Summary
Denne protokol beskriver brugen af et specielt intravenøst kateter, standardiseret steril engangsslange, temperaturregulering suppleret med realtidsovervågning og et alarmsystem til to-trins kollagenaseperfusionsprocedure for at forbedre konsistensen i levedygtigheden, udbyttet og funktionaliteten af isolerede primære rotte hepatocytter.
Abstract
Primære hepatocytter anvendes i vid udstrækning i grundforskning i leversygdomme og til toksicitetstest in vitro. To-trins collagenase perfusionsproceduren for primær hepatocytisolering er teknisk udfordrende, især i portalvene kanylering. Proceduren er også tilbøjelig til lejlighedsvis forurening og variationer i perfusionsbetingelser på grund af vanskeligheder med montering, optimering eller vedligeholdelse af perfusionsopsætningen. Her præsenteres en detaljeret protokol for en forbedret to-trins kollagenaseperfusionsprocedure med multiparameterperfusionskontrol. Primære rotte hepatocytter blev med succes og pålideligt isoleret ved at tage de nødvendige tekniske forholdsregler ved kritiske trin i proceduren og ved at reducere driftsvanskelighederne og afbøde variabiliteten af perfusionsparametre gennem vedtagelse af et specielt intravenøst kateter, standardiseret steril engangsslange, temperaturkontrol og realtidsovervågnings- og alarmsystem. De isolerede primære rotte hepatocytter udviser konsekvent høj cellelevedygtighed (85%-95%), udbytte (2-5 x 108 celler pr. 200-300 g rotte) og funktionalitet (albumin, urinstof og CYP-aktivitet). Proceduren blev suppleret med et integreret perfusionssystem, som er kompakt nok til at blive sat op i den laminære flowhætte for at sikre aseptisk drift.
Introduction
Primære hepatocytter er vigtige værktøjer til leverrelateret grundforskning, sygdomsbehandling og anvendelse såsom lægemiddeltestning. Den nuværende guldstandard for primær hepatocytisolering er to-trins collagenase perfusionsprocedure 1,2,3 introduceret af Seglen i 1970'erne4. Denne procedure er imidlertid teknisk udfordrende og har en høj fejlrate, når den udføres af nybegyndere. Selv når en perfusion betragtes som vellykket, kan der observeres drastiske forskelle i hepatocyts levedygtighed (typisk 60%-95%) og udbytte (0,5-5 x 108 pr. 200-300 g rotte) mellem isolationer. Dette påvirker kvaliteten og omfanget af downstream-eksperimenter. Bortset fra den tekniske procedure er perfusionsopsætningen, der anvendes til isoleringen, enten kommercielt tilgængelig eller specialbygget, en medvirkende faktor. Der skal lægges vægt på montering, optimering og vedligeholdelse af perfusionsopsætningen. Formålet med denne protokol er at forbedre succesraten og stabiliteten mellem isolationer af primære rotte hepatocytter gennem multiparameter perfusionskontrol af den tekniske procedure og perfusionsopsætning af to-trins kollagenaseperfusionsproceduren.
Fra det tekniske aspekt er det sværeste trin i proceduren portalvene kanyleringen. Hvad angår de andre trin, kan isolationens stabilitet forbedres, hvis god praksis overholdes, og der træffes generelle forholdsregler. Derfor er forståelsen af begrundelsen for hvert trin vigtig, så kirurgen kan reagere på forskellige variabler, der kan opstå under proceduren.
Forskellige protokoller for isolering af hepatocytter og lever ikke-parenkymale celler fra rotte og mus er blevet offentliggjort 1,2,5,6,7,8,9. Perfusionsopsætningerne, der blev anvendt i disse protokoller, havde flere ulemper, som omfatter genbrug af perfusionsrør, problemer med temperaturregulering, behov for rutinemæssig optimering af perfusionsparametre og / eller brug af uegnet type intravenøst (IV) kateter til portalvene kanylet. Genbrug af perfusionsrør vil øge chancerne for forurening, især hvis slangen ikke blev rengjort og desinficeret korrekt. Genbrug af slanger uden rutinemæssig udskiftning vil også udsætte perfusionsopsætningen for problemer som utætte slanger eller stik, tilstoppet boblefælde og indsnævret slange, som alle vil reducere perfusattrykket og strømningshastigheden betydeligt og dermed påvirke leverfordøjelseseffektiviteten. Uden en konstant varmekilde i nogle opsætninger til temperaturregulering vil forvarmede buffere køle ned over tid, hvilket fører til lav kollagenaseaktivitet og fordøjelse. Selvom andre opsætninger bruger en kappeglaskondensator, der er forbundet til en vandcirkulationspumpe for at opvarme bufferen, er de omfangsrige og kræver omhyggelig rengøring. Temperatur, tryk og strømningshastighed for buffer, der forlader kateteret, skal måles og optimeres inden isolationens start for at sikre stabil perfusionstilstand. Selv efter optimering kan parametrene stadig ændre sig halvvejs under isolering på grund af operatørens handlinger, hvilket fører til suboptimal perfusion og fordøjelse. De fleste typer IV-kateter er ikke egnede til portalvenekanskulering, fordi de ikke tillader kontinuerlig perfusion under kanylering. De er ikke i stand til straks at informere kirurgen, når kanyleringen er vellykket. Desuden er det udfordrende at fastgøre portalvenen på det bløde kateter uden at deformere det.
Her løser vi disse problemer ved hjælp af standardiserede engangssterile slanger, en silikonevarmerkappe til præcis og stabil temperaturkontrol, realtidsovervågnings- og alarmsystem med datalagring og styring og brug af et specielt IV-kateter, som muliggør kontinuerlig perfusion, mens du punkterer portalvenen under kanylering. Efter vores bedste overbevisning er vi den første gruppe, der kombinerer alle disse funktioner i et integreret perfusionssystem (IPS), der er kompakt, hvilket gør det meget bærbart og i stand til at passe ind i en laminær flowhætte for at sikre aseptisk drift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer og stalde blev udført under protokolnummer R15-0027 og R19-0669 i overensstemmelse med kravene fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved National University of Singapore.
