Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.
Abstract
Primaire hepatocyten worden veel gebruikt in fundamenteel onderzoek naar leverziekten en voor toxiciteitstests in vitro. De tweestaps collagenaseperfusieprocedure voor primaire hepatocytenisolatie is technisch uitdagend, vooral bij portale adercannulatie. De procedure is ook gevoelig voor incidentele verontreiniging en variaties in perfusieomstandigheden als gevolg van problemen bij de assemblage, optimalisatie of onderhoud van de perfusie-opstelling. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor een verbeterde tweestaps collagenaseperfusieprocedure met multiparameterperfusiecontrole. Primaire rattenhepatocyten werden met succes en betrouwbaar geïsoleerd door de nodige technische voorzorgsmaatregelen te nemen bij kritieke stappen van de procedure, en door de operationele moeilijkheid te verminderen en de variabiliteit van perfusieparameters te verminderen door de toepassing van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslang, temperatuurregeling en real-time monitoring- en alarmsysteem. De geïsoleerde primaire rattenhepatocyten vertonen consequent een hoge cel levensvatbaarheid (85%-95%), opbrengst (2-5 x 108 cellen per 200-300 g rat) en functionaliteit (albumine, ureum en CYP-activiteit). De procedure werd aangevuld met een geïntegreerd perfusiesysteem, dat compact genoeg is om in de laminaire stromingskap te worden geïnstalleerd om een aseptische werking te garanderen.
Introduction
Primaire hepatocyten zijn belangrijke hulpmiddelen voor levergerelateerd fundamenteel onderzoek, ziektebehandeling en toepassing zoals het testen van geneesmiddelen. De huidige gouden standaard voor primaire hepatocytenisolatie is de tweestaps collagenaseperfusieprocedure 1,2,3 geïntroduceerd door Seglen in de jaren 19704. Deze procedure is echter technisch uitdagend en heeft een hoog faalpercentage wanneer uitgevoerd door beginnende chirurgen. Zelfs wanneer een perfusie als succesvol wordt beschouwd, kunnen drastische verschillen in levensvatbaarheid van hepatocyten (typisch 60% -95%) en opbrengst (0,5-5 x 108 per 200-300 g rat) worden waargenomen tussen isolaties. Dit beïnvloedt de kwaliteit en schaal van downstream experimenten. Afgezien van de technische procedure, is de perfusie-opstelling die wordt gebruikt voor de isolatie, commercieel verkrijgbaar of op maat gemaakt, een bijdragende factor. Er moet aandacht worden besteed aan de montage, optimalisatie en het onderhoud van de perfusie-opstelling. Het doel van dit protocol is om het succespercentage en de stabiliteit tussen isolaties van primaire rathepatocyten te verbeteren door middel van multiparameter perfusiecontrole van de technische procedure en perfusie-instelling van de tweestaps collagenaseperfusieprocedure.
Vanuit het technische aspect is de moeilijkste stap in de procedure de portaaladercannulatie. Wat de andere stappen betreft, als goede praktijken in acht worden genomen en algemene voorzorgsmaatregelen worden genomen, kan de stabiliteit van de isolatie worden verbeterd. Daarom is het belangrijk om de redenering voor elke stap te begrijpen, zodat de chirurg kan reageren op verschillende variabelen die tijdens de procedure kunnen optreden.
Verschillende protocollen voor de isolatie van hepatocyten en lever niet-parenchymale cellen van rat en muis zijn gepubliceerd 1,2,5,6,7,8,9. De perfusie-opstellingen die in deze protocollen worden gebruikt, hadden verschillende nadelen, waaronder het hergebruik van perfusiebuizen, problemen met temperatuurregeling, behoefte aan routinematige optimalisatie van perfusieparameters en / of gebruik van ongeschikt type intraveneuze (IV) katheter voor portale aderconnulatie. Het hergebruik van perfusiebuizen vergroot de kans op besmetting, zeker als de slang niet goed gereinigd en gedesinfecteerd is. Hergebruik van buizen zonder routinematige vervanging zal de perfusie-opstelling ook blootstellen aan problemen zoals lekkende buizen of connectoren, verstopte bellenvanger en vernauwde slangen, die allemaal de perfusaatdruk en stroomsnelheid aanzienlijk zullen verminderen, waardoor de efficiëntie van de leververtering wordt beïnvloed. Zonder een constante warmtebron in sommige opstellingen voor temperatuurregeling, zullen voorverwarmde buffers na verloop van tijd afkoelen, wat leidt tot een lage collagenase-activiteit en spijsvertering. Hoewel andere opstellingen een glazen condensor met mantel gebruiken die is aangesloten op een watercirculatiepomp om de buffer te verwarmen, zijn ze omvangrijk en moeten ze zorgvuldig worden gereinigd. Temperatuur, druk en debiet van de buffer die de katheter verlaat, moeten vóór het begin van de isolatie worden gemeten en geoptimaliseerd om een stabiele perfusieconditie te verzekeren. Zelfs na optimalisatie kunnen de parameters nog steeds halverwege de isolatie veranderen als gevolg van de acties van de operator, wat leidt tot suboptimale perfusie en spijsvertering. De meeste soorten IV-katheters zijn niet geschikt voor poortader cannulatie omdat ze geen continue perfusie tijdens cannulatie toestaan. Ze zijn niet in staat om de chirurg onmiddellijk te informeren wanneer de cannulatie succesvol is. Bovendien is het een uitdaging om de poortader op de zachte katheter vast te zetten zonder deze te vervormen.
Hier pakken we deze problemen aan met behulp van gestandaardiseerde steriele wegwerpbuizen, een siliconen verwarmingsmantel voor nauwkeurige en stabiele temperatuurregeling, real-time bewaking en alarmsysteem met gegevensopslag en -beheer en gebruik van een speciale IV-katheter, die continue perfusie mogelijk maakt tijdens het doorboren van de poortader tijdens cannulatie. Voor zover we weten, zijn we de eerste groep die al deze functies combineert in een geïntegreerd perfusiesysteem (IPS) dat compact is, waardoor het zeer draagbaar is en in een laminaire stroomkap kan worden geplaatst om een aseptische werking te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en huisvesting van dieren werden uitgevoerd onder protocolnummers R15-0027 en R19-0669 in overeenstemming met de vereisten van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de National University of Singapore.
1. Bereiding van oplossingen en chirurgische instrumenten
- Bereid buffers en celkweekmedia in tabel 1 voor met ultrapuur water.
