Summary
Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.
Abstract
Hepatócitos primários são amplamente utilizados em pesquisas básicas sobre doenças hepáticas e para testes de toxicidade in vitro. O procedimento de perfusão de colagem de duas etapas para isolamento primário de hepatócitos é tecnicamente desafiador, especialmente na canulação venosa do portal. O procedimento também é propenso a contaminação ocasional e variações nas condições de perfusão devido a dificuldades na montagem, otimização ou manutenção da configuração de perfusão. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para um procedimento de perfusão de colagem de duas etapas melhorado com controle de perfusão multiparmétrica. Os hepatócitos primários foram isolados com sucesso e confiabilidade, tomando as precauções técnicas necessárias em etapas críticas do procedimento, e reduzindo a dificuldade operacional e mitigando a variabilidade dos parâmetros de perfusão através da adoção de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura e sistema de monitoramento e alarme em tempo real. Os hepatócitos primários isolados exibem consistentemente alta viabilidade celular (85%-95%), rendimento (2-5 x 108 células por rato de 200-300 g) e funcionalidade (atividade albumina, ureia e CYP). O procedimento foi complementado por um sistema integrado de perfusão, compacto o suficiente para ser configurado na coifa de fluxo laminar para garantir o funcionamento asséptico.
Introduction
Hepatócitos primários são ferramentas importantes para pesquisa básica relacionada ao fígado, tratamento de doenças e aplicação, como testes de drogas. O padrão-ouro atual para o isolamento primário do hepatocito é o procedimento de perfusão de colagem de duas etapas 1,2,3 introduzido pela Seglen na década de 19704. No entanto, este procedimento é tecnicamente desafiador e tem uma alta taxa de falha quando realizado por cirurgiões iniciantes. Mesmo quando uma perfusão é considerada bem sucedida, podem ser observadas diferenças drásticas na viabilidade do hepatocito (tipicamente 60%-95%) e rendimento (0,5-5 x 108 por rato de 200-300 g) entre os isolamentos. Isso influencia a qualidade e a escala dos experimentos a jusante. Além do procedimento técnico, a configuração de perfusão utilizada para o isolamento, seja comercialmente disponível ou personalizada, é um fator contribuinte. Deve-se prestar atenção à montagem, otimização e manutenção da configuração da perfusão. O objetivo deste protocolo é melhorar a taxa de sucesso e a estabilidade entre os isolamentos dos hepatócitos primários de ratos através do controle de perfusão multiparmétrica do procedimento técnico e da configuração de perfusão do procedimento de perfusão de colagenase em duas etapas.
Do ponto de vista técnico, o passo mais difícil no procedimento é a cannulação venosa do portal. Quanto às outras etapas, se forem observadas boas práticas e forem tomadas precauções gerais, a estabilidade do isolamento pode ser melhorada. Portanto, a compreensão do raciocínio de cada passo é importante para que o cirurgião possa responder a diversas variáveis que podem ocorrer durante o procedimento.
Vários protocolos para o isolamento de hepatócitos e células não-parenchímicas hepáticas de ratos e camundongos foram publicados 1,2,5,6,7,8,9. As configurações de perfusão utilizadas nesses protocolos apresentaram diversas desvantagens, que incluem o reaproveitamento da tubulação de perfusão, problemas com controle de temperatura, necessidade de otimização rotineira dos parâmetros de perfusão e/ou uso de tipo inadequado de cateter intravenoso (IV) para cannulação venosa portal. O reaproveitamento da tubulação de perfusão aumentará as chances de contaminação, especialmente se a tubulação não foi limpa e desinfetada corretamente. O reaproveitamento de tubos sem substituição de rotina também exporá a configuração de perfusão a problemas como tubos ou conectores com vazamento, armadilha de bolha entupida e tubulação constrito, que reduzirá substancialmente a pressão e a taxa de fluxo perfusadas, afetando assim a eficiência da digestão hepática. Sem uma fonte de calor constante em algumas configurações para controle de temperatura, os buffers pré-aquecidos esfriarão ao longo do tempo, levando a baixa atividade de colagem e digestão. Embora outras configurações utilizem um condensador de vidro com jaqueta conectado a um circulador de água para aquecer o tampão, eles são volumosos e requerem uma limpeza cuidadosa. A temperatura, pressão e taxa de fluxo de tampão que sai do cateter devem ser medidos e otimizados antes do início do isolamento para garantir a condição estável de perfusão. Mesmo após a otimização, os parâmetros ainda podem mudar na metade durante o isolamento devido às ações do operador, levando assim à perfusão e digestão abaixo do tempo. A maioria dos tipos de cateter IV não são adequados para a cannulação venosa portal porque não permitem perfusão contínua durante a cannulação. Eles são incapazes de informar imediatamente o cirurgião quando a cannulação é bem sucedida. Além disso, é desafiador proteger a veia portal no cateter macio sem deformá-la.
Aqui, abordamos esses problemas usando tubos estéreis descartáveis padronizados, uma jaqueta aquecedora de silicone para controle preciso e estável de temperatura, monitoramento e sistema de alarme em tempo real com armazenamento e gerenciamento de dados e uso de um cateter IV especial, que permite perfusão contínua ao perfurar a veia portal durante a cannulação. Pelo que sabemos, somos o primeiro grupo a combinar todos esses recursos em um sistema integrado de perfusão (IPS) compacto, tornando-o altamente portátil e capaz de ser encaixado em um capô de fluxo laminar para garantir a operação asséptica.
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Protocol
Todos os procedimentos e habitação animal foram realizados nos números do protocolo R15-0027 e R19-0669 de acordo com as exigências do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Cingapura.
1. Elaboração de soluções e instrumentos cirúrgicos
- Prepare buffers e mídia de cultura celular na Tabela 1 usando água ultrapurada.
- Pré-aqueça o tampão sem cálcio e o tampão de colagem até 37 °C em um banho de água antes de usar.