1. Fremstilling af opløsninger og kirurgiske instrumenter
- Forbered buffere og cellekulturmedier i tabel 1 ved hjælp af ultrarent vand.
- Forvarm den calciumfrie buffer og kollagenasebufferen til 37 °C i et vandbad inden brug.
- Autoklave følgende kirurgiske instrumenter og laboratorieudstyr: et par skarpe-stump kirurgiske saks, et par stump-stump kirurgisk saks, et par buede kirurgiske saks, to par tandvævspinc, to par buede tang, to veneklip, en 5 cm lang 3-0 silke kirurgisk sutur, et 100 μm nylonnetfilter, et 400 ml bægerglas, og et trin (flydende mikrocentrifugerørstativ).
2. Opsætning af IPS (se figur 1)
- Tør den laminære flowhætte af med 70 % ethanol. Tør IPS'en af med 70% ethanol, og flyt den ind i den laminære flowhætte. Steriliser med UV i >15 min, før emhætten tændes.
FORSIGTIG: Udsættelse for UV-lys kan forårsage smertefulde øjne og hudforbrændinger. Sørg for, at rammen er helt lukket, når UV-lyset tændes. - Saml et nyt sæt engangsslanger på IPS. Pak slangen nedstrøms for den peristaltiske pumpe i en silikonevarmerkappe. Saml perfusionsmonitoren på slangen nedstrøms for silikonevarmerkappen.
- Sørg for, at rulleklemmerne til begge slangeindløb løsnes helt. Tilslut hvert slanges indløb til den koniske ende af en steril 2 ml aspirationspipette. Efterlad både aspirationspipetter (indløb) og IV-kateteret (udløbet) i en 1 L flaske med calciumfri buffer for at muliggøre recirkulation af bufferen under efterfølgende grundtrin.
Figur 2: Selvtestgrænseflade. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Tænd IPS. Udfør følgende handlinger på kontrolpanelet på den berøringsfølsomme skærm. Softwaren udfører en omfattende selvtest, hver gang den startes.
FORSIGTIG: IPS er et elektrisk udstyr, der er tilsluttet en ekstern strømkilde. Væskeudslip på IPS eller strømkabler kan skabe elektriske farer.- Sørg for, at selvteststatus vises på skærmen (figur 2). Komponenter, der har bestået selvtesten, vises med grønt; dem, der har fejlet, vises med rødt. Efter rettelse skal du trykke på ikonet Test for at gentage selvtesten igen eller trykke på Enter System ikon for at komme direkte ind i betjeningsgrænsefladen.
- Tryk et vilkårligt sted på skærmen for at logge ind på betjeningsgrænsefladen.
- I øverste venstre hjørne af betjeningsgrænsefladen (figur 3) skal du trykke på et af de cirkulære pilikoner for at indstille rotationsretningen for den peristaltiske pumpe. I højre panel af grænsefladen skal du trykke på pil op / ned ikoner for at indstille værdier for de tilsvarende parametre. Indstil flowet til konstant flowtilstand; varmelegemets temperatur til 42 °C (justeres for at sikre, at perfusatets temperatur holdes på 37 °C) og pumpehastighed til 38 o / min for en strømningshastighed på ~ 33 ml / min.
- I nederste højre panel i betjeningsgrænsefladen skal du kontrollere, om boblealarmen, perfusionsstopalarmen og mute-ikonet er slået fra.
- Kontroller for temperaturen, trykket og strømningshastigheden af perfusatet i venstre panel. Indstil intervallerne manuelt ved at klikke på pil op og ned øverst og nederst i kolonnerne. Kontrollér, om der vises data i realtid som værdier midt i kolonnerne. Kolonnens farve skifter fra grøn til rød, hvis realtidsdataene bevæger sig ud over det indstillede område.
- Find ikonerne for at starte, pause og stoppe perfusionen og ikonet for at skifte fra realtidsdatavisning til diagramtilstand i midterpanelet. Tryk på startikonet for at starte perfusionen og prime slangen med calciumfri buffer. Der oprettes en ny logfil. Indtast filnavnet og brugernavnet i popup-vinduet (figur 4).
Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Popup-vindue, der beder om filnavn og brugernavn.
- Fyld dryppekammeret til halvt fyldt. Sørg for, at der ikke er fanget luftlommer i slangen under grunding.
- Fjern enhver boble, der dannes nedstrøms for boblefilteret, ved at svirpe på slangen for at løsne boblen og lade den skylles ud.
BEMÆRK: Der kan dannes bobler langs slangen, når bufferen opvarmes af varmelegemets kappe. - Fyld et 400 ml bægerglas med 200 ml kollagenasebuffer. Sæt scenen oven på bægerglasset. Uden at indføre luft i slangen skal du stramme rulleklemmen til et af slangeindløbene helt og flytte aspirationspipetten til indsugningen i bægerglasset.
3. Dyreforsøg
- Forbered en ung voksen mandlig Wistar-rotte omkring 200-300 g i kropsvægt.
BEMÆRK: Denne protokol blev optimeret til rotter omkring 200-300 g i kropsvægt. Hanrotter foretrækkes, da hormonelle ændringer under østruscyklussen hos hunrotter vil påvirke hepatocytfunktionen. - Anæstesi
- Udtræk det krævede volumen antikoagulerende heparin (5.000 IE/ml; 0,2 ml/100 g kropsvægt) og rotteanæstesi ketamin/xylazincocktail (37,5 mg/ml ketamin, 5 mg/ml xylazin; 0,2 ml/100 g kropsvægt) i 1 ml sprøjter med 27 G nål.
FORSIGTIG: Anæstesi og heparin er skadelige stoffer. Vær forsigtig, når du håndterer skarpe. - Begræns rotten. Intraperitonealt injicere heparin efterfulgt af ketamin / xylazin cocktail i den nederste højre kvadrant af maven.