- Verwarm de calciumvrije buffer en collagenasebuffer voor gebruik tot 37 °C in een waterbad.
- Autoclaaf de volgende chirurgische instrumenten en laboratoriumapparatuur: een scherpe chirurgische schaar, een stompe chirurgische schaar, een gebogen chirurgische schaar, twee paar tandweefseltangen, twee paar gebogen tangen, twee paar gebogen tangen, twee aderclips, een 5 cm lange 3-0 zijden chirurgische hechting, een nylon mesh-filter van 100 μm, een bekerglas van 400 ml, en een trap (zwevend microcentrifugebuizenrek).
2. Het IPS instellen (zie figuur 1)
- Veeg de laminaire stromingskap af met 70% ethanol. Veeg het IPS af met 70% ethanol en plaats het in de laminaire stroomkap. Steriliseer door UV gedurende >15 minuten voordat u de kap inschakelt.
LET OP: Blootstelling aan UV-licht kan pijnlijke ogen en brandwonden op de huid veroorzaken. Zorg ervoor dat de vleugel volledig gesloten is wanneer het UV-lampje wordt ingeschakeld. - Monteer een nieuwe set wegwerpslangen op de IPS. Wikkel de slang stroomafwaarts van de peristaltische pomp in een siliconen kachelmantel. Monteer de perfusiemonitor op de slang stroomafwaarts van de siliconen kachelmantel.
- Zorg ervoor dat de rolklemmen voor beide buisinlaten volledig zijn losgemaakt. Sluit elke buisinlaat aan op het taps toelopende uiteinde van een steriele 2 ml aspiratiepipet. Laat beide aspiratiepipetjes (inlaten) en de iv-katheter (uitlaat) in een fles van 1 liter met calciumvrije buffer om recirculatie van de buffer mogelijk te maken tijdens de daaropvolgende primingstappen.
Figuur 2: Zelftestinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Schakel de IPS in. Voer de volgende bewerkingen uit op het bedieningspaneel van het aanraakscherm. De software voert elke keer dat deze wordt gestart een uitgebreide zelftest uit.
LET OP: De IPS is een elektrisch apparaat dat is aangesloten op een externe voedingsbron. Gemorste vloeistoffen op de IPS- of stroomkabels kunnen elektrische gevaren veroorzaken.- Zorg ervoor dat de zelfteststatus op het scherm wordt weergegeven (afbeelding 2). Onderdelen die de zelftest hebben doorstaan, worden in het groen weergegeven; degenen die zijn mislukt, worden in het rood weergegeven. Tik na rectificatie op het pictogram Testen om de zelftest opnieuw te herhalen of tik op het pictogram Systeem invoeren om rechtstreeks in de bedieningsinterface te komen.
- Tik ergens op het scherm om in te loggen op de bedieningsinterface.
- Tik in de linkerbovenhoek van de bedieningsinterface (figuur 3) op een van de cirkelvormige pijlpictogrammen om de draairichting voor de peristaltische pomp in te stellen. Tik in het rechterdeelvenster van de interface op de pijl-omhoog / omlaag-pictogrammen om waarden in te stellen voor de bijbehorende parameters. Stel de stroom in op de constante stroommodus; temperatuur van de verwarmingsmantel tot 42 °C (in te stellen om ervoor te zorgen dat de temperatuur van het perfusaat op 37 °C wordt gehouden); en pompsnelheid tot 38 rpm voor een debiet van ~33 ml/min.
- Controleer in het rechteronderpaneel van de bedieningsinterface op de status van het bellenalarm, het perfusiestopalarm en het mute-pictogram.
- Controleer op de temperatuur, druk en stroomsnelheid van het perfusaat in het linkerpaneel. Stel de intervallen handmatig in door op de pijlen omhoog en omlaag boven en onder in de kolommen te klikken. Controleer op de realtime gegevens die als waarden in het midden van de kolommen worden weergegeven. De kleur van de kolom verandert van groen naar rood als de realtime gegevens buiten het ingestelde bereik gaan.
- Zoek de pictogrammen om de perfusie te starten, te pauzeren en te stoppen, en het pictogram om over te schakelen van realtime gegevensweergave naar grafiekmodus in het middelste deelvenster. Tik op het startpictogram om de perfusie te starten en de slang te primen met een calciumvrije buffer. Er wordt een nieuw logboek gemaakt. Voer de bestandsnaam en gebruikersnaam in het pop-upvenster in (afbeelding 4).
Figuur 3: Bedieningsinterface. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Pop-upvenster waarin wordt gevraagd om bestandsnaam en gebruikersnaam. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Vul de druppelkamer tot halfvol. Zorg ervoor dat er tijdens het primen geen opgesloten luchtzakken in de slang zitten.
- Verwijder elke bel die zich stroomafwaarts van het bellenfilter vormt door op de slang te vegen om de bel los te maken en uit te spoelen.
OPMERKING: Bubbels kunnen zich langs de slang vormen als de buffer wordt opgewarmd door de kachelmantel. - Vul een bekerglas van 400 ml met 200 ml collagenasebuffer. Zet het podium bovenop het bekerglas. Zonder lucht in de slang te brengen, spant u de rolklem voor een van de buisinlaten volledig aan en verplaatst u de aspiratiepipet voor de inlaat in het bekerglas.
3. Dierprocedure
- Bereid een jongvolwassen mannelijke Wistar-rat voor op ongeveer 200-300 g lichaamsgewicht.
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor ratten met een lichaamsgewicht van ongeveer 200-300 g. Mannelijke ratten hebben de voorkeur omdat hormonale veranderingen tijdens de oestruscyclus bij vrouwelijke ratten de hepatocytenfunctie zullen beïnvloeden. - Anesthesie
- Trek het vereiste volume antistollingsmiddel heparine (5.000 IE/ml; 0,2 ml/100 g lichaamsgewicht) en rattenanesthesie ketamine/xylazinecocktail (37,5 mg/ml ketamine, 5 mg/ml xylazine; 0,2 ml/100 g lichaamsgewicht) op in spuiten van 1 ml met een naald van 27 g.
LET OP: Anesthesie en heparine zijn schadelijke stoffen. Wees voorzichtig bij het hanteren van scherpe voorwerpen. - Houd de rat in bedwang. Injecteer intraperitoneaal heparine gevolgd door ketamine / xylazinecocktail in het kwadrant rechtsonder in de buik.