- Autoclave os seguintes instrumentos cirúrgicos e equipamentos de laboratório: um par de tesouras cirúrgicas afiadas, um par de tesoura cirúrgica sem corte, um par de tesouras cirúrgicas curvas, dois pares de fórceps de tecido dente, dois pares de fórceps curvos, dois clipes de veia, uma sutura cirúrgica de seda de 5 cm de comprimento, um filtro de malha de 100 μmlon ny, um 400 m de comprimento 3-0 de seda cirúrgica, um filtro de malha de 100 μmlon ny, um 400 m de comprimento 3-0 de seda cirúrgica, um filtro de malha de 100 μmlon ny, um 400 m de comprimento 3-0 de seda cirúrgica, um filtro de malha de 100 μmlon ny, um 400 m de comprimento 3-0 de seda cirúrgica, um filtro de malha de ny 100 μmlon, um 400 m de comprimento 3-0 de seda cirúrgica, um filtro de malha de ny 100 μmlon, um 400 m de comprimento 3-0 de seda cirúrgica, um filtro de malha de 100 μmlon ny, um 400 m de comprimento 3-0 de seda cirúrgica, um filtro de malha de 10 e um estágio (rack flutuante de tubo de microcentrifuge).
2. Configuração do IPS (ver Figura 1)
- Limpe o capô de fluxo laminar com 70% de etanol. Limpe o IPS com 70% de etanol e mova-o para o capô de fluxo laminar. Esterilizar por UV por >15 min antes de ligar o capô.
ATENÇÃO: A exposição à luz UV pode causar dores nos olhos e queimaduras na pele. Certifique-se de que a faixa está totalmente fechada quando a luz UV estiver acesa. - Monte um novo conjunto de tubos descartáveis no IPS. Enrole o tubo rio abaixo da bomba peristáltica em uma jaqueta de aquecedor de silicone. Monte o monitor de perfusão na tubulação rio abaixo da jaqueta de aquecedor de silicone.
- Certifique-se de que as travas do rolo para ambas as entradas de tubulação estão completamente soltas. Conecte cada entrada de tubulação à extremidade afilada de uma pipeta de aspiração estéril de 2 mL. Deixe tanto as pipetas de aspiração (entradas) quanto o cateter IV (saída) em uma garrafa de 1 L com tampão sem cálcio para permitir a recirculação do tampão durante as etapas subsequentes de escorvamento.
Figura 2: Interface de autoteste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Ligue o IPS. Execute as seguintes operações no painel de controle da tela de toque. O software realizará um autoteste abrangente toda vez que for iniciado.
ATENÇÃO: O IPS é um equipamento elétrico conectado a uma fonte de energia externa. Derramamentos líquidos nos IPS ou cabos de alimentação podem produzir riscos elétricos.- Certifique-se de que o status do autoteste seja exibido na tela (Figura 2). Os componentes que passaram no autoteste serão mostrados em verde; aqueles que falharam serão mostrados em vermelho. Após a retificação, toque no ícone De teste para repetir o autoteste novamente ou toque no ícone Enter System para inserir diretamente na interface de operação.
- Toque em qualquer lugar da tela para fazer login na interface de operação.
- No canto superior esquerdo da interface de operação (Figura 3), toque em qualquer um dos ícones de seta circular para definir a direção de rotação para a bomba peristáltica. No painel direito da interface, toque nos ícones de seta para cima/para baixo para definir valores para os parâmetros correspondentes. Definir o fluxo para o modo de fluxo constante; temperatura da jaqueta aquecedora a 42 °C (a ser ajustada para garantir que a temperatura do perfusato seja mantida em 37 °C); e velocidade da bomba a 38 rpm para uma vazão de ~33 mL/min.
- No painel inferior direito da interface de operação, verifique o status do alarme de bolha, alarme de parada de perfusão e ícone mudo.
- Verifique a temperatura, pressão e vazão do perfusado no painel esquerdo. Ajuste manualmente os intervalos clicando nas setas para cima na parte superior e inferior das colunas. Verifique os dados em tempo real mostrados como valores no meio das colunas. A cor da coluna passará de verde para vermelho se os dados em tempo real forem além do intervalo definido.
- Localize os ícones para iniciar, pausar e parar a perfusão e o ícone para mudar de exibição de dados em tempo real para o modo gráfico no painel do meio. Toque no ícone iniciar para iniciar a perfusão e prime o tubo com tampão sem cálcio. Um novo log será criado. Digite o nome do arquivo e o nome de usuário na janela pop-up (Figura 4).
Figura 3: Interface de operação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Janela popup solicitando nome de arquivo e nome de usuário. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Encha a câmara de gotejamento até a metade cheia. Certifique-se de que não há bolsões de ar presos na tubulação durante a escorva.
- Remova qualquer bolha que se forme a jusante do filtro de bolha, piscando na tubulação para desprender a bolha e permitir que ela seja lavada.
NOTA: As bolhas podem se formar ao longo da tubulação à medida que o tampão é aquecido pela jaqueta do aquecedor. - Encha um béquer de 400 mL com 200 mL de tampão de colagenase. Coloque o palco em cima do béquer. Sem introduzir ar na tubulação, aperte completamente o grampo do rolo para uma das entradas de tubulação e mova a pipeta de aspiração para a entrada no béquer.
3. Procedimento animal
- Prepare um rato Wistar macho adulto em torno de 200-300 g em peso corporal.
NOTA: Este protocolo foi otimizado para ratos em torno de 200-300 g em peso corporal. Ratos machos são preferidos, uma vez que alterações hormonais durante o ciclo estrous em ratos fêmeas afetarão a função hepatocita. - Anestesia
- Elaborar o volume necessário de heparina anticoagulante (5.000 UI/mL; 0,2 mL/100 g de peso corporal) e coquetel de cetamina/xilazina de rato (37,5 mg/mL de cetamina, 5 mg/mL de xilazina; 0,2 mL/100 g de peso corporal) em seringas de 1 mL com agulha de 27 G.
