ، نواة الخلايا بدون الألبومين (الأحمر). أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: صورة تباين الطور لخلايا كبد الفئران الأولية المعزولة من تروية الكولاجيناز المكونة من خطوتين في زراعة الساندويتش في اليوم 3. شريط المقياس 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم المخازن المؤقتة/الوسائط | التركيز النهائي | مبلغ | التعليقات/الوصف |
| وسائل الإعلام ثقافة خلايا الكبد | |||
| ويليام إي ميديا | 500 مل | أضف جميع الكواشف إلى وسائط ويليام E. تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية. | |
| جيش صرب البوسنه | 1 ملغم/مل | 0.5 غرام | |
| البنسلين الستربتومايسين (100X) | 1X | 5 مل | |
| الأنسولين (20 ملغم/مل) | 0.5 ميكروغرام/مل | 12.5 ميكرولتر | |
| ديكساميثازون (1 ملليمتر) | 100 نانومتر | 50 ميكرولتر | |
| حمض اللينوليك (7.5 ميكروغرام / مل) | 50 نانوغرام/مل | 3.33 ميكرولتر | |
| الجلوتاماكس (100X) | 1X | 5 مل | |
| كولاجيناز المخزن المؤقت | |||
| كلوريد الصوديوم | 0.100 غ | يذوب في 380 مل من الماء فائق النقاء. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.49 - 7.51 مع NaOH. قم بتعبئة ما يصل إلى 400 مل بالماء فائق النقاء. تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية. | |
| كيه سي ال | 0.789 غ | ||
| كولاجيناز من النوع الرابع | 80 - 200 يو/مل | ||
| كاكل 2·2H2O | 0.140 غ | ||
| هيبس | 4.800 غ | ||
| مخزن مؤقت خال من الكالسيوم | |||
| KH2PO4 | 0.0815 غ | تذوب في 900 مل من الماء فائق النقاء. اضبط على درجة الحموضة 7.49-7.51 مع HCl. قم بتعبئة ما يصل إلى 1 لتر بالماء فائق النقاء. تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. | |
| ناهكو3 | 1.0500 غ | ||
| كلوريد الصوديوم | 3.4480 غ | ||
| كيه سي ال | 0.1750 غ | ||
| DMEM لعزل الخلايا | |||
| DMEM | 1 كيس | قم بتعبئة ما يصل إلى 1 لتر بالماء فائق النقاء. تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية. | |
| ناهكو3 | 1.5 غرام | ||
| البنسلين الستربتومايسين (100X) | 1X | 10 مل | |
| تراكب الكولاجين (1 مل) | |||
| 0.1 م ناوه | 1 جزء | 20.8 ميكرولتر | تحضير طازجة. أضف الكولاجين أخيرا. |
| 10X PBS | 1 جزء | 20.8 ميكرولتر | |
| 1X PBS | 6 أجزاء | 125 ميكرولتر | |
| وسائل الإعلام ثقافة خلايا الكبد | 32 جزء | 667 ميكرولتر | |
| النوع الأول من الكولاجين البقري | 8 أجزاء | 167 ميكرولتر | |
| محلول طلاء الكولاجين (1 مل) | |||
| النوع الأول من الكولاجين البقري | 1 جزء | 0.5 مل | تحضير طازجة. |
| 0.01 نيوتن هيدروكلورايد | 1 جزء | 0.5 مل | |
الجدول 1: وصفات للمخازن المؤقتة والحلول.
| جدوى خلايا الكبد (٪) | محصول خلايا الكبد (× 108 خلايا) | إنتاجية خلايا الكبد القابلة للحياة (x 108 خلايا) |
| 91.4 ± 3.4 | 4.39 ± 1.58 | 4.04 ± 1.48 |
الجدول 2: صلاحية الخلايا وإنتاجيتها. يتم عرض قيم SD ± من 18 تجربة مختلفة.