OPMERKING: Het caecum heeft een grotere kans om zich aan de linkerkant te bevinden. Vermijd het doorboren van het caecum tijdens de injectie om het risico op besmetting te verminderen. - Controleer na 10 minuten de diepte van de anesthesie door de pedaalreflex op beide voeten van de rat te beoordelen. Blijf van tijd tot tijd controleren en wacht tot de rat niet langer reageert op teenknijpen. Extra anesthesie kan indien nodig worden geïnjecteerd.
- Trek het vereiste volume antistollingsmiddel heparine (5.000 IE/ml; 0,2 ml/100 g lichaamsgewicht) en rattenanesthesie ketamine/xylazinecocktail (37,5 mg/ml ketamine, 5 mg/ml xylazine; 0,2 ml/100 g lichaamsgewicht) op in spuiten van 1 ml met een naald van 27 g.
- Plaats de rat in rugligging met uitgestrekte ledematen op een met aluminiumfolie bedekt polystyreenplatform bovenop een dienblad. Plak de poten van de rat vast en speld de tape stevig op het platform met 27 G-naalden.
- Desinfecteer de borst en buik door ze te besproeien en te drenken met 70% ethanol. Scheren voorafgaand aan desinfectie is optioneel. Zet de rat in de motorkap. Ga verder met de volgende stap terwijl de vacht nog nat is.
OPMERKING: Drenken met 70% ethanol houdt ook huidschilfers en bontstof tot een minimum beperkt. - Scheid de huid van de spier.
- Met een paar tandweefseltangen in één hand, til de huid op in de buurt van de basis van de buik. Knip met een scherp-stompe chirurgische schaar in de andere hand de tenthuid. Duw het scherpe uiteinde van de schaar onder de huid en maak een middellijnincisie op de huid van net boven de achterpoten tot net onder de voorpoten.
- Terwijl u de huid optrekt en licht uitrekt met de tang, snijdt u elk bindweefsel af dat de huid op de spier in de borst en buik houdt. Om het risico op besmetting te verminderen, voorkomt u dat losse vacht op de spier valt. Om opgebouwde losse vacht op de schaar te verwijderen, veegt u ze af aan de gedesinfecteerde buitenkant van de huid.
- Maak laterale incisies op de huid, van de middellijn tot beide zijden van de rat iets boven de achterpoten en iets onder de voorpoten. Duw de flappen van de huid naar de zijkanten om de spier bloot te leggen.
- Snijd de buikspier open om de organen bloot te leggen.
- Met een nieuw paar tandweefseltangen in één hand, til de spier op in de buurt van de basis van de buik. Met een stompe chirurgische schaar in de andere hand, snijd voorzichtig door de spier zonder een van de organen te snijden. Maak een middellijnincisie op de spier van iets boven de achterpoten tot aan het borstbeen.
- Maak laterale incisies op de spier, van de middellijn naar beide zijden van de rat iets boven de achterpoten en net onder de ribbenkast, zonder een van de organen te snijden. Duw de spierflappen naar de zijkanten om de organen bloot te leggen. Zorg ervoor dat de laterale incisies van de huid en spier de zijkanten van de rat bereiken, zodat bloed en buffers bij latere stappen uit de buikholte kunnen stromen.
- Portalader cannulatie
- Duw met de achterkant van een gebogen tang de darmen voorzichtig naar rechts. Klap de leverlobben voorzichtig omhoog om de poortader bloot te leggen.
- Gebruik een 3-0 zijden chirurgische hechting om een zeer losse ligatuur te maken rond de poortader dicht bij de lever, net voordat de ader zich links en rechts in verschillende leverkwabben vertakt. Span de ligatuur niet aan om te voorkomen dat de bloedstroom door de poortader wordt verstoord. Een zeer dun membraan onder het galkanaal moet worden doorbroken met de punt van de gebogen tang voordat de hechting eronder kan passeren en rond de poortader (en galweg) kan worden gelust.
- Gebruik de uiteinden van twee paar gebogen tangen om voorzichtig een gat door het weefsel onder de poortader te prikken, zonder de poortader te beschadigen. Doe dit ongeveer 2-3 cm stroomopwaarts van de eerste ligatuur, vlak voordat de maagader zich vertakt van de poortader. Het weefsel is dunner op deze specifieke locatie.
- Rek het gat voorzichtig groter uit met de tang. Met dit gat kan de tang de poortader ondersteunen tijdens de cannulatie.
- Verlaag de pompsnelheid tot 4 rpm voor een debiet van ~3 ml/min. Zorg ervoor dat de uitstroom van calciumvrije buffer uit de IV-katheter wordt teruggebracht tot een langzaam infuus.
OPMERKING: Drukopbouw in de lever zal de dood van hepatocyten veroorzaken. Een lagere stroomsnelheid zou de drukopbouw in de lever moeten vertragen bij het succesvol inbrengen van de canule in de poortader bij een latere stap. - Ondersteun de poortader voorzichtig met een tang. Houd met de andere hand de infuuskatheter vast met de schuine kant van de naald naar boven gericht. Richt de naald in een hoek van 10-20° in de poortader en ga langzaam vooruit totdat de hele schuine kant zich in de ader bevindt. Zodra de naald correct in de poortader is ingebracht, begint de lever te blancheren en verliest hij zijn donkerrode kleur.
OPMERKING: De hele schuine kant van de naald moet in de ader worden ingebracht om een gat te maken dat groot genoeg is voor het inbrengen van de canule. Steek de naald echter niet te diep in om te voorkomen dat de ader te veel wordt doorboord. - Breng de canule over de naald en in de ader. Trek vervolgens de naald terug totdat deze 2-3 mm achter de canule is; net genoeg zodat de scherpe punt veilig in de canule zit. Gebruik de duim en middelvinger om de katheter vast te houden en gebruik de wijsvinger om de vleugel terug te trekken om de naald in te trekken.
- Bevestig de poortader snel op de katheter met een aderclip. Klem niet direct op het zijgat van de naald om te voorkomen dat de perfusaatstroom wordt verstoord. Klik er in plaats daarvan onder.
- Snijd onmiddellijk de infrahepatische inferieure vena cava (IVC) om drukopbouw in de lever te voorkomen. Inmiddels zullen de infrahepatische IVC en aangrenzende bloedvaten worden verduisterd door bloed uit de poortader. Om ervoor te zorgen dat de IVC correct werd gesneden en afgehakt, moet u letten op bloed dat in pulsen uitspat; bloed zal alleen uit aangrenzende bloedvaten druppelen.