ATENÇÃO: Anestesia e heparina são substâncias nocivas. Tenha cuidado ao manusear os sharps. - Contenha o rato. Injetar heparina intraperitoneal seguida de coquetel de cetamina/xilazina no quadrante inferior direito do abdômen.
NOTA: O caecum tem maior probabilidade de estar localizado à esquerda. Evite perfurar o caecum durante a injeção para reduzir o risco de contaminação. - Após 10 min, verifique a profundidade da anestesia avaliando o reflexo do pedal em ambos os pés do rato. Continue verificando de tempos em tempos e espere até que o rato não responda mais aos dedo do dedo do dedo do dedo. Anestesia adicional pode ser injetada, conforme necessário.
- Elaborar o volume necessário de heparina anticoagulante (5.000 UI/mL; 0,2 mL/100 g de peso corporal) e coquetel de cetamina/xilazina de rato (37,5 mg/mL de cetamina, 5 mg/mL de xilazina; 0,2 mL/100 g de peso corporal) em seringas de 1 mL com agulha de 27 G.
- Coloque o rato em uma posição supina com membros estendidos em uma plataforma de poliestireno coberta de papel alumínio em cima de uma bandeja. Grave os pés do rato e fixe a fita firmemente na plataforma com agulhas de 27 G.
- Desinfete o peito e o abdômen pulverizando-os e encharcando-os com 70% de etanol. Barbear-se antes da desinfecção é opcional. Coloque o rato no capô. Continue o próximo passo enquanto a pele ainda estiver molhada.
NOTA: O encharcado com 70% de etanol também mantém o pó de casque e pele ao mínimo. - Separe a pele do músculo.
- Com um par de fórceps de tecido dente em uma mão, levante a pele perto da base do abdômen. Com um par de tesouras cirúrgicas afiadas na outra mão, corte a pele. Empurre a extremidade afiada da tesoura por baixo da pele e faça uma incisão midline na pele de logo acima das patas traseiras para logo abaixo das pernas do ante.
- Ao puxar para cima e esticar levemente a pele com as fórceps, corte qualquer tecido conjuntivo segurando a pele sobre o músculo no peito e abdômen. Para reduzir o risco de contaminação, evite que peles soltas caiam sobre o músculo. Para remover peles soltas acumuladas na tesoura, limpe-as no lado externo da pele desinfetada.
- Faça incisões laterais na pele, da linha média para ambos os lados do rato ligeiramente acima das patas traseiras e ligeiramente abaixo das pernas do ante. Empurre os retalhos da pele para os lados para expor o músculo.
- Abra o músculo abdominal para expor os órgãos.
- Com um novo par de fórceps de tecido dente em uma mão, levante o músculo perto da base do abdômen. Com um par de tesoura cirúrgica sem cortes na outra mão, corte cuidadosamente o músculo sem cortar nenhum dos órgãos. Faça uma incisão no músculo desde um pouco acima das patas traseiras até o esterno.
- Faça incisões laterais no músculo, da linha média para ambos os lados do rato ligeiramente acima das patas traseiras e logo abaixo da caixa torácica, sem cortar nenhum dos órgãos. Empurre os retalhos do músculo para os lados para expor os órgãos. Certifique-se de que as incisões laterais da pele e do músculo cheguem às laterais do rato para permitir que sangue e tampões fluam da cavidade abdominal em etapas posteriores.
- Cannulação venosa portal
- Com a parte de trás das fórceps curvas, empurre suavemente os intestinos para a direita. Vire suavemente os lóbulos do fígado para expor a veia do portal.
- Use uma sutura cirúrgica de seda 3-0 para fazer uma ligadura muito solta ao redor da veia portal perto do fígado, pouco antes dos ramos da veia esquerda e direita em diferentes lóbulos do fígado. Não aperte a ligadura para evitar interromper o fluxo sanguíneo através da veia do portal. Uma membrana muito fina sob o ducto biliar precisará ser quebrada com a ponta dos fórceps curvos antes que a sutura possa passar por baixo e ser enrolada ao redor da veia portal (e do ducto biliar).
- Utilizando as pontas de dois pares de fórceps curvos, puna cuidadosamente um buraco através do tecido sob a veia do portal, sem danificar a veia do portal. Faça isso cerca de 2-3 cm a montante da primeira ligadura, pouco antes da veia gástrica se ramifica da veia portal. O tecido é mais fino neste local específico.
- Estique cuidadosamente o orifício maior com as fórceps. Este orifício permitirá que os fórceps suportem a veia do portal durante a cannulação.
- Reduza a velocidade da bomba para 4 rpm para uma vazão de ~3 mL/min. Certifique-se de que a saída do buffer livre de cálcio do cateter IV seja reduzida a um gotejamento lento.
NOTA: O acúmulo de pressão no fígado causará morte por hepatocitte. Uma taxa de fluxo mais baixa deve retardar o acúmulo de pressão no fígado após a inserção bem sucedida da cânula na veia portal em um passo posterior. - Suporte suavemente a veia do portal usando fórceps. Por outro lado, segure o cateter IV com o bisel da agulha virado para cima. Direcione a agulha para a veia portal em um ângulo de 10-20° e avance lentamente até que todo o bisel esteja dentro da veia. Uma vez que a agulha é inserida corretamente na veia portal, o fígado começará a branquear e perderá sua cor vermelha escura.
NOTA: Todo o bisel da agulha deve ser inserido na veia para criar um orifício grande o suficiente para a inserção da cânula. No entanto, não insira a agulha muito profunda para evitar perfurar a veia. - Avance a cânula sobre a agulha e para a veia. Em seguida, retraia a agulha até que esteja 2-3 mm atrás da cânula; apenas o suficiente para que a ponta afiada esteja segura dentro da cânula. Use o polegar e o dedo médio para segurar o cateter e use o dedo indicador para puxar a asa para puxar a agulha.