BEMÆRK: Caecum har en højere sandsynlighed for at være placeret til venstre. Undgå at punktere cækummet under injektionen for at reducere risikoen for kontaminering. - Efter 10 minutter skal du kontrollere dybden af anæstesi ved at vurdere pedalrefleks på begge fødder af rotten. Fortsæt med at kontrollere fra tid til anden og vent, indtil rotten ikke længere reagerer på tåklemme. Yderligere anæstesi kan injiceres efter behov.
- Udtræk det krævede volumen antikoagulerende heparin (5.000 IE/ml; 0,2 ml/100 g kropsvægt) og rotteanæstesi ketamin/xylazincocktail (37,5 mg/ml ketamin, 5 mg/ml xylazin; 0,2 ml/100 g kropsvægt) i 1 ml sprøjter med 27 G nål.
- Placer rotten i liggende stilling med udstrakte lemmer på en aluminiumsfoliedækket polystyrenplatform oven på en bakke. Tape rottens fødder og fastgør båndet sikkert på platformen med 27 G nåle.
- Desinficer brystet og maven ved at sprøjte og dryppe dem med 70% ethanol. Barbering før desinfektion er valgfri. Sæt rotten i emhætten. Fortsæt det næste trin, mens pelsen stadig er våd.
BEMÆRK: Drenching med 70% ethanol holder også skæl og pelsstøv på et minimum. - Adskil huden fra musklen.
- Med et par tandvævspink i den ene hånd løftes huden nær bunden af maven. Skær telthuden med en skarp stump kirurgisk saks i den anden hånd. Skub den skarpe ende af saksen under huden og lav et midterlinjesnit på huden fra lige over bagbenene til lige under forbenene.
- Mens du trækker op og let strækker huden med tangen, skal du skære ethvert bindevæv, der holder huden på musklen i brystet og maven. For at reducere risikoen for forurening skal du forhindre løs pels i at falde ned på musklen. For at fjerne opbygget løs pels på saksen skal du tørre dem af på den desinficerede yderside af huden.
- Lav laterale snit på huden, fra midterlinjen til begge sider af rotten lidt over bagbenene og lidt under forbenene. Skub hudens klapper til siderne for at udsætte musklen.
- Skær op i mavemusklen for at udsætte organerne.
- Med et nyt par tandvævspink i den ene hånd skal du løfte musklen nær bunden af maven. Med en stump stump kirurgisk saks i den anden hånd skæres forsigtigt gennem musklen uden at nikke nogen af organerne. Lav et midterlinjesnit på musklen fra lidt over bagbenene til brystbenet.
- Lav laterale snit på musklen, fra midterlinjen til begge sider af rotten lidt over bagbenene og lige under ribbenburet uden at nikke nogen af organerne. Skub muskelklapperne til siderne for at udsætte organerne. Sørg for, at de laterale snit i hud og muskel når rottens sider for at tillade blod og buffere at strømme ud fra bughulen ved senere trin.
- Portal vene kanylering
- På bagsiden af buede tang skal du forsigtigt skubbe tarmene til højre. Vend forsigtigt leverlobberne op for at udsætte portalvenen.
- Brug en 3-0 silke kirurgisk sutur til at lave en meget løs ligatur omkring portalvenen tæt på leveren, lige før venen forgrener sig til venstre og højre ind i forskellige leverlapper. Stram ikke ligaturen for at undgå at forstyrre blodgennemstrømningen gennem portalvenen. En meget tynd membran under galdegangen skal brydes igennem med spidsen af den buede tang, før suturen kan passere nedenunder og sløjfes rundt om portalvenen (og galdegangen).
- Brug spidserne af to par buede tang til forsigtigt at punktere et hul gennem vævet under portalvenen uden at beskadige portalvenen. Gør dette ca. 2-3 cm opstrøms for den første ligatur, lige før mavevenen forgrener sig fra portalvenen. Vævet er tyndere på dette specifikke sted.
- Stræk forsigtigt hullet større med tangen. Dette hul gør det muligt for tangen at understøtte portalvenen under kanylering.
- Reducer pumpehastigheden til 4 omdr./min. for en strømningshastighed på ~ 3 ml / min. Sørg for, at udstrømningen af calciumfri buffer fra IV-kateteret reduceres til et langsomt dryp.
BEMÆRK: Trykopbygning i leveren vil forårsage hepatocytdød. En lavere strømningshastighed bør bremse trykopbygningen i leveren efter en vellykket indsættelse af kanylen i portalvenen på et senere trin. - Støt forsigtigt portalvenen op ved hjælp af tang. Med den anden hånd skal du holde fast i IV-kateteret med nålens skråning vendt op. Ret nålen ind i portalvenen i en 10-20 ° vinkel og gå langsomt frem, indtil hele skråningen er inde i venen. Når nålen er indsat korrekt i portalvenen, begynder leveren at blanchere og miste sin mørkerøde farve.
BEMÆRK: Hele nålens kant skal indsættes i venen for at skabe et hul, der er stort nok til indsættelse af kanylen. Indsæt dog ikke nålen for dybt ind for at undgå at punktere venen for meget. - Fremryk kanylen over nålen og ind i venen. Træk derefter nålen tilbage, indtil den er 2-3 mm bag kanylen; lige nok, så den skarpe spids er sikkert inde i kanylen. Brug tommelfingeren og langfingeren til at holde fast i kateteret, og brug pegefingeren til at trække vingen tilbage for at trække nålen tilbage.
- Fastgør hurtigt portalvenen på kateteret med en veneklemme. Klip ikke direkte på nålens sidehul for at undgå at forstyrre perfusatstrømmen. Klip i stedet under det.