OPMERKING: Het duurt te lang om de infrahepatische IVC te snijden na cannulatie of het niet snijden voordat u doorgaat naar de volgende stap, zal de dood van de hepatocyt veroorzaken. Het dier wordt onder narcose geëuthanaseerd door exsanguinatie (door het snijden van de IVC) tijdens deze stap. De procedure moet worden voortgezet terwijl het bloedverlies aan de gang is. De dood kan worden bevestigd door visuele observatie van het stoppen van de hartslag / ademhaling wanneer de borstholte bij een latere stap wordt geopend. - Verhoog de pompsnelheid tot 38 rpm voor een debiet van ~33 ml/min. Spoel de lever drie keer door de IVC met een tang voor 2-3 s (maar niet te lang) te sluiten en opnieuw te openen.
OPMERKING: Tijdens het spoelen zal de lever iets uitzetten voordat deze weer normaal wordt. Spoelen vergemakkelijkt de permeatie van perfusaat in de hele lever. Na het spoelen moet de lever volledig lichtbruin van kleur zijn. - Zorg ervoor dat de canulepunt vóór het punt wordt geplaatst waar de poortader zich vertakt in verschillende leverlobben, om perfusie van alle leverlobben te garanderen. Maak indien nodig de poortader los en pas de positie van de canule aan. Achteraf opnieuw knippen.
- Span de losse ligatuur rond de poortader aan, iets stroomopwaarts van het vertakkingspunt. Maak drie knopen op de plaats waar de zachte canule wordt ondersteund door de harde metalen naald, tussen de schuine kant en het zijgat. Zorg ervoor dat de knopen de canule op zijn plaats bevestigen, vastzetten aan de poortader en terugstroming van buffers voorkomen.
- Reseceer de hele lever intact.
- Perfuseer de lever met een calciumvrije buffer met een stroomsnelheid van ~ 33 ml / min gedurende de volgende 12 minuten (zie figuur 5A). Voer in de tussentijd leverresectie uit. De perfusietijd kan indien nodig worden verlengd, maar zorg ervoor dat de calciumvrije buffer niet opraakt.
- Maak met een gebogen schaar de poortader voorzichtig los van de darmen door het mesenterium te knippen dat ze met elkaar verbindt. Prik niet in het maagdarmkanaal (slokdarm, maag en dunne en dikke darm) om ervoor te zorgen dat er geen besmetting optreedt.
OPMERKING: Dit is om te voorkomen dat de poortader scheurt wanneer de lever tijdens de resectie wordt verplaatst. - Maak de lever los van het maagdarmkanaal door bindweefsels, pancreas en mesenterium te snijden dat de lever verbindt met het maagdarmkanaal. Om los te maken, knip altijd met een schaar en trek niet om te scheuren. Nogmaals, niet inkeping of snijd het maagdarmkanaal.
- Draai de lever voorzichtig naar beneden om het middenrif bloot te leggen. Knip het diafragma langs de wanden van de ribben. Zorg ervoor dat het grootste deel van het diafragma verbonden blijft met de lever. Pas op dat u de lever niet prikt of kneuzen.
- Zodra de borstholte is geopend, zijn twee kanalen te zien: de witachtige suprahepatische IVC aan de linkerkant en de gelige slokdarm aan de rechterkant. Klem de suprahepatische IVC en knip deze net boven de clip. Het knippen van de suprahepatische IVC is optioneel. Het voorkomt dat de borstholte onder water komt te staan.
OPMERKING: Visueel observeren voor het stoppen van de hartslag / ademhaling om de dood van dieren te bevestigen. - De slokdarm is omgeven door het middenrif. Om de slokdarm van het diafragma te isoleren, snijdt u het diafragma van rechts naar de slokdarm. Snijd alle resterende bindweefsels die de slokdarm en maag verbinden met de lever en het middenrif.
- Duw het maagdarmkanaal naar rechts weg. Breng de aderclip over van de suprahepatische IVC naar de infrahepatische IVC; buffer zal nu perfuseren uit de suprahepatische IVC.
OPMERKING: Tijdens de perfusie worden de canule en infrahepatische IVC bedekt door de lever. Sterke bufferuitstroom van de suprahepatische IVC zal de chirurg helpen om perfusielekkages uit te sluiten. - Snijd het resterende diafragma af dat de lever verbindt met de borstholte. Snijd weefsels af die de lever verbinden met de buikholte. Zorg ervoor dat u de infrahepatische IVC boven de clip niet snijdt om te voorkomen dat de clip van de lever wordt losgemaakt.
- Om ervoor te zorgen dat de lever volledig wordt gereseceerd, tilt u de lever voorzichtig op door het middenrif met een tang vast te houden. Als er resterende weefsels zijn die de lever met de buikholte verbinden, snijd ze dan af. Als de nier en milt nog steeds verbonden zijn met de lever, maak ze dan los.
4. Leverperfusie en spijsvertering
- Als de resectie vroeg is voltooid, wacht dan tot de lever gedurende 12 minuten is doordrenkt met calciumvrije buffer.
- Verander de perfusiebuffer in collagenasebuffer. Maak de rolklem voor collagenasebuffer volledig los voordat u de rolklem volledig aanspant voor een calciumvrije buffer (zie figuur 5B). Zodra de collagenasebuffer de lever bereikt via de slang, spoelt u de lever drie keer door de suprahepatische IVC gedurende 2-3 s te sluiten en opnieuw te openen.
- Verplaats de lever voorzichtig naar het stadium bovenop het bekerglas voor recirculatie van collagenasebuffer. Beweeg de lever door het diafragma vast te houden met een tang terwijl u de katheter ondersteunt. Vermijd trekken aan de katheter om onbedoeld losmaken van de katheter te voorkomen.
OPMERKING: Als de katheter losraakt en de poortader te beschadigd is voor herkansing, cannulaat dan de suprahepatische IVC en laat de buffer uit de poortader doordringen. Zorg ervoor dat de infrahepatische IVC geknipt blijft. - Verteer de lever gedurende 12 min. Let op het verschijnen van doorschijnende vlekken / netwerk als de lever zijn gladde bruine textuur begint te verliezen. De lever wordt groter en zachter naarmate het wordt verteerd. Zodra de lever een papperige consistentie heeft, stop dan met de perfusie. De verteringstijd kan indien nodig worden verlengd.