- Segure rapidamente a veia do portal no cateter com um grampo de veia. Não corte diretamente no orifício lateral da agulha para evitar interromper o fluxo de perfusato. Em vez disso, clipe abaixo dele.
- Corte imediatamente a veia cava inferior infrahpática (IVC) para evitar o acúmulo de pressão no fígado. Agora, o IVC infra-hepática e os vasos sanguíneos adjacentes serão obscurecidos pelo sangue da veia portal. Para garantir que o IVC foi corretamente cortado e cortado, observe se o sangue jorrava nos pulsos; sangue só vai escorrer para fora de vasos adjacentes.
NOTA: Demorar muito para cortar o IVC infrahático após a cannulação ou falha em cortá-lo antes de passar para o próximo passo causará a morte de hepatócito. O animal é eutanizado sob anestesia por exsanguinação (através do corte do IVC) durante esta etapa. O procedimento deve continuar enquanto a perda de sangue está em andamento. A morte pode ser confirmada pela observação visual da cessação dos batimentos cardíacos/respiração quando a cavidade torácica é aberta em um passo posterior. - Aumente a velocidade da bomba para 38 rpm para uma vazão de ~33 mL/min. Lave o fígado três vezes fechando o IVC com fórceps para 2-3 s (mas não por muito tempo) e reabrindo-o.
NOTA: Durante a lavagem, o fígado se expandirá ligeiramente antes de voltar ao normal. A descarga facilita a permeação de perfusato em todo o fígado. Após a descarga, o fígado deve ser totalmente marrom claro na cor. - Certifique-se de que a ponta da cânula seja colocada antes do ponto onde a veia portal se ramifica em diferentes lóbulos do fígado, para garantir a perfusão de todos os lóbulos do fígado. Se necessário, despreeje a veia do portal e ajuste a posição da cânula. Re-clipe depois.
- Aperte a ligadura solta ao redor da veia do portal, ligeiramente a montante do ponto de ramificação. Faça três nós sobre onde a cânula macia é apoiada pela agulha de metal duro, entre o bevel e o orifício lateral. Certifique-se de que os nós fixam a cânula na posição, protegendo-a na veia do portal e evite o fluxo de buffers.
- Ressecção do fígado inteiro intacto.
- Perfunda o fígado com tampão livre de cálcio na taxa de fluxo de ~33 mL/min para os próximos 12 minutos (ver Figura 5A). Enquanto isso, faça a ressecção hepática. O tempo de perfusão pode ser estendido se necessário, mas certifique-se de que o buffer livre de cálcio não se escora.
- Usando um par de tesouras curvas, desprende cuidadosamente a veia portal dos intestinos cortando a mesenteria que os conecta. Não corte o trato gastrointestinal (esôfago, estômago e intestinos pequenos e grandes) para garantir que não ocorra contaminação.
NOTA: Isto é para evitar que a veia do portal se rasgue quando o fígado é movido durante a ressecção. - Retire o fígado do trato gastrointestinal cortando tecidos conjuntivos, pâncreas e mesenteria que conecta o fígado ao trato gastrointestinal. Para desapegar, corte sempre com uma tesoura e não puxe para rasgar. Novamente, não corte ou corte o trato gastrointestinal.
- Abaixe suavemente o fígado para expor o diafragma. Corte o diafragma seguindo as paredes das costelas. Certifique-se de que a maior parte do diafragma permanece conectada ao fígado. Tenha cuidado para não cutucar ou machucar o fígado.
- Uma vez aberta a cavidade torácica, dois dutos podem ser vistos: o IVC suprahepário esbranquiçado à esquerda, e o esôfago amarelado à direita. Corte o IVC supraháptico e corte-o logo acima do clipe. Cortar o IVC supraháptico é opcional. Evita que a cavidade torácica fique inundada.
NOTA: Observe visualmente a cessação dos batimentos cardíacos/respiração para confirmar a morte animal. - O esôfago está cercado pelo diafragma. Para isolar o esôfago do diafragma, corte o diafragma da direita em direção ao esôfago. Corte todos os tecidos conjuntivos restantes que liguem o esôfago e o estômago ao fígado e diafragma.
- Afaste o trato gastrointestinal para a direita. Transferir o clipe da veia do IVC suprahepático para o IVC infrahético; buffer agora perfuse fora do IVC supraháptico.
NOTA: Durante a perfusão, a cânula e o IVC infrahético serão cobertos pelo fígado. O forte fluxo de buffer do IVC suprahepático ajudará o cirurgião a descartar vazamentos de perfusão. - Corte qualquer diafragma restante que ligue o fígado à cavidade torácica. Corte tecidos que ligam o fígado à cavidade abdominal. Tenha cuidado para não cortar o IVC infrahático acima do clipe para evitar separar o clipe do fígado.
- Para garantir que o fígado esteja completamente ressecado, levante cuidadosamente o fígado segurando o diafragma com fórceps. Se houver algum tecido restante ligando o fígado à cavidade abdominal, corte-os. Se o rim e o baço ainda estiverem ligados ao fígado, desapeça-os.
4. Perfusão e digestão hepática
- Se a ressecção foi concluída mais cedo, espere até que o fígado tenha sido perfundido com tampão livre de cálcio por 12 minutos.
- Altere o tampão de perfusão para o buffer de colagem. Solte completamente o grampo do rolo para o tampão de colagem antes de apertar completamente o grampo do rolo para o tampão livre de cálcio (ver Figura 5B). Uma vez que o tampão de colagem atinge o fígado através da tubulação, lave o fígado três vezes fechando o IVC supraháptico para 2-3 s e reabrindo-o.
- Mova cuidadosamente o fígado para o palco em cima do béquer para recirculação do tampão de colagenase. Mova o fígado segurando o diafragma com fórceps enquanto suporta o cateter. Evite puxar o cateter para evitar o descolamento acidental do cateter.