- Skær straks den infrahepatiske ringere vena cava (IVC) for at forhindre trykopbygning i leveren. På nuværende tidspunkt vil den infrahepatiske IVC og tilstødende blodkar blive skjult af blod fra portalvenen. For at sikre, at IVC blev korrekt skåret og afskåret, skal du observere for blod, der sprøjter ud i impulser; blod vil kun sive ud fra tilstødende kar.
BEMÆRK: Hvis du tager for lang tid at skære den infrahepatiske IVC efter kanylering eller manglende skæring af den, før du går videre til næste trin, vil det forårsage hepatocytdød. Dyret aflives under anæstesi ved ekssanguinering (gennem skæring af IVC) under dette trin. Proceduren bør fortsætte, mens blodtab er i gang. Døden kan bekræftes ved visuel observation af ophør af hjerteslag/åndedræt, når brysthulen åbnes på et senere trin. - Forøg pumpehastigheden til 38 omdr./min. for en strømningshastighed på ~ 33 ml / min. Skyl leveren tre gange ved at lukke IVC med tang i 2-3 s (men ikke for længe) og åbn den igen.
BEMÆRK: Under skylning vil leveren udvide sig lidt, før den vender tilbage til normal. Skylning letter gennemtrængningen af perfusat gennem hele leveren. Efter skylning skal leveren være helt lysebrun i farven. - Sørg for, at kanylespidsen placeres før det punkt, hvor portalvenen forgrener sig i forskellige leverlapper for at sikre perfusion af alle leverlapper. Fjern om nødvendigt portalvenen og juster kanylens position. Klip igen bagefter.
- Stram den løse ligatur omkring portalvenen lidt opstrøms for forgreningspunktet. Lav tre knuder på, hvor den bløde kanyle understøttes af den hårde metalnål, mellem skrå og sidehullet. Sørg for, at knuderne fastgør kanylen på plads, fastgør den til portalvenen og forhindrer tilbagestrømning af buffere.
- Resekter hele leveren intakt.
- Perfuser leveren med calciumfri buffer ved en strømningshastighed på ~33 ml/min i de næste 12 minutter (se figur 5A). I mellemtiden skal du udføre leverresektion. Perfusionstiden kan forlænges, hvis det er nødvendigt, men sørg for, at den calciumfrie buffer ikke løber tør.
- Brug et par buede saks til forsigtigt at løsne portalvenen fra tarmene ved at skære mesenteriet, der forbinder dem sammen. Nick ikke mave-tarmkanalen (spiserør, mave og små og tyktarmen) for at sikre, at der ikke opstår forurening.
BEMÆRK: Dette er for at forhindre portalvenen i at rive, når leveren flyttes rundt under resektion. - Fjern leveren fra mave-tarmkanalen ved at skære bindevæv, bugspytkirtel og mesenteri, der forbinder leveren med mave-tarmkanalen. For at løsne skal du altid skære med en saks og ikke trække for at rive. Igen må du ikke nick eller skære mave-tarmkanalen.
- Vend forsigtigt leveren ned for at udsætte membranen. Skær membranen efter ribbenens vægge. Sørg for, at det meste af membranen forbliver forbundet med leveren. Pas på ikke at stikke eller blå mærke leveren.
- Når brysthulen er åbnet, kan to kanaler ses: den hvidlige suprahepatiske IVC til venstre og den gullige spiserør til højre. Klip den suprahepatiske IVC og klip den lige over klippet. Klipning af den suprahepatiske IVC er valgfri. Det forhindrer brysthulen i at blive oversvømmet.
BEMÆRK: Observer visuelt for ophør af hjerteslag / åndedræt for at bekræfte dyredød. - Spiserøret er omgivet af membranen. For at isolere spiserøret fra membranen skal du skære gennem membranen fra højre mod spiserøret. Skær eventuelle resterende bindevæv, der forbinder spiserøret og maven med leveren og membranen.
- Skub mave-tarmkanalen væk til højre. Overfør veneklemmen fra den suprahepatiske IVC til den infrahepatiske IVC; buffer vil nu perfuse ud fra den suprahepatiske IVC.
BEMÆRK: Under perfusion vil kanylen og infrahepatisk IVC blive dækket af leveren. Stærk bufferudstrømning fra den suprahepatiske IVC vil hjælpe kirurgen med at udelukke perfusionslækager. - Skær eventuel resterende membran, der forbinder leveren med brysthulen. Afskær væv, der forbinder leveren med bukhulen. Pas på ikke at klippe den infrahepatiske IVC over clipsen for at undgå at løsne clipsen fra leveren.
- For at sikre, at leveren er fuldstændig resekteret, skal du forsigtigt løfte leveren ved at holde fast i membranen med tang. Hvis der er resterende væv, der forbinder leveren med bukhulen, skal du afskære dem. Hvis nyrerne og milten stadig er forbundet med leveren, skal du løsne dem.
4. Leverperfusion og fordøjelse
- Hvis resektionen blev afsluttet tidligt, skal du vente, indtil leveren er blevet perfuseret med calciumfri buffer i 12 minutter.
- Skift perfusionsbufferen til kollagenasebuffer. Løsn rulleklemmen helt for kollagenasebuffer, før rulleklemmen strammes helt for calciumfri buffer (se figur 5B). Når kollagenasebufferen når leveren gennem slangen, skylles leveren tre gange ved at lukke den suprahepatiske IVC i 2-3 s og genåbne den.
- Flyt forsigtigt leveren til scenen oven på bægerglasset for recirkulation af kollagenasebuffer. Flyt leveren ved at holde fast i membranen med tang, mens du støtter kateteret. Undgå at trække i kateteret for at forhindre utilsigtet kateterløsning.
BEMÆRK: Hvis kateteret løsner sig, og portalvenen er for beskadiget til re-kanylering, kan du kanuere den suprahepatiske IVC og lade bufferen perfuse ud fra portalvenen. Sørg for, at den infrahepatiske IVC forbliver klippet. - Fordøje leveren i 12 min. Overhold for udseendet af gennemskinnelige pletter / netværk, da leveren begynder at miste sin glatte brune tekstur. Leveren bliver større og blødere, når den bliver fordøjet. Når leveren har en grødet konsistens, skal du stoppe perfusionen. Fordøjelsestiden kan forlænges, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Hvis Glissons kapsel er blevet brudt, kan kollagenasebufferen i bægerglasset blive overskyet på grund af undslupne leverceller.