| اليوريا (ميكروغرام / مليون خلية / يوم) | الزلال (ميكروغرام / مليون خلية / يوم) | نشاط CYP1A2 (ميكروغرام / مليون خلية / يوم) | نشاط CYP2B1/2 (ميكروغرام / مليون خلية / يوم) | نشاط CYP3B2 (ميكروغرام / مليون خلية / يوم) | |
| اليوم 1 | 124 ± 2.6 | 39.0 ± 3.6 | |||
| اليوم 3 | 65.7 ± 3.8 | 516.0 ± 95.1 | 2249 ± 56 | 188 ± 49 | 93.7 ± 0.6 |
الجدول 3: المستويات الوظيفية لخلايا كبد الفئران الأولية المعزولة في زراعة الشطائر. يتم عرض قيم SD ± اليوريا والألبومين و CYP1A2 و CYP2B1/2 و CYP3B2 من ثلاث تجارب مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك بعض النقاط التي من المهم بشكل خاص ملاحظتها لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين بشكل عام. أولا ، يجب إيلاء عناية خاصة عند استئصال الكبد. تأكد من عدم تلف الجهاز الهضمي لأن تسرب المحتويات سيؤدي إلى تلوث بكتيري. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب إتلاف كبسولة غليسون ، التي تغطي سطح الكبد أثناء الإجراء الحيواني. إذا كان التمزق كبيرا بما فيه الكفاية ، فقد يسمح بالإفراج المبكر عن خلايا الكبد المنفصلة في مخزن الكولاجيناز المؤقت. ثانيا ، قد تختلف قدرة الكولاجيناز على هضم الكبد مع ضمان بقاء خلايا الكبد بشكل جيد حسب عدد القرعة. يجب تحسين كمية الكولاجيناز المستخدمة لكل كمية جديدة من الكولاجيناز5. من المستحسن اختبار عدد قليل من الكثير من الكولاجيناز واختيار أفضل الكثير قبل الشراء بكميات كبيرة. تأكد من أن الماء فائق النقاء ، وأن الرقم الهيدروجيني صحيح. يمكن أن تؤثر الشوائب الموجودة في الماء مثل أيونات الحديدوز والحديديك والرقم الهيدروجيني الخاطئ على نشاط الكولاجيناز ، مما سيؤثر بشكل كبير على جودة الخلايا المعزولة. على الرغم من أن إعادة تدوير الكولاجيناز المؤقت في هذا البروتوكول يمكن أن يكون اختياريا ، إلا أنه لا ينصح به لأن حجم الكولاجيناز المؤقت المطلوب سيزداد إلى >400 مل. وأخيرا، ينبغي أن يكون ضغط التروية ومعدل التدفق في نطاق مناسب. سيؤدي الضغط العالي ومعدل التدفق إلى موت خلايا الكبد بينما سيؤدي انخفاض الضغط ومعدل التدفق إلى عدم كفاية تدفق المخزن المؤقت عبر الأوعية الصغيرة10. أثناء التروية العازلة الخالية من الكالسيوم ، سيرتفع الضغط في البداية. ومع ذلك ، عند تروية الكولاجيناز العازلة ، سينخفض الضغط ببطء بمرور الوقت لأن الهضم بواسطة الكولاجيناز يقلل من مقاومة التدفق. إذا لم يلاحظ انخفاض الضغط ، يمكن تمديد وقت الهضم كما هو مطلوب. نظرا لأن IPS يحتوي على مستشعر الضغط الاختياري ، فمن الممكن تغيير معدل تدفق العطر للتعويض عن اختلافات الضغط. من ناحية أخرى ، على الرغم من استخدام تنظيف الدائرة باستخدام جهاز أكسجين في بعض البروتوكولات 2,5 ، وجدنا أنه لم يكن حاسما لبقاء خلايا الكبد وإنتاجها. وبالتالي ، فإن جهازنا لا يتضمن جهاز أكسجين.