NOTA: Se o cateter se soltar e a veia portal estiver muito danificada para a re-cannulação, cannulate o IVC suprahepático e permita que o tampão peruuse da veia do portal. Certifique-se de que o IVC infra-hepática permaneça cortado. - Digerir o fígado por 12 minutos. Observe para o aparecimento de manchas translúcidas/rede à medida que o fígado começa a perder sua textura marrom lisa. O fígado vai ficar maior e mais macio à medida que ele é digerido. Uma vez que o fígado tenha uma consistência mole, pare a perfusão. O tempo de digestão pode ser estendido, se necessário.
NOTA: Se a cápsula do Glisson foi quebrada, o tampão de colagem no béquer pode ficar nublado devido a células hepáticas escapou.
5. Isolamento hepatocito
- Remova cuidadosamente a cânula cortando a veia do portal. Remova cuidadosamente o clipe. Transfira o fígado para um prato de 150 mm contendo 60 mL de dulbecco frio do Médio de Águia Modificada (DMEM).
- Bata suavemente o fígado usando a parte de trás das fórceps curvas para quebrar e descascar a cápsula do Glisson. Em seguida, balance suavemente o fígado lado a lado no DMEM para liberar células hepáticas. Continue a fazer isso até que as células hepáticas estejam totalmente dissociadas no DMEM.
NOTA: Ocasionalmente, todo o fígado ou certos lóbulos só serão parcialmente digeridos. Ao não raspar o fígado que removerá à força, e danificar hepatócitos não dissociados, uma viabilidade celular maior e mais consistente pode ser obtida. - Balance suavemente o prato de 150 mm até que as células hepáticas sejam bem distribuídas no DMEM. Para remover pedaços de tecido e aglomerados celulares, despeje a suspensão celular através de um filtro de malha de nylon tamanho 100 μm colocado sobre um novo prato de 150 mm. Enxágüe o prato antigo com 30 mL de DMEM e transfira a suspensão para o filtro de malha. Toque suavemente no filtro de malha para permitir que células hepáticas únicas presas passem.
- Retire o filtro de malha e balance delicadamente o novo prato de 150 mm até que as células hepáticas sejam bem distribuídas. Divida a suspensão igualmente em tubos de 4 x 50 mL. Enxágüe o prato com 30 mL de DMEM e divida a suspensão igualmente nos mesmos tubos. Certifique-se de que cada tubo tenha um volume igual de suspensão celular.
- Centrifugar os tubos de 4 x 50 mL de suspensão celular a 50 x g por 2 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o supernasce sem perturbar a pelota solta. Descarte o supernatante. Adicione 20 mL de DMEM em cada tubo e balance suavemente os tubos para resuspensar a pelota da célula. Misture a suspensão celular de quatro tubos em dois.
- Centrifugar os tubos de 2 x 50 mL a 20 x g por 2 min a 4 °C. Aspire e descarte o supernaspe. Adicione 20 mL de DMEM em cada tubo e balance suavemente os tubos para resuspensar a pelota da célula. Misture a suspensão celular de dois tubos em um. Mantenha as células no gelo até usar.
- Prepare a solução azul trypan misturando 400 μL de 1x PBS com 50 μL de azul trypan. Adicione 50 μL de suspensão de hepatocitte na solução azul trypan. Conte o número de hepatócitos viáveis e mortos com um hemótmetro sob o microscópio de luz.
6. Cultura hepatocita
- Realize todos os passos de cultura celular no capô. Adicione 1 mL de solução de revestimento de colágeno em uma prato de 35 mm e incubar por 4h. Enxágüe os pratos três vezes com 1x PBS.
- Diluir a suspensão do hepatocito em meio de cultura hepatocitada a uma concentração de 0,8 milhões de células/mL. Adicione 1 mL de suspensão de hepatocitado diluída no prato de 35 mm.
NOTA: Os hepatócitos são sensíveis ao estresse da tesoura durante a pipetação. Considere usar pontas largas de pipeta de furo. - Arrase o prato para distribuir os hepatócitos uniformemente. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 3-4 h para permitir que os hepatócitos se conectem.
- Para a cultura do sanduíche.
- Remova o meio de cultura hepatocita. Enxágüe uma vez com 1 mL de cultura hepatócica para remover células nãoectadas. Adicione 1 mL de solução de sobreposição de colágeno. Adicione a solução de sobreposição de colágeno nas paredes do prato para evitar a introdução de bolhas na solução.
- Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite para permitir a gelação de colágeno.
- Adicione 1 mL de meio de cultura hepatócica fresca. Incubar a 37 °C, 5% de CO2.
- Para a cultura da monocamadas.
- Após a etapa 6.3, remova o meio de cultura hepatocitte. Enxágüe uma vez com 1 mL de cultura hepatócica para remover as células nãoectadas.
- Adicione 1 mL de meio de cultura hepatócica fresca. Incubar a 37 °C, 5% de CO2.
- Avalie a pureza e a função hepatócidas realizando imunostaining para marcador específico de hepatócito e ensaios funcionais, conforme descrito anteriormente10,11.
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Representative Results
Um cirurgião poderia dizer se a perfusão hepática está acontecendo sem problemas observando o resultado após certos passos. O primeiro desfecho pode ser observado após a canulação, corte do IVC infrahético e restauração da vazão de perfusão. O fígado deve ter mudado completamente a cor do vermelho escuro para o marrom, mantendo seu volume. Se o fígado parece ligeiramente deflacionado e tem uma tonalidade avermelhada ou manchas de vermelho, significa que a taxa de fluxo de perfusão foi definida erroneamente (muito baixa), ou a veia portal não foi cânulada corretamente. Se o fígado não só fica marrom, mas fica inchado e rígido, significa que a taxa de fluxo foi definida erroneamente (muito alta), ou o IVC infrahético não foi cortado corretamente. Se apenas alguns lóbulos não estão sendo bem perfundidos, significa que o cateter foi inserido muito profundo e está apenas perfusando um ramo da veia portal. O segundo desfecho pode ser observado após a ressecção e o recorte do IVC infrahético. Se o fluxo de saída do IVC suprahepático for lento e fraco, pode significar que o cateter se desprendeu durante a ressecção, ou que o IVC infrahático não foi cortado corretamente. O terceiro desfecho pode ser observado durante a digestão. No fígado marrom, as manchas translúcidas/rede devem aparecer e aumentar. O fígado deve perder sua consistência elástico e ficar macio e mole. Otimizamos nossa concentração de colagem para que este estado possa ser alcançado dentro de 12 minutos. Ao experimentar um novo lote de colagemnase, o tempo de digestão deve ser estendido até que este estado seja atingido. O quarto desfecho pode ser observado quando as células são liberadas do fígado. Quando as células são liberadas, a mídia deve parecer nebulosa. Se muito de textura granulada for observada, pode significar que o fígado foi insuficientemente digerido. Se a digestão estiver completa, apenas vasos brancos como teia devem ser deixados. Mesmo que a digestão seja parcial (Figura 6), ainda é possível adquirir boas células.