OPMERKING: Als de Glisson-capsule is gebroken, kan de collagenasebuffer in het bekerglas troebel worden als gevolg van ontsnapte levercellen.
5. Hepatocytenisolatie
- Verwijder de canule voorzichtig door de poortader af te snijden. Verwijder de clip voorzichtig. Breng de lever over in een schaal van 150 mm met 60 ml koude Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Tik zachtjes op de lever met behulp van de achterkant van de gebogen tang om de capsule van de Glisson te breken en af te pellen. Zwaai vervolgens voorzichtig de lever zij aan zij in DMEM om levercellen vrij te geven. Blijf dit doen totdat levercellen volledig zijn gedissocieerd in de DMEM.
OPMERKING: Af en toe wordt de hele lever of bepaalde lobben slechts gedeeltelijk verteerd. Door de lever niet te schrapen, die met geweld zal verwijderen en ongestoorde hepatocyten zal beschadigen, kan een hogere en consistentere levensvatbaarheid van de cel worden verkregen. - Schommel de 150 mm schaal voorzichtig totdat de levercellen goed verdeeld zijn in DMEM. Om weefselstukken en celklonten te verwijderen, giet u de celsuspensie door een nylon gaasfilter van 100 μm poriegrootte dat over een nieuwe schaal van 150 mm is geplaatst. Spoel de oude schaal af met 30 ml DMEM en breng de suspensie over naar het gaasfilter. Tik zachtjes op het gaasfilter om gevangen enkele levercellen door te laten.
- Verwijder het gaasfilter en schommel de nieuwe 150 mm schaal voorzichtig totdat de levercellen goed verdeeld zijn. Verdeel de ophanging gelijkmatig in buizen van 4 x 50 ml. Spoel de schaal af met 30 ml DMEM en verdeel de suspensie gelijkmatig in dezelfde buizen. Zorg ervoor dat elke buis een gelijk volume celsuspensie heeft.
- Centrifugeer de buizen van 4 x 50 ml celsuspensie bij 50 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Adem het supernatant voorzichtig op zonder de losse pellet te verstoren. Gooi het supernatant weg. Voeg 20 ml DMEM toe aan elke buis en schommel de buizen voorzichtig om de celkorrel opnieuw te conditioneren. Combineer de celsuspensie van vier buizen in twee.
- Centrifugeer de buizen van 2 x 50 ml bij 20 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Aspirateer en gooi het supernatant weg. Voeg 20 ml DMEM toe aan elke buis en schommel de buizen voorzichtig om de celkorrel opnieuw te conditioneren. Combineer celsuspensie van twee buizen tot één. Houd de cellen op ijs tot gebruik.
- Bereid trypan blauwe oplossing door 400 μL 1x PBS te mengen met 50 μL trypan blauw. Voeg 50 μL hepatocytensuspensie toe aan de trypanblauwe oplossing. Tel het aantal levensvatbare en dode hepatocyten met een hemocytometer onder de lichtmicroscoop.
6. Hepatocytencultuur
- Voer alle celkweekstappen in de kap uit. Voeg 1 ml collageen coatingoplossing toe in een schaal van 35 mm en incubeer gedurende 4 uur. Spoel de vaat drie keer af met 1x PBS.
- Verdun hepatocytensuspensie in hepatocytenkweekmedium tot een concentratie van 0,8 miljoen cellen/ml. Voeg 1 ml verdunde hepatocytensuspensie toe aan de schaal van 35 mm.
OPMERKING: Hepatocyten zijn gevoelig voor schuifspanning tijdens het pipetteren. Overweeg het gebruik van pipetpunten met brede boring. - Schommel het gerecht om de hepatocyten gelijkmatig te verdelen. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3-4 uur om de hepatocyten te laten hechten.
- Voor de sandwichcultuur.
- Verwijder het medium hepatocytenkweek. Spoel eenmaal met 1 ml hepatocytenkweekmedium om niet-gehechte cellen te verwijderen. Voeg 1 ml collageenoverlay-oplossing toe. Voeg collageenoverlay-oplossing toe aan de wanden van de schaal om te voorkomen dat er bubbels in de oplossing komen.
- Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende een nacht om collageengeilatie mogelijk te maken.
- Voeg 1 ml vers hepatocytenkweekmedium toe. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2.
- Voor monolayer cultuur.
- Verwijder na stap 6.3 het medium van de hepatocytenkweek. Spoel eenmaal met 1 ml hepatocytenkweekmedium om de niet-aangebonden cellen te verwijderen.
- Voeg 1 ml vers hepatocytenkweekmedium toe. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2.
- Beoordeel de zuiverheid en functie van hepatocyten door immunostaining uit te voeren voor hepatocytspecifieke marker- en functionele assays zoals eerder beschreven10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een chirurg kan zien of de leverperfusie soepel verloopt door de uitkomst na bepaalde stappen te observeren. De eerste uitkomst kan worden waargenomen bij cannulatie, het snijden van de infrahepatische IVC en het herstellen van de perfusiestroomsnelheid. De lever moet volledig van kleur zijn veranderd van donkerrood naar bruin, met behoud van het volume. Als de lever er enigszins leeggelopen uitziet en een roodachtige tint of vlekken rood heeft, betekent dit dat de perfusiestroomsnelheid verkeerd is ingesteld (te laag) of dat de poortader niet correct is gekannuleerd. Als de lever niet alleen bruin wordt, maar ook opgeblazen en stijf wordt, betekent dit dat de stroomsnelheid verkeerd is ingesteld (te hoog), of dat de infrahepatische IVC niet goed is gesneden. Als slechts een paar lobben niet goed worden doordrenkt, betekent dit dat de katheter te diep is ingebracht en slechts één tak van de poortader doordringt. De tweede uitkomst kan worden waargenomen na resectie en clipping van de infrahepatische IVC. Als de uitstroom uit de suprahepatische IVC langzaam en zwak is, kan dit betekenen dat de katheter tijdens de resectie is losgekomen of dat de infrahepatische IVC niet goed is geknipt. De derde uitkomst kan worden waargenomen tijdens de spijsvertering. Op de bruine lever moeten doorschijnende vlekken /netwerk verschijnen en vergroten. De lever moet zijn verende consistentie verliezen en zacht en papperig worden. We optimaliseren onze collagenaseconcentratie zodat deze toestand binnen 12 minuten kan worden bereikt. Bij het uitproberen van een nieuwe partij collagenase, moet de verteringstijd worden verlengd totdat deze toestand is bereikt. De vierde uitkomst kan worden waargenomen wanneer cellen uit de lever worden vrijgegeven. Wanneer de cellen worden vrijgegeven, moeten de media er troebel uitzien. Als er veel korrelige textuur wordt waargenomen, kan dit betekenen dat de lever onvoldoende is verteerd. Als de spijsvertering voltooid is, mogen alleen witte webachtige vaten overblijven. Zelfs als de vertering gedeeltelijk is (figuur 6) is het nog steeds mogelijk om goede cellen te verkrijgen.