5. Hepatocytisolering
- Fjern forsigtigt kanylen ved at afskære portalvenen. Fjern forsigtigt clipsen. Overfør leveren til et 150 mm fad indeholdende 60 ml kold Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Tryk forsigtigt på leveren ved hjælp af bagsiden af den buede tang for at bryde og skrælle Glissons kapsel af. Derefter svinges leveren forsigtigt fra side til side i DMEM for at frigive leverceller. Fortsæt med at gøre dette, indtil leverceller er helt dissocieret i DMEM.
BEMÆRK: Lejlighedsvis vil hele leveren eller visse lapper kun blive delvist fordøjet. Ved ikke at skrabe leveren, som med magt vil fjerne og beskadige udisk-adskilte hepatocytter, kan der opnås en højere og mere konsistent cellelevedygtighed. - Rock forsigtigt 150 mm skålen, indtil levercellerne er fordelt godt i DMEM. For at fjerne vævsstykker og celleklumper hældes cellesuspensionen gennem et nylonnetfilter i porestørrelse på 100 μm placeret over en ny 150 mm skål. Skyl den gamle skål med 30 ml DMEM og overfør suspensionen til maskefilteret. Tryk forsigtigt på maskefilteret for at tillade fangede enkeltleverceller at passere igennem.
- Fjern netfilteret, og ryk forsigtigt det nye 150 mm fad, indtil levercellerne er fordelt godt. Opdel suspensionen ligeligt i 4 x 50 ml rør. Skyl fadet med 30 ml DMEM og del suspensionen ligeligt i de samme rør. Sørg for, at hvert rør har et lige stort volumen cellesuspension.
- Centrifugering af cellesuspensionens 4 x 50 ml rør ved 50 x g i 2 minutter ved 4 °C. Aspirer forsigtigt supernatanten uden at forstyrre den løse pellet. Kassér supernatanten. Tilsæt 20 ml DMEM i hvert rør og rock forsigtigt rørene for at resuspend cellepillen. Kombiner cellesuspensionen fra fire rør til to.
- Centrifugering af 2 x 50 ml-rørene ved 20 x g i 2 minutter ved 4 °C. Aspirer og kassér supernatanten. Tilsæt 20 ml DMEM i hvert rør og rock forsigtigt rørene for at resuspend cellepillen. Kombiner cellesuspension fra to rør til et. Opbevar cellerne på is indtil brug.
- Forbered trypanblå opløsning ved at blande 400 μL 1x PBS med 50 μL trypanblå. Tilsæt 50 μL hepatocytsuspension i den trypanblå opløsning. Tæl antallet af levedygtige og døde hepatocytter med et hæmocytometer under lysmikroskopet.
6. Hepatocytkultur
- Udfør alle cellekulturtrin i emhætten. Tilsæt 1 ml kollagenbelægningsopløsning i en 35 mm skål og inkuber i 4 timer. Skyl opvasken tre gange med 1x PBS.
- Fortynd hepatocytsuspension i hepatocytkulturmedium til en koncentration på 0,8 millioner celler / ml. Tilsæt 1 ml fortyndet hepatocytsuspension i 35 mm fadet.
BEMÆRK: Hepatocytter er følsomme over for forskydningsspænding under pipettering. Overvej at bruge pipettespidser med bred boring. - Rock skålen for at fordele hepatocytterne jævnt. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 3-4 timer, så hepatocytterne kan sætte sig fast.
- Til sandwichkultur.
- Fjern hepatocytkulturmedium. Skyl en gang med 1 ml hepatocytkulturmedium for at fjerne ikke-fastgjorte celler. Tilsæt 1 ml kollagenoverlejringsopløsning. Tilsæt kollagenoverlejringsopløsning på skålens vægge for at undgå at indføre bobler i opløsningen.
- Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 natten over for at tillade kollagengelering.
- Tilsæt 1 ml frisk hepatocytkulturmedium. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
- Til monolagskultur.
- Efter trin 6.3 skal du fjerne hepatocytkulturmediet. Skyl en gang med 1 ml hepatocytkulturmedium for at fjerne de ikke-fastgjorte celler.
- Tilsæt 1 ml frisk hepatocytkulturmedium. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
- Vurdere hepatocytrenhed og -funktion ved at udføre immunplettering for hepatocytspecifik markør og funktionelle assays som beskrevet tidligere10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kirurg kunne fortælle, om leverperfusion foregår glat ved at observere resultatet efter visse trin. Det første resultat kan observeres ved kanylering, skæring af den infrahepatiske IVC og gendannelse af perfusionsstrømningshastigheden. Leveren skulle have ændret farve fuldstændigt fra mørkerød til brun, samtidig med at dens volumen opretholdes. Hvis leveren ser lidt deflateret ud og har en rødlig farvetone eller pletter af rødt, betyder det, at perfusionsstrømningshastigheden blev indstillet forkert (for lavt), eller portalvenen blev ikke kanyleret korrekt. Hvis leveren ikke kun bliver brun, men bliver oppustet og stiv, betyder det, at strømningshastigheden blev indstillet forkert (for højt), eller den infrahepatiske IVC blev ikke skåret ordentligt. Hvis kun et par lapper ikke bliver perfuseret godt, betyder det, at kateteret blev indsat for dybt og kun perfuserer en gren af portalvenen. Det andet resultat kan observeres efter resektion og klipning af den infrahepatiske IVC. Hvis udstrømningen fra den suprahepatiske IVC er langsom og svag, kan det betyde, at kateteret havde løsnet sig under resektion, eller at den infrahepatiske IVC ikke blev klippet korrekt. Det tredje resultat kan observeres under fordøjelsen. På den brune lever skal gennemsigtige pletter / netværk vises og forstørres. Leveren skal miste sin fjedrende konsistens og blive blød og grødet. Vi optimerer vores kollagenasekoncentration, så denne tilstand kan nås inden for 12 minutter. Når du prøver en ny masse kollagenase, skal fordøjelsestiden forlænges, indtil denne tilstand er nået. Det fjerde resultat kan observeres, når celler frigives fra leveren. Når cellerne frigives, skal medierne se overskyede ud. Hvis der observeres en masse kornet tekstur, kan det betyde, at leveren ikke blev fordøjet tilstrækkeligt. Hvis fordøjelsen er afsluttet, skal der kun være hvide weblike fartøjer tilbage. Selvom fordøjelsen er delvis (figur 6),er det stadig muligt at erhverve gode celler.