Nosso protocolo descrito aqui consistentemente gera maior rendimento celular de até 5 × 108 hepatócitos por isolamento de ratos pesando 200-300 g e viabilidade celular entre 88%-94,8% conforme determinado pela contagem azul trypan 12,13,14,15,16 (Tabela 2). A pureza hepatocita obtida como determinada pela imunostenção de albumina foi de 96,8 ± 2,0%11 (Figura 7). Hepatócitos na cultura sanduíche formaram canais biliabululis distintos e tiveram bom contato celular (Figura 8). Os hepatócitos têm alta funcionalidade, como mostrado pelos ensaios albumina, ureia e CYP10 (Tabela 3).
Figura 1: Diagrama esquemático do IPS. O perfusato começa no saco ou garrafa perfusada (1, 2). Dois reguladores de fluxo (3, 4) trabalham juntos para controlar a passagem do perfusado. Perfusate segue para uma armadilha de bolhas (5). Os processos subsequentes são controlados pela tela sensível ao toque LCD (6) do sistema principal. O perfusato é então puxado por uma bomba peristáltica (7) e passa por um aquecedor eletrônico de silicone (8), que aquece o perfusato à temperatura desejada. A jaqueta aquecedora de silicone (8) é conectada ao sistema principal por um conector (9). Quando necessário, um sensor de pressão descartável (10) pode ser conectado ao sistema principal por um conector (11), para permitir a medição da pressão de perfusão. O perfusado passa então por um monitor de perfusão (12), que mede a temperatura do perfusado e detecta a presença de bolhas. O monitor também pode determinar se o perfusado se esgota. As leituras do monitor são transmitidas para o sistema principal via LoRa. O perfusado então segue para um filtro de bolha (13) e entra no fígado através da cânula venosa portal (14). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Diagrama esquemático da perfusão de colagenase de duas etapas para isolamento hepatócito primário de rato. (A) Perfusão de tampão livre de cálcio. O grampo do rolo é completamente solto para entrada 1 e completamente apertado para a entrada 2. (B) Digestão hepática com tampão de colagenase. Fígado ressecado é transferido para o topo de um béquer para permitir a recirculação tampão. O grampo do rolo está completamente solto para a entrada 2 e completamente apertado para a entrada 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Fígado após digestão de colagem e isolamento hepatocitado. Mostrado é um lobo hepático parcialmente digerido. Partes não digeridas do fígado permaneceram marrons. Em partes digeridas do fígado, apenas vasos brancos foram deixados para trás. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imunostaining de marcador hepatocítico para quantificação da pureza hepatocita. (A) Cultura sanduíche de suspensão celular hepática não purificada (antes da centrifugação diferencial; esquerda) e suspensão de hepatócito purificada (após centrifugação diferencial; direita) semeada em baixa densidade celular. (B) Imagens representativas mostram células manchadas com DAPI (núcleo; azul) e anticorpo contra albumina (marcador específico de hepatocitado; verde). (C) Quantificação da pureza hepatócica. A pureza foi determinada contando células manchadas fluorescentes positivas em relação ao número total de células visualizadas pela coloração nuclear da DAPI. Imagens em cores falsas foram mostradas. Albumina (verde), núcleo de células com albumina (azul), núcleo de células sem albumina (vermelho). Barras de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Imagem de contraste de fase de hepatócitos primários isolados de colagenase de duas etapas na cultura sanduíche no dia 3. Barra de escala 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome de Buffers/Mídia | Concentração final | Quantidade | Comentários/Descrição |
| Mídia cultural hepatócica | |||
| William's E mídia | 500 mL | Adicione todos os reagentes na mídia E do William. Filtrar através de filtro de 0,22 μm. Armazenar a 4 °C. | |
| Bsa | 1 mg/mL | 0,5 g | |
| Penicilina-Estreptomicina (100X) | 1X | 5 mL | |
| Insulina (20 mg/ml) | 0,5 μg/mL | 12,5 μL | |
| Dexametasona (1 mM) | 100 nM | 50 μL | |
| Ácido linoleico (7,5 μg/mL) | 50 ng/mL | 3,33 μL | |
| Glutamax (100X) | 1X | 5 mL | |
| Tampão de colagenase | |||
| NaCl | 0.100 g | Dissolva-se em 380 mL de água ultrapura. Ajuste para pH 7.49 - 7.51 com NaOH. Cubra até 400 mL com água ultrapurada. Filtrar através de filtro de 0,22 μm. Armazenar a 4 °C. | |
| Kcl | 0,789 g | ||
| Colagenase Tipo IV | 80 - 200 U/mL | ||
| CaCl2·2H2O | 0,140 g | ||
| HEPES | 4.800 g | ||
| Tampão sem cálcio | |||
| KH2PO4 | 0,0815 g | Dissolva-se em 900 mL de água ultrapura. Ajuste para pH 7.49-7.51 com HCl. Cubra até 1 L com água ultrapura. Filtrar através de filtro de 0,22 μm. | |
| NaHCO3 | 1.0500 g | ||
| NaCl | 3.4480 g | ||
| Kcl | 0,1750 g | ||
| DMEM para isolamento celular | |||
| DMEM | 1 sachê | Cubra até 1 L com água ultrauso. Filtrar através de filtro de 0,22 μm. Armazenar a 4 °C. | |
| NaHCO3 | 1,5 g | ||
| Penicilina-Estreptomicina (100X) | 1X | 10 mL | |
| Sobreposição de colágeno (1 mL) | |||
| 0.1 M Naoh | 1 parte | 20,8 μL | Prepare-se fresco. Adicione colágeno por último. |
| PBS 10X | 1 parte | 20,8 μL | |
| 1X PBS | 6 peças | 125 μL | |
| Mídia cultural hepatócica | 32 peças | 667 μL | |
| Tipo I colágeno bovino | 8 peças | 167 μL | |
| Solução de revestimento de colágeno (1 mL) | |||
| Tipo I colágeno bovino | 1 parte | 0,5 mL | Prepare-se fresco. |
| 0.01 N HCl | 1 parte | 0,5 mL | |
Tabela 1: Receitas para tampões e soluções.