على النقيض من الممارسة الشائعة لهضم الكبد قبل الاستئصال ، يتضمن هذا البروتوكول استئصال الكبد قبل الهضم. يحمل النهج المتبع في هذا البروتوكول العديد من المزايا مقارنة بالممارسة الشائعة. أولا ، يمكن تجنب الإفراط في هضم الكبد. اعتمادا على مهارة الجراح ، قد يستغرق استئصال الكبد في أي مكان من 5-10 دقائق. باتباع الممارسة الشائعة ، على الرغم من توقف التروية ، إلا أن هذا لا يزال يعادل 5-10 دقائق إضافية حيث يتعرض الكبد للكولاجيناز. الإفراط في الهضم قد يقلل من صلاحية الخلايا ويقلل من ارتباط خلايا الكبد ووظيفتها. ثانيا ، يمكن لهذا النهج أن يقلل من فقدان خلايا الكبد. من غير المرجح أن تتمزق كبسولة غليسون عندما يكون الكبد لا يزال نابضا قبل الهضم ، مقارنة بالوقت الذي يكون فيه طريا وطريا بعد الهضم. وأخيرا ، فإن استئصال الكبد قبل الهضم يتيح إمكانية إعادة تدوير الكولاجيناز. إعادة تدوير الكولاجيناز يزيل حدوث العزلات الفاشلة بسبب عدم كفاية حجم الكولاجيناز الذي يتم إعداده. يسمح نهجنا بتمديد وقت الهضم ، حسب الضرورة. كما أن لديها ميزة بسيطة تتمثل في تقليل كمية الكولاجيناز اللازمة لكل عزلة. العيب الرئيسي لهذا النهج هو أنه يقدم مشكلة جديدة تتمثل في انفصال القسطرة في منتصف الطريق أثناء التروية ، ولكن يمكن معالجتها ببعض الاحتياطات التقنية. فرق آخر هو أن هذا البروتوكول لا ينطوي على استخدام تدرج الكثافة مثل Percoll. عن طريق إزالة الخلايا الميتة ، تم الإبلاغ عن أن Percoll يزيد من الجدوى النهائية للخلايا مع بعض فقدان الغلة ، من 20٪ إلى 50٪ 16. صلاحية خلايانا عالية لأننا نختبر ونختار الكثير من الكولاجيناز. من تجربتنا ، فإن بعض الكثير من الكولاجيناز يعطي باستمرار قابلية أقل للبقاء. بدون الطرد المركزي بالكثافة ، سيكون من الضروري تجنب الكثير من الكولاجيناز السيئ من خلال الاختبار المسبق. بالنسبة لأولئك الذين ليس لديهم مثل هذه الحرية ويجب أن يأخذوا في الاعتبار تدرج الكثافة ، يجب توخي الحذر أثناء تخفيف Percoll لتجنب اختيار المجموعات الفرعية لخلايا الكبد ذات المظهر الأيضي المختلف قليلا17,18.
نهجنا في استخدام IPS لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران يحل العديد من المشكلات مع إعدادات التروية الحالية1،2،5،6،7،8،9. يوفر استخدام الأنابيب المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة الوقت عن طريق إزالة الحاجة إلى تنظيف وتطهير أنابيب التروية قبل وبعد كل عزل. إنه يقلل من خطر الحريق لأن أنابيب التروية لا تحتاج إلى أن تملأ بالإيثانول القابل للاشتعال بنسبة 70٪ عندما لا تكون قيد الاستخدام للحفاظ على العقم. يمكن أيضا القضاء على خطر التلوث بسبب التطهير والتخزين غير السليمين. الأهم من ذلك ، يمكن التحايل على الحاجة إلى الاستبدال الروتيني للأنابيب القديمة ؛ هذه العملية ضرورية ولكنها غالبا ما تكون معقدة وتستغرق وقتا طويلا. تسمح إضافة مرشح فقاعة إلى الأنبوب بالقرب من القسطرة للفقاعات بالهروب قبل الوصول إلى القسطرة وتمنع الهواء من المرور عندما ينفد مخزن التروية المؤقت. يسمح استخدام سترة سخان السيليكون كنظام للتحكم في درجة الحرارة بصيانة دقيقة ومستقرة لدرجة حرارة العطر أثناء الهضم ، على عكس المخازن المؤقتة التي تم تسخينها مسبقا والتي ستبرد بشكل كبير بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سترة سخان السيليكون مدمجة ويمكن صيانتها بسهولة ، على عكس السترة الزجاجية المقترنة بجهاز تدوير الحمام المائي. يحل استخدام مستشعرات المراقبة لدرجة الحرارة والضغط محل خطوة التحسين قبل العزل. قد يحدث اختلاف في درجة الحرارة أثناء التجارب أو بينها. قد يتغير الضغط (وبالتالي معدل التدفق) أيضا بسبب مشاكل في أنابيب التروية. يسمح