Vores protokol beskrevet her genererer konsekvent højere celleudbytte på op til 5 × 108 hepatocytter pr. Isolering fra rotter, der vejer 200-300 g, og cellelevedygtighed mellem 88% -94,8% som bestemt ved trypanblåtælling 12,13,14,15,16 (tabel 2). Hepatocytrenhed opnået som bestemt ved immunsådning af albumin var 96,8 ± 2,0%11 (figur 7). Hepatocytter i sandwichkultur dannede tydelige galdekanaler og havde god celle-cellekontakt (figur 8). Hepatocytterne har høj funktionalitet som vist ved albumin-, urinstof- og CYP-assays10 (tabel 3).
Figur 1: Skematisk diagram over IPS. Perfusatet starter i perfusatposen eller flasken (1, 2). To flowregulatorer (3, 4) arbejder sammen for at kontrollere passagen af perfusat. Perfusat fortsætter til en boblefælde (5). Efterfølgende processer styres af LCD-berøringsskærmen (6) i hovedsystemet. Perfusat trækkes derefter af en peristaltisk pumpe (7) og passerer gennem en silikonekappe elektronisk varmelegeme (8), som opvarmer perfusatet til den ønskede temperatur. Silikonevarmerkappen (8) er forbundet til hovedsystemet ved hjælp af et stik (9). Når det er nødvendigt, kan en engangstryksensor (10) tilsluttes hovedsystemet ved hjælp af et stik (11) for at muliggøre måling af perfusionstrykket. Perfusatet passerer derefter gennem en perfusionsmonitor (12), som måler perfusatets temperatur og detekterer tilstedeværelsen af bobler. Skærmen kan også afgøre, om perfusatet er løbet tør. Monitoraflæsninger overføres til hovedsystemet via LoRa. Perfusatet fortsætter derefter til et boblefilter (13) og kommer ind i leveren gennem portalvenekaylen (14). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skematisk diagram over totrinskollagenasperfusion til primær rotte hepatocytisolering. (A) Perfusion af calciumfri buffer. Rulleklemmen løsnes helt for indløb 1 og strammes helt til indløb 2. (B) Leverfordøjelse med kollagenasebuffer. Resekteret lever overføres til toppen af et bægerglas for at muliggøre bufferrecirkulation. Rulleklemmen er helt løsnet til indløb 2 og helt strammet til indløb 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Lever efter kollagenase fordøjelse og hepatocytisolering. Vist er en delvist fordøjet leverlap. Ufordøjede dele af leveren forblev brune. I fordøjede dele af leveren blev kun hvide kar efterladt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Immunfæstelse af hepatocytisk markør til kvantificering af hepatocytrenhed. (A) Sandwichkultur af urenset levercellesuspension (før differentiel centrifugering; venstre) og renset hepatocytsuspension (efter differentiel centrifugering; højre) podet ved lav celletæthed. (B) Repræsentative billeder viser celler farvet med DAPI (kerne; blå) og antistof mod albumin (hepatocytspecifik markør; grøn). C) Kvantificering af hepatocytrenhed. Renheden blev bestemt ved at tælle albuminpositive fluorescerende farvede celler i forhold til det samlede celleantal visualiseret ved DAPI-nuklear farvning. Billeder i falske farver blev vist. Albumin (grøn), kerne af celler med albumin (blå), kerne af celler uden albumin (rød). Skalabjælker 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Fasekontrastbillede af isolerede primære rotte hepatocytter fra to-trins kollagenase perfusion i sandwichkultur på dag 3. Skalabjælke 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn på buffere/medier | Endelig koncentration | Beløb | Kommentarer/beskrivelse |
| Hepatocyt kultur medier | |||
| Williams E-medier | 500 ml | Tilføj alle reagenser i Williams E-medier. Filtrer gennem 0,22 μm filter. Opbevares ved 4 °C. | |
| Bsa | 1 mg/ml | 0,5 g | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 1X | 5 ml | |
| Insulin (20 mg/ml) | 0,5 μg/ml | 12,5 μL | |
| Dexamethason (1 mM) | 100 nM | 50 μL | |
| Linolsyre (7,5 μg/ml) | 50 ng/ml | 3,33 μL | |
| Glutamax (100X) | 1X | 5 ml | |
| Collagenase buffer | |||
| NaCl | 0,100 g | Opløs i 380 ml ultrarent vand. Juster til pH 7,49 - 7,51 med NaOH. På fyldes op til 400 ml med ultrarent vand. Filtrer gennem 0,22 μm filter. Opbevares ved 4 °C. | |
| KCl | 0,789 g | ||
| Collagenase Type IV | 80 - 200 U/ml | ||
| CaCl2·2H2O | 0,140 g | ||
| HEPES | 4.800 g | ||
| Calciumfri buffer | |||
| KH2PO4 | 0,0815 g | Opløs i 900 ml ultrarent vand. Juster til pH 7,49-7,51 med HCl. Filtrer gennem 0,22 μm filter. | |
| NaHCO3 | 1.0500 g | ||
| NaCl | 3.4480 g | ||
| KCl | 0,1750 g | ||
| DMEM til celleisolering | |||
| DMEM | 1 pose | På op til 1 L med ultrarent vand. Filtrer gennem 0,22 μm filter. Opbevares ved 4 °C. | |
| NaHCO3 | 1,5 g | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | 1X | 10 ml | |
| Kollagenoverlejring (1 ml) | |||
| 0,1 M NaOH | 1 del | 20,8 μL | Forbered frisk. Tilsæt kollagen sidst. |
| 10X PBS | 1 del | 20,8 μL | |
| 1X PBS | 6 dele | 125 μL | |
| Hepatocyt kultur medier | 32 dele | 667 μL | |
| Type I kvæg kollagen | 8 dele | 167 μL | |
| Opløsning af kollagenbelægning (1 ml) | |||
| Type I kvæg kollagen | 1 del | 0,5 ml | Forbered frisk. |
| 0,01 N HCl | 1 del | 0,5 ml | |
Tabel 1: Opskrifter på buffere og opløsninger.