| Viabilidade hepatócida (%) | Rendimento de hepatócito (x 108 células) | Rendimento viável de hepatócitos (x 108 células) |
| 91.4 ± 3.4 | 4.39 ± 1,58 | 4.04 ± 1.48 |
Tabela 2: Viabilidade e rendimento celular. Valores ± SD de 18 experimentos diferentes são mostrados.
| Ureia (μg/milhões de células/dia) | Albumina (μg/milhões de células/dia) | Atividade CYP1A2 (μg/milhões de células/dia) | Atividade CYP2B1/2 (μg/milhões de células/dia) | Atividade CYP3B2 (μg/milhões de células/dia) | |
| Dia 1º | 124 ± 2,6 | 39.0 ± 3.6 | |||
| Dia 3. | 65,7 ± 3,8 | 516,0 ± 95,1 | 2249 ± 56 | 188 ± 49 | 93,7 ± 0,6 |
Tabela 3: Níveis funcionais de hepatócito de rato primário isolado na cultura sanduíche. São mostrados os ensaios ± SD de ureia, albumina, CYP1A2, CYP2B1/2 e CYP3B2 de três experimentos diferentes.
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Discussion
Existem alguns pontos que são particularmente importantes de se observar para o procedimento de coagem de duas etapas em geral. Em primeiro lugar, deve-se dar um cuidado especial ao resseccionar o fígado. Certifique-se de que o trato gastrointestinal não esteja danificado, pois o vazamento do conteúdo resultará em contaminação bacteriana. Além disso, evite danificar a cápsula do Glisson, que cobre a superfície do fígado durante o procedimento animal. Se a lágrima for grande o suficiente, pode permitir a liberação prematura de hepatócitos desassociados no tampão de colagemnase. Em segundo lugar, a capacidade de colagenase digerir o fígado, garantindo uma boa viabilidade hepatócida pode variar de acordo com o número do lote. A quantidade de colagemnase utilizada deve ser otimizada para cada novo lote de colagemnase5. É aconselhável testar alguns lotes de colagemnase e selecionar o melhor lote antes de comprar a granel. Certifique-se de que a água está ultrauso, e o pH está correto. Impurezas na água, como íons ferrosos e férricos e o pH errado podem afetar a atividade de colagem, o que afetará drasticamente a qualidade das células isoladas. Embora a recirculação do buffer de colagenase neste protocolo possa ser opcional, não é aconselhável porque o volume de buffer de colagenase necessário aumentará para >400 mL. Por último, a pressão de perfusão e a taxa de fluxo devem estar em uma faixa apropriada. A alta pressão e a vazão levarão à morte das células hepáticas, enquanto a baixa pressão e a vazão resultarão em fluxo tampão insuficiente através dos vasos menores10. Durante a perfusão tampão sem cálcio, a pressão aumentará inicialmente. No entanto, após a perfusão do buffer de colagenase, a pressão cairá lentamente ao longo do tempo, uma vez que a digestão por colagenase reduz a resistência ao fluxo. Se a queda de pressão não foi observada, o tempo de digestão pode ser estendido conforme necessário. Como o IPS possui o sensor de pressão opcional, é possível variar a taxa de fluxo do perfusado para compensar as variações de pressão. Em outra nota, embora a descarga do circuito com um oxigenador tenha sido usada em alguns protocolos 2,5, descobrimos que não era fundamental para a viabilidade e rendimento hepatócida. Assim, nosso dispositivo não inclui um oxigenador.
Em contraste com a prática comum de digestão hepática antes da ressecção, este protocolo envolve a ressecção do fígado antes da digestão. A abordagem neste protocolo contém diversas vantagens em relação à prática comum. Em primeiro lugar, a digestão excessiva do fígado pode ser evitada. Dependendo da habilidade do cirurgião, a ressecção hepática pode levar de 5 a 10 minutos. Seguindo a prática comum, embora a perfusão tenha sido interrompida, isso ainda equivale a um adicional de 5-10 min onde o fígado é exposto à colagemnase. A super digestão pode diminuir a viabilidade celular e reduzir o apego e a função do hepatocitte. Em segundo lugar, essa abordagem poderia potencialmente reduzir a perda de hepatócitos. A cápsula do Glisson é menos propensa a rasgar quando o fígado ainda está elástico antes da digestão, em comparação com quando é macio e mole após a digestão. Finalmente, a ressecção do fígado antes da digestão permite a possibilidade de recirculação de colagem. A recirculação de colagenase elimina a ocorrência de isolamentos fracassados devido ao volume insuficiente de colagemnase sendo preparado. Nossa abordagem permite que o tempo de digestão seja estendido, conforme necessário. Também tem uma pequena vantagem de reduzir a quantidade de colagem necessária por isolamento. A principal desvantagem dessa abordagem é que ela introduz um novo problema de desprendimento de cateter no meio da perfusão, mas que poderia ser tratada com algumas precauções técnicas. Outra diferença é que este protocolo não envolve o uso de gradiente de densidade, como o Percoll. Ao remover células mortas, percoll foi relatado para aumentar a viabilidade final das células com alguma perda de rendimento, de 20%-50%16. Nossa viabilidade celular é alta porque testamos e selecionamos lotes de colagem. Pela nossa experiência, alguns lotes de colagem consistentemente dão menor viabilidade. Sem centrifugação de densidade, será necessário evitar lotes de colagem ruins através de testes prévios. Para aqueles que não têm tal liberdade e devem considerar gradiente de densidade, deve-se prestar cuidado durante a diluição de Percoll para evitar a seleção de subpopulações de hepatócitos com um perfil metabólico ligeiramente diferente17,18.