Ons hier beschreven protocol genereert consequent een hogere celopbrengst van maximaal 5 × 108 hepatocyten per isolatie van ratten met een gewicht van 200-300 g en de levensvatbaarheid van de cel tussen 88% -94,8% zoals bepaald door trypan blauw tellen 12,13,14,15,16 (tabel 2). De zuiverheid van hepatocyten, bepaald door immunostaining van albumine, was 96,8 ± 2,0%11 (figuur 7). Hepatocyten in sandwichcultuur vormden verschillende galkanaaliculi en hadden goed cel-celcontact (figuur 8). De hepatocyten hebben een hoge functionaliteit zoals blijkt uit albumine-, ureum- en CYP-assays10 (tabel 3).
Figuur 1: Schematisch diagram van het IPS. Het perfusaat begint in de perfusate zak of fles (1, 2). Twee stroomregelaars (3, 4) werken samen om de doorgang van perfusaat te regelen. Perfusate gaat over tot een bellenval (5). Latere processen worden geregeld door het LCD-aanraakscherm (6) van het hoofdsysteem. Perfusaat wordt vervolgens getrokken door een peristaltische pomp (7) en gaat door een elektronische verwarming met siliconenmantel (8), die het perfusaat opwarmt tot de gewenste temperatuur. De siliconen kachelmantel (8) is verbonden met het hoofdsysteem door een connector (9). Indien nodig kan een wegwerpdruksensor (10) via een connector (11) op het hoofdsysteem worden aangesloten om de perfusiedruk te kunnen meten. Het perfusaat gaat vervolgens door een perfusiemonitor (12), die de temperatuur van het perfusaat meet en de aanwezigheid van bellen detecteert. De monitor kan ook bepalen of het perfusaat op is. Monitormetingen worden via LoRa naar het hoofdsysteem verzonden. Het perfusaat gaat vervolgens naar een bellenfilter (13) en komt de lever binnen via de poortadercanule (14). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schematisch diagram van de tweestaps collagenaseperfusie voor primaire rattenhepatocytenisolatie. (A) Perfusie van calciumvrije buffer. De rolklem is volledig losgemaakt voor inlaat 1 en volledig vastgedraaid voor inlaat 2. (B) Leververtering met collagenasebuffer. Gereseceerde lever wordt overgebracht naar de bovenkant van een bekerglas om bufferrecirculatie mogelijk te maken. De rolklem is volledig losgemaakt voor inlaat 2 en volledig vastgedraaid voor inlaat 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Lever na collagenasevertering en hepatocytenisolatie. Getoond is een gedeeltelijk verteerde leverkwab. Onverteerde delen van de lever bleven bruin. In verteerde delen van de lever bleven alleen witte vaten achter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Immunostaining van hepatocytische marker voor kwantificering van de zuiverheid van hepatocyten. (A) Sandwichcultuur van ongezuiverde levercelsuspensie (vóór differentiële centrifugatie; links) en gezuiverde hepatocytensuspensie (na differentiële centrifugatie; rechts) gezaaid bij lage celdichtheid. (B) Representatieve beelden tonen cellen gekleurd met DAPI (kern; blauw) en antilichaam tegen albumine (hepatocyt-specifieke marker; groen). (C) Kwantificering van de zuiverheid van hepatocyten. De zuiverheid werd bepaald door albuminepositieve fluorescerende gekleurde cellen te tellen in relatie tot het totale celgetal gevisualiseerd door DAPI-nucleaire kleuring. Beelden in valse kleuren werden getoond. Albumine (groen), kern van cellen met albumine (blauw), kern van cellen zonder albumine (rood). Schaalbalken 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Fasecontrastbeeld van geïsoleerde primaire rattenhepatocyten van tweestaps collagenaseperfusie in sandwichcultuur op dag 3. Schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van buffers/media | Eindconcentratie | Aantal | Opmerkingen/Beschrijving |
| Hepatocytencultuur media | |||
| William's E media | 500 ml | Voeg alle reagentia toe aan William's E media. Filter door een filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C. | |
| Bsa | 1mg/ml | 0,5 g | |
| Penicilline-Streptomycine (100X) | 1x | 5 ml | |
| Insuline (20 mg/ml) | 0,5 μg/ml | 12,5 μL | |
| Dexamethason (1 mM) | 100 nM | 50 μL | |
| Linolzuur (7,5 μg/ml) | 50 ng/ml | 3,33 μL | |
| Glutamax (100x) | 1x | 5 ml | |
| Collagenasebuffer | |||
| NaCl | 0,100 g | Los op in 380 ml ultrapuur water. Stel in op pH 7,49 - 7,51 met NaOH. Vul tot 400 ml aan met ultrapuur water. Filter door een filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C. | |
| Kcl | 0,789 g | ||
| Collagenase Type IV | 80 - 200 U/ml | ||
| CaCl2·2H2O | 0,140 g | ||
| Hepes | 4,800 g | ||
| Calciumvrije buffer | |||
| KH2PO4 | 0,0815 g | Los op in 900 ml ultrapuur water. Stel in op pH 7,49-7,51 met HCl. Top tot 1 L met ultrapuur water. Filter door een filter van 0,22 μm. | |
| NaHCO3 Zoekertjes | 1.0500 gr | ||
| NaCl | 3,4480 g | ||
| Kcl | 0,1750 g | ||
| DMEM voor celisolatie | |||
| Dmem | 1 zakje | Vul tot 1 L aan met ultrapuur water. Filter door een filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C. | |
| NaHCO3 Zoekertjes | 1,5 g | ||
| Penicilline-Streptomycine (100X) | 1x | 10 ml | |
| Collageen overlay (1 ml) | |||
| 0,1 M NaOH | 1 deel | 20,8 μL | Vers bereiden. Voeg als laatste collageen toe. |
| 10x pbs | 1 deel | 20,8 μL | |
| 1x pbs | 6 delen | 125 μL | |
| Hepatocytencultuur media | 32 delen | 667 μl | |
| Type I rundercollageen | 8 delen | 167 μL | |
| Collageen coating oplossing (1 ml) | |||
| Type I rundercollageen | 1 deel | 0,5 ml | Vers bereiden. |
| 0,01 N HCl | 1 deel | 0,5 ml | |
Tabel 1: Recepten voor buffers en oplossingen.