| Hepatocyt levedygtighed (%) | Hepatocytudbytte (x 108 celler) | Levedygtigt hepatocytudbytte (x 108 celler) |
| 91.4 ± 3.4 | 4.39 ± 1.58 | 4.04 ± 1.48 |
Tabel 2: Cellelevedygtighed og udbytte. Værdier ± SD fra 18 forskellige eksperimenter vises.
| Urinstof (μg/million celler/dag) | Albumin (μg/million celler/dag) | CYP1A2-aktivitet (μg/million celler/dag) | CYP2B1/2-aktivitet (μg/million celler/dag) | CYP3B2-aktivitet (μg/million celler/dag) | |
| Dag 1 | 124 ± 2.6 | 39.0 ± 3.6 | |||
| Dag 3 | 65,7 ± 3,8 | 516,0 ± 95,1 | 2249 ± 56 | 188 ± 49 | 93,7 ± 0,6 |
Tabel 3: Funktionelle niveauer af isoleret primær rotte hepatocyt i sandwichkultur. Værdier ± SD for urinstof, albumin, CYP1A2, CYP2B1/2 og CYP3B2 assays fra tre forskellige eksperimenter er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er et par punkter, der er særligt vigtige at observere for to-trins collagenase perfusionsprocedure generelt. For det første skal der udvises særlig omhu ved resektering af leveren. Sørg for, at mave-tarmkanalen ikke beskadiges, da lækage af indholdet vil resultere i bakteriel forurening. Derudover skal du undgå at beskadige Glissons kapsel, som dækker leverens overflade under dyreproceduren. Hvis tåren er stor nok, kan det tillade for tidlig frigivelse af disassocierede hepatocytter i kollagenasebufferen. For det andet kan kollagenasens evne til at fordøje leveren og samtidig sikre god hepatocyt levedygtighed variere efter partiantal. Mængden af collagenase, der anvendes, skal optimeres til hvert nyt parti collagenase5. Det er tilrådeligt at teste et par partier af collagenase og vælge det bedste parti, før du køber i løs vægt. Sørg for, at vandet er ultrarent, og pH er korrekt. Urenheder i vandet som jernholdige og jernholdige ioner og den forkerte pH kan påvirke kollagenaseaktiviteten, hvilket så drastisk vil påvirke kvaliteten af de isolerede celler. Selvom kollagenasebufferrecirkulation i denne protokol kan være valgfri, er det ikke tilrådeligt, fordi mængden af collagenasebuffer, der er nødvendig, vil stige til >400 ml. Endelig bør perfusionstrykket og strømningshastigheden være inden for et passende område. Højt tryk og strømningshastighed vil føre til levercelledød, mens lavt tryk og strømningshastighed vil resultere i utilstrækkelig bufferstrøm gennem de mindrekar 10. Under calciumfri bufferperfusion vil trykket i første omgang stige. Ved kollagenasebufferperfusion vil trykket dog langsomt falde over tid, da fordøjelsen ved kollagenase reducerer strømningsmodstanden. Hvis trykfaldet ikke blev observeret, kan fordøjelsestiden forlænges efter behov. Da IPS har den valgfri tryksensor, er det muligt at variere perfusatets strømningshastighed for at kompensere for trykvariationer. På en anden note, selvom skylning af kredsløbet med en oxygenator blev brugt i nogle protokoller 2,5, fandt vi, at det ikke var kritisk for hepatocyts levedygtighed og udbytte. Således inkluderer vores enhed ikke en oxygenator.
I modsætning til den almindelige praksis med leverfordøjelse før resektion involverer denne protokol resektion af leveren før fordøjelsen. Tilgangen i denne protokol har flere fordele i forhold til den almindelige praksis. For det første kan overfordøjelse af leveren undgås. Afhængigt af kirurgens dygtighed kan leverresektion tage alt fra 5-10 minutter. Efter den almindelige praksis, selvom perfusionen er stoppet, svarer det stadig til yderligere 5-10 minutter, hvor leveren udsættes for kollagenase. Overfordøjelse kan nedsætte cellens levedygtighed og reducere hepatocytfastgørelse og funktion. For det andet kan denne tilgang potentielt reducere hepatocyttab. Glissons kapsel er mindre tilbøjelig til at rive, når leveren stadig er fjedrende før fordøjelsen, sammenlignet med når den er blød og grødet efter fordøjelsen. Endelig muliggør resektion af leveren før fordøjelsen muligheden for kollagenaserecirkulation. Kollagenaserecirkulation eliminerer forekomsten af mislykkede isolationer på grund af utilstrækkelig mængde kollagenase, der fremstilles. Vores tilgang gør det muligt at forlænge fordøjelsestiden efter behov. Det har også en mindre fordel ved at reducere mængden af collagenase, der er nødvendig pr. Isolering. Den største ulempe ved denne tilgang er, at den introducerer et nyt problem med kateterløsning halvvejs under perfusion, men som kunne løses med et par tekniske forholdsregler. En anden forskel er, at denne protokol ikke involverer brugen af densitetsgradient som Percoll. Ved at fjerne døde celler er Percoll blevet rapporteret at øge cellernes endelige levedygtighed med et vist tab af udbytte, fra 20% -50%16. Vores cellelevedygtighed er høj, fordi vi tester og udvælger collagenasepartier. Fra vores erfaring giver nogle collagenasepartier konsekvent lavere levedygtighed. Uden densitetscentrifugering vil det være nødvendigt at undgå dårlige kollagenasepartier gennem forudgående test. For dem, der ikke har en sådan frihed og skal overveje densitetsgradient, bør der udvises omhu under Percoll-fortynding for at undgå udvælgelse af hepatocyt-subpopulationer med en lidt anden metabolisk profil17,18.