وضع أجهزة الاستشعار بالقرب من القنية بقراءة أكثر دقة لدرجة حرارة العازلة التي تندمج في الكبد. يمكن لإنذارات المستشعر تذكير المستخدم باتخاذ إجراءات تصحيحية. يسمح السجل المسجل أيضا باستكشاف الأخطاء وإصلاحها. استخدام قسطرة IV خاصة للقنية يبسط تعليب تعليب الوريد البابي. على عكس الأنواع الأخرى من القسطرة الوريدية ، تسمح القسطرة الموصوفة هنا بالتواصل السائل بين القنية والأنابيب في كل من موضع الإبرة المثقوبة والتراجع بسبب وجود ثقب في جانب الإبرة. وبالتالي ، يمكن للجراحين استخدام تغيير لون الكبد كعلامة على نجاح القنية. عند القنية الناجحة ، يمكن سحب طرف الإبرة خلف طرف القسطرة لمنع إعادة ثقب الوريد البابي. يمكن أن تعمل الإبرة المسحوبة أيضا كأساس للرباط لتأمين الوريد البابي على القنية الناعمة ومنعها من التشوه. يمكن تشغيل هذه القسطرة بيد واحدة. لذلك ، يمكن استخدام اليد غير المهيمنة لدعم الوريد البابي بالملقط. يسمح التصميم المدمج المدمج بوضع جهاز التروية بالكامل في الغطاء الرقائقي ، مما يقلل من خطر التلوث ويوفر المساحة. هذا مهم بشكل خاص إذا كان سيتم تنفيذ الإجراء الحيواني في منشأة حيوانية مخصصة حيث يمكن أن يكون توافر المساحة تحديا.
بالمقارنة مع بروتوكولات عزل خلايا كبد الفئران التي تم الإبلاغ عنها سابقا باستخدام إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين1 ، فإن الظروف الموصوفة تولد باستمرار إنتاجية أعلى للخلايا تصل إلى 5 × 10 8 خلايا كبدية لكل عزلة ، وقابلية بقاء الخلية بين 88٪ -94.8٪ ووظيفة جيدة خاصة بخلايا الكبد.
يمكن استخدام هذا البروتوكول في وقت واحد لعزل خلايا الكبد الأخرى غير المتنية مثل خلايا كوبفر والخلايا البطانية للكبد والخلايا النجمية الكبدية من نفس الفئران. يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لعزل خلايا الكبد عن الفئران باستخدام قسطرة IV أصغر مقياسا للقنية وتقليل معدل تدفق التروية إلى نطاق مناسب لأنواع الفئران6. يمكن تبسيط إجراء التروية للفئران عن طريق استئصال الكبد بعد الهضم.
يمكن أيضا استخدام جهاز IPS المستخدم في هذه التجربة لتطبيق تروية الكبد خارج الجسم الحي مثل التجارب على زراعة الكبد وكذلك إزالة الخلايا من القوارض والكبد البشري المهمل19,20. يتمتع IPS بميزة حيث يجب أن يكون الكبد قابلا للتشغيل لفترات طويلة لأن IPS يمكنه مراقبة ظروف التروية في الوقت الفعلي والسماح بإيقاف التروية عند الانتهاء إما تلقائيا أو يدويا عن طريق التحكم عن بعد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن تشو يان وهانري يو عن مصالح متنافسة لأنهما يمتلكان أسهما في Vasinfuse ، التي تصنع وتسوق نظام التروية المتكامل. يمتلك Hanry Yu أسهما في Histoindex و Invitrocue و Osteopore و Pishon Biomedical و Ants Innovate و Synally Futuristech التي ليس لها مصالح منافسة مع المعلومات الواردة هنا.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل وزارة التربية والتعليم ARC (MOE2017-T2-1-149) ؛ منحة بذور الابتكار في NUHS 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02) ؛ معهد علم الأحياء الميكانيكي في سنغافورة (R-714-106-004-135); ومعهد الهندسة الحيوية وتكنولوجيا النانو، مجلس البحوث الطبية الحيوية، وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A*STAR) (أرقام المشاريع IAF-PP H18/01/a0/014، IAF-PP H18/01/a0/K14 و MedCaP-LOA-18-02) تمويل إلى هانري يو. نغ تشان واي هو باحث باحث في جامعة سنغافورة الوطنية. نود أن نشكر وحدة المجهر البؤري ووحدة قياس التدفق الخلوي بجامعة سنغافورة الوطنية على المساعدة والمشورة في تحليل نقاء خلايا الكبد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