| Levensvatbaarheid van hepatocyten (%) | Opbrengst hepatocyten (x 108 cellen) | Levensvatbare hepatocytenopbrengst (x 108 cellen) |
| 91,4 ± 3,4 | 4,39 ± 1,58 | 4,04 ± 1,48 |
Tabel 2: Levensvatbaarheid en opbrengst van de cel. Waarden ± SD uit 18 verschillende experimenten worden getoond.
| Ureum (μg/miljoen cellen/dag) | Albumine (μg/miljoen cellen/dag) | CYP1A2-activiteit (μg/miljoen cellen/dag) | CYP2B1/2 activiteit (μg/miljoen cellen/dag) | CYP3B2-activiteit (μg/miljoen cellen/dag) | |
| Dag 1 | 124 ± 2,6 | 39,0 ± 3,6 | |||
| Dag 3 | 65,7 ± 3,8 | 516,0 ± 95,1 | 2249 ± 56 | 188 ± 49 | 93,7 ± 0,6 |
Tabel 3: Functionele niveaus van geïsoleerde primaire rattenhepatocyten in sandwichcultuur. Waarden ± SD van ureum, albumine, CYP1A2, CYP2B1/2 en CYP3B2-assays uit drie verschillende experimenten worden getoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een paar punten die bijzonder belangrijk zijn om in acht te nemen voor de tweestaps collagenaseperfusieprocedure in het algemeen. Ten eerste moet speciale zorg worden besteed bij het reseceren van de lever. Zorg ervoor dat het maagdarmkanaal niet wordt beschadigd, omdat lekkage van de inhoud zal leiden tot bacteriële besmetting. Vermijd bovendien beschadiging van de Glisson-capsule, die het oppervlak van de lever bedekt tijdens de dierprocedure. Als de scheur groot genoeg is, kan dit voortijdige afgifte van gedisassocieerde hepatocyten in de collagenasebuffer mogelijk maken. Ten tweede kan het vermogen van collagenase om de lever te verteren en tegelijkertijd een goede levensvatbaarheid van hepatocyten te garanderen, variëren per lotnummer. De gebruikte hoeveelheid collagenase moet worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe partij collagenase5. Het is raadzaam om een paar partijen collagenase te testen en de beste partij te selecteren voordat u in bulk koopt. Zorg ervoor dat het water ultrapuur is en dat de pH correct is. Onzuiverheden in het water zoals ijzer- en ijzerionen en de verkeerde pH kunnen de collagenase-activiteit beïnvloeden, wat vervolgens de kwaliteit van de geïsoleerde cellen drastisch zal beïnvloeden. Hoewel collagenasebufferrecirculatie in dit protocol optioneel kan zijn, is het niet aan te raden omdat het benodigde volume collagenasebuffer zal toenemen tot >400 ml. Ten slotte moeten de perfusiedruk en het debiet binnen een geschikt bereik liggen. Hoge druk en debiet zullen leiden tot leverceldood, terwijl lage druk en stroomsnelheid zullen resulteren in onvoldoende bufferstroom door de kleinere vaten10. Bij calciumvrije bufferperfusie zal de druk in eerste instantie stijgen. Bij collagenasebufferperfusie zal de druk echter in de loop van de tijd langzaam dalen, omdat de spijsvertering door collagenase de stroomweerstand vermindert. Als de drukval niet werd waargenomen, kan de vergistingstijd naar wens worden verlengd. Omdat de IPS de optionele druksensor heeft, is het mogelijk om het debiet van het perfusaat te variëren om drukvariaties te compenseren. Aan de andere kant, hoewel het spoelen van het circuit met een oxygenator werd gebruikt in sommige protocollen 2,5, ontdekten we dat het niet kritisch was voor de levensvatbaarheid en opbrengst van hepatocyten. Ons apparaat bevat dus geen oxygenator.
In tegenstelling tot de gebruikelijke praktijk van leververtering vóór resectie, omvat dit protocol resectie van de lever voorafgaand aan de spijsvertering. De aanpak in dit protocol heeft verschillende voordelen ten opzichte van de gangbare praktijk. Ten eerste kan oververtering van de lever worden vermeden. Afhankelijk van de vaardigheid van de chirurg kan leverresectie overal van 5-10 minuten duren. Volgens de gangbare praktijk, hoewel de perfusie is gestopt, komt dit nog steeds neer op een extra 5-10 minuten waar de lever wordt blootgesteld aan collagenase. Oververtering kan de levensvatbaarheid van de cel verminderen en de aanhechting en functie van hepatocyten verminderen. Ten tweede zou deze aanpak mogelijk het verlies van hepatocyten kunnen verminderen. De Glisson-capsule zal minder snel scheuren wanneer de lever nog steeds verend is voor de spijsvertering, vergeleken met wanneer deze zacht en papperig is na de spijsvertering. Ten slotte maakt resectie van de lever voorafgaand aan de spijsvertering de mogelijkheid van collagenase-recirculatie mogelijk. Collagenase-recirculatie elimineert het optreden van mislukte isolaties als gevolg van onvoldoende volume collagenase dat wordt voorbereid. Onze aanpak maakt het mogelijk om de verteringstijd te verlengen, indien nodig. Het heeft ook een klein voordeel van het verminderen van de hoeveelheid collagenase die nodig is per isolatie. Het grootste nadeel van deze aanpak is dat het halverwege de perfusie een nieuw probleem van katheterloslating introduceert, maar dat met enkele technische voorzorgsmaatregelen kan worden aangepakt. Een ander verschil is dat dit protocol geen gebruik maakt van dichtheidsgradiënt zoals Percoll. Door dode cellen te verwijderen, is gemeld dat Percoll de uiteindelijke levensvatbaarheid van cellen verhoogt met enig verlies van opbrengst, van 20% -50% 16. Onze cel levensvatbaarheid is hoog omdat we collagenase partijen testen en selecteren. Uit onze ervaring geven sommige collagenase-partijen consequent een lagere levensvatbaarheid. Zonder dichtheidscentrifugatie zal het nodig zijn om slechte collagenasepartijen te voorkomen door middel van voorafgaande tests. Voor degenen die niet over een dergelijke vrijheid beschikken en rekening moeten houden met dichtheidsgradiënt, moet tijdens percoll verdunning voorzichtigheid worden betracht om selectie van subpopulaties van hepatocyten met een iets ander metabolisch profiel te voorkomen17,18.