Vores tilgang til at bruge en IPS til primær rotte hepatocytisolering løser flere problemer med eksisterende perfusionsopsætninger 1,2,5,6,7,8,9. Brug af engangssteril slange sparer tid ved at fjerne behovet for at rengøre og desinficere perfusionsrør før og efter hver isolering. Det reducerer brandfaren, da perfusionsslangen ikke behøver at blive fyldt med brandfarlig 70% ethanol, når den ikke er i brug for at opretholde sterilitet. Risikoen for forurening på grund af forkert desinfektion og opbevaring kan også elimineres. Vigtigst er det, at behovet for rutinemæssig udskiftning af gamle slanger kan omgås; denne proces er vigtig, men er ofte kompliceret og tidskrævende. Tilsætningen af et boblefilter til slangen nær kateteret gør det muligt for bobler at undslippe, før de når kateteret og forhindrer luft i at passere igennem, når perfusionsbufferen løber tør. Brug af en silikonevarmerkappe som temperaturstyringssystem muliggør præcis og stabil vedligeholdelse af perfusattemperaturen under fordøjelsen i modsætning til forvarmede buffere, som vil køle betydeligt ned over tid. Derudover er silikonevarmerjakken kompakt og kan let vedligeholdes, i modsætning til en glaskappe koblet til en vandbadcirkulationspumpe. Brug af overvågningssensorer til temperatur og tryk erstatter optimeringstrinnet før isolering. Temperaturvariation kan forekomme under eller mellem forsøg. Tryk (og dermed strømningshastighed) kan også ændre sig på grund af problemer med perfusionsrør. Placering af sensorer nær kanylen muliggør mere nøjagtig aflæsning af temperaturen på bufferperfusing i leveren. Sensoralarmer kan minde brugeren om at foretage korrigerende handlinger. Den optagede log giver også mulighed for fejlfinding. Brug af et specielt IV-kateter til kanylering forenkler kanylering af portalvenen. I modsætning til andre typer IV-kateter tillader kateteret, der er beskrevet her, væskekommunikation mellem kanylen og slangen i både dens punktering og tilbagetrukne nåleposition på grund af et hul ved siden af nålen. Således kunne kirurger bruge farveændring af leveren som et tegn på vellykket kanylering. Efter vellykket kanylering kan nålespidsen trækkes tilbage bag kateterspidsen for at forhindre genpiercing af portalvenen. Den tilbagetrukne nål kan også fungere som et fundament for ligaturen for at sikre portalvenen på den bløde kanyle og forhindre den i at blive deformeret. Dette kateter kan betjenes med den ene hånd; derfor kan den ikke-dominerende hånd bruges til at understøtte portalvenen med tang. Det kompakte integrerede design gør det muligt at sætte hele perfusionsenheden i den laminære hætte, hvilket reducerer risikoen for forurening og sparer plads. Dette er især vigtigt, hvis dyreforsøget skal udføres i et særligt dyreanlæg, hvor der kan være en udfordring at få plads til.
Sammenlignet med tidligere rapporterede rotte hepatocyt isolationsprotokoller ved hjælp af to-trins collagenase perfusion procedure1, genererer de beskrevne betingelser konsekvent højere celleudbytte på op til 5 x 108 hepatocytter pr. isolation, cellelevedygtighed mellem 88% -94,8% og god hepatocytspecifik funktion.
Denne protokol kan samtidig anvendes til at isolere andre ikke-parenkymale leverceller såsom Kupffer-celler, leverendotelceller og leverstellatceller fra den samme rotte. Denne protokol kan også ændres til isolering af leverceller fra mus ved at anvende et mindre måler IV-kateter til kanylering og reducere perfusionsstrømningshastigheden til et område, der er egnet til museart6. Perfusionsproceduren for mus kan forenkles ved at resektere leveren efter fordøjelsen.
IPS-enheden, der anvendes i dette eksperiment, kan også bruges til ex vivo leverperfusionsapplikation såsom eksperimenter med levertransplantation samt decellularisering af gnaver og kasserede humane lever19,20. IPS har en fordel, hvor leveren skal perfuseres i lange perioder, fordi IPS kan overvåge perfusionsbetingelser i realtid og tillade seponering af perfusionen efter afslutning enten automatisk eller manuelt med fjernbetjening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Zhou Yan og Hanry Yu erklærer konkurrerende interesser, da de har aktier i Vasinfuse, som fremstiller og markedsfører det integrerede perfusionssystem. Hanry Yu har aktier i Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate og Synally Futuristech, der ikke har nogen konkurrerende interesser med de oplysninger, der er rapporteret her.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes delvist af MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mekanobiologi Institut i Singapore (R-714-106-004-135); og Institut for Bioengineering og Nanoteknologi, Biomedicinsk Forskningsråd, Agenturet for Videnskab, Teknologi og Forskning (A* STAR) (Projektnumre IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 og MedCaP-LOA-18-02) finansiering til Hanry Yu. Ng Chan Way er forsker ved National University of Singapore. Vi vil gerne takke Confocal Microscopy Unit & Flow Cytometry Unit ved National University of Singapore for hjælp og rådgivning i hepatocytrenhedsanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