Nossa abordagem no uso de um IPS para isolamento hepatócito primário de rato resolve vários problemas com configurações de perfusão existentes 1,2,5,6,7,8,9. O uso de tubos estéreis descartáveis economiza tempo removendo a necessidade de limpar e desinfetar tubos de perfusão antes e depois de cada isolamento. Reduz o risco de incêndio, uma vez que a tubulação de perfusão não precisa ser preenchida com 70% de etanol inflamável quando não está em uso para manter a esterilidade. O risco de contaminação devido à desinfecção e armazenamento inadequados também pode ser eliminado. Mais importante, a necessidade de substituição rotineira de tubos antigos pode ser contornada; esse processo é essencial, mas muitas vezes é complicado e demorado. A adição de um filtro de bolha ao tubo próximo ao cateter permite que as bolhas escapem antes de atingir o cateter e impede que o ar passe quando o tampão de perfusão acabar. Uso de uma jaqueta aquecedora de silicone, pois o sistema de controle de temperatura permite uma manutenção precisa e estável da temperatura perfusada durante a digestão, em contraste com tampões pré-aquecidos que esfriarão significativamente ao longo do tempo. Além disso, a jaqueta de aquecedor de silicone é compacta e pode ser facilmente mantida, ao contrário de uma jaqueta de vidro acoplada a um circulador de banho de água. O uso de sensores de monitoramento para temperatura e pressão substitui o passo de otimização antes do isolamento. A variação de temperatura pode ocorrer durante ou entre experimentos. A pressão (e, portanto, a taxa de fluxo) também pode mudar devido a problemas com tubos de perfusão. A colocação de sensores perto da cânula permite uma leitura mais precisa da temperatura do tampão perfumando no fígado. Os alarmes do sensor podem lembrar o usuário de tomar medidas corretivas. O registro gravado também permite a solução de problemas. O uso de um cateter IV especial para cannulação simplifica a cannulação da veia portal. Ao contrário de outros tipos de cateter IV, o cateter descrito aqui permite a comunicação fluida entre a cânula e a tubulação tanto em sua posição de puncção quanto de agulha retraída devido a um buraco na lateral da agulha. Assim, os cirurgiões poderiam usar a mudança de cor do fígado como sinal de cannulação bem sucedida. Após a cannulação bem sucedida, a ponta da agulha pode ser retraída atrás da ponta do cateter para evitar o re-perfurante da veia portal. A agulha retraída também poderia atuar como base para a ligadura para fixar a veia portal na cânula macia e evitar que ela fosse deformada. Este cateter pode ser operado com uma mão; portanto, a mão não dominante pode ser usada para apoiar a veia portal com fórceps. O design integrado compacto permite que todo o dispositivo de perfusão seja colocado no capô laminar, reduzindo o risco de contaminação e economizando espaço. Isso é especialmente importante para que o procedimento animal seja realizado em uma instalação animal dedicada onde a disponibilidade do espaço pode ser um desafio.
Em comparação com os protocolos de isolamento de hepatócitos de rato relatados anteriormente usando o procedimento de perfusão de colagem de duas etapas1, as condições descritas consistentemente geram maior rendimento celular de até 5 x 108 hepatócitos por isolamento, viabilidade celular entre 88%-94,8% e boa função específica do hepatocito.
Este protocolo pode ser usado simultaneamente para isolar outras células hepáticas não parenchímicas, como células kupffer, células endoteliais hepáticas e células estelares hepáticas do mesmo rato. Este protocolo também pode ser modificado para o isolamento de células hepáticas de camundongos usando um cateter de bitola IV menor para a cannulação e diminuindo a taxa de fluxo de perfusão para uma faixa adequada para espécies de camundongos6. O procedimento de perfusão para camundongos pode ser simplificado ressecndo o fígado após a digestão.
O dispositivo IPS usado neste experimento também pode ser usado para aplicação de perfusão hepática ex vivo, como experimentos em transplante hepático, bem como descelularização de roedores e fígados humanos descartados19,20. O IPS tem uma vantagem onde o fígado deve ser perfundido por longos períodos, pois o IPS pode monitorar as condições de perfusão em tempo real e permitir a interrupção da perfusão após a conclusão, automaticamente ou manualmente por controle remoto.
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Disclosures
Zhou Yan e Hanry Yu declaram interesses concorrentes, pois detêm capital próprio em Vasinfuse, que fabrica e comercializa o Sistema Integrado de Perfusão. Hanry Yu detém equidade em Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Inovar e Synally Futuristech que não têm interesses concorrentes com as informações aqui relatadas.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado em parte pelo MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NuHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instituto de Mecanobiologia de Cingapura (R-714-106-004-135); e Instituto de Bioengenharia e Nanotecnologia, Conselho de Pesquisa Biomédica, Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR) (Projeto Números IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 e MedCaP-LOA-18-02) para Hanry Yu. Ng Chan Way é um pesquisador da Universidade Nacional de Singapura. Gostaríamos de agradecer à Unidade de Microscopia Confocal & Unidade de Citometria de Fluxo da Universidade Nacional de Cingapura por ajuda e aconselhamento na análise da pureza hepatocyte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
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