Onze aanpak bij het gebruik van een IPS voor primaire rattenhepatocytenisolatie lost verschillende problemen op met bestaande perfusie-opstellingen 1,2,5,6,7,8,9. Het gebruik van steriele wegwerpbuizen bespaart tijd door de noodzaak om perfusiebuizen voor en na elke isolatie te reinigen en te desinfecteren te verwijderen. Het vermindert brandgevaar omdat de perfusiebuis niet hoeft te worden gevuld met brandbare 70% ethanol wanneer deze niet wordt gebruikt om de steriliteit te behouden. Het risico op besmetting door onjuiste desinfectie en opslag kan ook worden geëlimineerd. Het belangrijkste is dat de noodzaak van routinematige vervanging van oude buizen kan worden omzeild; dit proces is essentieel, maar is vaak ingewikkeld en tijdrovend. De toevoeging van een bellenfilter aan de slang in de buurt van de katheter zorgt ervoor dat bellen kunnen ontsnappen voordat ze de katheter bereiken en voorkomt dat lucht doorlaat wanneer de perfusiebuffer opraakt. Het gebruik van een siliconen kachelmantel als temperatuurregelsysteem maakt nauwkeurig en stabiel onderhoud van de perfusaattemperatuur tijdens de spijsvertering mogelijk, in tegenstelling tot voorverwarmde buffers die na verloop van tijd aanzienlijk zullen afkoelen. Bovendien is de siliconen kachelmantel compact en gemakkelijk te onderhouden, in tegenstelling tot een glazen mantel gekoppeld aan een waterbadcirculatiepomp. Het gebruik van bewakingssensoren voor temperatuur en druk vervangt de optimalisatiestap vóór isolatie. Temperatuurschommelingen kunnen optreden tijdens of tussen experimenten. De druk (en dus het debiet) kan ook veranderen als gevolg van problemen met perfusiebuizen. Plaatsing van sensoren in de buurt van de canule maakt een nauwkeurigere aflezing van de temperatuur van de buffer in de lever mogelijk. Sensoralarmen kunnen de gebruiker eraan herinneren corrigerende maatregelen te nemen. Het opgenomen logboek maakt het ook mogelijk om problemen op te lossen. Het gebruik van een speciale IV-katheter voor cannulatie vereenvoudigt de cannulatie van de poortader. In tegenstelling tot andere soorten infuuskatheters, maakt de hier beschreven katheter een vloeiende communicatie mogelijk tussen de canule en de slang in zowel de prikkende als de ingetrokken naaldpositie als gevolg van een gat aan de zijkant van de naald. Chirurgen kunnen dus kleurverandering van de lever gebruiken als een teken van succesvolle cannulatie. Bij succesvolle cannulatie kan de naaldpunt achter de kathetertip worden ingetrokken om te voorkomen dat de poortader opnieuw wordt doorboord. De ingetrokken naald kan ook fungeren als basis voor de ligatuur om de poortader op de zachte canule te bevestigen en te voorkomen dat deze wordt vervormd. Deze katheter kan met één hand worden bediend; daarom kan de niet-dominante hand worden gebruikt om de poortader met een tang te ondersteunen. Het compacte geïntegreerde ontwerp maakt het mogelijk om het hele perfusieapparaat in de laminaire kap te plaatsen, waardoor het risico op besmetting wordt verminderd en ruimte wordt bespaard. Dit is vooral belangrijk als de dierprocedure moet worden uitgevoerd in een speciale dierenfaciliteit waar de beschikbaarheid van ruimte een uitdaging kan zijn.
In vergelijking met eerder gerapporteerde rathepatocytenisolatieprotocollen met behulp van de tweestaps collagenaseperfusieprocedure1, genereren de beschreven aandoeningen consequent een hogere celopbrengst van maximaal 5 x 108 hepatocyten per isolatie, cel levensvatbaarheid tussen 88% -94,8% en een goede hepatocytenspecifieke functie.
Dit protocol kan tegelijkertijd worden gebruikt om andere niet-parenchymale levercellen zoals Kupffer-cellen, lever endotheelcellen en leversteraatcellen van dezelfde rat te isoleren. Dit protocol kan ook worden aangepast voor de isolatie van levercellen van muizen door een kleinere iv-katheter te gebruiken voor cannulatie en het perfusiedebiet te verlagen tot een bereik dat geschikt is voor muissoort6. De perfusieprocedure voor muizen kan worden vereenvoudigd door de lever na de spijsvertering te reseceren.
Het IPS-apparaat dat in dit experiment wordt gebruikt, kan ook worden gebruikt voor ex vivo leverperfusietoepassingen, zoals experimenten met levertransplantatie en decellularisatie van knaagdieren en afgedankte menselijke levers19,20. De IPS heeft een voordeel waarbij de lever gedurende lange perioden moet worden toegediend, omdat de IPS de perfusieomstandigheden in realtime kan volgen en stopzetting van de perfusie na voltooiing automatisch of handmatig met afstandsbediening mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Zhou Yan en Hanry Yu verklaren concurrerende belangen omdat ze aandelen hebben in Vasinfuse, dat het geïntegreerde perfusiesysteem produceert en op de markt brengt. Hanry Yu heeft aandelen in Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate en Synally Futuristech die geen concurrerende belangen hebben met de hier gerapporteerde informatie.
Acknowledgments
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mechanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); en Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Project Numbers IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 en MedCaP-LOA-18-02) financiering aan Hanry Yu. Ng Chan Way is een onderzoeker van de National University of Singapore. We willen graag confocale microscopie-eenheid en flowcytometrie-eenheid van de National University of Singapore bedanken voor hulp en advies bij de zuiverheidsanalyse van hepatocyten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
